Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysi siekacz to organ, który rośnie nieprzerwanie przez cały okres życia myszy. Nabłonkowe i mezenchymalne komórki macierzyste znajdujące się w tkankach proksymalnych siekaczy dają początek potomstwu, które różnicuje się w ameloblasty, odontoblasty i fibroblasty miazgi. Komórki te odgrywają kluczową rolę we wspieraniu trwałego obrotu tkanek siekaczy, co sprawia, że siekacz mysi jest doskonałym modelem do badania homeostazy dorosłych komórek macierzystych. Uważa się, że komórki macierzyste zawierają długowieczne komórki w stanie spoczynku, które mogą być znakowane analogami nukleotydów, takimi jak 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU). Komórki zachowują tę etykietę w czasie i są odpowiednio nazywane komórkami zachowującymi znacznik (LRC). Metody wizualizacji LRC in vivo stanowią solidne narzędzie do monitorowania homeostazy komórek macierzystych. W niniejszym opracowaniu opisaliśmy metodę wizualizacji i analizy LRC. Nasze innowacyjne podejście obejmuje LRC w siekaczach myszy po oczyszczeniu tkanek i barwieniu EdU w całości, a następnie mikroskopii konfokalnej i trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji za pomocą oprogramowania do obrazowania. Metoda ta umożliwia akwizycję obrazowania 3D i bezstronną ocenę ilościową w porównaniu z tradycyjną analizą LRC na przekrojonych szkiełkach.
Wprowadzenie
Ciągle rosnący siekacz myszy jest doskonałym modelem do badania dorosłych komórek macierzystych1. Nabłonkowe (pętla szyjna wargowa i językowa) i mezenchymalne komórki macierzyste (między pętlą szyjną wargową a językową), które znajdują się po bliższej stronie siekaczy, różnicują się w ameloblasty, odontoblasty i komórki miazgi zębowej. Ten unikalny proces stanowi źródło komórek do kompensacji utraty i obrotu tkanek2. Chociaż kilka markerów komórek macierzystych, takich jak Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 itp., zostało zidentyfikowanych in vivo dla podzbiorów dorosłych komórek macierzystych w siekaczach myszy, są one....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dla Texas A&M University College of Dentistry.
1. Przygotowanie koktajlu etykietującego EdU
- Przygotować roztwory bulionu koktajlowego zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Przygotuj koktajl z etykietą EdU zgodnie z opisem w Tabeli 1.
2. Przygotowanie myszy i roztworu EdU
- Przygotuj roztwór EdU. Rozpuścić EdU w DMSO w stężeniu 20 mg/ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
UWAGA: EdU jest ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po znakowaniu EdU i przeprowadzeniu procesu klarowania tkanek PEGASOS (Rycina 2), uzyskano przezroczystą żuchwę, co przedstawiono na naszym obrazie (Rycina 3B). Porównano zmodyfikowaną próbkę z normalną żuchwą, która nie była poddawana procesowi klarowania tkanek (Rycina 3A). Przezroczystą żuchwę (Rycina 3B) ze znakowaniem EdU poddano obrazowaniu konfokalnemu. Skupiono się na wierzchołku siekacza wykazu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wielokrotne dawki zastrzyków (BrdU, EdU) są zwykle stosowane u rosnących noworodków myszy w celu jak największego znakowania proliferujących komórek 1,6,13. Okres gonitwy jest uważany za krytyczny krok w odniesieniu do tempa odnawiania tkanek 6,13. Siekacz myszy odnawia się mniej więcej co miesiąc. Ta cecha pozwala badaczom ustawić okres pogoni na 4 tygodnie lub dłużej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Meghann K. Holt za redakcję rękopisu. Badanie to było wspierane przez granty NIH/NIDCR DE026461 i DE028345 oraz finansowanie start-upu z Texas A&M School of Dentistry dla dr Xiaofang Wang.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 i razy; Obiektyw/NA 0.9 | Probówki | 507702 | |
| 50 ml | Falcon | 352070 | |
| BD Igła PrecisionGlide | BD | REF 305111 | |
| Benzoesan bezylu (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND | Millipore Sigma | BR475505 | |
| Myszy C57BL / 6J | Jackson | Laboratory Strain #: 000664 | |
| Pompa obiegowa | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparyna | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| System obrazowania | Olympus | DP27 | |
| LAS X Oprogramowanie | Leica | ||
| Olympus Stereoskop | Olympus Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Askorbinian sodu | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-cyjanina 3 Azydowa | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Technologia sygnalizacji komórkowej | 12498 | |
| TCS SP8 Mikroskop konfokalny | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
Bibliografia
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712(2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth d....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
