Method Article

Wytwarzanie mikrowzorzystego chipa o kontrolowanej grubości do wysokoprzepustowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/63739

⸱

April 21st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowo opracowany mikro-wzorzysty chip z okienkami z tlenku grafenu jest wytwarzany przy użyciu technik systemów mikroelektromechanicznych, umożliwiając wydajne i wysokoprzepustowe obrazowanie kriogenicznej mikroskopii elektronowej różnych biomolekuł i nanomateriałów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym ograniczeniem dla efektywnej i wysokoprzepustowej analizy struktury biomolekuł za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM) jest trudność w przygotowaniu próbek kriogenicznych o kontrolowanej grubości lodu w nanoskali. Chip na bazie krzemu (Si), który ma regularny układ mikrootworów z okienkiem z tlenku grafenu (GO) wzorowanym na warstwie z azotku krzemu o kontrolowanej grubości (SixNy), został opracowany przy użyciu technik systemów mikroelektromechanicznych (MEMS). Fotolitografia UV, chemiczne osadzanie z fazy gazowej, trawienie cienkiej warstwy na mokro i na sucho oraz odlewanie matrycowe materiałów nanoarkuszowych 2D zostały wykorzystane do masowej produkcji mikrowzorzystych chipów z oknami GO. Głębokość mikrootworów jest regulowana w celu kontrolowania grubości lodu na żądanie, w zależności od wielkości próbki do analizy krioelektromagnetycznej. Korzystne powinowactwo GO do biomolekuł koncentruje interesujące biomolekuły w mikrootworze podczas przygotowywania próbki cryo-EM. Mikrowzorzysty chip z oknami GO umożliwia wysokoprzepustowe obrazowanie kriogeniczne różnych cząsteczek biologicznych, a także nanomateriałów nieorganicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) została opracowana w celu rozpoznania trójwymiarowej (3D) struktury białek w ich stanie naturalnym1,2,3,4. Technika ta polega na utrwaleniu białek w cienkiej warstwie (10-100 nm) lodu szklistego i uzyskaniu obrazów projekcyjnych losowo zorientowanych białek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), przy czym próbka jest utrzymywana w temperaturze ciekłego azotu. Tysiące do milionów obrazów projekcyjnych jest pozyskiwanych i wykorzystywanych do rekonstrukcji struktury 3D białka za ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja mikro-wzorzystego chipa z oknami GO (Rysunek 1)

  1. Osadzać azotek krzemu.
    1. Osadzać niskonaprężeniowy azotek krzemu (SixNy) po obu stronach płytki Si (średnica 4 cali i grubość 100 μm) za pomocą niskociśnieniowego chemicznego osadzania z fazy gazowej (LPCVD) w temperaturze 830 °C i pod ciśnieniem 150 mTorr, pod przepływem 170 sccm dichlorosilanu (SiH2Cl2, DCS) i 38 sccm amoniaku (NH3).
    2. Stosując szybkość stapiania ~30 A/min, kontroluj grubość SixNy w zakresie 25-100 nm, zmieniając czas os....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrowzorzysty chip z oknami GO został wyprodukowany przez produkcję MEMS i transfer nanoarkuszy 2D GO. Chipy do mikro-wzorów były produkowane masowo, z około 500 chipami wyprodukowanymi z jednego 4-calowego wafla (Rysunek 1B i Rysunek 2A,B). Projekty mikrowzorzystych chipów mogą być manipulowane przy użyciu różnych wzorów maski chromowej (Rysunek 2) podczas procedury fotolitografii. Stworzone chipy z mikrowzorami miały kontrolowaną liczbę i wym.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj procesy mikrofabrykacji do produkcji mikrowzorzystych chipów z oknami GO. Wykonany chip z mikrowzorem jest przeznaczony do regulacji grubości warstwy lodu szklistego poprzez kontrolowanie głębokości mikrootworu z oknami GO w zależności od wielkości analizowanego materiału. Mikrowzorzysty chip z okienkami GO został wytworzony przy użyciu szeregu technik MEMS i metody transferu nanoarkuszy 2D (ilustracja 1). Główną zaletą stosowania techniki wytwarzania MEMS jest jej zdolno.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.-H.K., S.K., M.L. i J.P. dziękują za wsparcie finansowe ze strony Instytutu Nauk Podstawowych (grant nr. IBS-R006-D1). S.K., M.L. i J.P. dziękują za wsparcie finansowe ze strony Creative-Pioneering Researchers Program za pośrednictwem Seoul National University (2021) oraz grant NRF ufundowany przez rząd koreański (MSIT; Granty nr NRF-2020R1A2C2101871 oraz NRF-2021M3A9I4022936). M.L. i J.P. dziękują za wsparcie finansowe ze strony POSCO Science Fellowship Fundacji POSCO TJ Park oraz grantu NRF ufundowanego przez rząd koreański (MSIT; Nr dotacji NRF-2017R1A5A1015365). J.P. przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe z dotacji NRF ufundowanej przez rząd koreański (MSIT;....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-metylo-2-pirolidynon (NMP)Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone443778
Aceton
AFMPark Systems, Korea PołudniowaNX-10
AlignerMidas System, Korea PołudniowaMDA-600S
AZ 300 MIF developerAZ Electronic Materials USA Corp., Stany Zjednoczone184411
UchwytCryo-EMGatan, Stany Zjednoczone626 uchwyt krio-EM z pojedynczym przechyłem
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%Alfa Aesar, Stany Zjednoczone10226590
Niskociśnieniowe chemiczne osadzanie z fazy gazowej (LPCVD)Centrotherm, NiemcyLPCVD E1200
maP1205 dodatni PRTechnologia mikrorezystu, NiemcyA15139
Wodorotlenek potasu (KOH), płatkiDAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., Korea Południowa6597-4400
Spektrometr RamanaNOST, Korea PołudniowaKonfokalny mikro system Ramana HEDA
Reaktywny wytrawiacz jonowy (RIE)Inżynieria naukowa, Korea PołudniowaZbudowany
SEMCarl Zeiss, NiemcySUPRA 55VP
Wafel SiJP COMMERCE, Korea4" Wafel krzemowy, typ P(B), (100), 1-30ohm.c m, DSP, T: 100um
Powlekarka wirowaDong Ah Trade Corp., Korea PołudniowaACE-200
TEM JEOL, JaponiaJEM-2100F
Krio-zanurzalnia Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV Mikroskopia elektronowa ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM)Firma FEI, USA Helios NanoLab 650 Wyładowczy żarówka Ted Pella Inc., Stany Zjednoczone Roztwór tlenku grafenu (GO) PELCO easiGlow Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone 763705w laboratorium Południowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein dis....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Electron MicroscopyMicro Patterned ChipControlled Ice ThicknessGraphene Oxide WindowSilicon Nitride MembraneUV PhotolithographyChemical Vapor DepositionReactive Ion EtchingHigh Throughput ImagingBiomolecule Structure Analysis

Related Articles