Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Summary

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Abstract

Zastosowano kilka technik do bezpośredniej wizualizacji włókien cytoszkieletu i związanych z nimi białek. Mikroskopia TIRF (Total internal-reflection-fluorescence) ma wysoki stosunek sygnału do tła, ale cierpi z powodu fotowybielania i fotouszkodzenia białek fluorescencyjnych. Techniki bezznacznikowe, takie jak mikroskopia interferencyjna i refleksyjna (IRM) i interferometryczna mikroskopia rozpraszania (iSCAT), omijają problem fotowybielania, ale nie są w stanie łatwo uwidocznić pojedynczych cząsteczek. W artykule przedstawiono protokół łączenia IRM z komercyjnym mikroskopem TIRF do jednoczesnego obrazowania białek związanych z mikrotubulami (MAP) i dynamicznych mikrotubul in vitro. Protokół ten pozwala na szybką obserwację MAP oddziałujących z dynamicznymi mikrotubulami. Stanowi to ulepszenie istniejących dwukolorowych konfiguracji TIRF, eliminując zarówno potrzebę znakowania mikrotubul, jak i potrzebę stosowania kilku dodatkowych komponentów optycznych, takich jak drugi laser wzbudzający. Oba kanały są obrazowane na tym samym chipie kamery, aby uniknąć problemów z rejestracją obrazu i synchronizacją klatek. Ten układ jest demonstrowany poprzez wizualizację pojedynczych cząsteczek kinezyny chodzących po dynamicznych mikrotubulach.

Introduction

Mikroskopia TIRF (Total-internal-reflection-fluorescence) jest powszechnie stosowana do wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. W porównaniu z obrazowaniem epifluorescencyjnym, TIRF osiąga lepszą supresję tła, umożliwiając lokalizację i śledzenie pojedynczych fluoroforów w wysokiej rozdzielczości. Z tego powodu TIRF jest preferowaną metodą wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie białek związanych z mikrotubulami i jest często używana do obrazowania mikrotubul^1,2.

Aby zbadać regulację dynamiki mikrotubul przez MAP, często konieczne jest jednoczesne obrazowanie zarówno mikrotubul, jak i MAP. Większość istniejących metod do tego celu jest kosztowna lub ma wady techniczne. Na przykład jednoczesny dwukolorowy TIRF wymaga dwóch laserów wzbudzających i dwóch kamer. Oprócz wysokich kosztów, konieczność stosowania oddzielnych kamer stwarza problemy z synchronizacją klatek i rejestracją obrazu. Tę potrzebę można obejść, jeśli obracająca się kostka filtrująca jest używana do fizycznego przełączania między laserami wzbudzenia w kolejnych klatkach³. W takiej konfiguracji można użyć pojedynczego układu kamery, a klatki naprzemiennie zmieniają się między obrazami mikrotubul i MAP. Ta technika jest jednak ograniczona przez szybkość wymiany filtra, która zazwyczaj ogranicza liczbę klatek na sekundę do mniej niż 0,5 klatki na sekundę³ (fps). Taka liczba klatek na sekundę jest niewystarczająca do rozwiązania szybkich procesów dynamicznych, takich jak kurczenie się mikrotubuli zachodzące z prędkością do 500 nm/s, chodzenie kinezyny z prędkością rzędu 800 nm/s, czy dyfuzja MAP zachodząca ze współczynnikami dyfuzji przekraczającymi 0,3 μm²/s⁴. Jest to szczególnie problematyczne podczas śledzenia względnych pozycji dwóch ruchomych celów w każdym kanale, takich jak położenie MAP względem położenia ruchomej końcówki mikrotubul⁵.

Oprócz tych ograniczeń optycznych, dwukolorowa mikroskopia TIRF wymaga, aby MAP i mikrotubule były oznaczone różnymi fluoroforami, których widma emisyjne są wystarczająco oddzielone. Fluorescencyjne znakowanie tubuliny może zmienić dynamikę mikrotubul⁶, a fotowybielanie fluoroforów ogranicza szybkość obrazowania⁷. Z powodu tych problemów opracowano techniki obrazowania bez znaczników w celu wizualizacji mikrotubul. Należą do nich: interferometryczna mikroskopia rozpraszania (iSCAT)^8,9, mikroskopia rotaccyjno-koherentno-rozpraszająca (ROCS)¹⁰, przestrzenna mikroskopia interferencyjna światła (SLIM)¹¹, oraz mikroskopia interferencyjna (IRM)^12,13. Techniki te umożliwiają szybkie obrazowanie mikrotubul bez znaczników bez wad obrazowania fluorescencyjnego, ale nie można ich używać do wizualizacji pojedynczych MAP.

Spośród tych technik bez etykiet, IRM wyróżnia się niskim kosztem i skromnymi wymaganiami dotyczącymi oprzyrządowania. Niedawno zaprezentowaliśmy protokół łączenia IRM z komercyjnym mikroskopem TIRF, umożliwiający obrazowanie mikrotubul i fluorescencyjnych MAP w naprzemiennych ramkach^3,13. W tym artykule przedstawiono protokół modyfikacji tej konfiguracji w celu jednoczesnego przechwytywania obrazów TIRF i IRM na jednym chipie kamery. Polega to na dodaniu niedrogiego rozdzielacza wiązki na ścieżce wzbudzenia, aby jednocześnie oświetlić próbkę za pomocą lasera TIRF i źródła światła LED IRM. Zmodyfikowany komercyjny rozdzielacz obrazu służy do spektralnego oddzielania sygnałów TIRF i IRM i rzutowania ich na oddzielne połówki tego samego układu kamery. Stosujemy również system mikroprzepływowy, który pozwala na szybką wymianę odczynników podczas obrazowania. Ten protokół opisuje, w jaki sposób ta konfiguracja może być używana do obrazowania dynamicznych mikrotubul i MAP. Możliwości aparatu zostały zademonstrowane poprzez przedstawienie pierwszej wizualizacji białek kinezyny-1 chodzących po kurczących się mikrotubulach, która jest rejestrowana z szybkością 10 klatek na sekundę

.

Protocol

1. Przygotowanie komór przepływowych

UWAGA: Mikroprzepływowe komory przepływowe zostaną zbudowane poprzez przyklejenie mikrokanalików polidimetylosiloksanu (PDMS) do oczyszczonego i funkcjonalizowanego szkła nakrywkowego. Mikrokanaliki zostaną odlane w formie wzorcowej.

1. Przygotowanie kanałów PDMS
   1. Przygotować oczyszczone i/lub funkcjonalizowane szkła nakrywkowe o składzie chemicznym powierzchni odpowiednim do konkretnego obrazowanego testu.
      UWAGA: Do testów ruchliwości kinezyny stosuje się silanizowane szkła nakrywkowe oczyszczone piranią. Są one przygotowywane zgodnie z opisem w Gell et. al.¹ Alternatywnie, prostszą procedurą jest sonikacja szkieł nakrywkowych w izopropanolu, a następnie metanolu przez 3 cykle po 20 minut.
   2. Aby przygotować formę główną, przytnij paski jednostronnej taśmy stacjonarnej do żądanego rozmiaru kanału przepływowego. Przyklej paski do dna 10 cm szalki Petriego, układając je na boki z zachowaniem co najmniej 1 cm odstępu między paskami.
      UWAGA: Jeśli wymagane są dokładne wymiary kanału, forma może być wykonana na płytkach krzemowych za pomocą fotolitografii¹⁴.
   3. Aby przygotować polimer PDMS, należy połączyć utwardzacz i elastomer bazowy w stosunku masowym 1:10. Mieszaj przez 2 min.
      UWAGA: Ten stosunek mieszania można zmieniać, aby dostroić sztywność polimeru. Wyższy stosunek bazy do utwardzacza skutkuje bardziej miękkim polimerem.
   4. Odgazuj mieszaninę w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną.
   5. Wylej mieszaninę na formę wzorcową warstwą o grubości ~0,5 cm, uważając, aby nie tworzyć bąbelków.
   6. Piecz masę w piekarniku nagrzanym do 70 °C przez 40 min.
      UWAGA: Może być wymagany dłuższy czas utwardzania, jeśli blok PDMS jest gruby (>1 cm). Kontynuuj podgrzewanie w odstępach 5-minutowych, aż do całkowitego utwardzenia.
   7. Wytnij strukturalne obszary polimeru. Przebij otwory na każdym końcu kanału za pomocą dziurkacza PDMS.
      UWAGA: W tym protokole średnica otworu jest ustawiona na 0,75 mm i można ją regulować zgodnie z wymaganymi natężeniami przepływu. Kanały PDMS mogą być przechowywane w suchym środowisku przez dłuższy czas, ale należy je wyczyścić przed użyciem.
   8. Oczyść strukturalną stronę bloku PDMS. Użyj taśmy stacjonarnej, aby usunąć duże cząstki. Spłucz izopropanolem, a następnie metanolem. Powtórz te płukania 3 razy, spłucz ultraczystą wodą i wysusz powierzchnię suszarką.
   9. Plazma oczyść PDMS za pomocą tlenu lub plazmy powietrznej.
      UWAGA: W tym protokole używana jest plazma powietrzna o mocy 18 W.
   10. Umieść oczyszczony plazmowo PDMS na odpowiednio oczyszczonej szkle nakrywkowej i podgrzewaj na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 15 min.
       UWAGA: Żywicę epoksydową można nakładać na boki bloku PDMS, aby lepiej przylegać do szkła osłonowego.
   11. Włóż do otworów rurki z polietylenu o niskiej gęstości (LDPE) o odpowiedniej wielkości. Podłącz rurkę wylotową do strzykawki 0.5 ml.
       UWAGA: W tym protokole rurki o średnicy wewnętrznej 0,023 cala są połączone z PDMS za pomocą metalowego adaptera o średnicy zewnętrznej 0,025 cala.
   12. Wlać roztwory do mikrokanalików, zanurzając rurkę wlotową w roztworze i pobierając wymaganą objętość za pomocą strzykawki.

2. Konfiguracja optyczna

1. Modyfikacja mikroskopu (Rysunek 1)
   1. Zmodyfikuj mikroskop TIRF, aby włączyć obrazowanie IRM¹³. Wymień rozdzielacz wiązki 50/50 (Odbicie (R)/Transmisja (T)) używany w kole filtrów mikroskopu na rozdzielacz wiązki 10/90 (R/T).
   2. Wstaw rozdzielacz obrazu między aparatem a mikroskopem.
   3. W kostce filtra rozdzielacza obrazu wstaw rozdzielacz wiązki 10/90 (R/T). Umieść filtr długoprzepustowy o długości fali 600 nm przed wiązką odbitą, a odpowiedni filtr emisji fluorescencji przed wiązką transmitowaną.
      UWAGA: Rozdzielacze wiązki o różnych współczynnikach R/T mogą być używane do dostrajania frakcji zbieranego światła emisyjnego IRM i TIRF.
   4. Wyrównaj rozdzielacz obrazu zgodnie ze specyfikacją producenta, aby przestrzennie oddzielić sygnały TIRF i IRM na chipie aparatu.
      UWAGA: Przestrzenna separacja sygnałów jest wymagana, ponieważ sygnał TIRF typowych fluoroforów jest znacznie słabszy niż sygnał IRM mikrotubuli i nie byłby wykrywalny, gdyby te dwa sygnały zostały nałożone
   na siebie.

3. Obrazowanie dynamicznych mikrotubul i pojedynczych cząsteczek kinezyny

1. Funkcjonalizacja i pasywacja powierzchni
   1. Przelać bufor BRB80 (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, miareczkowany do pH 7,8 za pomocą NaOH) do komory reakcyjnej.
   2. Przepływowy roztwór antybiotyny rozcieńczony do 0,025 mg/ml w BRB80 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   3. Umyj kanał za pomocą BRB80.
   4. Przepłynąć w roztworze F-127 (1% Pluronic F-127 (w/v) rozpuszczony w BRB80 przez noc) i inkubować przez co najmniej 20 minut w celu pasywacji powierzchniowej.
      UWAGA: Jeśli zamiast silanizowanych szkieł nakrywkowych stosuje się łatwe do czyszczenia szkła nakrywkowe, pasywację przy użyciu 2 mg/ml kazeiny w BRB80 przez >20 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Umyj kanał za pomocą BRB80.
2. Przygotowanie do obrazowania
   1. Jeśli wymagana jest regulacja temperatury, użyj grzejnika obiektywowego i ustaw go na odpowiednią temperaturę.
      UWAGA: W tym protokole wszystkie eksperymenty są wykonywane w temperaturze 28 °C.
   2. Umieścić próbkę na stoliku mikroskopu i włączyć źródło światła epiiluminacji (>600 nm) do obrazowania IRM.
      UWAGA: W tym protokole używane jest białe źródło światła LED z filtrem długoprzepustowym 600 nm.
   3. Ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni próbki. Poszukaj właściwej płaszczyzny ogniskowej w pobliżu interfejsu rozwiązania PDMS.
      UWAGA: W IRM wodne wnętrze kanału powinno wydawać się znacznie jaśniejsze niż polimer PDMS.
   4. Wybierz pole widzenia w pobliżu środka kanału.
   5. Przygotować roztwór 0,1 μm fluorescencyjnych mikrokulek w BRB80 (gęstość: 10⁹ kulek/ml, co odpowiada 200-krotnemu rozcieńczeniu kulek stosowanych w tym protokole).
   6. Przepływ w co najmniej jednej objętości kanału roztworu mikrogranulek.
   7. Monitorowanie reakcji za pomocą usługi IRM. Poczekaj, aż mikrogranulki stopniowo "wylądują" na powierzchni. Po osiągnięciu pożądanej gęstości mikrogranulek zmyj nadmiar BRB80.
3. Uprawa biotynylowanych nasion mikrotubul stabilizowanych 5'-α,β-metylenodifosfonianem guanylylu (GMPCPP)
   1. W probówce wirówkowej o pojemności 0,6 ml przygotuj 50 μl roztworu zawierającego 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl₂ i 2 μM biotynylowanej tubuliny (5-10% oznaczania stechiometrii) w BRB80.
      UWAGA: Prawidłową stechiometrię znakowania można uzyskać, łącząc biotynylowaną tubulinę o dużej gęstości z nieznakowaną tubuliną bydlęcą w odpowiednim stosunku.
   2. Inkubować roztwór na lodzie przez 5 minut, następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 12,5 min.
      UWAGA: Długość nasion można kontrolować, dostrajając czas polimeryzacji.
   3. Zatrzymaj polimeryzację, dodając 100 μl BRB80 o temperaturze pokojowej.
   4. Odwirować roztwór w ultrawirówce w temperaturze pokojowej (126 000 x g, 5 min). Odrzucić supernatant za pomocą pipety w celu usunięcia niespolimeryzowanej tubuliny.
      UWAGA: W tym protokole używana jest ultrawirówka napędzana powietrzem.
   5. Do granulatu dodać 200 μl BRB80 o temperaturze pokojowej. Zawiesić osad przez delikatne, ale dokładne pipetowanie. Użyj pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką, aby zmniejszyć ścinanie mikrotubul.
4. Rosnące dynamiczne "rozszerzenia" tubuliny difosforanu guanozyny (GDP)
   UWAGA: Nasiona zostaną unieruchomione na powierzchni antybiotyny kanału przepływowego. Dynamiczne "przedłużenia" GTP/GDP będą wyrastać z końców unieruchomionych nasion.
   1. Rozcieńczyć nasiona 20x w BRB80. Przelej rozcieńczone nasiona do komory reakcyjnej.
   2. Monitorowanie reakcji za pomocą usługi IRM. Poczekaj, aż nasiona stopniowo "wylądują" na powierzchni i zwiążą się z nią. Po osiągnięciu pożądanej gęstości nasion zmyj nadmiar BRB80.
   3. Przygotować mieszaninę do przedłużania mikrotubul: 12 μM nieznakowanej tubuliny, 1 mM GTP, 5 mM ditiotreitolu (DTT) w buforze BRB80.
   4. Przepływ w co najmniej jednej objętości kanału mieszaniny przedłużającej. Upewnić się, że temperatura reakcji wynosi 28 °C.
   5. Poczekaj, aż z czasem z nasion wyrosną rozszerzenia mikrotubul.
      UWAGA: Długość w stanie ustalonym jest zwykle osiągana w czasie krótszym niż 20 minut.
   6. Użyj dynamicznych mikrotubul do obrazowania. Dodaj i zwizualizuj fluorescencyjne MAP na mikrotubulach, jak opisano w kroku 3.5 dla kinesin-1.
      UWAGA: Ponieważ mikrotubule są związane z powierzchnią, są łatwo widoczne dla TIRF.
5. Test ruchliwości kinezyny
   UWAGA: W tym kroku opisano protokół wizualizacji ruchliwej kinezyny-1 znakowanej zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) na kurczących się mikrotubulach. Skrócony konstrukt kinezyny-1 szczura połączony z eGFP (rKin430-eGFP) został poddany ekspresji i oczyszczeniu, jak opisano wcześniej^15,16.
   1. Przygotować bufor do pomiaru ruchliwości: 1 mM ATP i 0,2 mg/ml kazeiny w BRB80.
   2. Rozcieńczyć kinezynę-eGFP w buforze ruchliwości do 10 nM.
   3. Przygotuj 2x roztwór pochłaniacza tlenu, aby przeciwdziałać oksydacyjnemu fotowybielaniu (80 mM glukozy, 80 mg/ml oksydazy glukozowej, 32 mg/ml katalazy, 0,2 mg/ml kazeiny, 20 mM DTT) uzupełniony 2 mM ATP.
   4. Połącz 10 części pochłaniacza tlenu, 9 części BRB80 i 1 część 10 nM kinezyny-eGFP, aby uzyskać końcowe stężenie kinezyny 0,5 nM.
      UWAGA: Całkowita głośność powinna być co najmniej 1.5 raza większa niż głośność kanału.
   5. Skonfiguruj ustawienia obrazowania w oprogramowaniu mikroskopu.
      UWAGA: W tym protokole filmy są nagrywane z szybkością 10 kl./s i czasem naświetlania 100 ms. Natężenie lasera wynosi ~0,05 kW/cm².
   6. Rozpocznij obrazowanie i wlej roztwór kinezyny do komory.
   7. Po zakończeniu pomiaru nagraj krótki (~5 s) film, w którym stolik jest powoli przesuwany ruchem okrężnym lub bocznym. Użyj mediany projekcji tego filmu jako obrazu tła i odejmij ją od surowych pomiarów.

4. Przetwarzanie i analiza obrazu

UWAGA: Przetwarzanie obrazu zostało przeprowadzone przy użyciu NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). Opracowano makro w celu zautomatyzowania dzielenia i wyrównywania kanałów TIRF i IRM. To makro wymaga zainstalowania wtyczki GaussFit_OnSpot (dostępnej w repozytorium wtyczek ImageJ).

1. Z nagrania w tle utwórz projekcję mediany w ImageJ, klikając Obraz | Stosy | Projekt Z.
2. Odejmij medianę projekcji tła od surowych danych obrazu, klikając Procesowy | Kalkulator obrazów.
   UWAGA: Upewnij się, że zaznaczyłeś opcję "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)".
3. Aby zarejestrować obraz, wybierz kolekcję mikrokulek w pobliżu interesującej nas mikrotubuli i użyj ich do wyrównania obrazów TIRF i IRM.
4. Dla każdego ściegu w tej kolekcji użyj narzędzia do zaznaczania wielopunktowego, aby zaznaczyć przybliżone położenie w kanale TIRF, a następnie odpowiadające mu położenie w kanale IRM.
   UWAGA: Na przykład, jeśli istnieją dwa koraliki (1 i 2), zaznaczenie wielopunktowe będzie miało cztery punkty w następującej kolejności: (1) koralik 1 w TIRF, (2) koralik 1 w IRM, (3) koralik 2 w TIRF, (4) koralik 2 w IRM.
5. Uruchom dostarczone makro ImageJ (ImageSplitterRegistration.ijm).
   UWAGA: Automatyzuje to następujące kroki: i) oszacowanie środkowego położenia każdego ściegu poprzez dopasowanie do gaussa; ii) dla każdego koralika, obliczając wektor przemieszczenia oddzielający środek w kanale TIRF od środka w kanale IRM; iii) uśrednienie tego wektora przemieszczenia na wszystkich koralikach; iv) rozdzielenie kanałów TIRF i IRM na osobne obrazy; v) przełożenie obrazu TIRF za pomocą średniego wektora przemieszczenia obliczonego w punkcie iii; vi) nakładanie obrazów TIRF i IRM na wielokanałowy plik .tiff.

Results

Układ optyczny jest schematycznie opisany w Rysunek 1. Zarówno oświetlenie IRM, jak i światło wzbudzające TIRF są kierowane na tylną aperturę obiektywu (100x, NA: 1,49) za pomocą rozdzielacza wiązki 10/90 (R/T) (BS1). Emitowany sygnał przechodzi przez ten sam rozdzielacz wiązki (BS1) i jest odbijany do rozdzielacza obrazu za pośrednictwem lustra (M1). Elementy składowe rozdzielacza obrazu (ujęte liniami przerywanymi w Rysunek 1) rozdzielają sygnały IRM i TIRF za pomocą rozdzielacza wiązki 90/10 (R/T) (BS2) wraz z odpowiednimi filtrami spektralnymi. Na koniec podzielone obrazy są rzutowane na układ kamery w celu wizualizacji. Wyrównanie rozdzielacza obrazu jest takie, że sygnały TIRF i IRM są rzutowane na oddzielne połówki chipa.

W dobrze ustawionym mikroskopie, obraz z kamery powinien wyświetlać obraz podzielony na pół, jak pokazano w Rysunek 2. Mikrotubule związane z powierzchnią powinny być dobrze widoczne w kanale IRM¹³, a kinezyna fluorescencyjna powinna być widoczna w kanale TIRF.

Mikrokulki używane do wyrównywania i rejestrowania dwóch kanałów pojawiają się jako jasne punkty na obrazach TIRF i ciemne plamy na obrazach IRM. Chociaż koraliki są widoczne w surowych danych, odejmowanie tła znacznie poprawia kontrast (Rysunek 2). Obraz tła używany do odejmowania to mediana czasowa filmu nagranego z ruchomą sceną. Zgodnie z opisem w protokole, wyrównanie obrazu zostało wykonane poprzez wybranie kolekcji koralików w pobliżu obszaru zainteresowania i wykonanie dostarczonego makra (imageSplitterRegistration.ijm). Makro dopasowuje punkty do gaussianów i wyrównuje obrazy, minimalizując średnią odległość między punktami środkowymi pasowań w każdym kanale. Proces ten jest reprezentowany przez Rysunek 2, który pokazuje dobre ułożenie mikrokulek fluorescencyjnych (zielony w kanale TIRF, w kanale IRM).

Na koniec, możliwości tego systemu do jednoczesnego obrazowania są demonstrowane poprzez obserwację pojedynczych cząsteczek kinezyny idących w kierunku kurczących się końców mikrotubul. Rysunek 3 pokazuje kymograf cząsteczek kinezyny znakowanych eGFP (zielony) chodzących po kurczącej się mikrotubuli (szary). Zaprezentowana została również seria migawek z nagrania, z którego został wygenerowany kimograf.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie układu optycznego do jednoczesnego obrazowania IRM i TIRF ruchliwości kinezyny. Epiiluminacja ze źródła światła LED przechodzi przez membranę apertury i dociera do rozdzielacza wiązki 10/90 (R/T) (BS1). Rozdzielacz wiązki częściowo odbija czerwone światło świetlne IRM i światło wzbudzające TIRF 488 nm aż do obiektywu, aby oświetlić próbkę. Sygnał z próbki jest zbierany przez ten sam obiektyw i kierowany do zespołu rozdzielającego obraz, w którym obrazy IRM i TIRF są przestrzennie oddzielone rozdzielaczem wiązki 90/10 (R/T) (BS2). Sygnały są następnie filtrowane spektralnie przed dotarciem do układu kamery. Skróty: IRM = mikroskopia interferencyjna refleksyjna; TIRF = całkowite-wewnętrzne-odbicie-fluorescencja; LED = dioda elektroluminescencyjna; I_TIRF = oświetlenie TIRF; I_GFP = fluorescencja GFP; I_inc = oświetlenie IRM; I_ref = rozproszone światło na granicy faz szkło/woda; I_scat = rozproszone światło z mikrotubuli; I_IRM = sygnał IRM (Interferencja I_ref i_{I scat}); R/T = odbity/przepuszczony; LP600: filtr długoprzepustowy (600 nm); DM = zwierciadło dichroiczne; BS1 i BS2 = rozdzielacze wiązki 1 i 2; M1, M2, M3, M4 = lusterka; BP535/50 = pasmo przepustowe (535/50 nm); GFP = białko zielonej fluorescencji; GMPCPP = 5'-α,β-metylenodifosfonian guanylylu; GDP = difosforan guanozyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Odejmowanie tła i wyrównanie obrazu. Obrazy TIRF (lewa połowa) i IRM (prawa połowa) pojawiają się jednocześnie na dwóch połówkach tego samego układu kamery (obraz z kamery). Odejmowanie mediany czasowej tła zwiększa kontrast koralików (obraz odejmowany przez tło), które wydają się ciemne na obrazach IRM i jasne na obrazach TIRF. Obrazy IRM i TIRF są wyrównywane przez translację (po prawej) na podstawie lokalizacji wybranych koralików (białych prostokątów). Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kymogram i migawki ruchu kinezyn podczas kurczenia się mikrotubul. Kymograf (po lewej) pokazuje eGFP-kinezinę-1 (zieloną) idącą w kierunku dodatniego końca mikrotubuli (ciemnoszary). Migawki z odpowiednich szeregów czasowych są wyświetlane (po prawej). Białe strzałki pokazują pojedyncze cząsteczki kinezyny-1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

ImageSplitterRegistration File: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Badanie regulacji dynamiki mikrotubul przez białka związane z mikrotubulami (MAP) często wymaga jednoczesnego obrazowania mikrotubul i MAP. W tym celu zwykle stosuje się techniki mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak TIRF. Są one jednak ograniczone wadami obrazowania fluorescencyjnego, do których należą fotowybielanie, fotouszkodzenia i konieczność znakowania fluoroforowego. Metody bezznacznikowe, takie jak IRM, są odpowiednie do wizualizacji mikrotubul, ale nie są w stanie obrazować pojedynczych fluoroforów. Protokół ten łączy bezznacznikowe obrazowanie IRM i mikroskopię TIRF w celu jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i MAP.

Konfiguracja IRM wykorzystuje źródło oświetlenia LED filtrowane do >600 nm, podczas gdy konfiguracja TIRF wykorzystuje laser 488 nm. Użyliśmy niedrogiego rozdzielacza wiązki płytkowej, aby odbić światło świetlne na próbkę i przesłać zebrany sygnał do detektora (ilustracja 1). Wybrano rozdzielacz wiązki o 10% współczynniku odbicia i 90% transmisji, aby zminimalizować straty sygnału pojedynczej cząsteczki. Utrata 90% natężenia światła oświetleniowego jest kompensowana poprzez zwiększenie mocy lasera oświetleniowego i diody LED.

Separację spektralną sygnałów uzyskano za pomocą rozdzielacza wiązki 90/10 (R/T) oraz dwóch filtrów spektralnych (długoprzepustowy 600 nm dla IRM i pasmowo-przepustowy 535/50 nm dla TIRF). Oddzielone spektralnie sygnały IRM i TIRF są rzutowane na dwie połówki pojedynczego układu kamery za pomocą zespołu rozdzielacza obrazu. Zastosowanie rozdzielacza wiązki 90/10 poświęca 90% sygnału IRM, ale jest to kompensowane poprzez zwiększenie intensywności źródła oświetlenia LED. Lustro dichroiczne może być również wykorzystane do skuteczniejszego oddzielania sygnałów IRM i TIRF. Mikrogranulki fluorescencyjne zawarte w testach umożliwiają dokładne wyrównanie obrazów TIRF i IRM oraz służą jako punkt odniesienia przy ustawianiu ostrości obiektywu.

Najbardziej krytycznym elementem optycznym w tym protokole jest obiektyw o dużej aperturze numerycznej (NA). Jest to niezbędne nie tylko do uzyskania całkowitego odbicia wewnętrznego, ale także do maksymalizacji wydajności zbierania i kontrastu obrazu. Jakość uzyskanych obrazów zależy również od czystości powierzchni szkła i uzyskania wyraźnego obrazu tła w celu skorygowania nierównomiernego oświetlenia i usunięcia cech statycznych. Do obrazowania IRM zalecamy stosowanie oświetlenia o dużej długości fali (>600 nm), aby zminimalizować fotouszkodzenia mikrotubul i białek. Jest to szczególnie ważne, jeśli używane jest białe źródło światła LED, w którym to przypadku należy dołączyć filtr długoprzepustowy, aby usunąć wszelkie światło UV.

Protokół ten pozwala na bezznacznikowe, szybkie obrazowanie dynamicznych mikrotubul i jednoczesną wizualizację fluorescencyjnych map o wysokiej rozdzielczości¹⁷. W porównaniu z techniką przełączania kostek filtrujących, która naprzemiennie przechwytuje obrazy mikrotubul i map, ta konfiguracja jest w stanie uzyskać znacznie większą liczbę klatek na sekundę, ponieważ nie zależy od fizycznego obrotu kostki filtra. W porównaniu z dwukolorowymi technikami obrazowania TIRF, technika ta wykorzystuje mniej wymagającą konfigurację optyczną i omija potrzebę znakowania mikrotubul fluoroforem. Podstawowe ograniczenia tej konfiguracji wynikają z obrazowania TIRF MAPów; Liczba klatek na sekundę jest ograniczona przez czas ekspozycji fluoroforu, a fotowybielanie fluoroforów pozostaje możliwe. Niemniej jednak protokół ten ulepsza istniejące techniki, ponieważ wykorzystuje TIRF tylko wtedy, gdy jest to konieczne (tj. do wizualizacji MAP, ale nie mikrotubul) i osiąga najwyższą możliwą prędkość w granicach TIRF. Dalsze ulepszenia są możliwe tylko wtedy, gdy zarówno mikrotubule, jak i MAP są wizualizowane za pomocą techniki interferometrycznej, ale wymaga to znakowania MAP nanocząstkami metali, co ma swoje ograniczenia i wyzwania eksperymentalne.

Aby zademonstrować możliwości tej techniki, jednocześnie zwizualizowaliśmy dwa szybkie procesy dynamiczne za pomocą IRM i TIRF: kurczenie się mikrotubuli i chodzenie fluorescencyjnej cząsteczki kinezyny. Technika ta była wcześniej stosowana do wizualizacji szybkiej dyfuzji spadyny na kurczących się mikrotubulach⁵. Poza tym zastosowaniem do MAT i mikrotubul, protokół ten może być używany do wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych jednocześnie o dowolnej strukturze makromolekularnej wystarczająco masywnej, aby można ją było uwidocznić za pomocą IRM, takiej jak błona komórkowa lub włókno aktynowe.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rozdzielacz wiązki 10/90 (R/T)	Thorlabs	BSN10R	Płaski rozdzielacz wiązki stosowany w ścieżce wiązki wzbudzenia
Rozdzielacz wiązki 90/10 (R/T)	Thorlabs	BSX10R	Płaski rozdzielacz wiązki stosowany w rozdzielaczu obrazu
Przeciwciało antybiotynowe	Sigma-Aldrich	B3640	Służy do funkcjonalizacji powierzchni do klejenia biotynylowanych mikrotubul
ATP	Sigma-Aldrich	FLAAS	Służy do przygotowania bufora ruchliwości
Filtr pasmowo-przepustowy	Newport	HPM535-50	Filtr pasmowy z twardą powłoką jest używany w rozdzielaczu obrazu do obrazowania sygnału GFP
Biotynylowany cytoszkielet tubuliny	, Inc.	T333P-A	Służy do wiązania nasion mikrotubul z powierzchnią kanału przepływowego
Kazeina	Sigma-Aldrich	C8654	Kazeina służy do blokowania oddziaływań niespecyficznych
Katalaza	Sigma-Aldrich	C9322	Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu
Komora eksykatora	Southern Labware	55207	Eksykator służy do odgazowywania żywicy
DTT	Sigma-Aldrich	D0632	Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Służy do przygotowania buforu BRB80
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7528	Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu
Oksydaza glukozowa	Sigma-Aldrich	G7016	Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu
Nukleotydy	GMPCPPJena Bioscience	NU-405L	Służy do polimeryzacji stabilizowanych mikrotubul
Rozdzielacz obrazu	Teledyne-Photometrics Imaging	OptoSplit II	Rozdzielacz obrazu służy do przestrzennego dzielenia obrazów. Kupując, upewnij się o kompatybilności z mikroskopem
ImajeJ2	NIH		ImageJ2 służy do analizy obrazu
Kinezyna			przygotowana we własnym zakresie (patrz referencje w tekście)
Rurki LDPE Thomas	Scientific	9565S22	Nietoksyczna rurka z polietylenu o mniejszej gęstości z mikrootworem służy do przenoszenia płynów
Źródło światła LED	Lumencor	Lumencor sola silnik świetlny	Używany do obrazowania IRM
Filtry długoprzepustowe	Thorlabs	FELH0600	Filtry długoprzepustowe z twardą powłoką. Jeden jest używany jako filtr wzbudzenia, drugi jest używany w rozdzielaczu obrazu do obrazowania sygnału IRM
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	63068	Służy do przygotowania bufora BRB80
Grzałka obiektywu mikoskopowego	OKOLAB	H401-T-DUAL-BL	Służy do utrzymywania stałej temperatury próbki poprzez ogrzewanie obiektywu
Mikroskop	Nikon	Ti-Eclipse	Odwrócony mikroskop, który jest używany w eksperymentach
Na-PIPES	Sigma-Aldrich	P2949	Służy do przygotowania bufora BRB80
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Obiektyw olejowy	Nikon	MRD01991	Obiektyw do obrazowania ma aperturę numeryczną 1,49
PDMS i utwardzacz	Mikroskopia elektronowa Sciences	Sylgard 184 (24236-10)	Służy do konstruowania kanałów przepływowych
Dziurkacz PDMS	World Precision Instruments LLC	504529	Służy do wybijania otworów w PDMS
Środek do czyszczenia plazmowego	Harrick Plasma	DPC-32G	Plazma powietrzna służy do usuwania zanieczyszczeń organicznych z powierzchni PDMS
Poloxamer 407 (nazwa handlowa Pluronic F-127)	Sigma-aldrich	P2443	Służy do pasywacji powierzchni kanału w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	567530	Używany do przygotowania Bufor BRB80
Stabilizowane mikrotubule			przygotowane we własnym zakresie (patrz referencje w tekście)
Ultrawirówka stołowa	Beckman Coulter	340400	Służy do odkręcania nasion mikrotubul
Koraliki TetraSpeck	ThermoFisher Scientific	T7279	Używany jako odniesienie do wyrównywania obrazów
Aparat fotograficzny Zyla 4.2	Andor	Zyla 4.2	Naukowa kamera CMOS ze specyfikacją: 2048 x 2048 pikseli (6,5 μ m rozmiar piksela) z wydajnością kwantową 72% i 16-bitowym zakresem dynamiki