Artykuł metodologiczny

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63729

⸱

20 lipca 2022

 , 
1Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III CNIC, 2Centro de Investigaciones Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento, Saludable-CIBERFES

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Streszczenie

Pule ubichinonu (CoQ) w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (IMM) są częściowo podzielone na enzymy zależne od kompleksu I lub FAD. Taki podział można łatwo ocenić za pomocą testu porównawczego z użyciem NADH lub bursztynianu jako donorów elektronów w mitochondriach mrożonych i rozmrożonych, w których mierzy się redukcję cytochromu c (cyt c). Test opiera się na wpływie Na+ na IMM, zmniejszając jego płynność. W tym miejscu przedstawiamy protokół pomiaru aktywności oksydoreduktazy NADH-cyt c i aktywności oksydoreduktazy bursztynianowo-cyt c w obecności NaCl lub KCl. Reakcje, które polegają na mieszaninie odczynników w kuwecie w sposób stopniowy, są mierzone spektrofotometrycznie przez 4 minuty w obecności Na+ lub K+. Tę samą mieszaninę przeprowadza się równolegle w obecności specyficznych inhibitorów enzymów w celu odjęcia niespecyficznej zmiany absorbancji. Aktywność oksydoreduktazy NADH-cyt c nie zmniejsza się w obecności żadnego z tych kationów. Jednak aktywność oksydoreduktazy bursztynianowo-cyt c zmniejsza się w obecności NaCl. Ten prosty eksperyment podkreśla: 1) wpływ Na+ na zmniejszenie płynności IMM i transferu CoQ; 2) że nadkompleks I+III2 chroni transfer ubichinonu (CoQ) przed wpływem obniżenia płynności IMM; 3) że transfer CoQ między CI i CIII różni się funkcjonalnie od transferu CoQ między CII i CIII. Fakty te potwierdzają istnienie funkcjonalnie zróżnicowanych pul CoQ w IMM i pokazują, że mogą być regulowane przez zmieniające się środowisko Na+ mitochondriów.

Wprowadzenie

Mitochondrialny system fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) jest głównym szlakiem napędzającym syntezę trifosforanu adenozyny (ATP), produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i konsumpcję redukujących równoważników, takich jak dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH) lub bursztynian, przez mitochondria. System OXPHOS składa się z pięciu kompleksów białkowych: Kompleks I (CI) utlenia NADH i redukuje CoQ do ubichinolu (CoQH2). Kompleks II (CII) utlenia bursztynian do fumaranu i redukuje CoQ do CoQH2. Kompleks III (CIII) utlenia CoQH2 z powrotem do CoQ, redukując cytochrom c (cyt c). Wreszcie kompleks IV (CIV) utlenia cyt c i redukuje tlen do wody. Ten łańcuch oksydoredukcyjny, tak zwany łańcuch transportu elektronów (mETC), jest sprzężony z pompowaniem H+ przez IMM, co tworzy gradient elektrochemiczny wykorzystywany przez kompleks V (CV) do fosforylacji difosforanu adenozyny (ADP) do ATP.

mETC kompleksy mogą być albo same w IMM, albo łączyć się w czwartorzędowe struktury zwane superkompleksami. CIV może łączyć się z CIII, tworząc III2+IV lub Q-respirasom (ponieważ jest w stanie oddychać w obecności CoQH2)1,2,3 lub tworząc homodimery lub homooligomery4. CIII może wchodzić w interakcje z CI, tworząc superkompleks I+III25. Wreszcie, CI jest również w stanie wchodzić w interakcje z Q-respirasomem, budując I+III2+IV lub N-respirasom (ponieważ może oddychać, zużywając NADH)1,6,7,8,9,10.

CoQ i cyt c są mobilnymi nośnikami elektronów odpowiedzialnymi za przenoszenie elektronów z CI/CII do CIII i z CIII do CIV, odpowiednio. To, czy superkompleksy nakładają funkcjonalne lokalne ograniczenie dla tych nośników, było przedmiotem intensywnej debaty w ciągu ostatnich dwóch dekad2,7,11,12,13,14,15,16,17. Jednak kilka niezależnych grup wykazało, że CoQ i cyt c mogą być funkcjonalnie podzielone na pule w IMM. Jeśli chodzi o CoQ, można go funkcjonalnie podzielić na określoną pulę CoQ dla CI (CoQNAD) i inną pulę dedykowaną enzymom zależnym odFAD (CoQ FAD)1,7,12,18,19. Jednakże, aby zróżnicować istnienie częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ, wymagana była nadekspresja alternatywnej oksydazy (AOX) i generowanie specyficznych mutantów mtDNA, które mogą składać CI przy braku CIII1,19,20.

Mechanizm produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) podczas niedotlenienia był do niedawna nieznany. Po ostrym niedotlenieniu CI ulega przemianie aktywny/dezaktywny (A/D), która polega na zmniejszeniu aktywności oksydoreduktazy NADH-CoQ pompującej H+. Taki spadek pompowania H+ zakwasza macierz mitochondrialną i częściowo rozpuszcza osady wapniowo-fosforanowe w macierzy mitochondrialnej, uwalniając rozpuszczalny Ca2+. Ten wzrost rozpuszczalnego Ca2+ aktywuje wymiennik Na+/Ca2+ (NCLX), który wytłacza Ca2+ w zamian za Na+. Wzrost mitochondrialnego Na+ oddziałuje z fosfolipidami po wewnętrznej stronie IMM, zmniejszając jego płynność i transfer CoQ między CII i CIII, ostatecznie wytwarzając anion ponadtlenkowy, sygnał redoks21. Co ciekawe, transfer CoQ był zmniejszony tylko między CII i CIII, ale nie między CI i CIII, podkreślając, że 1) Na+ był w stanie modulować tylko jedną z istniejących pul CoQ w mitochondriach; 2) w IMM istnieją funkcjonalnie zróżnicowane pule CoQ. W związku z tym szeroko stosowany protokół do badania aktywności enzymów mitochondrialnych może być wykorzystany do oceny istnienia wspomnianych pul CoQ.

Obecny protokół opiera się na pomiarze redukcji utlenionego cyt c, substratu CIII, przez absorbancję w obecności bursztynianu (tj. substratu CII) lub NADH (tj. substratu CI). Ta sama próbka jest dzielona na dwie, z których jedna zostanie potraktowana KCl, a druga o tym samym stężeniu NaCl. W ten sposób, biorąc pod uwagę, że Na+ zmniejsza płynność IMM, gdyby CoQ istniało w unikalnej puli w IMM, zarówno CI+CIII, jak i CII+CIII zmniejszyłyby się w obecności Na+. Gdyby jednak CoQ istniał w częściowo segmentowanych funkcjonalnych pulach CoQ, wpływ Na+ byłby w większości (lub tylko) widoczny na aktywność CII+CIII, ale nie na CI+CIII. Jak ostatnio opublikowano21, Na+ wpływa tylko na transfer CoQ między CII i CIII (Rysunek 1C,D), ale nie między CI a CIII (Rysunek 1A,B).

Ten protokół, wraz z całym wachlarzem technik, został wykorzystany do potwierdzenia istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ w IMM, jednej dedykowanej CI (tj. CoQNAD), a drugiej dedykowanej enzymom powiązanym zFAD (np. CoQ FAD)1,3,7; obserwacja, która, choć nadal jest dyskutowana22, zostało potwierdzone niezależnie przez kilka grup7,19. Tak więc superorganizacja CI w superkompleksy wpływa na lokalną mobilność CoQ, ułatwiając jego wykorzystanie przez CIII w ramach superkompleksu1,7,13,14,23,24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Hiszpania, zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej z 22 września 2010 roku (2010/63/UE) oraz z hiszpańskim dekretem królewskim z 1 lutego 2013 roku (53/2013). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie.

UWAGA: Ten test porównawczy do badania segmentacji mitochondrialnych pul CoQ jest opisany w następujący sposób:

1. Kwantyfikacja białka

  1. Zamroź i rozmroź wyizolowane mitochondria26 z wątroby myszy typu dzikiego trzy razy (tj. błony mitochondrialne) przed eksperymentami, aby organelle były przepuszczalne dla substratów reakcyjnych.
  2. Określić ilościowo ilość białka w izolowanej próbce mitochondriów metodami Bradforda lub kwasu bicunchoninowego (BCA). W przypadku odczynnika Bradford dodać 2 μl próbki do 1 ml 1x odczynnika Bradford.
  3. Podzielić próbkę na cztery podpróbki o masie 20 μg każda (mianowicie: A, B, C, D; Rysunek 2A).

2. Pomiar aktywności CI+CIII

UWAGA: Ta część protokołu wykorzystuje próbki A i B do pomiaru aktywności CI+CIII (Rysunek 2B).

  1. Próbki A i B należy podzielić na dwie podpróbki o masie 10 μg każda (tj. A1, A2, B1 i B2). Wymieszać każdą z podpróbek w kuwecie o pojemności 1 ml z 30 μl cyt c (10 mg/ml), 10 μl 100 mM malonianu i dodać podgrzany bufor C1/C2 (tabela 1) w temperaturze 37 °C do 980 μl (979 μl dla kuwet A2 i B2).
    UWAGA: Ten etap wiąże się z użyciem toksycznych odczynników malonianu i cyjanku potasu.
    UWAGA: cyt c (10 mg/ml) musi być przygotowany na świeżo, mieszając 10 mg cyt c w 1 ml 10 mM K2HPO4 roztworu, pH dostosowanym do 7,2 i musi być utrzymywany w lodzie przez cały czas trwania doświadczenia.
  2. Dodać 10 μl 1 M KCl do kuwet A1 i A2 i dodać 10 μl 1 M NaCl do kuwet B1 i B2.
  3. Dodać 1 μl 1 mM rotenonu do kuwety zawierającej podpróbki A2 i B2.
    UWAGA: Ten krok wiąże się z użyciem toksycznego odczynnika rotenonu.
  4. Tuż przed pomiarem dodaj 10 μl NADH (10 mM) do wszystkich kuwet.
    UWAGA: 10 μl najlepiej dodać na etapie kuwety, aby reakcja rozpoczęła się po wymieszaniu.
  5. Wymieszaj kuwetę, ostrożnie obracając ją trzy razy. Umieścić go w czytniku kuwet absorbancji (spektrofotometr UV/VISJASCO).
  6. Kliknij Pomiar parametrów > > Ogólne i ustaw parametry pomiaru na Długość fali: 550 nm i Czas: 4 minuty odczytu; naciśnij przyciski Akceptuj i Start, aby rozpocząć eksperyment.
  7. Na końcu pomiaru zapisz nachylenie obejmujące liniowy wzrost absorbancji, klikając Plik i Zapisz jako. Nachylenie można również zbierać ręcznie.

3. Pomiar aktywności CII+CIII

UWAGA: Ta część protokołu wykorzystuje próbki C i D do pomiaru aktywności CII+CIII (Rysunek 2C).

  1. Podzielić próbki C i D na dwie podpróbki o masie 10 μg każda (mianowicie C1, C2, D1 i D2). Wymieszać każdą z podpróbek w kuwecie o pojemności 1 ml z 30 μl cyt c (10 mg/ml), 1 μl 1 mM rotenonu i dodać podgrzany bufor C1/C2 w temperaturze 37 °C do 980 μl (970 μl dla kuwet C2 i D2).
    UWAGA: Ten etap obejmuje użycie toksycznych odczynników cyjanku potasu i rotenonu.
    UWAGA: cyt c (10 mg/ml) musi być przygotowany na świeżo, mieszając 10 mg cyt c w 1 ml 10 mM K2HPO4 roztworu, pH dostosowanym do 7,2 i musi być utrzymywany w lodzie przez cały czas trwania doświadczenia.
  2. Dodać 10 μl 1 M KCl do kuwet C1 i C2 i dodać 10 μl 1 M NaCl do kuwet D1 i D2.
  3. Dodać 1 μl 1 mM antymycyny A do kuwety zawierającej podpróbki C2 i D2.
    UWAGA: Ten krok wiąże się z użyciem toksycznego odczynnika antymycyny A.
  4. Bezpośrednio przed pomiarem dodaj 10 μl bursztynianu (1 M) do wszystkich kuwet.
    UWAGA: 10 μl najlepiej dodać na etapie kuwety, aby reakcja rozpoczęła się po wymieszaniu.
  5. Dokładnie wymieszaj kuwetę, obracając ją trzy razy. Umieścić go w czytniku kuwety absorbancji (spektrofotometr UV/VIS).
  6. Kliknij Pomiar parametrów > > Ogólne i ustaw parametry pomiaru na Długość fali: 550 nm i Czas: 4 minuty odczytu; naciśnij przyciski Akceptuj i Start, aby rozpocząć eksperyment.
  7. Na końcu pomiaru zapisz nachylenie obejmujące liniowy wzrost absorbancji, klikając Plik i Zapisz jako. Nachylenie można również zbierać ręcznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowe wyniki uzyskane przy zastosowaniu tego protokołu przedstawiono poniżej (Rysunek 3). Ponieważ absorbancja zredukowanego cytochromu c występuje przy 50 nm, wszystkie niehamowane podpróbki muszą wykazywać wzrost absorbancji przy 550 nm. Podpróbki poddane hamowaniu powinny w Ideally wykazywać linię płaską lub lekko rosnący nachylenie (Rysunek 3). Nachylenia uzyskanie z podpróbek hamowanych należy odjąć od nachyleń podpróbek niehamowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż protokół ten stanowi bardzo prostą procedurę identyfikacji istnienia częściowo podzielonych pul CoQ, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Substraty (tj. NADH lub bursztynian) najlepiej dodawać na końcu, ponieważ może dojść do autooksydacji tych związków. Odwracanie kuwety musi być ostrożne, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, które mogą zakłócać odczyt.

Ponadto obecna technika ma kilka ograniczeń, o których warto wspomnieć. Pomiary nie są wykonywane w nienaruszonych mito...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez i E. R. Martínez-Jimenez za pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez MICIN: RTI2018-099357-B-I00 i HFSP (RGP0016/2018). CNIC jest wspierany przez Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) oraz Fundację Pro CNIC i jest Centrum Doskonałości Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Rysunek 2 utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antymycyna ASigma-AldrichA8674
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Test białka Sigma-Aldrich10775835001
BradfordBio-Rad5000001
Cytochrom c z serca koniSigma-AldrichC7752
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KClSigma-AldrichP3911
Kwas malonowySigma-AldrichM1296
MgCl2Sigma-AldrichM8266
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
Cyjanek potasuSigma-Aldrich207810
RotenoneSigma-AldrichR8875
Oprogramowanie Spectra ManagerJASCOwersja 2
SpektrofotometrUV/VISJASCO
SuccinateSigma-Aldrich398055

Bibliografia

  1. Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
  2. Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).
  3. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  4. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  5. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
  6. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  7. Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
  8. Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
  9. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
  10. Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290(2016).
  11. Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).
  12. Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).
  13. Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
  14. Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
  15. Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
  16. Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
  17. Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
  18. Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).
  19. Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).
  20. Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
  21. Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
  22. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
  23. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  24. Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
  25. Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
  26. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  27. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  28. den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).
  29. Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
  30. Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
  31. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).
  32. Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
  33. Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wra liwo na s dredukcja cytochromu caktywno NADH oksydoreduktazyaktywno bursztynian oksydoreduktazyanaliza spektrofotometrycznaaktywno kompleksu Iaktywno kompleksu IImitochondrialny transport elektron w

Powiązane artykuły