Wykorzystanie niskiego napięcia tlenu do redukcji komórek krwiotwórczych w hodowlach komórek zrębowych szpiku kostnego myszy

Podsumowanie

Rutynowa hodowla komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) prowadzi do izolacji heterogenicznych populacji komórek, z których wiele jest pochodzenia krwiotwórczego. W tym miejscu opisujemy metodę, która wykorzystuje niskie ciśnienie tlenu w celu znacznego zmniejszenia zanieczyszczeń krwiotwórczych w mysich hodowlach BMSC.

Streszczenie

Obecnie nadal brakuje powszechnie akceptowanych markerów do prospektywnego izolowania jednorodnej populacji szkieletowych komórek macierzystych (SSC). Z tego powodu BMSC, które wspierają hematopoezę i przyczyniają się do wszystkich funkcji szkieletu, są nadal szeroko stosowane do badania multipotencjalnych mezenchymalnych komórek progenitorowych (MMP) i wnioskowania o funkcji SSC. Co więcej, biorąc pod uwagę szeroki zakres transgenicznych modeli mysich wykorzystywanych do badania chorób układu mięśniowo-szkieletowego, zastosowanie BMSC służy również jako potężne narzędzie do badania mechanizmów molekularnych regulujących MMP i SSC. Jednak powszechne procedury izolacji mysich BMSC powodują, że ponad 50% odzyskanych komórek jest pochodzenia krwiotwórczego, co potencjalnie utrudnia interpretację danych wygenerowanych podczas tych badań. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą niskie ciśnienie tlenu lub hipoksję do selektywnej eliminacji komórek CD45 ⁺ w kulturach BMSC. Co ważne, metodę tę można łatwo wdrożyć nie tylko w celu zmniejszenia zanieczyszczeń krwiotwórczych, ale także w celu zwiększenia odsetka MMP i domniemanych SSC w kulturach BMSC.

Wprowadzenie

Podobnie jak hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), SSC znajdują się w mikrośrodowisku kostnym; jednakże, w przeciwieństwie do HSC, obecnie brakuje powszechnie akceptowanych markerów powierzchni komórek, które można by użyć do prospektywnej identyfikacji SSC1^,2,3. Jednak systemy hodowli in vitro i testy rekonstytucji in vivo pokazują, że część BMSC ma zdolność do wspierania hematopoezy, a także zdolność do różnicowania się we wszystkie komórki linii mezenchymalnych^4,5. Tak więc, podczas gdy BMSC reprezentują wysoce niejednorodną populację, część tych komórek ma cechy komórek macierzystych w dobrej wierze, zdefiniowanych przez ich zdolność do samoodnawiania się i odtwarzania wszystkich komórek w tkance, z której pochodzą. Co więcej, w przeciwieństwie do stosowania markerów powierzchni komórek, BMSC można szybko wyizolować na podstawie ich szybkiego przylegania do hodowli tkankowej plastic^6,7. Z tych powodów BMSC są często używane jako substytut SSCs⁵.

Podczas gdy preferencyjne stosowanie plastiku do hodowli tkankowej (TC) zostało wykorzystane do skutecznego izolowania BMSC od tkanek ludzkich, modele mysie stanowią dodatkowe wyzwanie dla tej metody. Przede wszystkim, ponieważ mysie komórki krwiotwórcze mają zdolność przylegania zarówno do plastiku TC, jak i do BMSC, w tym systemie modelowym występuje wysokie zanieczyszczenie krwiotwórcze, co utrudnia interpretację danych wygenerowanych przy użyciu tej metody izolacji⁶.

Warto zauważyć, że BMSC znajdują się w mikrośrodowisku kostnym, gdzie napięcie tlenu waha się od 1%-4%⁸. Jednak w standardowych warunkach hodowli tkankowej inkubatory do hodowli komórkowych są utrzymywane na poziomie tlenu atmosferycznego 21%, co odpowiada poziomom suprafizjologicznym. Podkreślając funkcjonalne znaczenie tych różnic, hodowla komórek pochodzenia mezenchymalnego przy zawartości tlenu 21% wiąże się ze zwiększoną śmiercią komórki^9,10. Co więcej, wykazaliśmy niedawno, że komórki hematologiczne i mezenchymalne różnie reagują na niskie napięcia tlenowe. W szczególności obserwuje się znaczny spadek liczby komórek krwiotwórczych CD45 ⁺, gdy hodowle BMSC są utrzymywane przy niskim napięciu tlenu. Rzeczywiście, zauważyliśmy 90% redukcję komórek krwiotwórczych CD45⁺ przy użyciu tej techniki¹¹.

Tutaj udostępniamy protokół, który można łatwo wdrożyć w laboratoriach, aby znacznie zmniejszyć zanieczyszczenie hematopoetyczne i poprawić czystość komórek mezenchymalnych podczas rutynowej hodowli BMSC.

Protokół

Wszystkie opisane metody z wykorzystaniem mysich modeli zostały wykonane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (A187-19-08).

1. Sekcja kości kończyn tylnych

1. Eutanazja 10-12-tygodniowego samca lub samicy myszy C57BL / 6 przez uduszenie CO₂ przy użyciu szybkości przepływu 2-4 l / min, a następnie potwierdzenie śmierci przez ścięcie. W tym teście można użyć zarówno samic, jak i samców myszy bez oczekiwanych różnic w wynikach. Spryskaj futro 70% etanolem.
2. Użyj sterylnych kleszczy chirurgicznych i nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w skórze pod mostkiem. Użyj rąk, aby rozerwać skórę na obwodzie ciała, a następnie pociągnij skórę dystalnie w kierunku kończyn tylnych, aby odsłonić leżącą pod spodem tkankę.
3. Użyj wysterylizowanych kleszczy chirurgicznych i nożyczek, aby delikatnie usunąć tylną kończynę, oddzielając głowę kości udowej (kulkę) od panewki (panewki) miednicy (biodra). Użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby delikatnie zeskrobać wzdłuż kości, aby usunąć jak najwięcej tkanki miękkiej.
4. Użyj sterylnego skalpela, aby oddzielić kość udową i piszczelową, używając minimalnego oporu, aby przeciąć więzadła (boczne i przyśrodkowe boczne, krzyżowe przednie i tylne oraz ścięgno rzepki [więzadło]) łączące dwie kości. Co ważne, po oddzieleniu należy zachować kłykcie zarówno na dystalnej części kości udowej, jak i bliższej kości piszczelowej w stanie nienaruszonym.
5. W przypadku dystalnych kości udowych wykonaj cięcie między głową kości udowej a trzecim krętarzem oraz nacięcie w nasadzie proksymalnie do płytki wzrostowej, minimalizując uszkodzenie płytki wzrostowej.
6. W przypadku bliższych kości piszczelowych wykonaj jedno cięcie proksymalnie do kostki bocznej i jedno cięcie dystalnie płaskowyżu piszczelowego tuż proksymalnie do płytki wzrostu.
7. Umieść kości udowe i piszczelowe ściętą stroną do dołu w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.

2. Izolacja BMSC od kości udowych i piszczelowych

1. Umieścić 1,5 ml probówek do mikrowirówek w wirówce stołowej i wirować w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 s.
2. Użyj sterylnej pęsety, aby ostrożnie usunąć kości z probówek do mikrowirówki, pozostawiając czerwoną zatyczkę szpiku kostnego na dnie probówki do mikrowirówki. Jeśli w trzonie kości pozostała trochę szpiku, przenieś kość do nowej probówki, powtórz szybkie wirowanie i połącz granulki w jednej probówce podczas ponownego zawieszania Krok 2.3.
3. Za pomocą pipety P1000 delikatnie zawiesić osad szpiku kostnego w 500 μl pożywki wzrostowej, MEMa uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą i 1000 U/ml penicyliny-streptomycyny. Przenieś komórki zrębu szpiku kostnego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4,5 ml pożywki wzrostowej.

3. Liza czerwonych krwinek

1. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać pożywkę wzrostową i delikatnie zawiesić osad w 1,5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych.
2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 75-90 s. Natychmiast ugasić 10 ml pożywki wzrostowej.
3. Wirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zassać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki wzrostowej w celu liczenia (patrz krok 4).
   UWAGA: Osad komórkowy nie powinien być już czerwony, ale biały, co wskazuje na pomyślną lizę czerwonych krwinek. Jeśli osad jest nadal czerwony, można wykonać dodatkową rundę buforu do lizy krwinek czerwonych.

4. Poszycie BMSC

1. Aby policzyć żywe komórki do posiewu, należy usunąć 10 μl zawiesiny komórek i dodać do 10 μl roztworu błękitu trypanowego.
2. Umieścić 10 μl mieszaniny roztworu błękitu trypanowego komórki na hemocytometrze i policzyć żywe (nieniebieskie) komórki. Większość komórek powinna wykluczać błękit trypanowy.
3. W przypadku testów kolonii należy umieścić komórki o gęstości 60 000 komórek/^cm2 w kolbach do hodowli tkankowych T-25^cm2. W przypadku kultur BMSC o dużej gęstości należy umieścić komórki o gęstości 130 000 komórek/^cm2 w naczyniach do hodowli tkankowych o średnicy 100^mm2. Użyć całkowitej objętości 5 ml dla kolb T-25 cm² i całkowitej objętości 10 ml dla szalek 100 cm².
4. Inkubować komórki przez 3 godziny w temperaturze 1%-2% (hipoksja) lub 21% tlenu (normoksja) i 5%_CO2. Do rutynowej hodowli BMSC przy niskim napięciu tlenu można użyć inkubatora komórek hipoksyjnych lub komory do hipoksji. Ustaw każdy przyrząd zgodnie z instrukcjami producenta tak, aby przepływ gazu azotu i dwutlenku węgla spowodował pożądany zakres tlenu i CO₂ .
5. Po 3 godzinach ostrożnie opłucz płytki 3x 1x PBS. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, które zaczęły się przyczepiać, delikatnie spłucz, spowalniając zasysanie i pipetowanie na bok szalek do hodowli tkankowych.
6. Po ostatnim płukaniu 1x PBS, zastąp PBS 10 ml pożywki wzrostowej, jeśli używasz 100 cm² szalek lub 5 ml pożywki wzrostowej, jeśli używasz kolb T-25 cm. Po spłukaniu większość pływających komórek należy usunąć.

5. Utrzymanie BMSC w warunkach niedotlenienia

1. W przypadku kultur niedotlenionych należy utrzymywać komórki w komorze do hipoksji lub inkubatorze ustawionym na 1%-2%_O2 i 5% CO_{2 .} W przypadku kultur normoksycznych utrzymuj komórki na poziomie 21%_O2 i 5% CO_{2 .} W przypadku korzystania z inkubatora do hipoksyji należy upewnić się, że drzwi są otwarte w minimalnym stopniu, aby zapobiec napływowi tlenu atmosferycznego (21%). Zmieniaj nośnik co 2-3 dni.
2. W przypadku testów kolonii należy inkubować komórki przez 7-10 dni, po czym należy zliczyć kolonie lub rozpocząć różnicowanie lub inne pożądane testy. W warunkach niedotlenienia można spodziewać się od 50 do 120 kolonii, podczas gdy w warunkach normoksyjnych można spodziewać się od 5 do 30 kolonii.
3. W przypadku kultur BMSC o dużej gęstości inkubuj komórki aż do zlewania się, około 7-10 dni w przypadku kultur niedotlenionych i około 14-21 dni w przypadku kultur normoksyjnych. Po zlaniu się trypsynizuj komórki 0,25% trypsyny do użycia w pożądanych testach.
4. Aby uwidocznić komórki, umieść naczynie do hodowli tkankowej na stoliku, obróć obiektyw fazowy do ścieżki optycznej i upewnij się, że suwak kontrastu fazowego jest wybrany dla odpowiedniego obiektywu. Przeglądaj komórki w powiększeniu 100x lub 200x.

Wyniki

Po 7 dniach izolacji komórek, komórki hodowane przy 21% tlenie są wysoce heterogeniczne. W szczególności występuje duża zmienność rozmiarów, gdzie większe komórki bipolarne przeplatają się z mniejszymi komórkami posiadającymi liczne wypustki (Rycina 1A). W przeciwieństwie do nich, komórki hodowane w warunkach hipoksji są wysoce homogeniczne. Komórki w obrębie kolonii są stosunkowo podobne pod względem rozmiaru i mają wygląd bipolarny, przypominający inne komórki pochodzenia mezenchymalnego h...

Dyskusja

Z naszych obserwacji wynika, że BMSC przylegają do plastiku hodowli tkankowej wcześniej niż makrofagi i inne komórki pochodzenia krwiotwórczego¹¹. Z tego powodu płukanie płytek 3 godziny po posiewie jest krytycznym krokiem, ponieważ usuwa pływające komórki krwiotwórcze, które mogą przyłączyć się do późniejszych punktów czasowych. Co więcej, płukanie to powinno być wykonywane ostrożnie, w szczególności poprzez pipetowanie pożywki na bok naczynia, aby zapobiec przerwaniu luźno przymocowanych, zaokrą...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100mm2 Naczynia do hodowli tkankowych	Corning	353003
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	100010-023
Hemocytometr Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	Jackson Laboratory	664
HyClone Płodowa surowica bydlęca (USA), scharakteryzowana	GE Healthcare Life Nauki	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nukleozydy	Gibco	12571-063
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)	Gibco	15140-122
Bufor lizujący czerwone krwinki Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  kolby do hodowli tkankowych	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Gibco	25200-056