Artykuł metodologiczny

Lipidomika tkanek gryzoni

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63726

⸱

18 listopada 2022

 ,  ,  , 
1PMI R&D, Philip Morris Products SA

W tym artykule

Podsumowanie

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Streszczenie

Lipidy odgrywają istotną rolę jako niezbędne składniki wszystkich komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Ciągły postęp technologiczny w spektrometrii mas sprawił, że lipidomika stała się potężnym narzędziem analitycznym do monitorowania składu lipidomu tkankowego w stanach homeostatycznych, a także chorobowych. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół dla metody analizy lipidów typu shotgun, która wspiera jednoczesne wykrywanie i kwantyfikację kilkuset gatunków lipidów molekularnych w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych przy dużej przepustowości. Metoda ta wykorzystuje zautomatyzowane bezpośrednie wstrzykiwanie nano-przepływu całkowitego ekstraktu lipidowego wzbogaconego znakowanymi wzorcami wewnętrznymi bez separacji chromatograficznej do instrumentu spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Zaczynając od submikrogramowych ilości tkanki gryzonia, analiza MS trwa 10 minut na próbkę i obejmuje do 400 lipidów z 14 klas lipidów w tkance płucnej myszy. Przedstawiona tutaj metoda doskonale nadaje się do badania mechanizmów chorobowych oraz identyfikacji i ilościowego określania biomarkerów, które wskazują na wczesną toksyczność lub korzystne efekty w tkankach gryzoni.

Wprowadzenie

Dym papierosowy (CS) jest uznawany za główny czynnik ryzyka związany z rozwojem przewlekłych chorób zapalnych płuc, w tym raka płuc, zapalenia oskrzeli i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP)1. Poza wpływem na płuca, narażenie na CS odgrywa znaczącą rolę w rozwoju innych chorób, takich jak miażdżycowa choroba wieńcowa i choroba naczyń obwodowych1. Choroby układu krążenia, wraz z POChP, są odpowiednio pierwszą i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie. Podejścia do oceny ryzyka toksykologicznego w przeszłości opierały się na wykorzystaniu modeli zwierzęcych, takich jak gryzonie. Modele szczurów i myszy in vivo z samym nosem lub całym ciałem są powszechnie stosowane do badania długoterminowych skutków narażenia na CS.

Na przykład, ogólnie rzecz biorąc, 6-miesięczna ekspozycja na dym tytoniowy wywołuje histologiczne i funkcjonalne nieprawidłowości w płucach myszy, które naśladują te związane z ludzkimi chorobami, w tym rozedmę płuc, przebudowę dróg oddechowych i nadciśnienie płucne, chociaż zmiany są stosunkowo łagodne w porównaniu z tymi obserwowanymi u długotrwałych palaczy2. Zarówno w tkankach zwierzęcych, jak i ludzkich w badaniach zaobserwowano szeroki zakres zmian molekularnych w odpowiedzi na ekspozycję na CS, w tym reakcje na stres oksydacyjny, stan zapalny i zmiany strukturalne w tkance3,4. Nic dziwnego, że doniesiono również, że narażenie na CS ma daleko idący wpływ na lipidom płuc, w tym wpływ na lipidy środków powierzchniowo czynnych, mediatory sygnalizacji lipidowej i lipidy strukturalne4,5,6.

Aby scharakteryzować duże zmiany lipidowe wywołane długotrwałą ekspozycją płuc myszy na CS, przeprowadziliśmy szybką i ilościową analizę spektrometrii mas metodą bezpośredniej infuzji shotgun. Po wprowadzeniu metody lipidomicznej shotgun w 2005 roku7, metoda ta została skutecznie wykorzystana do poszerzenia naszej wiedzy na temat metabolizmu komórek lipidowych8,9,10 w systemach modelowych, takich jak yeast11, Caenorhabditis elegans12 i Drosophila melanogaster13, a także w szerokim zakresie typów próbek ssaków, takich jak linie komórkowe14,15,16 różne human17,18 i tkanki gryzoni19,20 i płyny ustrojowe21,22.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci badania wykazały złożoność odpowiedzi komórkowych na zmiany środowiskowe, obejmujące tysiące połączonych ze sobą białek, lipidów i metabolitów. To jasno pokazało, że stosowanie najnowocześniejszych technik analitycznych jest niezbędne do uzyskania dogłębnego wglądu w maszynerię molekularną i odkrycia pełnej skali egzogenicznych skutków fizjologicznych. W tym kontekście, kompleksowe, ilościowe lipidowe odciski palców uzyskane za pomocą podejść lipidomicznych typu shotgun mogą skutecznie wzbogacić naszą wiedzę na temat metabolizmu lipidów komórkowych8,9,10.

Jeśli chodzi o narażenie na CS jako czynnik ryzyka dla wielu chorób, podejścia do oceny ryzyka toksykologicznego historycznie opierały się na wykorzystaniu modeli zwierzęcych, takich jak gryzonie. Shotgun Lipidomics MS zapewnia szybkie, czułe i ilościowe narzędzie analityczne do oceny zaburzeń lipidomu w wielu typach próbek. Unikalną cechą lipidomiki typu shotgun jest zautomatyzowana analiza bezpośredniego wstrzykiwania całkowitego ekstraktu lipidowego - wzbogaconego znakowanymi wzorcami wewnętrznymi - bez separacji chromatograficznej do instrumentu MS o wysokiej rozdzielczości przy użyciu przewodzącego nanochipa generującego jonizację elektrorozpylania (ESI) nanospray23.

Informacje o stosunku masy do ładunku, które są jednocześnie pobierane w trybie MS1, dostarczają całkowitego śladu lipidowego wszystkich nienaruszonych endogennych lipidów. Opcjonalnie tryb MS2/MS3, w którym macierzyste cząsteczki lipidów są fragmentowane i analizowane, dostarcza dodatkowych informacji strukturalnych. Analiza danych wymaga specjalistycznego oprogramowania i obejmuje dekonwolucję widm i przypisań pików w widmach zbiorczych, co prowadzi do identyfikacji lipidów i wyjaśnienia przypuszczalnej struktury chemicznej. Dodatkowo, bezwzględną kwantyfikację można przeprowadzić, dodając znakowaną mieszaninę wzorców wewnętrznych zawierającą co najmniej jeden wzorzec lipidów na klasę lipidów będących przedmiotem zainteresowania. Ogólnie rzecz biorąc, przy obecnej technice, analiza stwardnienia rozsianego trwająca kilka minut na próbkę może obejmować identyfikację i kwantyfikację do 800 lipidów z 14 klas lipidów24 w tkankach gryzoni.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone w obiekcie akredytowanym przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International i licencjonowanym przez Agri-Food & Veterinary Authority of Singapore, za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee oraz zgodnie z National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NACLAR, 2004).

1. Pobieranie próbek

  1. Wykonaj sekcje płuc myszy po 3 miesiącach i 6 miesiącach ekspozycji myszy ApoE−/−. Zbierz tkanki 16-24 godziny po ekspozycji, zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C przed rozpoczęciem procesu lipidomiki. Należy zapewnić pobranie łącznie dziewięciu próbek z każdej grupy preparacyjnej "omicznej".

2. Tkanka - proszkowanie próbek

  1. Przygotuj młotek magnetyczny i materiały eksploatacyjne do mielenia tkanek. Wstępnie schłodzić woreczki na tkanki, kleszcze, zakryte rurki do przenoszenia tkanek z nakrętkami, plastikową szpatułkę w kształcie litery "V" i plastikowe probówki o pojemności 2 ml na suchym lodzie. Zamontuj odpowiedni uchwyt rurki na młotku magnetycznym. Włącz młot magnetyczny i ustaw siłę uderzenia na Wysoką.
  2. Załadować próbkę do woreczka na chusteczki higieniczne; w razie potrzeby wprowadzić próbkę przez górny otwór torebki na chusteczki za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczyków. Umieść próbkę na środku elastycznej torebki, z dala od krawędzi.
  3. Uszczelnij woreczek na chusteczki higieniczne, przykręcając wstępnie schłodzoną rurkę zbiorczą do górnej części woreczka na chusteczki higieniczne.
  4. Błyskawiczne zamrożenie próbki poprzez zanurzenie elastycznej torebki w ciekłym azocie na 10 sekund.
  5. Odpowietrzyć rurkę zbiorczą; poluzować rurkę na 1/4 obrotu w celu odpowietrzenia, aby uniknąć pęknięcia woreczka w przypadku uderzenia młotka magnetycznego.
  6. Załaduj woreczek z zamrożonymi tkankami na młotek magnetyczny.
  7. Zastosuj młotek magnetyczny, naciskając przycisk aktywacji, aby sproszkować próbkę. Jeśli niesproszkowane kawałki tkanki pozostaną w woreczku, ponownie zamroź próbkę w ciekłym azocie i powtórz przy drugim uderzeniu.
  8. Wyjmij woreczek na chusteczki z młotkiem magnetycznym, trzymając sproszkowaną próbkę na dnie. Aby zapobiec stopieniu się próbki, należy ją natychmiast ponownie zamrozić.
  9. Przenieść próbkę do probówki zbiorczej. Szybko odwróć probówkę tak, aby woreczek na chusteczki znalazł się na górze, i postukaj w woreczek, aby przenieść cząstki tkanki na dno probówki do pobierania pokarmów.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać szybko, aby uniknąć stopienia tkanki.
  10. Przenieść podwielokrotność tkankową 10 mg do probówki o pojemności 2 ml w celu dalszej analizy lipidomicznej i przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu wykonania dalszych kroków.

3. Homogenizacja tkanek

  1. Włącz przyrząd do lizera tkankowego i ustaw częstotliwość wytrząsania na 30 Hz, a czas wytrząsania na 2 minuty. Przygotować roztwór buforowy do homogenizacji tkanek: 150 mM wodorowęglanu amonu w wodzie, o pH ~8,2.
  2. Wyjmij próbki z zamrażarki do przechowywania, umieść je na lodzie i dodaj cztery koraliki ze stali nierdzewnej do probówek zawierających sproszkowaną tkankę. Do każdej próbki dodać 0,5 ml 150 mM buforu wodorowęglanu amonu.
  3. Umieścić probówki z próbkami w uchwytach lizera tkankowego. Przeciwwaga dla obu uchwytów z tą samą liczbą rur. Zamocuj uchwyty w ramieniu przytrzymującym lizer tkankowy. Zakłócić tkankę.
  4. Umieść probówki na lodzie i sprawdź wzrokowo, czy w probówce nie ma resztek tkanki. Jeśli rozerwanie tkanki jest niepełne (widoczne są agregaty), należy powtórzyć proces rozrywania, wykonując kolejny cykl leczenia. Umieścić próbki na lodzie.
  5. Utworzyć podwielokrotność 1 ze 100 μl próbki w probówce o pojemności 1,5 ml przeznaczonej do oznaczania białka. Odwirować w temperaturze 18 200 × g przez 5 minut w temperaturze 10 °C.
  6. Oznaczyć zawartość białka w podwielokrotności 1 za pomocą testu Bradforda (patrz punkt 4). Próbki należy przechowywać na lodzie.
  7. Utworzyć porcję 2 z 20-100 μl homogenatu podstawowego w nowej mikroprobówce o pojemności 2 ml do ekstrakcji lipidów (patrz punkt 5). Jeśli próbki nie są natychmiast analizowane, należy je przechowywać na lodzie do czasu przeprowadzenia ekstrakcji.
    UWAGA: Ostateczna objętość ekstrakcji musi być określona na podstawie całkowitej ilości białka. Musi mieścić się w zakresie 0,015-0,045 mg białka na całkowitą podwielokrotność.

4. Test oznaczania białka Bradforda

UWAGA: Próbki do badań powinny być randomizowane przed rozpoczęciem analizy, a randomizacja jest przestrzegana na wszystkich etapach przetwarzania próbki.

  1. Rozcieńczony odwirowany podwielokrotny 1 supernatant 2x z buforem wodorowęglanowym amonu.
    UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia zależy od stężenia homogenatu tkankowego. W przypadku roztworów o większym stężeniu należy zastosować wyższy współczynnik, tak aby oznaczone stężenie mieściło się w zakresie dynamicznym testu.
  2. Przygotować krzywą wzorcową albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zgodnie z tabelą 1. Odwiruj standardowe rurki. Odwirować probówki o stężeniu 18 200 × g przez 15 s w temperaturze pokojowej.
  3. Z wcześniej przygotowanych probówek wzorcowych przenieś po 6 μl każdej z ślepych prób i wzorców na 96-dołkową płytkę z płaskim dnem zgodnie z układem płytek pokazanym na Rysunek 1.
  4. Przenieś wcześniej przygotowane próbki na 96-dołkową płytkę z płaskim dnem zgodnie z układem płytki opisanym w Rysunek 1.
  5. Dodaj 250 μl odczynnika Bradforda do każdego dołka za pomocą wielokanałowej pipety i wymieszaj. Inkubować przez 5 minut.
  6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą czytnika płytkowego.
  7. Obliczyć stężenia białka w podwielokrotnościach na podstawie krzywej wzorcowej.
    UWAGA: Przy obliczaniu stężeń białka należy wziąć pod uwagę współczynnik rozcieńczenia zastosowany na początku procedury.

5. Ekstrakcja BUME

UWAGA: Unikaj używania plastikowych probówek o niskiej wiązalności do ekstrakcji lipidomicznej, ponieważ silne rozpuszczalniki organiczne uwalniają plastyfikatory i tworzą silne tło podczas analizy próbki.

  1. Przygotować probówki o pojemności 1,5 ml ze 100 μl roztworu wodorowęglanu amonu w każdej probówce z całkowitą próbą ślepą (TB), próbą wzorzec wewnętrzny (ISB) i próbkami kontroli jakości (QC), biorąc pod uwagę, że 1 próbka QC jest umieszczona między każdym zestawem 10 próbek. Wszystkie próbki należy przechowywać na lodzie.
  2. Dodać 10 μl połączonego osocza ludzkiego do wszystkich próbek kontroli jakości. Wstrzyknąć 10 μl roztworu wzorca wewnętrznego do wszystkich ISB, QC i badanych próbek (tj. wszystkich próbek z wyjątkiem TB).
    UWAGA: W przypadku materiału do kontroli jakości należy użyć dowolnego dostępnego na rynku osocza K2EDTA. Określić ilościowo stężenie lipidów w połączonym osoczu przy użyciu wspomnianego protokołu po otrzymaniu i zachować te zakresy jako odniesienia dla wszystkich analiz, w których stosuje się materiał kontroli jakości. Używaj osocza NIST tylko do bardziej ukierunkowanych zastosowań lub do globalnej weryfikacji metod, w których należy zająć się dokładnością testu.
  3. Do każdej próbki dodać 300 μl mieszaniny butanol/metanol o temperaturze -20 °C (3/1, v/v). Wstrząsać w temperaturze 450 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze.
  4. Dodać 300 μl mieszaniny heptanu/octanu etylu (3/1, v/v). Wstrząsać w temperaturze 450 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze.
  5. Dodać 300 μl 1% mieszaniny kwasu octowego. Wstrząsaj przez 5 minut w temperaturze 450 × g w temperaturze pokojowej na termomikserze. Wirować przy 2 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 360 μl górnej fazy do nowej probówki samoblokującej o pojemności 2 ml 2,
    UWAGA: Ekstrakcja ciecz-ciecz może powodować przesunięcie pozycji granicy faz w sposób zależny od próbki, co może skutkować niewielką rozbieżnością objętości dla górnej fazy. W razie potrzeby dostosuj objętość zbierania dla górnej fazy.
  6. Dodać 320 μl heptanu/octanu etylu (3/1, v/v) do probówki 1 z fazą wodną. Wstrząsać w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze. Wirować przy 2 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 320 μl górnej fazy i połączyć z frakcją z kroku 5.11.
    UWAGA: W razie potrzeby dostosuj objętość zbierania dla górnej fazy.
  7. Dodać 250 μl heptanu/octanu etylu (3/1, v/v) do fazy wodnej w probówce 1. Wstrząsać w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej na termomikserze. Wirować przy 2 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 200 μl górnej fazy i połączyć z frakcjami z kroku 5.11 i kroku 5.15 w probówce 2.
    UWAGA: W razie potrzeby dostosuj objętość zbierania dla górnej fazy.
  8. Odparować do sucha w temperaturze 35 °C w koncentratorze próżniowym.
    UWAGA: W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
  9. Rozpuścić ponownie w 300 μl roztworu mieszaniny MS (7,5 mM octanu amonu w roztworze izopropanolu/metanolu/chloroformu, 4:2:1). Wiruj każdą probówkę przez 5 sekund, aby upewnić się, że wszystko się rozpuściło. Wirować w temperaturze 18 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Przenieść podwielokrotność 50 μl na płytkę mikrolitrową zgodnie z układem płytki w Rysunek 2 do analizy w trybie jonizacji dodatniej (kolumny 1-6) i rozcieńczyć 50 μl roztworu mieszającego MS.
  11. Przenieść podwielokrotność 20 μl na płytkę MTP zgodnie z układem płytki w Rysunek 2 do analizy w trybie jonizacji ujemnej (kolumny 7-12) i rozcieńczyć 80 μl mieszanki MS. Owinąć płytkę folią i przechowywać w temperaturze 4 °C przed analizą.

6. Analiza MS

  1. Spektrometr mas (MS) należy skalibrować zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym, zgodnie z instrukcjami producenta na 5 dni lub mniej przed analizą.
  2. Zainstaluj nanoźródło infuzji bezpośredniej z przodu, upewniając się, że jest prawidłowo wyrównane z kapilarą transferową MS. Zainstaluj chip dyszy 4,1 μm w uchwycie chipa i skonfiguruj go w oprogramowaniu.
  3. Użyj następujących parametrów do ustawienia metody trybu dodatniego i ujemnego: ciśnienie gazu 1.25 psi; napięcie źródła 1,1 kV; 5 μl objętości próbki do wstrzykiwania; zamknięcie styku wyjściowego Rel1 na 2,5 s; 5 min czasu dostawy; chłodzenie płyty w temperaturze 4 °C.
  4. Ustaw kolejkę sekwencji analizy dla robota do infuzji bezpośredniej w trybie dodatnim.
  5. Skonfiguruj metodę MS dla trybu dodatniego, korzystając z następujących ustawień MS:
    1. Ustaw temperaturę kapilary na 250 °C, a poziom RF soczewki S na 65.0. Wykonuj pełne skanowanie akwizycji MS od 0 do 1 minuty w zakresie 550-1000 m/z z rozdzielczością 140 000 z automatyczną kontrolą wzmocnienia 1 ×106 i maksymalnym czasem wtrysku 50 ms. Zastosować masę blokady 680.48022.
    2. Ustaw niezależną od danych metodę akwizycji MS/MS w zakresie od 1 do 5 minut w rozdzielczości 17 500 ze stałą pierwszą masą 250 m/z. Użyj automatycznej kontroli wzmocnienia dla MS2 przy 1 × 105 i maksymalnym czasie wtrysku 64 ms, energii zderzenia 20 NCE i oknie izolacji 1 m/z. Użyj listy mas inkluzji od 550 do 1 000 m/z, z krokiem masy 1 Da.
  6. W przypadku akwizycji w trybie ujemnym należy ustawić temperaturę kapilary na 250 °C, a poziom RF soczewki S-Lens na 65,0 w pliku MS tune.
    1. Użyj następujących ustawień metody MS: tryb akwizycji pełnego skanowania od 0 do 1 minuty przy rozdzielczości 140 000 obejmującej zakres 400-940 m/z, automatyczna kontrola wzmocnienia 1 × 106; maksymalny czas wtrysku 50 ms; Użyj masy blokady 529.46262.
    2. Ustaw akwizycję MS2 w trybie DIA między 1 a 5 minutami przebiegu z rozdzielczością 17 500 przy ustalonej pierwszej masie 150 m/z; automatyczna kontrola wzmocnienia 1 × 105; maksymalny czas wstrzykiwania: 64 ms; i 35NCE energii zderzenia. Użyj listy mas inkluzji od 400 do 940 z krokiem masowym 1 Da.
  7. Utwórz kolejkę sekwencji analizy w oprogramowaniu MS w trybie pozytywnym. Poczekaj, aż akwizycja próbki zostanie wyzwalona przez sygnał zamknięcia styku pochodzący z robota do bezpośredniej infuzji dla każdej próbki.
  8. Po zakończeniu analizy w trybie dodatnim utwórz kolejkę sekwencji dla robota do infuzji bezpośredniej w trybie ujemnym.
  9. Ustaw kolejkę sekwencji analizy w oprogramowaniu MS w trybie ujemnym.

7. Przetwarzanie danych

  1. Aby przekonwertować pliki danych z trybu dodatniego i ujemnego z formatu .raw na format .mzML, należy użyć oprogramowania konwertującego.
    UWAGA: Pliki danych z trybu dodatniego i ujemnego muszą być konwertowane oddzielnie (ze względu na ich różne ustawienia akwizycji i różny próg szumów).
    1. Wypełnij następujące ustawienia, aby przeprowadzić konwersję plików: współczynnik progowy szumu wynosi 3 i 5 odpowiednio dla MS i MS2; Aktywuj funkcję usuwania szumów zarówno dla MS, jak i MS2, kompresji danych, średnich skanów MS2 i wybierania szczytów. Ustaw progi TIC dla trybów dodatnich i ujemnych (np. 10 000 i 5 000; które zostaną zdefiniowane na podstawie poziomu hałasu danej próbki wytwarzanej przez określony instrument). Generuj raporty XLC i PDF po zakończeniu przetwarzania.
  2. Wykonaj identyfikację lipidów. Zdefiniuj następujące (przykładowe) parametry ustawień importu plików: okno wyboru ±0,5 Da (zależy od okna wyboru w metodzie MS); zakres czasu 2-300 s (w zależności od czasu skanowania w metodzie MS); brak mas kalibracyjnych dla MS i MS2; przenieść i zaokrąglić w górę zakres mas z plików metadanych oprogramowania Peak by Peak (masa minimalna [MS]) i (masa minimalna [MS2]); tolerancja 3 ppm i 10 ppm odpowiednio dla MS i MS2; pole progowe MS i MS2 powinno być puste, filtr częstotliwości, przesunięcie MS1 i PMO; Wybrano korekcję izotopową dla MS i MS2; przenieść gradient rozdzielczości z pliku metadanych konwertera jako (Dopasowanie liniowe rozdzielczości [MS]) i jako (Dopasowanie liniowe rozdzielczości [MS2]).
    UWAGA: Identyfikacja lipidów w trybie dodatnim i ujemnym musi być wykonywana oddzielnie ze względu na ich różne ustawienia akwizycji.
  3. Po zaimportowaniu danych przejdź do menu Uruchom i prześlij pliki MFQL do identyfikacji lipidów.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat struktury MFQL można znaleźć w publikacji Herzog et al.25. Zobacz kilka przykładów plików MFQL na https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library i zobacz dyskusję. Wszystkie MFQL wykorzystywane do przetwarzania danych znajdują się w Materiałach Uzupełniających.
  4. Określić ilościowo zidentyfikowane gatunki na poziomie MS, dzieląc intensywność masy prekursora cechy lipidowej przez odpowiednią intensywność znakowanego wzorca wewnętrznego, a następnie mnożąc iloraz przez stężenie znakowanego wzorca wewnętrznego. Znormalizuj końcowe stężenie lipidów na ilość całkowitego białka mierzone za pomocą testu Bradforda.

8. Procedura kontroli jakości

UWAGA: Procedura kontroli jakości jest niezbędnym krokiem do sprawdzenia technicznej odtwarzalności metody. W tym celu analizowane jest komercyjne osocze zbiorcze w celu określenia endogennych poziomów różnych lipidów w ciągu 5 dni w 15 identycznych podwielokrotnościach na partię (łącznie pięć partii). Należy zauważyć, że w tym przypadku potok oceny danych został utworzony jako aplikacja internetowa Shiny przy użyciu środowiska oprogramowania statystycznego R.

  1. Zdefiniuj referencyjny zakres akceptacji jako średnią wartość obliczoną dla wszystkich pięciu partii ±3 odchylenia standardowe.
  2. Stosować zasady akceptacji "pozytywnej" dla każdej partii analitycznej: 90 % docelowych parametrów odniesienia musi zostać spełnionych, biorąc pod uwagę, że jeden związek odniesienia reprezentuje jedną klasę lipidów. Na przykład, jeśli weryfikacja QC obejmuje 15 wzorców referencyjnych, upewnij się, że 13 celów spełnia wymagania partii, która ma zostać zaakceptowana.
    UWAGA: Innymi słowy, 68% próbek QC na związek referencyjny musi przejść pomyślnie, aby dane dla tej klasy lipidów zostały zaakceptowane.
  3. Jeżeli badana partia nie spełnia kryteriów akceptacji do kontroli jakości, należy powtórzyć procedurę.

9. Oszacowanie (względnych) ilości sprzężonych kwasów tłuszczowych

  1. Dla każdej klasy lipidów oszacuj ilości sprzężonych kwasów tłuszczowych na podstawie ich intensywności MS2.
    UWAGA: Ze względu na różnice w fragmentacji i jonizacji, uzyskane wartości były przeznaczone wyłącznie do porównań względnej obfitości w grupach próbek, a nie, na przykład, do oszacowania względnego udziału określonego kwasu tłuszczowego w ogólnej puli sprzężonych kwasów tłuszczowych klasy lipidów.
  2. Znormalizować intensywność MS2 fragmentów kwasów tłuszczowych przez średnią intensywność fragmentów kwasów tłuszczowych odpowiedniego wzorca wewnętrznego. Na podstawie stężenia wzorca wewnętrznego i zmierzonej masy tkanki wyprowadź "znormalizowane stężenie" dla sprzężonych kwasów tłuszczowych. Zsumuj te wartości dla każdej klasy lipidów, aby oszacować całkowitą ilość każdego sprzężonego kwasu tłuszczowego w próbce.

10. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadzanie analiz statystycznych. Dopasuj model liniowy dla każdego warunku i odpowiadającej mu grupy kontrolnej i oblicz wartości p na podstawie statystyki t dla danych przekształconych log2. Użyj metody współczynnika fałszywych wykryć Benjaminiego-Hochberga, aby skorygować wiele efektów testowania.
    UWAGA: Lipidy o skorygowanych wartościach p < 0,05 są uważane za zróżnicowane obfite. W tym przypadku analiza statystyczna została przeprowadzona w środowisku statystycznym R26.

Wyniki

W tym miejscu, jako wyniki reprezentatywne, przedstawiamy dane ilustrujące, w jaki sposób lipidomika typu shotgun może zostać wykorzystana do badania wpływu CS na płuca myszy. Protokół analizy lipidów typu shotgun z sukcesem zastosowano w badaniu in vivo w celu analizy porównawczej dwóch grup próbek: tkanek płuc pobranych od dziewięciu samic myszy Apoe−/− narażonych na CS (grupa 3R4F; kontrola pozytywna) oraz od równiej liczby myszy utrzymywanych w warunkach świeżego powietrza (grupa pozorowana) jako kontrola negatywna, pobranych w punktach czasowych ekspozycji wynoszących odpowiednio 3 miesiące, 4 miesiące i 6 miesięcy. Zwierzęta przebywały w warunkach filtrowanego i kondycjonowanego świeżego powietrza w temperaturze 22 °C ± 2 °C i wilgotności 55% ± 15%, otrzymując dietę w formie granulatu poddanego napromieniowaniu gamma. Reżim oświetlenia utrzymywano na poziomie 12 h na dobę. W każdej klatce przebywało do ośmiu myszy. Papierosy referencyjne 3R4F do traktowania ekspozycyjnego zakupiono z University of Kentucky w celu wytworzenia aerozolu CS 3R4F (600 µg całkowitej materii cząsteczkowej TPM/L aerozolu) dla docelowego stężenia ekspozycji równoważnego 28 µg nikotyny/L. Dym CS z papierosów 3R4F wytwarzano przy użyciu 30-portowych rotacyjnych maszyn do palenia zgodnie z metodą Phillipsa i wsp.27. W oparciu o protokół intensywnego palenia Health Canada, w celu zapewnienia odpowiedniej ekspozycji, zastosowano objętość zaciągnięcia 55 mL, jedno zaciągnięcie co 30 s oraz 100% zablokowanie otworów wentylacyjnych papierosów 3R4F. Wszystkie dodatkowe szczegóły dotyczące projektu badania zostały opisane wcześniej27,28.

Ogólnie zidentyfikowano i określono ilość około 400 molekularnych gatunków lipidów z 14 najliczniejszych klas lipidowych (Rysunek 3). Całkowite znormalizowane stężenie lipidów w poszczególnych klasach było nieco podwyższone dla klas lipidów PE, PEO, PC, PCO, PI i PG, natomiast w przypadku lipidów SM, LPE i PA zaobserwowano pewną regulację w dół (Rysunek 3A), podczas gdy nie stwierdzono różnic dla TAG i PS. Co ciekawe, podwyższone poziomy lipidów plazmalogenowych PCO i PEO w grupie CS zgłaszano w komórkach zapalnych29. Jedną z wewnątrzkomórkowych funkcji lipidów plazmalogenowych jest aktywność przeciwutleniająca. W przypadku ekspozycji na reaktywne formy tlenu (ROS) i azotu (RNS) zgłoszono selektywne utlenianie plazmalogenów w porównaniu z fosfolipidami diacylowymi30. Wiązanie enyl-eterowe w strukturze chemicznej plazmalogenów jest wrażliwe na atak rodnikowy podczas stresu oksydacyjnego31. Głównymi produktami ataku rodnikowego są hydroksylowane kwasy eikosatetraenowe, fosfolipidy 2-monoacyloglicerolowe, pentadekanol, kwasy mrówkowe, α-hydroksyaldehydy o różnych długościach łańcucha, 1-formylo-2-arachidonilo-glicerofosfolipid oraz lizofosfolipidy.

Wyniki te pokazują, że spośród cech molekularnych opartych na całkowitym wzorze cząsteczkowym, ekspozycja na CS znacząco wpłynęła na 100-120 związków (Ryc. 3D). Szczegółowa dekonwolucja informacji o fragmentacji MS2 oraz normalizacja intensywności sygnałów fragmentów pozwoliły na przybliżone określenie całkowitej ilości każdego sprzężonego kwasu tłuszczowego (FA) reprezentowanego w każdej klasie lipidów (Ryc. 3E) oraz porównanie tych danych pomiędzy grupami eksponowanymi i kontrolnymi. Zaobserwowano wyraźny spadek zarówno w przypadku FA w pełni nasyconych, jak i tych z niewielką liczbą nienasyceń, głównie w kontekście lizo-lipidów. Z kolei wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) w składzie klas fosfolipidów PC, PE i PG były podwyższone w grupie CS we wszystkich punktach czasowych. Ekstremalne przypadki PC i PG sprzężonych z kwasem eikozapentainenowym (EPA) i dokozaheksainenowym (DHA) wykryto wyłącznie w grupie narażonej na dym papierosów 3R4F CS (Ryc. 3E, kolor czerwony).

Układ mikropłytki dla analizy ze standardami, próbami ślepymi i próbkami badawczymi; kontekst oceny danych.
Rysunek 1: Układ płytki dla rozkładu próbek w metodzie Bradforda. Próbki ślepe i standardy są umieszczane w trzech powtórzeniach w kolumnach 1-3; próbki nieznane są umieszczane w dwóch powtórzeniach w kolumnach 4-11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ płytki mikrotitracyjnej przedstawiający pozycje próbek, kontrole QC oraz testy TB/ISB dla wyników analizy.
Rysunek 2: Układ 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej do analizy metodą spektrometrii mas typu shotgun. Rozmieszczenie próbek pustych, wzorców, próbek nieznanych oraz próbek QC dla akwizycji w dodatnim trybie jonizacji jest zaznaczone po lewej stronie płytki (kolumny 1-6); wszystkie próbki dla ujemnego trybu jonizacji znajdują się po prawej stronie (kolumny 7-12). Skróty: pos = dodatni; QC = kontrola jakości; neg = ujemny; TB = całkowita próba pusta. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki analizy lipidomicznej, wykresy słupkowe i wykresy rozrzutu zmian krotności, analiza korelacyjna mapą ciepła.
Rycina 3: Analiza shotgun lipidomics płuc myszy eksponowanych na dym tytoniowy. Myszy Apoe−/− były eksponowane na dym tytoniowy (CS) z papierosów referencyjnych 3R4F lub na świeże powietrze (grupa kontrolna – sham). (A) Stężenia klas lipidów i liczba gatunków lipidów w każdej klasie. Dla każdej klasy liczba zidentyfikowanych gatunków lipidów podano w nawiasach. Przedstawiono średnie i 95% przedziały ufności dla każdej klasy lipidów, oddzielnie dla każdego typu ekspozycji (zagregowane dla trzech punktów czasowych). (B) Wykresy wulkaniczne (volcano plots) przedstawiające wielkość efektu (log2 fold change) i istotność (-log10 FDR-adjusted p value) zidentyfikowanych gatunków lipidów dla porównania 3R4F CS względem grupy kontrolnej w trzech punktach czasowych. Lipidy o istotnie podwyższonym poziomie zaznaczono na żółto; lipidy o istotnie obniżonym poziomie zaznaczono na cyjanowo (FDR-adjusted p value < 0,05). (C) Różnice w zawartości 25 gatunków lipidów z największymi absolutnymi średnimi zmianami krotności. Zmiany log2 fold change dla porównania 3R4F CS względem grupy kontrolnej są zakodowane kolorami, a istotność statystyczna jest wskazana: *: FDR-adjusted p value < 0,01; X: FDR-adjusted p value < 0,05. (D) Wykresy porównawcze. Współczynniki korelacji dla porównań zmian krotności są zakodowane kolorami, a liczba wspólnych lipidów o zmienionej zawartości jest wskazana (całkowite liczby na marginesach). Wykresy kołowe przedstawiają procent wspólnych lipidów o zmienionej zawartości w tym samym kierunku zmian (znak FC). Gwiazdka wskazuje na istotne nakładanie się lipidów o różnej zawartości. (E) Różnice w zawartości sprzężonych FA w podziale na klasy lipidów. Mapa ciepła, analogicznie jak w panelu C, dla sprzężonych kwasów tłuszczowych z istotnymi różnicami w zawartości między ekspozycją 3R4F a grupą kontrolną we wszystkich trzech punktach czasowych (FDR-adjusted p value < 0,05). Ilość każdego kwasu tłuszczowego w danej klasie lipidów oszacowano na podstawie intensywności MS2 fragmentów kwasów tłuszczowych. Skróty: CS = dym tytoniowy; FDR = wskaźnik fałszywych odkryć; FC = zmiana krotności; FA = kwasy tłuszczowe; PC = fosfatydylocholina; PS = fosfatydyloseryna; TAG = triacylglicerol; SM = sfingomielina; PEO = plazmalogen fosfatydyloetanoloamina; PE = fosfatydyloetanoloamina; PG = fosfatydyloglicerol; PI = fosfatydyloinozytol; DAG = diacylglicerol; SE = estry steroli/cholesterolu; PCO = plazmalogen fosfatydylocholina; LPC = lizofosfatydylocholina; LPE = lizofosfatydyloetanoloamina; PA = kwas fosfatydowy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

końcowe stężenie BSA (mg/ml)roztwór BSA o stężeniu 2 mg/ml (µL)bufor wodorowęglanowy amonu (µL)
15050
0.7537.562.5
0.52575
0.2512.587.5
0.12512.5187.5
0.062550 μL roztworu o stężeniu 0,125 mg/ml50
00100

Tabela 1: Schemat rozcieńczania wewnętrznego standardu BSA dla krzywej kalibracyjnej w analizie Bradforda. Skrót: BSA = albuminy surowicy bydlęcej.

Informacje uzupełniające: Pliki MFQL wykorzystywane do identyfikacji lipidów w programie LipidXplorer.Pakiet .zip zawiera poszczególne wymagane pliki MFQL, z których każdy został nazwany zgodnie z wzorem: __MS2.mfql (np. PE_neg_MS2.mfql). Nazwy plików służące do identyfikacji znakowanych standardów wewnętrznych zawierają tag D7(D9) w obrębie (np. PED7_neg_MS2.mfql). Pliki MFQL te są wykorzystywane do weryfikacji ilości deuteru w standardzie wewnętrznym. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Chociaż postępy w dziedzinie stwardnienia rozsianego zaowocowały różnymi metodami dokładnego monitorowania wielu gatunków lipidów, wcześniejsze profilowanie lipidowe różnych tkanek ssaków nie wykazało spójnych wyników, a w konsekwencji poszczególne funkcje lipidów specyficzne dla tkanek pozostają niejasne. W porównaniu z analizą funkcjonalną białek, dla której dostępne są bardziej solidne podejścia do eliminacji ekspresji poszczególnych związków, większość lipidów nie może być selektywnie wyłączona lub nadmiernie eksprymowana w tkankach, co utrudnia funkcjonalną ocenę lipidów. Zaawansowane profilowanie stężeń lipidomu w tkankach może stanowić alternatywne podejście do identyfikacji powiązań między krążącymi lipidami a chorobami ludzkimi.

Oceniając kompleksowe metody lipidomiczne, które są w stanie jakościowo i ilościowo pokryć endogenny profil lipidowy dowolnej tkanki myszy, preferowaliśmy metodę lipidomiczną typu shotgun. Ogólnie rzecz biorąc, możliwe są dwa przeciwstawne typy analizy próbek: albo całkowicie nieukierunkowane badanie przesiewowe lipidów przy użyciu separacji opartej na chromatografii cieczowej (LC) z dalszą detekcją spektrometrii mas w celu ujawnienia całkowitej złożoności lipidów w próbce, albo podejścia celowane, które w większości pozwalają na bardzo precyzyjną kwantyfikację określonych lipidów będących przedmiotem zainteresowania. W przeciwieństwie do tego, mocną cechą prezentowanego przepływu pracy lipidomiki shotgun jest szybkie, kompleksowe pokrycie setek endogennych lipidów z predefiniowanych klas lipidów, które nadal można wykonać w solidny sposób półilościowy.

Skuteczność jonizacji różnych klas lipidów jest zależna od struktury i może się drastycznie różnić w zależności od różnych eksperymentalnych warunków jonizacji. W przeciwieństwie do metod separacji opartych na LC, analiza shotgun minimalizuje te różnice ze względu na bezpośrednią jednoczesną infuzję całego ekstraktu lipidowego w tych samych warunkach jonizacji do instrumentu MS. Zastosowanie izotopowo znakowanych analogów lipidów lub strukturalnie podobnych wzorców nieendogennych pozwala na półkwantyfikację wszystkich klas lipidów. Lipidomika typu shotgun zapewnia niską zmienność między i wewnątrz serii podczas analizy stwardnienia rozsianego; W rezultacie, metoda ta daje niższe współczynniki zmienności21 niż metody oparte na nieukierunkowanej chromatografii cieczowej, które wymagają wielu wzorców w celu odpowiedniej kwantyfikacji. Co ważne, chociaż w obecnej metodzie nie stosuje się zewnętrznej krzywej kalibracyjnej, metoda ta jest nadal uważana za w pełni ilościową32.

Jeden poziom znakowanego wzorca wewnętrznego (lub nieznakowanego wzorca, który nie jest wyrażany endogennie) na klasę lipidów jest wystarczający do ilościowego określenia większości lipidów. Tylko kilka publikacji donosiło o częściowej walidacji metody lipidomicznej typu shotgun. Na przykład w Gryzbek i wsp.17 oraz Surma i wsp.21 odwrócone krzywe kalibracyjne przygotowano przy użyciu wzorców wewnętrznych i ustalonej ilości matrycy próbki. Liniowość oceniano za pomocą regresji liniowej ilości lipidów przekształconych logarytmicznie i ich intensywności, a następnie podawano je odpowiednio jako R2 i nachylenie. Granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) określono za pomocą ważonej regresji liniowej opartej na stosunku sygnału do szumu wynoszącym 3 dla LOD i 10 dla LOQ. Dla większości klas lipidów LOQ określono w zakresie 2-9,8 pmol dla tkanki tłuszczowej i 0,05-5 μM w osoczu. W obu przypadkach do uzyskania szacunków dla wszystkich lipidów w tej klasie zastosowano nieendogenne pojedyncze wzorce wewnętrzne dla każdej klasy. Jednak w tej pracy nie podajemy LOD/LOQ z powodu kilku obaw: matryca endogenna nie jest wolna od związków, a matryca zastępcza dla tkanek jest niedostępna - w związku z tym skok małych znanych ilości wzorców nie jest możliwy. Nie stosujemy klasycznego podejścia do celowanej kwantyfikacji z wykorzystaniem serii krzywych kalibracyjnych konkretnego związku znormalizowanego przez identyczny wzorzec znakowany izotopowo ze względu na brak czystych wzorców i bardzo ograniczoną dostępność izotopowo znakowanych lipidów. Detektory orbitrap automatycznie przeprowadzają konwersję sygnału przejściowego, stosując transformację Fouriera, a część sygnału jest już podstawiona - w rezultacie dolny zakres stężeń będzie tylko liniowy aż do pewnego minimalnego sygnału, poniżej którego cząsteczka nie będzie już wykrywalna. Wartości sygnału do szumu w oprogramowaniu Xcalibur zależą od stosunku m/z cząsteczki; W rezultacie związki z każdej klasy lipidów, zawierające różne kombinacje kwasów tłuszczowych, będą miały różne wartości szumu. Co więcej, wartości LOQ/LOQ są ściśle związane z typem matrycy, a gdy kwantyfikacja lipidomu jest przeprowadzana w różnych tkankach gryzoni, powinna znaleźć odzwierciedlenie w ocenie LOQ dla każdego typu tkanki indywidualnie.

W rzeczywistości metoda ta oferuje wysoki liniowy dynamiczny zakres kwantyfikacji do czterech rzędów wielkości33 i bardzo dobrą czułość obejmującą najważniejsze endogenne lipidy strukturalne, które można dodatkowo zwiększyć dzięki ulepszeniom technicznym w zakresie pozyskiwania MS32. Współczynniki zmienności średnich stężeń lipidów wynosiły w większości poniżej 15%, co oznacza, że lipidomika typu shotgun spełnia wymagania Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) jako metoda, którą należy wziąć pod uwagę w badaniach dobrej praktyki laboratoryjnej (GLP) i dobrej praktyki klinicznej (GCLP)34.

Należy jednak zauważyć, że ze względu na ich różną polarność, na niektóre klasy lipidów znacznie większy wpływ ma udział określonych sprzężonych FA. Prowadzi to do zniekształcenia odpowiedzi na intensywność w mieszaninach równomolowych zawierających szeroki zakres sprzężonych FA, co skutkuje błędem kwantyfikacyjnym, jak podkreślili Koivusalo i wsp.35 dla klas fosfolipidów. Warto zauważyć, że autorzy ci przedstawili dane dla szerokiego zakresu FA, od 24 do 48 długości łańcucha, co prawdopodobnie nie odzwierciedla sytuacji w rzeczywistej próbce biologicznej. Odpowiedź dla gatunków wielonienasyconych była o 40% wyższa niż dla gatunków w pełni nasyconych, ale efekt ten zaobserwowano tylko dla wyższych stężeń. Gdy mieszanina była stopniowo rozcieńczana, efekt nienasycenia stopniowo zmniejszał się i praktycznie zniknął przy 0,1 pmol/μl na gatunek. Dodatkowo, wszystkie pomiary zostały wykonane na instrumentach z pułapką jonową i potrójnymi kwadrupolami, a nie na sprzęcie Q-Exactive.

Kolejną zaletą prezentowanego workflow jest jego elastyczność techniczna, która pozwala na dostosowanie do konkretnych wymagań projektu. Na przykład, każdy protokół ekstrakcji lipidów - taki jak zmodyfikowany Bligh i Dyer36, eter metylowo-tert-butylowy37 lub metody butanol-metanol38 - może być wykorzystany do przygotowania całkowitego ekstraktu lipidowego przed analizą MS. Głównym ograniczeniem ekstrakcji chloroformem-metanolem jest to, że dolna faza zawiera frakcję lipidową, co komplikuje rutynową pracę, a zwłaszcza automatyzację; Ponadto należy wziąć pod uwagę toksyczność chloroformu. Ekstrakcja eteru tert-butylowego jest szeroko stosowana do analizy lipidów próbek osocza37, a jej zautomatyzowana wersja została zaproponowana21. W tym przypadku wybraliśmy metodę BUME, ponieważ zapewnia ona jeszcze lepsze odzyski dla wzbogaconych klas lipidów PG, PI, PA i PS38, mniejsze zużycie rozpuszczalnika i możliwość automatyzacji39, podczas gdy ogólne stężenia określone ilościowo dla próbek tkanek ekstrahowanych wszystkimi trzema metodami były porównywalne. Dodatkowo, podczas gdy ekstrakcja próbki została przeprowadzona ręcznie w obecnych pracach, możliwe jest również uzyskanie powtarzalnych i precyzyjnych wyników z dużych zestawów próbek poprzez automatyczne przygotowanie próbki i ekstrakcję lipidów w formacie 96-dołkowym 40,41. Pozwala to na zastosowanie analizy lipidomicznej w badaniach klinicznych i toksykologicznych na dużą skalę.

W obecnej pracy przeprowadziliśmy akwizycję MS modów dodatnich i ujemnych oddzielnie bez przełączania polaryzacji, jak opisano przez Schuhmanna i wsp.42. Stabilność sygnału nanomatu jest lepsza w trybie ujemnym dla nieco mniej stężonego roztworu niż w trybie dodatnim. Dodatkowo opracowaliśmy w pełni identyfikowalną procedurę z oprogramowaniem konwertującym z plików .raw na mzML, które zapewnia wartości do określenia w oprogramowaniu LipidXplorer - dzięki temu nie są wymagane ręczne obliczanie nachylenia rozdzielczości. Zastosowaliśmy również różne substytucje ustawień szumu, ponieważ w trybie dodatnim poziomy szumów widm są wyższe niż w trybie ujemnym. Wszystkie etapy zostały zoptymalizowane pod kątem identyfikowalnych, rutynowych analiz o wysokiej przepustowości.

W celu identyfikacji, analiza lipidomiczna typu shotgun może wykorzystać unikalne zachowanie różnych klas lipidów, które tworzą unikalne addukty w różnych trybach polarności. W tej metodzie gatunki PC i PE o tej samej masie cząsteczkowej, które nakładają się na siebie w trybie jonizacji dodatniej, mogą być całkowicie oddzielone w trybie jonizacji ujemnej, ponieważ PC tworzy addukty octanu lub mrówczanu, a PE jest jonizowany w postaci zdeprotonowanej. Co więcej, możliwa jest (częściowa) dekonwolucja strukturalna w przypadku metody wykorzystującej nie tylko wzór cząsteczkowy, ale także strukturę masowych kwasów tłuszczowych. Na przykład identyfikacja FA na poziomie całkowitego węgla i całkowitej liczby nienasyconych działa dla wszystkich fosfolipidów, DAG, TAG i lizofosfolipidów. Kwantyfikacja od dołu do góry każdej formy izomerycznej może być częściowo przeprowadzona dla niektórych klas fosfolipidów43 , ale jest znacznie bardziej złożona dla DAG i TAG ze względu na nierówną odpowiedź sygnałową różnych FA w widmach MS2.

Należy również podkreślić konieczność wdrożenia odpowiednich procedur kontroli jakości, w pełni zgodnych z ostatnimi inicjatywami w tej dziedzinie44. Ponieważ chcemy zapewnić odpowiednią identyfikowalność i odtwarzalność danych między laboratorium i w jego obrębie, podjęto szereg kroków, takich jak właściwa randomizacja próbek dla wszystkich etapów analizy, praca z certyfikowanymi przez dostawcę mieszaninami standardowymi, włączenie próbek kontroli jakości, procedury weryfikacji przyjęcia lub odrzucenia partii oraz utworzenie wewnętrznej bazy danych w celu śledzenia wyników kontroli jakości w perspektywie długoterminowej. Spójna z tymi inicjatywami jest również potrzeba ustandaryzowanej metody rozwiązywania problemów ze stabilnością próbki. Ogólnie rzecz biorąc, na większość lipidów strukturalnych nie ma wpływu utlenianie lipidów, co jest bardziej istotne w przypadku oksylipin, utlenionych lipidów i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, które są zatem znacznie bardziej wrażliwe na warunki przechowywania i obsługi. Jednak prawidłowa ocena stabilności próbki jest nadal trudnym technicznie zadaniem.

Protokół ten ma jednak ograniczenie, jeśli chodzi o określanie submolekularnych poziomów związków. Biorąc pod uwagę, że nie ma oddzielenia całkowitego ekstraktu, wszystkie izoformy lipidów o tej samej masie cząsteczkowej, ale różnym składzie kwasów tłuszczowych są łączone w analizie MS. Dla większości klas możliwe jest osiągnięcie częściowej dekonwolucji struktury przy użyciu współczynników fragmentacji resztkowych fragmentów kwasów tłuszczowych w MS2. Jednak niezależna kwantyfikacja każdej izoformy pozostaje szczególnie trudnym zadaniem ze względu na duże różnice w zachowaniu fragmentacji różnych izoform oraz fakt, że czyste wzorce chemiczne nie są dostępne w wystarczająco dużej różnorodności, aby określić wartości kompensacji. Innym ograniczeniem jest to, że proces ESI nieuchronnie generuje artefakty, co skutkuje sztucznym generowaniem pików dla niektórych lipidów, takich jak DAG, Pas i FA, co może prowadzić do błędnej kwantyfikacji.

Następnie podsumowujemy najbardziej krytyczne części protokołu w oparciu o nasze doświadczenie. Pierwsza z nich związana jest z faktem, że każdy typ tkanki myszy ma unikalny profil lipidowy zarówno pod względem ilości lipidów, jak i proporcji klas. W związku z tym należy dokładnie określić początkowe ilości tkanki w oparciu o całkowitą zawartość białka przed ekstrakcją, aby nie nasycić sygnału MS i nie opuścić dynamicznego zakresu kwantyfikacji z powodu agregacji lipidów w wysokich stężeniach33 lub - na przeciwnym biegunie - aby zapewnić wystarczającą ilość sygnału MS, aby pokryć główne związki lipidowe dla każdej klasy lipidów.

Drugim krytycznym aspektem jest zapewnienie prawidłowego wyrównania położenia wylotu chipa nanoźródła z bezpośrednią infuzją do kapilary transferowej spektrometru masowego. Biorąc pod uwagę, że pełna kalibracja spektrometru mas w obu trybach jest wykonywana co tydzień, zamiana między źródłem kalibracji a konfiguracją chipa nanoźródła może być przyczyną dramatycznej zmienności intensywności sygnału z powodu niewspółosiowości podczas instalacji.

Kolejną krytyczną częścią protokołu jest ostrożne obchodzenie się z wewnętrzną mieszanką wzorcową. Ponieważ mieszanina ta zawiera znaczną ilość dichlorometanu, po otwarciu należy ją szybko spożyć, aby uniknąć długiego przechowywania i wielokrotnego użycia prowadzącego do parowania i sztucznej zmiany stężenia. Ponadto ważne jest konsekwentne obchodzenie się z mieszaniną wzorcową po wyjęciu z magazynu w temperaturze -20 °C, ponieważ różnice temperatur mogą prowadzić do niespójności objętości podczas pipetowania pipetami z poduszką powietrzną. Alternatywą byłoby zastąpienie dichlorometanu w standardowym buforze do resuspensji czystym metanolem, co mogłoby poprawić wygodę obsługi, ale mogłoby negatywnie wpłynąć na rozpuszczalność niektórych klas lipidów, a tym samym zmniejszyć dokładność oznaczania ilościowego dla tych klas lipidów.

Ostatnią krytyczną częścią jest przetwarzanie danych. Przepływ pracy przetwarzania danych łączy konwersję oprogramowania Peak by Peak z formatu .raw do .mzML, stosując uśrednianie skanów MS2 i filtrację szumów MS1 i MS2, a także pobieranie szczytów i kompresję danych. Alternatywnie oprogramowanie Proteowizard może być również używane do konwersji danych, ale w tym przypadku kilka ustawień w LipidXplorer musi być zdefiniowanych ręcznie. Cała złożoność lipidomiki typu shotgun jest szczególnie skoncentrowana na etapie dekonwolucji widm MS1 i MS2 z wtryskiem bezpośrednim. Oprogramowanie LipidXplorer o otwartym kodzie źródłowym importuje przekonwertowane widma z formatu pliku mzML w oparciu o dokładność masy, rozdzielczość masy i nachylenie jej zmiany wraz ze wzrostem m/z. Oprogramowanie łączy wiele indywidualnych widm MS i MS/MS uzyskanych w ramach analizy. Następnie wyrównuje poszczególne piki w różnych seriach próbek, a w każdym klastrze wyrównanych pików zastępuje ich masy pojedynczą średnią masą ważoną intensywnością, podczas gdy ich obfitość w każdym pliku danych pozostaje nietknięta. Reprezentatywne masy wyrównanych klastrów pików i poszczególnych intensywności pików są przechowywane w głównej bazie danych skanowania. Baza danych skanowania głównego zawiera wszystkie widma MS1 i MS2 wygenerowane dla wszystkich próbek w partii i może być dekonwoluowana do identyfikacji lipidów za pomocą zapytań napisanych w języku zapytań o fragmentację molekularną (MFQL).

Ogólnie rzecz biorąc, metoda obejmuje identyfikację lipidów DAG, TAG i SE w oparciu o tryb dodatni oraz lipidów PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC i LPE w oparciu o akwizycję w trybie ujemnym. Podczas identyfikacji lipidów przeprowadzana jest korekcja izotopowa dla MS1 i MS2, a dostosowane intensywności są podawane w pliku wyjściowym .xlsx. Alternatywnie dostępnych jest kilka innych programów do przetwarzania danych ze strzelby, takich jak ALEX45 i LipidHunter46.

Kwasy tłuszczowe - główne składniki błony jądrowej i komórkowej - są przechowywane w postaci fosfolipidów do dalszej konwersji w cząsteczki bioaktywne. Mogą być przekształcane przez enzymy acylotransferazy lizofosfolipidowej w lizofosfolipidy przez szlak Lands47. Na przykład wiadomo, że enzym LPCAT3 wykazuje wysoką specyficzność w włączaniu AA do produktów pośrednich lizofosfatydylocholiny i lizofosfatydyloseryny. Stosunkowo wysoką ekspresję tych enzymów odnotowano w komórkach zapalnych, takich jak makrofagi pęcherzykowe i komórki nabłonka oskrzeli47, co prowadzi do uwolnienia większych względnych proporcji fosfolipidów zawierających AA w tych komórkach. Jednak po ich uwolnieniu od fosfolipidów błonowych przez fosfolipazę A2, przekształcenie PUFA w różne typy mediatorów lipidowych jest katalizowane przez wiele enzymów48. Co więcej, te PUFA mogą stać się substratem do produkcji prozapalnych i przeciwzapalnych prostaglandyn poprzez działanie enzymów cyklooksygenazy (COX)-1 i COX-247. Fosfolipidy są jednym ze źródeł mediatorów lipidowych uwalnianych w określonych miejscach, w których mediatory te są wymagane do wykazania swoich efektów biologicznych.

Płuco jest złożonym narządem składającym się z wielu typów komórek, z których każdy odgrywa nakładające się na siebie i niszowe role w ułatwianiu prawidłowego rozwoju i funkcji płuc. Przeprowadzono tylko kilka badań w celu wyizolowania i profilowania różnych typów komórek w płucach myszy lub człowieka (np. komórki pęcherzyków płucnych typu 2)49,50; Inne główne typy komórek płuc nie zostały scharakteryzowane. Inne interesujące badanie51 przeprowadzono w celu wyizolowania i przeprowadzenia analizy lipidów śródbłonka, nabłonka, mezenchymalnych i mieszanych komórek odpornościowych w płucach myszy. Zaobserwowano, że stężenie PUFA wchodzących w skład PCO i PG zostało wzbogacone w komórkach odpornościowych. Biorąc pod uwagę fakt, że CS indukuje wzrost komórek odpornościowych w płucach (4-5 razy), co oceniano za pomocą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)52, całkowite zmiany lipidowe zaobserwowane w tym badaniu można wytłumaczyć skumulowanym wzrostem rekrutacji komórek odpornościowych w płucach myszy.

Podsumowując, obserwowane zniekształcenie jednonienasyconych kwasów tłuszczowych i PUFA zawartych w fosfolipidach może odzwierciedlać nadmiar niektórych FA w komórce i/lub stanowić wewnątrzkomórkowy zasób prekursorów oksylipiny, które są nadprodukowane w warunkach stresu oksydacyjnego i zapalnego. Jednak dodatkowe dane dotyczące wolnych EPA, DHA i innych oksylipiny są niezbędne do wyjaśnienia tej kwestii i wykraczają poza zakres obecnego zastosowania metody.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Philip Morris International. Philip Morris International jest jedynym źródłem finansowania i sponsorem tego projektu.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować zespołowi badawczemu, a szczególnie podziękować za pomoc techniczną i wsparcie zespołów biobadań i aerozoli w PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapur, oraz PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Szwajcaria. Autorzy dziękują Samowi Ansariemu za zarządzanie biobankiem i dziękują za wsparcie Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy za redakcję szkicu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki samoblokujące 1, 5 i 2 mlEppendorf30120086, 30120094
3 mm nierdzewne koraliki niegazowaneQiagen69997
4.1 µ m chip dyszyAdvionHD-D-384
Kwas octowySigma Aldrich45754-100ML-F
Octan amonuHoneywell14267-25G
Wodorowęglan amonuSigmaAldrich 09830-500G
Wzorcowa albumina surowicy bydlęcej, 2 mg/mlThermo Scientific  23209
ButanolHoneywell33065-2,5L
ChloroformSigma Aldrich650498-1L
DichlorometanHoneywell34856-1L
Octan etyluHoneywell33211
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytkiSigmaM9686
HeptanSigma Aldrich34873-2.5L
IsopropanolFisher ScientificA461
MetanolFisher ScientificA456
Mysz z pulą osoczaMysz BioIvt
SPLASH standardAvanti Polar Lipids330710XWzorzec wewnętrzny
Nunc 96-płaskie dno przezroczyste płytkiVWR62409-068
Plastikowa szpatułkaSigmaZ560049-300EA
Szybki start Bradford 1x Odczynnik barwnikowyBioRad5000205
Rozcieńczalnik do surowicySigma AldrichD5197
Sprzęt/oprogramowanie
CryoPrep CP02 instrument udarowyCovaris   Młotek magnetyczny
Wirówka 5427REppendorf.   wirówka
ChipSoft 8.3Advion Biosciences.   Oprogramowanie do konfiguracji metody i akwizycji na robocie Triversa nanomate
LipidXplorer 1.2.8.1Nie dotyczy.   Oprogramowanie do identyfikacji lipidów
Spektrum pik popikuSwiss.   Program do konwersji .raw danych z formatu MS do .mzml
ProteoWizardProteoWizard.   Alternatywne (open source) oprogramowanie do konwersji danych .raw z formatu MS na .mzml
Q-Exactive MSThermo Fisher.   Spektrometr masowy orbitrap o wysokiej rozdzielczości
Qiagen Tissue Lyser IIQiagen.   Lizer tkankowy
SpeedVac SPD140DDAThermo Fisher.   Koncentrator próżni
Tecan Infinite M nano plusTecan.   Czytnik płytek
Mieszalnik ThermoMixer CEppendorf.   Mieszalnik termiczny
TriVersa NanomateAdvion Biosciences.   Nanoźródło naparu bezpośredniego
Xcalibur 4.3Thermo Scientific.   Oprogramowanie do ustawiania metody i akwizycji w Q-Exactive MS

Bibliografia

  1. Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893(2021).
  2. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
  3. Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
  4. Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
  5. Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
  6. Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681(2017).
  7. Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
  8. Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
  9. Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
  10. Talikka, M., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. Lyubimov, A., et al. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2016).
  11. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  12. Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
  13. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  14. Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
  15. Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
  18. Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
  19. Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68(2013).
  20. Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
  21. Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
  22. Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
  23. Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
  24. Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364(2021).
  25. Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
  26. R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing. , Available from: https://www.R-project.org/ (2018).
  27. Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
  28. Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
  29. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
  30. Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
  31. Nagan, N., Zoeller, R. A. Plasmalogens: Biosynthesis and functions. Progress in Lipid Research. 40 (3), 199-229 (2001).
  32. Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
  33. Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
  34. Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
  35. Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
  36. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  37. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  38. Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688(2016).
  39. Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
  40. Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
  41. Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753(2020).
  42. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  43. Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
  44. Lipidomics Standards Initiative Consortium. Lipidomics needs more standardization. Nature Metabolism. 1 (8), 745-747 (2019).
  45. Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736(2013).
  46. Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
  47. Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
  48. Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
  49. Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
  50. Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
  51. Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455(2018).
  52. Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ilościowe oznaczanie lipidówspektrometria masekstrakcja lipidówbezpośredni wtryskstandardy wewnętrzneklasy lipidówidentyfikacja biomarkerówskład kwasów tłuszczowych
Lipidomika tkanek gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.