Method Article

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek

DOI:

10.3791/63721

⸱

June 10th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Texas A&M School of Dentistry

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi siekacz to organ, który rośnie nieprzerwanie przez cały okres życia myszy. Nabłonkowe i mezenchymalne komórki macierzyste znajdujące się w tkankach proksymalnych siekaczy dają początek potomstwu, które różnicuje się w ameloblasty, odontoblasty i fibroblasty miazgi. Komórki te odgrywają kluczową rolę we wspieraniu trwałego obrotu tkanek siekaczy, co sprawia, że siekacz mysi jest doskonałym modelem do badania homeostazy dorosłych komórek macierzystych. Uważa się, że komórki macierzyste zawierają długowieczne komórki w stanie spoczynku, które mogą być znakowane analogami nukleotydów, takimi jak 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU). Komórki zachowują tę etykietę w czasie i są odpowiednio nazywane komórkami zachowującymi znacznik (LRC). Metody wizualizacji LRC in vivo stanowią solidne narzędzie do monitorowania homeostazy komórek macierzystych. W niniejszym opracowaniu opisaliśmy metodę wizualizacji i analizy LRC. Nasze innowacyjne podejście obejmuje LRC w siekaczach myszy po oczyszczeniu tkanek i barwieniu EdU w całości, a następnie mikroskopii konfokalnej i trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji za pomocą oprogramowania do obrazowania. Metoda ta umożliwia akwizycję obrazowania 3D i bezstronną ocenę ilościową w porównaniu z tradycyjną analizą LRC na przekrojonych szkiełkach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciągle rosnący siekacz myszy jest doskonałym modelem do badania dorosłych komórek macierzystych1. Nabłonkowe (pętla szyjna wargowa i językowa) i mezenchymalne komórki macierzyste (między pętlą szyjną wargową a językową), które znajdują się po bliższej stronie siekaczy, różnicują się w ameloblasty, odontoblasty i komórki miazgi zębowej. Ten unikalny proces stanowi źródło komórek do kompensacji utraty i obrotu tkanek2. Chociaż kilka markerów komórek macierzystych, takich jak Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 itp., zostało zidentyfikowanych in vivo dla podzbiorów dorosłych komórek macierzystych w siekaczach myszy, są one nieodpowiednie do reprezentowania populacji komórek macierzystych, gdy są używane samodzielnie1,3,4,5. Wizualizacja długowiecznych komórek w stanie spoczynku poprzez znakowanie i przechowywanie analogowego DNA nukleotydów może zapewnić bezstronne wykrywanie większości podzbiorów dorosłych komórek macierzystych6. Co więcej, podejście to jest przydatne wśród wielu metod identyfikacji komórek macierzystych7 do zrozumienia zachowania komórek i homeostazy populacji komórek macierzystych zębów3,8. Podczas gdy dzielące się komórki macierzyste straciłyby swoje oznakowanie DNA po znacznym pościgu, domniemane komórki macierzyste w stanie spoczynku zachowują swoją etykietę DNA, uznając je za komórki zachowujące etykietę (LRC)6. Znakowanie i przechowywanie DNA przez niedzielące się komórki macierzyste oznaczy i zlokalizuje domniemane dorosłe komórki macierzyste w ich niszach.

W ciągu ostatnich lat, znakowanie analogiem 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU) analogu tymidyny zastąpiło kłopotliwą, czasochłonną i niekompatybilną metodę znakowania DNA 3H-tymidyny za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości do testów proliferacji komórek6,9. W ostatnich latach technika znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) jest coraz częściej stosowana w BrdU. Ten wzorzec pojawił się z kilku powodów. Po pierwsze, metoda BrdU jest powolna i pracochłonna. Warunki użytkowania są zmienne i nie jest w stanie zachować ultrastruktury w próbkach (ze względu na denaturację DNA). Podobnie, metoda BrdU traci antygenowość komórek, co czyni ją nieefektywną w dalszych analizach funkcjonalnych i testach, takich jak eksperymenty kolokalizacyjne i przeszczep komórek macierzystych in vivo3,7,9,10,11,12. BrdU jest również teratogenem, który nie nadaje się do oznaczania LRC w rozwoju embrionalnym6. Ponadto metoda BrdU jest nieefektywna, gdy jest stosowana w próbkach z pełnym mocowaniem. Wadą jest niska penetracja przeciwciał w głębokiej części próbek lub wymóg długiego okresu inkubacji przeciwciał do głębokiej penetracji13. Znakowanie EdU wymyka się etapom denaturacji próbek, zachowując w ten sposób ultrastrukturę. Ta funkcja jest korzystna w przypadku dalszych analiz funkcjonalnych, takich jak eksperymenty kolokalizacyjne i przeszczep komórek macierzystych11,12. Ponadto etykietowanie EdU jest bardzo czułe i szybkie; penetracja próbki jest wysoka dzięki zastosowaniu szybko wchłanianych i mniejszych azydków fluorescencyjnych do wykrywania etykiet EdU poprzez katalizowaną Cu(I) [3 + 2] reakcję cykloaddycji (chemia "klik")14.

Inną coraz częściej stosowaną metodą znakowania DNA jest użycie zmodyfikowanych myszy transgenicznych. Myszy te wykazują ekspresję histonu 2B białka zielonej fluorescencji (H2B-GFP) kontrolowanego przez element regulatorowy reagujący na tetracyklinę5,14. Po karmieniu myszy karmą/wodą z tetracykliną przez okres od 4 tygodni do 4 miesięcy, fluorescencja GFP zmniejszy się w komórkach cyklicznych i tylko LRC zachowają fluorescencję6. Zaletą tej metody jest to, że znakowane LRC mogą być izolowane i pozostają żywotne dla hodowli komórkowych lub dalszych analiz funkcjonalnych6,7. Niektóre badania wykazały niedokładne oznaczanie komórek macierzystych w stanie spoczynku, gdy są one ścigane do długotrwałego stosowania. Wynik ten był spowodowany nieszczelnym wyrazem tła ze szczepu H2B-GFP, a nie odpowiednią odpowiedzią regulowaną przez tetracyklinę15.

Ponadto, większość literatury w przeszłości używała wykrywania LRC głównie na przekrojach slajdów, które są dwuwymiarowe i często błędnie pokazują dokładną lokalizację i liczbę LRC. Podejście wyświetlało nieprawidłowe kąty dla przekrojów złożonych struktur tkankowych16. Druga metoda polegała na pozyskaniu obrazów 3D z przekrojów seryjnych i wykonaniu rekonstrukcji po obrazie. Te kroki były niedokładne ze względu na zniekształcenia obrazu spowodowane zmianami w każdej sekcji szeregowej z powodu skompresowanych lub rozciągniętych sekcji, co skutkowało brakiem informacji16,17,18. Metoda była również pracochłonna i czasochłonna.

Aby ułatwić obrazowanie LRC w całości, próbki muszą być czyste, a fluorescencja dobrze utrzymana. Obecne techniki oczyszczania tkanek można podzielić na trzy główne kategorie: techniki oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalników organicznych, techniki oczyszczania tkanek na bazie odczynników wodnych oraz techniki oczyszczania tkanek na bazie hydrożelu17,19. Niedawno opracowano system rozpuszczalnikowy na bazie glikolu polietylenowego (PEG) (PEGASOS). Takie podejście sprawia, że prawie wszystkie rodzaje tkanek są przezroczyste i zachowują endogenną fluorescencję, w tym tkanki twarde, takie jak kości i zęby20. Metoda PEGASOS ma przewagę nad innymi metodami oczyszczania tkanek, zwłaszcza w przypadku oczyszczania materiałów zębowych i kostnych. Większość innych metod może tylko częściowo usunąć twarde tkanki, ma długi czas przetwarzania lub wymaga kosztownych odczynników21. Ponadto metoda PEGASOS może skutecznie zachować endogenną fluorescencję w porównaniu z innymi metodami.

Ta literatura doprowadziła nas do stworzenia nowej metody badania komórek. Połączyliśmy zalety wykrywania LRC wynikające z etykietowania EdU z najdoskonalszym obrazowaniem 3D w całości próbek oczyszczonych tkankowo; próbki zostały przetworzone za pomocą zaawansowanej techniki oczyszczania tkanek związanych z systemem rozpuszczalnikowym związanym z glikolem polietylenowym (PEG) (PEGASOS)15. Przezroczystość tkanek twardych umożliwiła nam zrekonstruowanie sygnału 3D fluorescencji LRC in vivo bez łamania zębów lub żuchwy, tworząc dokładniejszy sposób wizualizacji i ilościowego oznaczania LRC.

W tym badaniu dostarczamy innowacyjny przewodnik do wizualizacji LRC w siekaczu myszy. Przeprowadziliśmy wizualne podejście 3D, aby określić lokalizację i ilość LRC w niszy komórek macierzystych siekaczy myszy. W ramach tego projektu wykorzystano znakowanie EdU, techniki oczyszczania tkanek PEGASOS oraz mikroskopię konfokalną. Nasza metoda znakowania LRC metodą EdU na całej masowej tkance oraz wykorzystanie oczyszczonej i przezroczystej próbki pokonuje zarówno ograniczenia tradycyjnych szkiełek sekcyjnych, jak i inne niekorzystne metody znakowania DNA. Tym samym nasza technika będzie odpowiednia do badań nad homeostazą komórek macierzystych wymagających wykrycia LRC, zwłaszcza na tkankach twardych. Protokół może być równie korzystny dla tych, którzy koncentrują się na homeostazie komórek macierzystych w innych tkankach i narządach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dla Texas A&M University College of Dentistry.

1. Przygotowanie koktajlu etykietującego EdU

  1. Przygotować roztwory bulionu koktajlowego zgodnie z opisem w Tabeli 1.
  2. Przygotuj koktajl z etykietą EdU zgodnie z opisem w Tabeli 1.

2. Przygotowanie myszy i roztworu EdU

  1. Przygotuj roztwór EdU. Rozpuścić EdU w DMSO w stężeniu 20 mg/ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: EdU jest mutagenem. Użytkownicy powinni nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas obchodzenia się z tą substancją.
  2. Wstrzyknąć 5-dniowym myszom C57BL/6J przygotowany roztwór EdU dootrzewnowo w stężeniu 3 μl/g masy ciała. Myszy muszą otrzymywać roztwór raz dziennie przez 7 kolejnych dni. Następnie przechodzą okres pościgu przez 6 tygodni, zanim zostaną zebrane do analizy (Rysunek 1).
    UWAGA: Należy uważać, aby uniknąć ukłucia igły podczas wstrzykiwania EdU myszom. Po wstrzyknięciu EdU przez 7 kolejnych dni umieść myszy w nowej klatce. Po tym, jak myszy znajdą się w nowym domu, wyrzuć ściółkę do starej klatki, stosując odpowiednie zasady dotyczące zagrożenia biologicznego.

3. Przygotowanie próbki przez perfuzję przezsercową (53-dniowe myszy po urodzeniu po 6-tygodniowym okresie pościgu)

UWAGA: Wątroba myszy powinna zblednąć po udanej perfuzji przezsercowej.

  1. Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym. Należy im podać kombinację ksylazyny i środków znieczulających ketaminą (ksylazyna 10-12,5 mg/kg; Ketamina, 80-100 mg/kg masy ciała).
  2. Odczekaj ~10 minut, aż mysz przestanie reagować na bolesne bodźce (takie jak odruch szczypania łapy).
  3. Umieść myszy w pozycji leżącej stabilizowanej na styropianowym podłożu za pomocą igieł w każdej łapie.
  4. Odsłoń klatkę piersiową, otwierając leżącą nad nią skórę za pomocą pęsety i nożyczek preparujących.
  5. Rozetnij membranę ostrymi nożyczkami. Uważaj, aby nie przebić serca.
  6. Przeciąć klatkę piersiową, chwytając podstawę mostka nożyczkami zaciskowymi, aby odsłonić serce.
  7. Przenieś mysz do etapu perfuzji w pobliżu pompy cyrkulacyjnej w okapie wyciągowym.
  8. Wprowadzić igłę 25 G (z rurki wypełnionej roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)/4% roztworem paraformaldehydu (PFA)) do wierzchołka lewej komory. Uważaj, aby końcówka igły znajdowała się w świetle komory.
    UWAGA: PFA jest umiarkowanie toksyczny i prawdopodobnie rakotwórczy. Używaj środków ochrony osobistej do obchodzenia się z PFA i przygotuj roztwór pod wyciągiem chemicznym. Odpady PFA wymagają odpowiedniej utylizacji zgodnie z wytycznymi instytucji.
  9. Przeciąć prawą komorę ostrymi nożyczkami natychmiast po wprowadzeniu igły do lewej komory. Ten krok pozwala na wypłynięcie krwi z myszy i spływanie do naczynia zbiorczego.
  10. Próbki należy przeprowadzić perfuzję w 50 ml roztworu PBS przy natężeniu przepływu 7 ml/min.
  11. Po perfuzji PBS przełączyć zawór odcinający, aby umożliwić przepływ 20 ml 4% roztworu PFA przy tym samym natężeniu przepływu 5 ml/min.
  12. Gdy pompa cyrkulacyjna jest nadal włączona, wyjmij igłę z lewej komory.
    UWAGA: Mysz jest teraz ustawiona na pozycję do pobierania tkanek. Aby zachować fluorescencję, należy unikać ekspozycji na światło, gdy tylko jest to możliwe przez cały czas trwania protokołu. Podczas przetwarzania tkanki stożkowa probówka o pojemności 50 ml z próbkami tkanek może być pokryta folią aluminiową.

4. Oczyszczanie tkanki żuchwy za pomocą techniki PEGASOS

UWAGA: Stożkowa probówka o pojemności 15 ml lub 50 ml w zależności od objętości tkanek może być użyta do utrzymania próbek w gotowości do leczenia na każdym etapie. Próbki są przetwarzane w wytrząsarkach o temperaturze 37 °C (~100 obr./min) od stopni 4.2 do 4.7. Używaj plastikowych pojemników na bazie polipropylenu, które są odporne na rozpuszczalniki organiczne, aby uniknąć stopienia plastiku. Alternatywnie można użyć szkła.

UWAGA: Technika oczyszczania tkanek PEGASOS wykorzystuje toksyczne roztwory, takie jak Quadrol, glikol polietylenowy (PEG), benzoesan benzylu (BB), MMA500, itp. Wymagane są odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć potencjalnego narażenia.

  1. Wypreparuj żuchwy i następnie utrwal próbki w 4% PFA. Przechowuj je w temperaturze pokojowej przez noc.
  2. Usuń mięśnie z żuchwy i zanurz je w 0,5 M roztworze EDTA (pH 8,0) w celu odwapnienia na 4 dni. W tym czasie należy codziennie wymieniać pożywkę w wytrząsarce o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Pożądane jest usunięcie mięśni z próbki w jak największym stopniu. Ten środek ostrożności uprości proces obrazowania i zmniejszy autofluorescencję mięśni
    3. .
  3. Odbarwić żuchwy 25% roztworem Quadrol (v/v w H2O) na wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez jeden dzień w celu usunięcia pozostałego hemu krwi.
  4. Kompletne barwienie EdU całego mocowania.
    1. Przygotuj świeży koktajl z etykietą EdU zgodnie z tabelą 1.
      UWAGA: Koktajl do etykietowania EdU musi być za każdym razem świeży z dodatkiem świeżo przygotowanego roztworu askorbinianu w celu uzyskania optymalnych wyników etykietowania EdU.
    2. Płukać żuchwy PBST przez 30 minut na wytrząsarce o temperaturze 37 °C.
    3. Opłucz żuchwy PBS trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.
    4. Inkubuj żuchwy w świeżo przygotowanym koktajlu z etykietą EdU na shakerze o temperaturze 37 °C przez noc.
    5. Opłucz żuchwy PBS trzy razy przez 3 minuty za każdym razem.
  5. Przeprowadzić seryjne odlipidanie w każdym z poniższych roztworów przez 6 godzin w temperaturze 37 °C:
    30% roztwór tert-butanolu (tB): 75% v/vH2O, 22% v/v tB i 3% v/v Quadrol.
    Roztwór 50% tB: 50% v/v H2O, 47% v/v tB i 3% v/v Quadrol.
    70% tB roztwór: 30% v/v H2O, 67% v/v tB i 3% v/v Quadrol
    UWAGA: Etap delipidacji ma kluczowe znaczenie. Delipidację można przeprowadzić przez 4-6 godzin w roztworze o stężeniu 30% i 50% tB oraz przez 1 dzień w roztworze o stężeniu 70% tB.
  6. Odwodnić żuchwy w roztworze tB-PEG przez 2 dni z następującą dzienną zmianą podłoża: 75% tB, 22% v/v metakrylanu eteru metylowego glikolu polietylenowego średnia MMA500 i 3% v/v Quadrol w temperaturze 37 °C.
  7. Oczyść żuchwę w podłożu oczyszczającym benzoesan benzylu (BB)-PEG, aby uzyskać dopasowanie współczynnika załamania: 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 i 3% Quadrol aż do uzyskania przezroczystości.
    UWAGA: Mamy informacje na temat dopasowania współczynnika załamania światła. Składniki nieorganiczne i organiczne w tkankach, takie jak woda, lipidy, białka, minerały, organelle itp., Mają różny współczynnik załamania światła (RI) w zakresie od 1,33 do 1,55. To niedopasowanie RI między składnikami tkanki utrudnia proces obrazowania. Przezroczystość można osiągnąć poprzez wyeliminowanie niedopasowania RI w tkance. Zaleca się zanurzenie próbek oczyszczonych tkankowo w podłożu czyszczącym BB-PEG. Ten krok zapewni jednolite wewnętrzne RI wynoszące ~1,54 (zwane dopasowaniem RI) dla całej próbki, ułatwiając proces obrazowania.
  8. Zachowaj żuchwy w pożywce do oczyszczania tkanek BB-PEG w temperaturze pokojowej do przechowywania i obrazowania.
    UWAGA: Dobrze jest zakończyć obrazowanie tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć stopniowej utraty reporterów fluorescencyjnych. Jednak metoda PEGASOS pozwoli utrzymać reportery fluorescencji w dobrym stanie nawet po kilku tygodniach przechowywania20,21. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki można również przechowywać w temperaturze 4°C.

5. Konfokalne obrazowanie żuchwy oczyszczonej z tkanek

  1. Zamontuj oczyszczoną tkankę całą żuchwę na markowych szkiełkach w podłożu czyszczącym BB-PEG i przykryj szkiełkami szklanymi. Unikaj pęcherzyków.
  2. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą odpowiedniego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Wybierz opcję Acquire (Akwizycja) i ustaw parametry akwizycji obrazu na rozdzielczość 512 x 512 pikseli i szybkość akwizycji 400 Hz. Ustawienia te znajdują się w menu trybu akwizycji oprogramowania sterującego mikroskopem.
  3. W panelu do wzbudzenia fluorescencyjnego aktywuj wymagany laser (TRITC) do optymalnego wzbudzenia fluoroforów (sonda, której użyliśmy do wizualizacji LRC, ma właściwości fluorescencyjne, takie jak Cy3 ze wzbudzeniem przy 548 nm i emisją przy 563 nm długości fali lasera).
  4. W panelu wykrywania fluorescencyjnego przesuń suwak, aby wybrać długości fal, które będą mierzone (na przykład od 555 do 625 nm dla fluoroforu podobnego do Cy3).
  5. Umieść zamontowaną żuchwę na stoliku mikroskopu, aby zwizualizować i znaleźć próbkę za pomocą białego światła i obiektywu o mniejszym powiększeniu (2-10x).
  6. Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego, aby dopasować współczynnik załamania światła szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu.
    UWAGA: Dopasuj współczynnik załamania światła obiektywów, mediów obrazowych i tkanek tak dokładnie, jak to możliwe, aby zminimalizować wprowadzanie zniekształceń optycznych podczas akwizycji obrazu.
  7. Włącz lampy fluorescencyjne i wybierz odpowiedni obiektyw powiększający, aby obrazować obszary zainteresowania. Użyliśmy obiektywu o powiększeniu 20x i aperturze numerycznej 0,9 przy odległości roboczej 1,95 mm. Soczewka o większej odległości roboczej może być wymagana podczas obrazowania większych próbek tkanek w mikroskopie konfokalnym. Alternatywnie, obrazowanie można łatwo wykonać za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi w przypadku większych próbek tkanek.
  8. W oprogramowaniu do obrazowania konfokalnego naciśnij przycisk Na żywo, aby uruchomić tryb skanowania na żywo. Aby zmaksymalizować zakres dynamiczny obrazów i uniknąć nasycenia pikseli, dostosuj wzmocnienie i intensywność lasera dla wybranego kanału.
  9. Zidentyfikuj pole widzenia, aby zwizualizować cały obszar żuchwy w wymiarach X i Y. Ustaw górne i dolne parametry akwizycji stopnia Z, które dokładnie pokrywają objętość niszy komórek macierzystych w siekaczu myszy. Użyj kroku Z o rozmiarze 2 μm lub zgodnie z własnymi wymaganiami. Nowsze wersje mikroskopów konfokalnych powinny być w stanie automatycznie rejestrować stosy z różnych nakładających się na siebie obszarów.
  10. Pobieraj i zapisuj pliki obrazów stosu Z w formacie .lif.
    UWAGA: Muchy .lif można przekonwertować na pliki .tiff i wykorzystać w innym oprogramowaniu do analizy 3D.

6. Przetwarzanie obrazu, rekonstrukcja obrazu 3D i kwantyfikacja komórek zachowujących etykiety poprzez tworzenie powierzchni, segmentację obszaru zainteresowania (ROI), maskowanie ROI i tworzenie plam

UWAGA: Użyliśmy Imaris (Bitplane 9.0.1) do przetwarzania obrazów i rekonstrukcji 3D, ale podobne kroki przetwarzania obrazu można przeprowadzić za pomocą innych pakietów oprogramowania (np. ImageJ/Fiji, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira, itp.).

  1. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij przycisk Arena, a następnie wybierz opcję Obraz. Wybierz oryginalny plik .lif i wybierz scalony plik, obrazy zostaną zaimportowane do oprogramowania do obrazowania.
    UWAGA: Alternatywnie użyj konwertera plików oprogramowania do obrazowania, aby przekonwertować plik obrazu stosu Z na natywny typ pliku dla oprogramowania. Na przykład: przekonwertuj pliki .lif na pliki .ims za pomocą konwertera plików Imaris i otwórz pliki .ims w oprogramowaniu do obrazowania. Konwersja danych do natywnego formatu pliku oprogramowania pozwoli na szybką konwersję plików i zminimalizuje błędy.
  2. Kliknij dwukrotnie zaimportowany plik, aby otworzyć zestaw danych obrazu.
  3. Odwiedź panel Regulacja wyświetlania, kliknij nazwę kanału. Zwykle jest oznaczony jako czerwony w trybie domyślnym.
    1. W oknie Właściwości obrazu kliknij kartę Odwzorowany kolor. W opcji Plik tabeli kolorów wybierz Fire Flow, a następnie kliknij OK. Kolor wyświetlacza jest zwykle wybierany w celu odróżnienia fluorescencji tła i fluorescencji dodatniej od próbki.
  4. W lewym górnym rogu ekranu w okienku Scena — Właściwości kliknij niebieską ikonę z etykietą Dodaj nową powierzchnię. Usuń zaznaczenie ikony głośności, która usunie większość fluorescencji tła, a fluorescencja dodatnia będzie wyraźnie widoczna (patrz krok 6.4.2).
    1. Rozpocznij proces ręcznej segmentacji regionu zainteresowania (ROI) klikając w zakładkę Create (Tworzenie) i wybierając zakładkę Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. W kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni kliknij kartę Kontur, aby wybrać orientację (XY, YZ lub XZ) na podstawie próbek, aby łatwo obrysować ROI. Tutaj wybieramy orientację XY.
    2. Następnie upewnij się, że menu wskaźnika w prawym rogu jest w trybie wyboru. Dostosuj pozycję plastru, aby zlokalizować ROI w tkance. Zauważysz, że większość fluorescencji tła została usunięta z wyraźną fluorescencją dodatnią, jak wspomniano w kroku 6.4. Kliknij przycisk Rysuj i narysuj wstępny obszar zainteresowania. Wybierz opcję Widoczność na brak, aby uniknąć zakłóceń z obszarów innych niż ROI.
    3. Powtórz krok 6.4.2. plasterek po plasterku, aby narysować cały obszar zainteresowania.
    4. Po zakończeniu rysowania ROI kliknij Utwórz powierzchnię, aby uzyskać geometrię 3D ROI.
    5. Kliknij przycisk Edytuj w kreatorze ręcznego tworzenia powierzchni i wybierz opcję Maskuj wszystko.
    6. W wyskakującym oknie Mask Channel (Kanał maski) wybierz Channel 1 (Kanał 1) w opcjach wyboru kanałów. Następnie wybierz Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski. W ustawieniach maski wybierz Stała wewnątrz/na zewnątrz i ustaw zewnętrzną powierzchnię woksela na 0.
    7. W okienku Właściwości sceny usuń zaznaczenie obiektu powierzchni i wybierz obiekt objętościowy. W Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania) usuń zaznaczenie oryginalnego kanału "Czerwony" i wybierz kanał Zamaskowany czerwony oraz dostosuj intensywność kolorów, aby uzyskać żądany zwrot z inwestycji w fluorescencję renderowany w 3D i pozytywnie oznaczony.
  5. Utwórz nowy obiekt dodatkowy. Zacznij od kliknięcia ikony Dodaj punkty, aby określić ilościowo LRC renderowane w 3D, tworząc punkty 3D, które w porównywalny sposób pokrywają się z LRC renderowanymi w 3D. Użyj dolnych strzałek, aby przechodzić między krokami w kreatorze tworzenia spotów.
    1. W kreatorze tworzenia spotów będą dostępne cztery sekwencyjne kroki instrukcji, aby automatycznie tworzyć spoty za pomocą oprogramowania. Upewnij się, że w pierwszym kroku jest zaznaczona opcja Segmentuj tylko obszar zainteresowania. Kliknij ikonę Dalej.
    2. W drugim kroku pojawi się "XYZ 3D box". Dostosuj pole XYZ, aby pokryć zwrot z inwestycji. Kliknij ikonę Dalej.
    3. W trzecim kroku przejdź do opcji Kanał źródłowy. Wybierz zamaskowany czerwony kanał; wprowadzić szacowaną średnicę plamki XY porównywalną do dopasowania i nałożenia na siebie kropek fluorescencyjnych próbki. Kliknij ikonę Dalej.
    4. W czwartym kroku dodaj typ filtra "Jakość" i dostosuj dolny próg intensywności, przesuwając przesuwane okno po histogramie "Jakość", aż większość możliwych do zidentyfikowania LRC zostanie oznaczona jako
      UWAGA: Segmentacja, a co za tym idzie odczyty statystyczne (przykład: liczba komórek) w dużym stopniu zależą od wartości progowych intensywności. Uważaj, aby precyzyjnie ustawić odpowiednie wartości progowe.
    5. Kliknij przycisk Zakończ i wybierz przycisk Statystyka. Wybierz kartę Ogólne, aby znaleźć wartość całkowitej liczby plam na obrazie.
    6. Eksportuj statystyki, klikając przycisk Zakładka Wyświetl do pliku i otrzymaj wyniki w .xls pliku.
    7. Użyj odpowiedniego diagramu, aby przedstawić wyniki kwantyfikacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po oznakowaniu EdU i procesie oczyszczania tkanek PEGASOS (Rysunek 2), uzyskano przezroczystą żuchwę, jak pokazano na naszym obrazie (Rysunek 3B). Porównaliśmy zmodyfikowaną próbkę z normalną żuchwą bez procesu oczyszczania tkanek (Rysunek 3A). Przezroczysta żuchwa (Ryc. 3B) z oznaczeniem EdU poddano obrazowaniu konfokalnemu. Skupiliśmy się na wierzchołku siekacza pokazującym niszę komórek macierzystych, jak pokazano na (rysunek uzupe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielokrotne dawki zastrzyków (BrdU, EdU) są zwykle stosowane u rosnących noworodków myszy w celu jak największego znakowania proliferujących komórek 1,6,13. Okres gonitwy jest uważany za krytyczny krok w odniesieniu do tempa odnawiania tkanek 6,13. Siekacz myszy odnawia się mniej więcej co miesiąc. Ta cecha pozwala badaczom ustawić okres pogoni na 4 tygodnie lub dłużej

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Meghann K. Holt za redakcję rękopisu. Badanie to było wspierane przez granty NIH/NIDCR DE026461 i DE028345 oraz finansowanie start-upu z Texas A&M School of Dentistry dla dr Xiaofang Wang.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 M EDTASigma AldrcihE9884
20 i razy; Obiektyw/NA 0.9Probówki507702
50 mlFalcon352070
BD Igła PrecisionGlideBDREF 305111
Benzoesan bezylu (BB)Sigma Aldrcih409529
Bitplane 9.0.1Imaris
BRANDMillipore SigmaBR475505
Myszy C57BL / 6JJacksonLaboratory Strain #: 000664
Pompa obiegowaVWR23609-170
CuSO4Sigma Aldrcih451657
DMSOSigma AldrcihD8418
EdUCarboynthNE08701
HeparynaMiiilipore SigmaH3149
System obrazowaniaOlympusDP27
LAS X OprogramowanieLeica
Olympus StereoskopOlympus OlympusSZX16
ParaformaldehyeSigma AldrichP6148
PBSSigma AldrichP4417
PEGMMA500Sigma Aldrich447943
QuadrolSigma Aldrich122262
Askorbinian soduSigma Aldrich11140
Sulfa-cyjanina 3 AzydowaLumiprobeD1330
TBS-10XTechnologia sygnalizacji komórkowej12498
TCS SP8 Mikroskop konfokalnyLeica
tert-butanol (tB)Sigma Aldrich360538
Triton X-100Sigma AldrichX100
wirówkowe Falcon Leica Szkiełka wnękowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712(2017).
  2. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  3. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378(2018).
  4. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
  5. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  6. Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
  7. de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595(2021).
  8. Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
  9. Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
  10. Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345(2021).
  11. Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
  12. Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
  13. Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
  14. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  15. Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357(2008).
  16. Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
  17. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  18. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  19. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).
  20. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  22. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  23. Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Retaining CellsMouse IncisorsTissue Clearing3D ReconstructionStem Cell NicheEdU StainingConfocal MicroscopyMandible DecalcificationMesenchymal Stem CellsEpithelial Stem Cells

Related Articles