Method Article

Wytwarzanie mikrowzorzystego chipa o kontrolowanej grubości do wysokoprzepustowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/63739

⸱

April 21st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowo opracowany mikro-wzorzysty chip z okienkami z tlenku grafenu jest wytwarzany przy użyciu technik systemów mikroelektromechanicznych, umożliwiając wydajne i wysokoprzepustowe obrazowanie kriogenicznej mikroskopii elektronowej różnych biomolekuł i nanomateriałów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym ograniczeniem dla efektywnej i wysokoprzepustowej analizy struktury biomolekuł za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM) jest trudność w przygotowaniu próbek kriogenicznych o kontrolowanej grubości lodu w nanoskali. Chip na bazie krzemu (Si), który ma regularny układ mikrootworów z okienkiem z tlenku grafenu (GO) wzorowanym na warstwie z azotku krzemu o kontrolowanej grubości (SixNy), został opracowany przy użyciu technik systemów mikroelektromechanicznych (MEMS). Fotolitografia UV, chemiczne osadzanie z fazy gazowej, trawienie cienkiej warstwy na mokro i na sucho oraz odlewanie matrycowe materiałów nanoarkuszowych 2D zostały wykorzystane do masowej produkcji mikrowzorzystych chipów z oknami GO. Głębokość mikrootworów jest regulowana w celu kontrolowania grubości lodu na żądanie, w zależności od wielkości próbki do analizy krioelektromagnetycznej. Korzystne powinowactwo GO do biomolekuł koncentruje interesujące biomolekuły w mikrootworze podczas przygotowywania próbki cryo-EM. Mikrowzorzysty chip z oknami GO umożliwia wysokoprzepustowe obrazowanie kriogeniczne różnych cząsteczek biologicznych, a także nanomateriałów nieorganicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) została opracowana w celu rozpoznania trójwymiarowej (3D) struktury białek w ich stanie naturalnym1,2,3,4. Technika ta polega na utrwaleniu białek w cienkiej warstwie (10-100 nm) lodu szklistego i uzyskaniu obrazów projekcyjnych losowo zorientowanych białek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), przy czym próbka jest utrzymywana w temperaturze ciekłego azotu. Tysiące do milionów obrazów projekcyjnych jest pozyskiwanych i wykorzystywanych do rekonstrukcji struktury 3D białka za pomocą algorytmów obliczeniowych5,6. Aby zapewnić pomyślną analizę za pomocą cryo-EM, przygotowanie próbek kriogenicznych zostało zautomatyzowane poprzez zamrażanie wgłębne sprzętu, który kontroluje warunki blottingu, wilgotność i temperaturę. Roztwór próbki jest ładowany na siatkę TEM z dziurawą membraną węglową, kolejno osuszany w celu usunięcia nadmiaru roztworu, a następnie zamrażany wgłębnie ciekłym etanem, aby wytworzyć cienki, szklisty lód1,5,6. Dzięki postępom w dziedzinie cryo-EM i automatyzacji przygotowywania próbek7, cryo-EM jest coraz częściej stosowany do rozwiązywania struktury białek, w tym białek otoczki wirusów i białek kanałów jonowych w błonie komórkowej8,9,10. Struktura białek otoczki patogennych cząstek wirusowych jest istotna dla zrozumienia patologii infekcji wirusowych, a także opracowania systemu diagnostycznego i szczepionek, np. SARS-CoV-211, które spowodowały pandemię COVID-19. Co więcej, techniki cryo-EM zostały ostatnio zastosowane w materiałoznawstwie, na przykład do obrazowania materiałów wrażliwych na wiązkę stosowanych w battery12,13,14 i systemach katalitycznych14,15 oraz analizowania struktury materiałów nieorganicznych w solution-state16.

Pomimo zauważalnych postępów w krio-EM i odpowiednich technikach, istnieją ograniczenia w przygotowaniu próbek kriogenicznych, co utrudnia wysokoprzepustową analizę struktury 3D. Przygotowanie szklistej warstwy lodu o optymalnej grubości jest szczególnie ważne dla uzyskania struktury 3D materiałów biologicznych o rozdzielczości atomowej. Lód musi być na tyle cienki, aby zminimalizować szum tła powodowany przez elektrony rozproszone przez lód i uniemożliwić nakładanie się biomolekuł wzdłuż ścieżki wiązki elektronów1,17. Jeśli jednak lód jest zbyt cienki, może to spowodować ułożenie cząsteczek białka w preferowanych orientacjach lub denaturację18,19,20. Dlatego grubość lodu szklistego powinna być zoptymalizowana w zależności od wielkości interesującego materiału. Co więcej, zwykle potrzebny jest znaczny wysiłek w celu przygotowania próbki i ręcznego przesiewania integralności lodu i białek na przygotowanych siatkach TEM. Proces ten jest niezwykle czasochłonny, co zmniejsza jego wydajność w przypadku wysokoprzepustowej analizy konstrukcji 3D. W związku z tym poprawa niezawodności i odtwarzalności przygotowania próbek cryo-EM zwiększyłaby wykorzystanie cryo-EM w biologii strukturalnej i komercyjnym odkrywaniu leków, a także w materiałoznawstwie.

Tutaj wprowadzamy procesy mikroprodukcji do tworzenia mikro-wzorzystego chipa z oknami z tlenku grafenu (GO) przeznaczonego do wysokowydajnego krio-EM z kontrolowaną grubością lodu21. Mikrowzorzysty chip został wytworzony przy użyciu technik systemu mikroelektromechanicznego (MEMS), który może manipulować strukturą i wymiarami chipa w zależności od celów obrazowania. Mikrowzorzysty chip z okienkami GO ma strukturę mikrodołka, który można wypełnić roztworem próbki, a głębokość mikrostudzienki można regulować, aby kontrolować grubość szklistego lodu. Silne powinowactwo GO do biomolekuł zwiększa stężenie biomolekuł do wizualizacji, poprawiając wydajność analizy struktury. Co więcej, chip z mikrowzorem składa się z ramy Si, która zapewnia wysoką stabilność mechaniczną dla grid19, dzięki czemu idealnie nadaje się do obsługi chipa podczas procedur przygotowywania próbek i obrazowania krio-EM. W związku z tym mikrowzorzysty chip z oknami GO wykonany technikami MEMS zapewnia niezawodność i powtarzalność przygotowania próbek cryo-EM, co może umożliwić wydajną i wysokoprzepustową analizę struktury w oparciu o cryo-EM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja mikro-wzorzystego chipa z oknami GO (Rysunek 1)

  1. Osadzać azotek krzemu.
    1. Osadzać niskonaprężeniowy azotek krzemu (SixNy) po obu stronach płytki Si (średnica 4 cali i grubość 100 μm) za pomocą niskociśnieniowego chemicznego osadzania z fazy gazowej (LPCVD) w temperaturze 830 °C i pod ciśnieniem 150 mTorr, pod przepływem 170 sccm dichlorosilanu (SiH2Cl2, DCS) i 38 sccm amoniaku (NH3).
    2. Stosując szybkość stapiania ~30 A/min, kontroluj grubość SixNy w zakresie 25-100 nm, zmieniając czas osadzania.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z waflem Si, ponieważ wafel jest bardzo cienki i delikatny. Uważaj, aby nie zginać płytki podczas jej przenoszenia lub ładowania do urządzenia.
  2. Wzór fotorezystu.
    1. Na płytkę Si osadzoną w krzemie SixN nanieść roztwór heksametylodylazanu (HMDS) o objętości wystarczającej do pokrycia całej powierzchni płytki, następnie obtoczyć powlekarką wirową z prędkością 3 000 obr./min przez 30 s i wypalić w temperaturze 95°C przez 30 s na płycie grzejnej, aby powierzchnia płytki stała się hydrofobowa, a tym samym zapewnić dobrą wydajność powlekania za pomocą fotorezystu (PR).
    2. Nałóż dodatni PR (Tabela Materiałów) o objętości wystarczającej do pokrycia całej powierzchni wafla, wiruj z prędkością 3 000 obr./min przez 30 s i piecz w temperaturze 100 °C przez 90 s na gorącej płycie. PR powlekany spinowo ma grubość 500 nm.
    3. Wystaw płytkę pokrytą PR światłem ultrafioletowym (długość fali 365 nm i intensywność 20 mW/cm2) przez 5 sekund przez maskę chromową (Rysunek 2A-D) za pomocą nakładki.
    4. Rozwijaj PR przez 1 minutę za pomocą wywoływacza (tabela materiałów) i opłucz wafel, zanurzając go w wodzie dejonizowanej (DI) 2x. Całkowicie wysusz wafel z wzorem PR, wdmuchując gaz N2 na powierzchnię płytki.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas wdmuchiwania gazu N2 na płytkę Si, ponieważ płytka jest bardzo cienka i delikatna. Nie wdmuchiwać gazuN2 pod wysokim ciśnieniem w kierunku prostopadłym do płytki, ponieważ może to spowodować pęknięcie płytki.
  3. Wzór SixNy.
    1. Wytrawić odsłonięte SixNy zgodnie z wzorcem PR za pomocą laboratoryjnego wytrawiacza jonów reaktywnych (RIE) z sześciofluorkiem siarki (SF6) o mocy 3 sccm o częstotliwości radiowej (RF) 50 W. Szybkość trawienia przy tych ustawieniach wynosi ~6 A/s. Ustaw czas trawienia w zależności od grubości nałożonej warstwy SixNy.
      UWAGA: Szybkość trawienia może się różnić i wymagać optymalizacji w laboratorium w zależności od specyfikacji używanego sprzętu RIE.
    2. Wyeliminuj PR, zanurzając wafel z wzorem SixNy w acetonie w temperaturze pokojowej na 30 minut, a następnie przepłukać wafel, zanurzając go w wodzie DI 2x. Całkowicie wysusz wafel, wdmuchując gaz N2 na powierzchnię płytki.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas zanurzania lub wyjmowania płytki z roztworów, ponieważ płytka może zostać pęknięta przez napięcie powierzchniowe roztworu. Nie zanurzaj ani nie wyjmuj płytki równolegle do powierzchni roztworu. Używaj precyzyjnej pęsety do obsługi wafli z końcówkami z włókna węglowego. Nie chwytaj mocno wafla pęsetą; Podnieś jedną stronę płytki, aż płytka przechyli się pod kątem, gdzie będzie można ją wyjąć z roztworu. Wafel może pękać, gdy wygina się z powodu mocnego chwytu podczas podnoszenia.
  4. Wytrawianie Si.
    1. Przygotować 1,5 M roztwór wodorotlenku potasu (KOH), rozpuszczając proszek KOH w wodzie demineralizowanej o temperaturze 80 °C.
    2. Zanurz wafel z wzorem SixNy w roztworze KOH, aby wytrawić odsłonięty Si. Pozostaw wafel w roztworze, mieszając, aż będzie można zaobserwować wolnostojące okienka SixNy po przeciwnej stronie wzorzystego SixNy.
      UWAGA: Czas trawienia na mokro może się różnić w zależności od grubości krzemu; W przypadku wafla o grubości 100 μm trawienie na mokro trwa zwykle kilka godzin. Nie ustawiaj zbyt dużej prędkości mieszania podczas trawienia Si, ponieważ wolnostojące okienka SixNy są bardzo cienkie i mogą ulec pęknięciu przez przepływ płynu. W tym eksperymencie szybkość mieszania została ustawiona na 250 obr./min.
    3. Wyczyść wytrawioną płytkę, zanurzając ją kilkakrotnie w kąpieli wodnej DI, aby wyeliminować pozostałości po trawieniu. Wysuszyć wafel na powietrzu.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas zanurzania lub wyjmowania wafla z wzorem Si z roztworów, ponieważ wolnostojące okna SixNy są bardzo cienkie i delikatne i mogą ulec pęknięciu pod wpływem napięcia powierzchniowego roztworu. Wafel należy zanurzyć lub wyjąć pod kątem, tak aby krawędź płytki najpierw wchodziła i wychodziła z roztworu.
  5. Wyeliminuj pozostałości po trawieniu KOH.
    1. Lekko naciśnij granice układu scalonego pęsetą, aby uzyskać tablicę chipów, która będzie mikrowzorzystą (Rysunek 1B).
    2. Przygotować 1,5 M roztwór KOH w temperaturze 80 °C, mieszając.
    3. Zanurz matrycę chipów w roztworze KOH na 30 s i wypłucz ją, zanurzając w wodzie DI 2x. Całkowicie wysusz wióry, wdmuchując gazN2.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas zanurzania wiórów w roztworach i suszenia ich gazemN2, ponieważ wolnostojące okna SixNy są bardzo cienkie i delikatne. Gdy chip jest zanurzony w roztworze KOH, mieszanie należy przerwać. Wióry należy zanurzyć krawędziami do przodu w kierunku prostopadłym do roztworu i przedmuchić gazemN2 w kierunku równoległym.
    4. Całkowicie wysuszyć matrycę wiórów na powietrzu przez co najmniej 1 godzinę.
  6. Wzorzec żądania ściągnięcia.
    1. Przygotuj pustą płytkę Si 525 μm jako solidne podłoże. Odwiruj wafel Si za pomocą HMDS i dodatniego PR, jak opisano powyżej, ale przymocuj układ chipów (wolnostojącą stroną z okienkiem SixNy skierowaną do góry) na płytce Si przed pieczeniem PR. PR działa jak klej między płytką a układem chipów. Piecz wafel Si dołączony do chipa w temperaturze 100 °C przez 90 sekund na gorącej płycie.
    2. Obróć zestaw chipów za pomocą HMDS i dodatniego PR, jak opisano powyżej.
    3. Naświetl zestaw chipów światłem ultrafioletowym (długość fali 365 nm; intensywność 20 mW/cm2) przez 5 sekund przez maskę chromową (Rysunek 2E,F) za pomocą nakładki.
    4. Rozwiń PR za pomocą wywoływacza przez 15 sekund, przepłucz zestaw chipów, zanurzając go w wodzie DI 2x i całkowicie wysusz zestaw chipów z wzorem PR, wdmuchując gazN2.
  7. Przygotuj mikrowzorzysty SixNy.
    1. Wytrawiaj SixNy zgodnie ze wzorem PR za pomocą zbudowanego w laboratorium RIE, z 3 gazami sccm SF6 o mocy RF 50 W. Kontroluj czas trawienia w zależności od grubości warstwy SixNy.
  8. Wyeliminuj żądanie ściągnięcia.
    1. Wyeliminuj PR, zanurzając wzorzysty zestaw chipów w roztworze 1-metylo-2-pirolidynonu (NMP) w temperaturze 60 °C i pozostawiając go na noc. Opłucz zestaw wiórów, zanurzając go w wodzie DI 2x i całkowicie wysusz wzorzysty zestaw wiórów, wdmuchując gazN2.
    2. Wyeliminuj pozostałości PR za pomocą procesu plazmowego O2 przy użyciu 100 sccm O2 gazu o mocy RF 150 W przez 1 minutę za pomocą laboratoryjnego RIE.
  9. Opłucz chip z mikrowzorem.
    1. Przygotować 1,5 M roztwór KOH w temperaturze 80 °C.
    2. Zanurz wióry z mikrowzorami w roztworze KOH na 30 sekund, aby całkowicie wyeliminować pozostałości PR i spłucz wióry, zanurzając je w wodzie DI 2x. Całkowicie wysusz wióry, wdmuchując gazN2.
    3. Całkowicie wysuszyć frytki na powietrzu przez co najmniej 1 godzinę.
  10. Przenieś tlenek grafenu (GO) metodą odlewania matrycowego.
    1. Rozcieńczyć roztwór GO (2 mg/ml) do 0,2 mg/l wodą DI i sonikować przez 10 minut w celu rozdrobnienia agregatów arkuszy GO. Odwirować rozcieńczony roztwór GO o stężeniu 300 x g przez 30 s.
    2. Wyładowanie jarzeniowe Wytrawiona w krzemie strona chipa z mikrowzorem, aby odwzorować powierzchnię chipa z ładunkiem dodatnim za pomocą wyładowania jarzeniowego (tabela materiałów) przy 15 mA przez 1 min.
    3. Upuść 3 μl roztworu GO na rozżarzoną stronę chipa z mikrowzorem i pozostaw kroplę na chipie na 1 minutę. Po 1 minutach zetrzyj nadmiar roztworu GO na chipie bibułą filtracyjną.
    4. Umyj chip przeniesiony przez GO kropelkami wody DI przygotowanymi na folii parafinowej i zetrzyj wodę z DI z chipa bibułą filtracyjną. Powtórz tę procedurę 2x po stronie przeniesionej GO i 1x po przeciwnej stronie. Suszyć chip przeniesiony przez GO w temperaturze pokojowej przez noc.
    5. Umyj mikrowzorzysty chip za pomocą okienek Go, zanurzając go w wodzie DI i wysusz chip gazemN2.

2. Obrazowanie Cryo-EM

  1. Przygotować próbkę kriogeniczną.
    1. Przygotuj próbkę kriogeniczną za pomocą mechanicznej maszyny do kriowgłębnego (Tabela materiałów), która kontroluje temperaturę, wilgotność, czas krzepnięcia i siłę. Po załadowaniu bibułki na bibułki należy upewnić się, że wilgotność i temperatura w komorze są utrzymywane odpowiednio na poziomie 100% i 15 °C.
    2. Podnieś mikrowzorzysty chip za pomocą typowej kriopęsety i załaduj pęsetę do maszyny do kriozanurzania. Odmierzyć pipetę 3 μl roztworu próbki na chip z mikrowzorem po stronie z otworami, z okienkami GO na spodzie. Kontroluj czas i siłę blotowania w zależności od roztworu próbki.
      UWAGA: W tym przypadku do obrazowania krio-EM wykorzystano próbki biologiczne, a mianowicie ludzki wirus niedoboru odporności (HIV-1), ferrytynę, proteasom 26S, groEL, cząstki białka białka apoferrytyny i białka filamentu tau. Ponadto do obrazowania krio-EM wykorzystano różne rodzaje materiałównieorganicznych, takie jak nanocząstki Fe2O3 (NP), nanocząstki Au, nanopręty Au i nanocząstki krzemionki. Żądany czas i siłę blotowania ustawiono na tłoku kriogenicznym dla różnych typów próbek.
    3. Po zakończeniu procesu blottingu należy natychmiast zamrozić wiór załadowany próbką w ciekłym etanie. Przenieś chip do skrzynki siatkowej w ciekłym azocie (LN2) i przechowuj go w LN2 przed obrazowaniem krio-EM.
  2. Przeprowadzić obrazowanie krio-EM.
    1. Załadować kriopróbkę do uchwytu cryo-EM o temperaturze utrzymywanej na poziomie -180 °C.
    2. Załadować uchwyt cryo-EM do TEM i obserwować próbki w trybie systemu minimalnej dawki (MDS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrowzorzysty chip z oknami GO został wyprodukowany przez produkcję MEMS i transfer nanoarkuszy 2D GO. Chipy do mikro-wzorów były produkowane masowo, z około 500 chipami wyprodukowanymi z jednego 4-calowego wafla (Rysunek 1B i Rysunek 2A,B). Projekty mikrowzorzystych chipów mogą być manipulowane przy użyciu różnych wzorów maski chromowej (Rysunek 2) podczas procedury fotolitografii. Stworzone chipy z mikrowzorami miały kontrolowaną liczbę i wym...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj procesy mikrofabrykacji do produkcji mikrowzorzystych chipów z oknami GO. Wykonany chip z mikrowzorem jest przeznaczony do regulacji grubości warstwy lodu szklistego poprzez kontrolowanie głębokości mikrootworu z oknami GO w zależności od wielkości analizowanego materiału. Mikrowzorzysty chip z okienkami GO został wytworzony przy użyciu szeregu technik MEMS i metody transferu nanoarkuszy 2D (ilustracja 1). Główną zaletą stosowania techniki wytwarzania MEMS jest jej zdolno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.-H.K., S.K., M.L. i J.P. dziękują za wsparcie finansowe ze strony Instytutu Nauk Podstawowych (grant nr. IBS-R006-D1). S.K., M.L. i J.P. dziękują za wsparcie finansowe ze strony Creative-Pioneering Researchers Program za pośrednictwem Seoul National University (2021) oraz grant NRF ufundowany przez rząd koreański (MSIT; Granty nr NRF-2020R1A2C2101871 oraz NRF-2021M3A9I4022936). M.L. i J.P. dziękują za wsparcie finansowe ze strony POSCO Science Fellowship Fundacji POSCO TJ Park oraz grantu NRF ufundowanego przez rząd koreański (MSIT; Nr dotacji NRF-2017R1A5A1015365). J.P. przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe z dotacji NRF ufundowanej przez rząd koreański (MSIT; Nr dotacji NRF-2020R1A6C101A183) oraz programy interdyscyplinarnych inicjatyw badawczych College of Engineering i College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. dziękuje za wsparcie finansowe z grantu NRF ufundowanego przez rząd Korei (MSIT; Nr dotacji NRF-2020R1I1A1A0107416612). Autorzy dziękują personelowi i załodze Centrum Obrazowania Makromolekularnego i Komórkowego Uniwersytetu w Seulu (SNU CMCI) za ich niestrudzone wysiłki i wytrwałość w eksperymentach krio-EM. Autorzy dziękują S. J. Kimowi z National Center for Inter-university Research Facilities za pomoc w eksperymentach FIB-SEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-metylo-2-pirolidynon (NMP)Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone443778
Aceton
AFMPark Systems, Korea PołudniowaNX-10
AlignerMidas System, Korea PołudniowaMDA-600S
AZ 300 MIF developerAZ Electronic Materials USA Corp., Stany Zjednoczone184411
UchwytCryo-EMGatan, Stany Zjednoczone626 uchwyt krio-EM z pojedynczym przechyłem
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%Alfa Aesar, Stany Zjednoczone10226590
Niskociśnieniowe chemiczne osadzanie z fazy gazowej (LPCVD)Centrotherm, NiemcyLPCVD E1200
maP1205 dodatni PRTechnologia mikrorezystu, NiemcyA15139
Wodorotlenek potasu (KOH), płatkiDAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., Korea Południowa6597-4400
Spektrometr RamanaNOST, Korea PołudniowaKonfokalny mikro system Ramana HEDA
Reaktywny wytrawiacz jonowy (RIE)Inżynieria naukowa, Korea PołudniowaZbudowany
SEMCarl Zeiss, NiemcySUPRA 55VP
Wafel SiJP COMMERCE, Korea4" Wafel krzemowy, typ P(B), (100), 1-30ohm.c m, DSP, T: 100um
Powlekarka wirowaDong Ah Trade Corp., Korea PołudniowaACE-200
TEM JEOL, JaponiaJEM-2100F
Krio-zanurzalnia Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV Mikroskopia elektronowa ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM)Firma FEI, USA Helios NanoLab 650 Wyładowczy żarówka Ted Pella Inc., Stany Zjednoczone Roztwór tlenku grafenu (GO) PELCO easiGlow Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone 763705w laboratorium Południowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424(2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293(2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991(2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942(2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456(2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544(2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216(2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Electron MicroscopyMicro Patterned ChipControlled Ice ThicknessGraphene Oxide WindowSilicon Nitride MembraneUV PhotolithographyChemical Vapor DepositionReactive Ion EtchingHigh Throughput ImagingBiomolecule Structure Analysis

Related Articles