Method Article

Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

DOI:

10.3791/63723

⸱

May 16th, 2022

 ,  ,  , 
1Danish Headache Center, Department of Neurology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail), Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology, University of Copenhagen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje model uwalniania peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) ex vivo oraz strategię ilościowego określania wpływu środków farmakologicznych na ilość CGRP uwalnianego z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) został po raz pierwszy odkryty w latach 80. jako wariant splicingu genu kalcytoniny. Od czasu jego odkrycia, jego rola w patofizjologii migreny została dobrze ustalona, najpierw ze względu na jego silne właściwości rozszerzające naczynia krwionośne, a następnie przez jego obecność i funkcję jako neuroprzekaźnika w czuciowym układzie trójdzielno-naczyniowym. Zdolność CGRP do wywoływania migreny pomogła przemysłowi farmaceutycznemu w opracowaniu przeciwciał monoklonalnych i antagonistów hamujących działanie CGRP. Nowy paradygmat leczenia okazał się skuteczny w profilaktyce migreny. Jednym z użytecznych narzędzi do lepszego zrozumienia mechanizmów migreny jest model ex vivo uwalniania CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego. Jest to stosunkowo prosta metoda, która może być stosowana z różnymi narzędziami farmakologicznymi w celu uzyskania know-how w celu dalszego rozwoju nowych skutecznych metod leczenia migreny. Niniejszy protokół opisuje model uwalniania CGRP oraz technikę ilościowego określania wpływu środków farmakologicznych na ilość CGRP uwalnianego z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni. Przedstawiono procedurę opisującą eksperymentalne podejście od eutanazji do pomiaru poziomu białka. Szczegółowo opisano niezbędną izolację zwoju nerwu trójdzielnego i jądra dolnego nerwu trójdzielnego zarówno od myszy, jak i szczurów oraz przygotowanie opony twardej szczura. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki dla obu gatunków (szczurów i myszy). Technika ta jest kluczowym narzędziem do badania mechanizmów molekularnych związanych z patofizjologią migreny przy użyciu różnych związków farmakologicznych i genetycznie modyfikowanych zwierząt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migrena to zaburzenie neurologiczne, które według WHO według szacunków dotyka ponad 1 miliarda ludzi i jest jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności na całym świecie1. W związku z tym migrena ma znaczący wpływ zarówno na pacjentów, jak i na społeczeństwo. Pomimo niedawnego sukcesu klinicznego leków antagonizujących CGRP, duża część pacjentów potrzebuje lepszych opcji leczenia2,3,4,5. Konieczne jest wyjaśnienie patofizjologii migreny prowadzące do nowych, skutecznych metod leczenia. Sygnalizacja w układzie trójdzielno-naczyniowym składającym się z opon mózgowych, zwojów nerwu trójdzielnego (TG) i jądra nerwu trójdzielnego (TNC) ma kluczowe znaczenie dla patofizjologii migreny6,7.

37-aminokwasowy peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) został po raz pierwszy odkryty na początku lat 80., kiedy Amara i współpracownicy wykazali, że pierwotny transkrypt RNA genu kalcytoniny może być przetworzony w celu uzyskania mRNA kodującego CGRP oprócz kalcytoniny8,9. Późniejsze badania sugerowały związek z patofizjologią migreny10. CGRP jest neuroprzekaźnikiem o silnych właściwościach rozszerzających naczynia krwionośne11,12,13,14,15,16,17, i jest szeroko rozpowszechniony w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym13,14,18,19,20,21,22. Udział CGRP w migrenie został podkreślony odkryciem podwyższonego poziomu CGRP w krążeniu pozamózgowym podczas ataków migreny u ludzi23, oraz że wlew CGRP powoduje ból podobny do migreny u pacjentów24. Dwa lata później opublikowano pierwsze badanie potwierdzające skuteczność antagonisty CGRP olcegepantu w leczeniu migreny25.

CGRP występuje obficie w układzie trigeminovascular (układ trójdzielno-naczyniowy), jak pokazano w TG21,26, czuciowe włókna nerwowe unerwiające oponę twardą27,28,29 oraz TNC30. W układzie trójdzielno-naczyniowym CGRP znajduje się w małych i średnich neuronach TG, w niezmielinizowanych włóknach C i ulega ekspresji w prawie 50% populacji neuronów TG. Receptor CGRP ulega ekspresji głównie w większych neuronach i znajduje się w mielinowanych włóknach Aδ31,32. CGRP jest uwalniany z neuronów po stymulacji chemicznej lub elektrycznej33,34. Badania szlaków prowadzących do uwalniania CGRP i lokalizacji tej aktywacji mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii migreny. W ciągu ostatnich 5 dekad badania przedkliniczne przyczyniły się do zdobycia obszernej wiedzy na temat sygnalizacji związanej z migreną i przyczyniły się do opracowania nowych metod leczenia35. Wiele metod uwzględniających zajęcie naczyń krwionośnych i neurogennych zostało zmodyfikowanych i zastosowanych w badaniach nad migreną. Modele in vivo i in vitro odpowiedzi tętnic na związki biologiczne lub leczenie farmakologiczne17,36,37, oraz elektryczna stymulacja nerwów38,39 można wymienić. Co więcej, aktywowane neurony w TNC mogą być wykrywane przez wyrażenie c-Fos40,41,42 i zapisy elektrofizjologiczne w tym obszarze43,44. Obie metody mierzą sygnały nocyceptywne przekazywane do mózgu z głowy, np. opony twardej. Zastosowanie tylko jednego modelu przedklinicznego nie daje pełnego obrazu patofizjologii migreny. Dlatego ważne jest, aby łączyć różne modele obejmujące jak najwięcej aspektów patofizjologii migreny. Ciągły rozwój nowych modeli obejmie różne aspekty mechanizmów migreny, a z czasem tajemnica patofizjologii migreny zostanie odkryta.

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół metody uwalniania CGRP, wykonywanej ex vivo w wyizolowanych TG i TNC od myszy po stymulacji chemicznej. Uwalnianie CGRP można również badać w oponie twardej u szczurów. Tak więc w protokole eksperymentalnym dla szczurów opona twarda jest opisana razem z TG i TNC. Podstawy metody uwalniania CGRP zostały po raz pierwszy opisane w 1999 roku, gdzie Ebersberger i współpracownicy przeprowadzili pionierskie badania i odkryli, że CGRP został uwolniony z opony twardej po chemicznej i elektrycznej stymulacji opony twardej aferentów u szczurów45. Później to podejście zostało rozszerzone na wydanie CGRP z TG46 i TNC47. Następnie metoda została zmodyfikowana, aby można ją było zastosować do TG i TNC u myszy. Do tej pory uwalnianie CGRP z opony twardej było wyzwaniem u myszy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z przewodnikiem Wspólnoty Europejskiej dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt (2010/63/UE). Do zademonstrowania tego protokołu wykorzystano samce myszy C57BL / 6JBomTac w wieku 10 tygodni i samce szczurów Sprague Dawley w wieku 10 tygodni.

1. Przygotowanie syntetycznego płynu śródmiąższowego

  1. Przygotować syntetyczny płyn śródmiąższowy (SIF) według następującej receptury: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 11,70 mM NaH2PO4, 1,50 mM CaCl2, 9,60 mM Na-glukonianu, 5,50 mM glukozy i 7,60 mM sacharozy (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: SIF może być zróżnicowany w zależności od celu stymulacji, np. podczas badania kanałów wapniowych można zastosować roztwór bezwapniowy.
  2. Dostosuj pH do 7,4 i ustabilizuj pH przez gazowanie karbogenem (5% CO2 i 95% O2)46.

2. Eutanazja

  1. Znieczulenie dorosłych myszy i szczurów mieszaniną 70% CO2 i 30% O2 . Ścinaj głowy myszom za pomocą nożyczek, a szczurom za pomocą gilotyny (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Użyj odmiany i wieku, które pasują do celu badania. W tym modelu można używać zarówno mężczyzn, jak i kobiet.
  2. Oddziel głowę od ciała na poziomie C3-C4 rdzenia kręgowego.
    UWAGA: Eutanazja może być również wykonana z dootrzewnowym wstrzyknięciem pentobarbitalu (100-150 mg/kg).

3. Sekcja

  1. Przygotuj tkankę szczura, wykonując poniższe czynności.
    1. Usuń skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą nożyczek (Rysunek 1A).
    2. Użyj trymera do kości i nożyczek, aby oddzielić dolne szczęki od głowy (Rysunek 1B-C).
    3. Otwórz rdzeń kręgowy, wkładając doogonowo trymer do kości w grzbietową część kręgów i usuń grzbietową część kręgów, aby odsłonić rdzeń kręgowy i pień mózgu (Rysunek 1D).
    4. Przeciąć część ogonową czaszki przy granicach kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne odsłaniające móżdżek (Rysunek 1E).
      UWAGA: Ważne jest, aby nie uszkodzić pnia mózgu i rdzenia kręgowego podczas przecinania i usuwania kręgów.
    5. Odizoluj TNC (Sp5C) biegnący doogonowo około 13-16 mm od bregmy z każdej strony, przecinając grzbietowo-boczną część pnia mózgu nożyczkami sprężynowymi. Zanurz lewą i prawą stronę TNC w SIF (Rysunek 1E-I).
      UWAGA: Opis dotyczy dorosłych szczurów.
    6. Przytnij głowę do połowy odległości strzałkowej, aby podzielić czaszkę na dwie części za pomocą piły (Rysunek 1J-L).
    7. Ostrożnie usuń mózg, nie dotykając opony twardej przyczepionej do czaszki za pomocą szpatułki i przecinając nerw trójdzielny w miejscu, w którym wchodzi on do pnia mózgu (Rysunek 1M-P).
    8. Aby odizolować TG, odetnij go, łącznie z jego gałęziami wokół granic wizualnych. Przetnij gałąź żuchwy w miejscu, w którym wchodzi ona w otwór owalny. Przetnij gałęzie okulistyczne i szczękowe wchodzące do czaszki, ponieważ nie są one podzielone makroskopowo. Podczas preparowania TG usuń oponę twardą pokrywającą TG (ryc. 1Q-T).
    9. Zanurz połówki czaszki i TG w SIF.
  2. Przygotuj tkankę myszy, wykonując poniższe czynności.
    1. Usuń skórę i mięśnie wokół głowy i szyi za pomocą małych nożyczek (Rysunek 2A-B).
    2. Otwórz rdzeń kręgowy, wkładając doogonowo parę małych nożyczek do grzbietowej części kręgów i usuń grzbietową część kręgów, aby odsłonić rdzeń kręgowy i pień mózgu (Rysunek 2C).
      UWAGA: Ważne jest, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego podczas przecinania i usuwania kręgów.
    3. Przeciąć czaszkę wzdłuż granic kości potylicznej i międzyciemieniowej, aby usunąć te struktury kostne odsłaniające móżdżek (Rysunek 2D-F).
    4. Następnie przetnij kość ciemieniową w połowie strzałki i usuń kość, aby odsłonić mózg (Rysunek 2G-I).
    5. Ostrożnie usuń móżdżek szpatułką, aby odsłonić pień mózgu (Rysunek 2J).
    6. Odizoluj część pnia mózgu zawierającą TNC za pomocą nożyczek sprężynowych (Rysunek 2K-N). Zanurz pień mózgu za pomocą TNC w SIF (Rysunek 2O).
    7. Usuń mózg i przetnij nerw trójdzielny w miejscu, w którym wchodzi on do pnia mózgu (Rysunek 2P-Q).
    8. Aby odizolować TG, odetnij go, łącznie z jego gałęziami wokół granic wizualnych. Przetnij gałąź żuchwy w miejscu, w którym wchodzi ona w otwór owalny. Przetnij gałęzie okulistyczne i szczękowe wchodzące do czaszki, ponieważ nie są one podzielone makroskopowo. Podczas preparowania TG usuń oponę twardą pokrywającą TG (Rysunek 2R-S).
    9. Zanurz TG w SIF (Rysunek 2T).

4. Mycie

  1. Myj połówki czaszki, TNC i TG w SIF przez 30 minut, wymieniając SIF co 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Etapy prania można wykonać, trzymając chusteczkę w plastikowych pojemnikach z tiulową pokrywką, aby umożliwić łatwą wymianę SIF (Rysunek 3A-B).
  2. Przygotuj tkankę szczura, wykonując poniższe czynności.
    1. Przenieś połówki TNC do oddzielnych nasadek probówek do mikrowirówek z 350 μl SIF (Rysunek 3C).
    2. Przenieś TG do nasadek probówek do mikrowirówek - jedna TG na nasadkę probówki do mikrowirówki z 350 μL SIF (Rysunek 3C).
    3. Umieść połówki czaszki na platformach wykonanych z gliny lub 6-dołkowej płytce hodowlanej i wypełnij czaszkę 400 μl SIF (Rysunek 3C).
  3. Przygotuj tkankę myszy, wykonując poniższe czynności.
    1. Przenieś pień mózgu za pomocą TNC do nasadki probówki mikrowirówkowej z 250 μl SIF (Rysunek 3D).
    2. Przenieś dwie TG do nasadki probówki do mikrowirówki z 250 μl SIF (Rysunek 3D).
      UWAGA: Umieść dwie TG na nasadkę probówki mikrowirówkowej podczas używania tkanek od myszy.
  4. Umieścić czaszki szczurów i nakrętki probówek do mikrowirówek z tkankami szczurów i myszy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C. Wymieniać SIF za pomocą pipety co 5 minut przez 20 minut.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie dotykać tkanki podczas dodawania i usuwania SIF.

5. Testy na obecność narkotyków

  1. Określ podstawowe poziomy uwalniania CGRP.
    1. Po ostatnim praniu dodaj 250 μl SIF do mysich TG i TNC. Dodać 350 μl do TG i TNC szczura i 400 μl do każdej czaszki szczura.
    2. Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki do probówki mikrowirówkowej i dodać 50 μl 10-krotnego buforu EIA (dostarczonego z zestawem do testu immunoenzymatycznego CGRP, patrz tabela materiałów), aby umożliwić pomiar podstawowego uwalniania CGRP (krok 6). Wylej pozostały płyn.
      UWAGA: Czas inkubacji musi być taki sam dla wszystkich próbek.
    3. Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Po pobraniu próbek podstawowych poziomów uwalniania CGRP postępuj zgodnie z jedną z trzech metod: (A) Pojedyncza stymulacja (krok 5.2); (B) stymulacja koncentracji-odpowiedzi (krok 5.3); oraz (C) Hamowanie stymulacji (krok 5.4) (Rysunek 4).
      UWAGA: Badany związek i zastosowane stężenia zależą od celu badania.
  2. Wykonaj pojedynczą stymulację, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Dodać badany związek lub nośnik do tkanki i pozostawić na 10 minut (objętość: 250 μl dla TG i TNC myszy, 350 μl dla TG i TNC szczura i 400 μl dla każdej czaszki szczura).
    2. Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki do probówki mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA. Pozostałą ciecz należy odrzucić i natychmiast przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Czas inkubacji musi być taki sam dla wszystkich próbek.
  3. Wykonaj stymulację koncentracji-odpowiedzi, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Rozcieńczyć badany związek lub nośnik do pożądanych stężeń. Dodać badany związek w rosnących stężeniach, zaczynając od najniższego stężenia.
      UWAGA: Badany związek i zastosowane stężenia zależą od celu badania. Na przykład w niniejszym badaniu użyto aldehydu supercynamonowego 1 μM, 10 μM i 100 μM.
    2. Dodać najniższe stężenie (1 μM dla niniejszego badania) badanego związku i odpowiadającego mu nośnika do dwóch identycznych preparatów tkankowych i inkubować przez 10 minut (objętość: 250 μl dla tkanki myszy, 350 μl dla TG i TNC szczura i 400 μl dla każdej czaszki szczura).
    3. Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki do probówki mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA.
    4. Odrzucić pozostałą ciecz i dodać drugie najniższe stężenie (10 μM dla niniejszego badania) do tkanki.
    5. Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. Powtórzyć tę procedurę dla pozostałych stężeń (100 μM dla niniejszego badania).
  4. Wykonaj hamowanie stymulacji, wykonując poniższe czynności.
    1. Dodać bloker lub nośnik do tkanki i inkubować przez 10 minut (objętość: 250 μl dla tkanki myszy, 350 μl dla TG i TNC szczura i 400 μl dla każdej czaszki szczura).
      UWAGA: Zastosowany bloker i stężenie zależą od celu badania. Na przykład glibenklamid 3 μM został użyty do uzyskania reprezentatywnego wyniku w Rysunek 5.
    2. Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki w probówce mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA. Odrzucić pozostałą ciecz i natychmiast przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.
    3. Dodać agonistę lub agonistę + bloker (patrz Tabela Materiałów) do tkanki i inkubować przez 10 min.
      UWAGA: Zastosowany agonista, bloker i stężenia zależą od celu badania. W niniejszym badaniu użyto 3 μM glibenklamidu i 1 μM kapsaicyny, Ryc. 5.
    4. Po 10 minutach inkubacji zebrać 200 μl próbki w probówce mikrowirówkowej z 50 μl 10-krotnego buforu EIA. Odrzucić pozostałą ciecz i natychmiast przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.
  5. Przeprowadzić kontrolę pozytywną dla eksperymentu.
    1. W stosownych przypadkach dodać kontrolę dodatnią (np. 1–10 μM kapsaicyny, zob. tabela materiałów) do tkanki na końcu protokołu i zebrać próbkę o objętości 200 μl do probówki mikrowirówkowej z 50 μl buforu 10x EIA po okresie inkubacji wynoszącym 10 min.
      UWAGA: Korzystne jest włączenie kontroli dodatniej, aby upewnić się, że konfiguracja i tkanki funkcjonują. Kapsaicyna48,49,50 lub depolaryzujący bodziec potasu (40-60 mM KCl)46,47,49 są rutynowo stosowane w celu spowodowania uwolnienia CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego. 40-60 mM KCl SIF przygotowuje się jako SIF, z wyjątkiem NaCl jest wymieniany na KCl na zasadzie równomolowej.

6. Analiza stężeń CGRP

  1. Zmierz ilość uwalnianego CGRP za pomocą zestawu do testu immunoenzymatycznego (EIA) zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
  2. Zmierzyć gęstość optyczną przy 410 nm za pomocą fotometru płytkowego. Jeśli używany jest inny zestaw CGRP EIA, zmierz gęstość optyczną przy długości fali podanej w protokole producenta.
    UWAGA: Próbki należy rozcieńczyć, aby pasowały do krzywej wzorcowej.
  3. Przeprowadzanie analizy danych.
    1. Przedstaw dane jako stężenia bezwzględne lub znormalizuj do podstawowego uwalniania CGRP z określonej tkanki.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika jest narzędziem do badania mechanizmów molekularnych związanych z migreną związanych z CGRP. Ma tę zaletę, że ocenia uwalnianie CGRP z różnych poziomów układu trójdzielno-naczyniowego i może być stosowany zarówno na myszach i szczurach typu dzikiego, jak i transgenicznych w połączeniu z różnymi związkami farmakologicznymi. Przedstawiono tu eksperymenty stężenie-odpowiedź i blokowanie u szczurów oraz wyniki stężenie-odpowiedź u myszy typu dzikiego i transgenicznego.

Metoda uwalniania CGRP została użyta do zbadania wpływu inhibitora kanału KATP glibenklamidu na uwalnianie CGRP z TG i opony twardej u samic szczurów z spontanicznym nerwem trójdzielnym (STA). Po pierwsze, optymalne stężenie kapsaicyny stwierdzono za pomocą projektu badania stężenie-odpowiedź. Ekspozycja na kapsaicynę indukowała znaczące uwalnianie CGRP z opony twardej i TG w porównaniu z nośnikiem (Rysunek 5). W oponie twardej maksymalne uwalnianie CGRP stwierdzono przy 1 μM kapsaicyny, a w TG maksymalne uwalnianie CGRP stwierdzono przy 10 μM kapsaicyny (Rysunek 5A-B). Na podstawie doświadczeń stężenie-odpowiedź, do eksperymentów blokujących użyto 1 μM kapsaicyny i 3 μM glibenklamidu. Glibenklamid nie wykazał wpływu na podstawowe uwalnianie CGRP z opony twardej (P = 0,441) i TG (P = 0,881) podczas analizy z jednokierunkową klasą ANOVA51. Glibenklamid znacząco zmniejszał indukowane kapsaicyną uwalnianie CGRP w oponie twardej o 40% (P = 0,031) i TG o 39% (P = 0,003) w porównaniu z kapsaicyną z podłożem, gdy analizowano je za pomocą jednoczynnikowej ANOVA (Rysunek 5C-D) 51.

U myszy, protokół został wykorzystany do zbadania udziału kanału jonowego transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) w mysim modelu migreny GTN, gdzie nadwrażliwość wywołana przez GTN była w pełni zależna od kanałów TRPA1. Stwierdzono, że agonistyczny aldehyd supercynamonowy (SCA) TRPA1 uwalnia CGRP w sposób zależny od dawki z TG przy 1 μM, 10 μM i 100 μM SCA, co skutkuje 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) i 69% (P = 0,0097) zwiększonym uwalnianiem CGRP w porównaniu z nośnikiem, odpowiednio podczas analizy za pomocą dwukierunkowej ANOVA. To uwolnienie było nieobecne w TG od myszy zerowych Trpa1, u których ekspozycja na 1 μM, 10 μM i 100 μM SCA spowodowała 11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) i 9% (P = 0,97) procentową zmianę w uwalnianiu CGRP w porównaniu z nośnikiem, odpowiednio podczas analizy za pomocą dwukierunkowej ANOVA. Późniejsza stymulacja 10 μM kapsaicyny (kontrola pozytywna) pokazuje, że wszystkie próbki tkanek mogą uwalniać CGRP (Rysunek 6) < sup class = "xref">50.

figure-results-1
Rysunek 1: Sekcja tkanki szczurów krok po kroku. Szczegóły (A-T) znajdują się w sekcji protokołu (krok 3.1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Sekcja tkanki myszy krok po kroku. Szczegóły (A-T) znajdują się w sekcji protokołu (krok 3.2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mycie i inkubacja tkanek gryzoni. Punkty A-B) Świeżo wyizolowana tkanka w plastikowych pojemnikach z SIF. Pojemniki pokryte są tiulem, co umożliwia łatwą wymianę SIF. (C) Tkanka szczura - Dwie połówki czaszki z oponą twardą pokrywającą wewnętrzną wyściółkę czaszki umieszczone na 6-dołkowej płytce hodowlanej. Prawe i lewe jądro nerwu trójdzielnego w oddzielnych pokrywkach probówek do mikrowirówek (górny rząd pokryw). Dwa zwoje nerwu trójdzielnego w pojedynczych pokrywkach probówek do mikrowirówek (dolny rząd pokrywek). (D) Tkanka myszy - Część pnia mózgu zawierająca jądro trójdzielne caudalis, w oddzielnej pokrywie probówki do mikrowirówki (u góry). Dwa mysie zwoje nerwu trójdzielnego znajdują się w jednej pokrywie probówki mikrowirówki (na dole). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Projekty badań dla wydania CGRP. Trzy różne protokoły do przeprowadzania eksperymentów z wydaniem CGRP. Leki należy rozcieńczać w syntetycznym płynie śródmiąższowym (SIF). (A) Pojedyncza stymulacja. (B) Stymulacja koncentracji i odpowiedzi. (C) Zahamowanie stymulacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Glibenklamid hamuje indukowane kapsaicyną uwalnianie CGRP z opony twardej i zwoju nerwu trójdzielnego szczura. Poziomy CGRP ze zwoju nerwu trójdzielnego i opony twardej wyizolowane od samic spontanicznych szczurów z allodyną nerwą trójdzielną (STA) (215-318 g) pierwotnie pochodzącej z Thomas Jefferson University52 zostały zmierzone za pomocą komercyjnych zestawów EIA CGRP dla ludzi. Punkty A-B) Uwalnianie CGRP z (A) opony twardej i (B) zwoju nerwu trójdzielnego po zwiększeniu stężeń kapsaicyny (10 nM, 100 nM, 1 μM i 10 μM) (n = 4). Dane prezentowane są jako pojedyncze punkty i zostały przeanalizowane za pomocą dwukierunkowej analizy ANOVA. p < 0,0001 (C-D) Poziomy CGRP uwalniane z (C) opony twardej i (D) zwoju nerwu trójdzielnego po 10 minutach ekspozycji na nośnik, 3 μM glibenklamid (glib), 1 μM kapsaicyna i 1 μM kapsaicyna + 3 μM glib (n = 6-11). Dane są prezentowane jako pojedyncze punkty i wartości średnie i zostały przeanalizowane za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA. *w porównaniu z pojazdem. #kapsaicyna w porównaniu do kapsaicyny + glib. #P < 0.05, ** oraz ##P < 0.01, ****P < 0.0001. Po analizach przeprowadzono test wielokrotnych porównań Bonferroniego. We wszystkich testach zastosowano istotny poziom α = 0,05. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Christensena i wsp.51. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Ekspozycja na SCA powoduje zależne od TRPA1 uwolnienie CGRP ze zwoju trójdzielnego myszy. Poziomy CGRP uwolnione ze zwoju nerwu trójdzielnego wyizolowanego z WT i Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 samce myszy (8-10 tygodni) mierzono za pomocą szczurzych zestawów CGRP EIA po ekspozycji na aldehyd supercynamonowy (SCA) w stężeniu 1 μM, 10 μM i 100 μM oraz kapsaicynę w ilości 10 μM jako kontrolę pozytywną (n = 6). Dane z każdej myszy są prezentowane jako indywidualne punkty, a słupki wskazują wartości średnie. Statystyki: Porównanie NZK i nośnika przy każdym stężeniu oraz między kontrolą podstawową a dodatnią przeprowadzono za pomocą dwukierunkowo powtarzanej ANOVA. Znaczący poziom α = 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Christensena i wsp.50. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda została opracowana na podstawie badań wykazujących znaczenie CGRP w patofizjologii migreny. Doskonale nadaje się do badania mechanizmów związanych z uwalnianiem CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego, co ma kluczowe znaczenie dla sygnalizacji bólu w okolicy głowy. Ilość CGRP uzyskana w tym modelu bezpośrednio mierzy uwalnianie CGRP z nerwów trójdzielnych unerwiających oponę twardą, TG i TNC. Ilość uwalniania CGRP jest ilościowo większa45,54 niż ilość uwalniania mierzonego w osoczu po termokoagulacji u ludzi, stymulacji trójdzielnej u kota 39,55,56 i podczas ataków migreny 23. Jednym z wyjaśnień może być to, że CGRP jest rozcieńczony i zdegradowany we krwi54. Należy jednak zauważyć, że bezpośrednia stymulacja substancjami chemicznymi może być lepsza niż aktywacja patofizjologiczna. Kolejną zaletą jest to, że możliwe jest zlokalizowanie uwolnienia z trzech różnych miejsc w układzie trójdzielno-naczyniowym i że może być ono stosowane razem z manipulacją farmakologiczną oraz w tkankach genetycznie zmodyfikowanych gryzoni.

Ostatnio wiele przedklinicznych modeli gryzoni koncentruje się na ogólnoustrojowym podawaniu substancji i późniejszych odczytach związanych z bólem lub migreną za pomocą testów von Freya57,58, grymasów 59,60,61 lub awersji do światła 62,63,64. Metody te są przydatne w zrozumieniu właściwości przeciwbólowych i przeciwbólowych różnych substancji. Podejścia te nie dostarczają jednak żadnych informacji na temat konkretnych tkanek docelowych zaangażowanych w badanie. W niniejszej metodzie układ trójdzielno-naczyniowy dzieli się na trzy struktury: oponę twardą, TG i TNC. Umożliwia to miejscową ekspozycję każdej struktury i ocenę miejsca działania konkretnej substancji. Zostało to wykorzystane w badaniu z 2011 roku, w którym zbadano rolę kanałów wapniowych bramkowanych napięciem u szczurów i stwierdzono, że hamowanie tych kanałów jest różne w trzech strukturach szlaku trójdzielno-naczyniowego47. Podczas preparowania struktur układu nerwowego aksotomia jest nieunikniona. Wykazano, że aksotomia zmienia transkrypcję różnych genów65. Te zmiany transkrypcyjne są zbyt wolne, aby wpłynąć na wyniki tej metody, ale nie można wykluczyć zmian w fosforylacji w porównaniu z sytuacjami in vivo 46. Chociaż neuropeptydy, takie jak CGRP, powstają w somie komórkowej, uwalnianie i działanie neuropeptydów odbywa się zwykle w centralnych lub obwodowych zakończeniach nerwowych. Tak więc badania nienaruszonych neuronów, w tym końcówek, są interesujące przy badaniu uwalniania neuropeptydów. W związku z tym ustalono metody badania kultur neuronów z izolowanych zwojów, które służą jako model zakończeń. Jednak hodowle komórek neuronalnych są narażone na kilka problemów, ponieważ mechaniczna dysocjacja może zniszczyć neurony w kulturze46. Dłuższe ramy czasowe związane z hodowlą komórek sprawiają, że metoda ta jest wrażliwa na zmiany transkryptomiczne spowodowane aksotomią i warunkami hodowli65. Co więcej, dodanie czynników wzrostu i hodowla na powłokach powierzchniowych zmieniły właściwości neuronów jako ekspresję przekaźnika i receptora 66,67,68,69. Problemów tych unika się, badając świeżo izolowane nienaruszone zwoje nerwowe zamiast kultur komórek neuronalnych.

Jednym z wyzwań związanych z metodą uwalniania CGRP ex vivo jest precyzyjna sekcja tkanki wymagana do uzyskania powtarzalnych wyników. Szczególnie dokładna sekcja TNC jest trudna, ponieważ jest to struktura w pniu mózgu bez widocznych granic. Co więcej, opona twarda jest delikatna, a usunięcie mózgu musi być przeprowadzone ostrożnie, aby zapewnić nienaruszoną strukturę. Przeszkody te mogą skutkować różną wielkością tkanki, a tym samym różnymi poziomami CGRP u podstawy i indukowanymi stymulacją. Jednak tę zmienność można wytłumaczyć normalizacją do podstawowego uwalniania CGRP. Należy również zauważyć, że podczas izolowania TNC od myszy izolowana jest cała dolna część pnia mózgu, a nie bardziej specyficzna część zawierająca TNC, jak to ma miejsce u szczurów. Ogólnie rzecz biorąc, stosowanie tkanki szczura może być korzystne, ponieważ umożliwia to pomiar uwalniania CGRP z opony twardej i bardziej precyzyjne rozwarstwienie TNC. Co więcej, rozmiar tkanki umożliwia również wykorzystanie szczura jako kontroli nośnika, ponieważ jeden szczur daje dwie połówki czaszki, dwie TG i dwa TNC, w których jeden fragment tkanki jest używany do stymulacji substancji, a drugi do nośnika. W przypadku korzystania z myszy, do jednego eksperymentu potrzebne są dwa zwierzęta, ponieważ oba TG są łączone w jednej próbce, a TNC są preparowane jako jeden pień mózgu. W związku z tym dwa TG i jeden pień mózgu są używane do stymulacji substancji, a dwa TG i jeden pień mózgu innej myszy są używane do kontroli pojazdu. Powoduje to użycie dwa razy więcej myszy w porównaniu ze szczurami, aby uzyskać tę samą liczbę powtórzeń. Aby zmniejszyć liczbę wykorzystywanych myszy, zaproponowano metodę pomiaru uwalniania CGRP z wycinków pnia mózgu49. Zaletą jest to, że metoda została zmodyfikowana, aby umożliwić wykorzystanie myszy. Pozwala to na wykorzystanie wielu już dostępnych transgenicznych szczepów myszy, co jest przydatnym narzędziem do badania np. szlaków sygnałowych. Kontrola pozytywna na koniec doświadczenia powinna być uwzględniona w celu zapewnienia, że tkanka użyta w doświadczeniu może uwolnić CGRP. Kontrolą pozytywną może być agonistyczna kapsaicyna TRPV1 lub depolaryzujący bodziec potasowy (KCl), które, jak stwierdzono, uwalniają CGRP z układu trójdzielno-naczyniowego zarówno u myszy, jak i szczurów 46,47,48,49,50. Co więcej, metoda została również dostosowana do pomiaru uwalniania innych istotnych peptydów, takich jak peptyd aktywujący cyklazę adenylanową przysadki (PACAP) - kolejny peptyd o dużym zainteresowaniu w badaniach nad migreną70.

Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badania uwalniania CGRP z określonych tkanek docelowych u szczurów i myszy. Jest to stosunkowo szybka metoda, która pozwala uniknąć problemów związanych z hodowlą neuronów. Protokół metody można łatwo zmodyfikować w celu zbadania zależności stężenie-odpowiedź lub hamowania odpowiedzi przez różne związki farmakologiczne. Metoda uwalniania CGRP ex vivo jest jedną z kilku metod przedklinicznych przydatnych do badania roli CGRP i innych mechanizmów związanych z uwalnianiem CGRP w patofizjologii migreny.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Candys.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6-dołkowa płytka hodowlanaNUNC140675
Chlorek wapnia dwuwodnyMerck1.02382.1000Do bufora SIF
Nakrętki do pojemników plastikowychThermoFisher Scientific536617
KapsaicynaMerckM2028
Zestawy CGRPAH DiagnosticsA05482.96
CO2Strandmø llen4.6Do gazowania karbonowego SIF
Delikatny trymer do kościFine Science Tools16109-14
GlibenklamidTocris911
GlukozaMerckG7021Do bufora SIF
Gilotyna dla szczurówScandidactNS-802
Siarczan magnezu siedmiowodnyMerckM5921Do bufora SIF
Rurki do mikrocenrifuge + pokrywki/nasadkiVWR700-5239
Mini piła do metaluBAHCO208
O2Strandmø llen4.5Do gazowania karbogenem SIF
PentobarbitalGlostrup aptekaNAFormuła magistralna
Pojemniki plastikoweThermoFisher Scientific536455
Fotometr płytkowy - Infinite M200TecanNAInfinite M200 zostaje wycofany z produkcji. Infinite 200 PRO jest dostępny pod adresem Tecan.
Oprogramowanie: SW Magellan v.6.3
Chlorek potasuMerckP9333Do bufora SIF
NożyceAllgaier Instruments307-156-170
Małe nożyczkiAllgaier Instruments04-520-115
Wodorowęglan soduMerckS6014Do bufora SIF
ChloreksoduMerckS9888Dla buforu SIF
Monohydrat diwodorofosforanu soduMerck1.06346.1000Dla buforu SIF
Glukonian soduMerckS2054Dla bufora SIF
SzpatułkaBochem Lab Supply3018
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15024-10
SacharozaMerck84097Dla Bufor SIF
Aldehyd supercynamonowyMerckS3322
Tiul (tkaniny)NANAKupiony w lokalnym sklepie z tkaninami

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).">GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).">Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6(2019).">Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6(2019).
  4. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).">Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).">Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338(2018).">Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338(2018).
  7. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).">Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).">Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).">Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).">Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).">Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).">Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).">Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).">Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).">Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).">Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).">Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).">Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).">Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).">Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).">Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).">Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).">Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).">Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).">Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).">Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).">Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).">Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).">Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112(2011).">Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112(2011).
  31. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).">Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).">Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).">Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).">Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).">Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).">Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).">Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).">Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).">Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).">Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).">Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).">Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).
  43. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).">Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).">Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).">Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).">Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).">Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).">Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).">Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).">Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).">Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336(2012).">Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336(2012).
  53. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).">Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).">Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).">Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).">Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).">Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).">Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).">Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55(2011).">Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55(2011).
  61. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).">Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).">Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).">Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).">Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).">Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).">Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).">Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).">Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).">Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).">Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CGRP ReleaseTrigeminovascular SystemEx Vivo ModelMigraine PathophysiologyDura MaterTrigeminal GanglionProtein QuantificationRodent Tissue PreparationEIA KitCapsaicin Stimulation

Related Articles