Artykuł metodologiczny

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63742

⸱

26 lipca 2022

 , 
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering, Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry, Wroclaw University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.

Streszczenie

Obecny protokół opisuje modyfikacje ustawienia transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) do obserwacji in situ wywołanych światłem. Szklane światłowód umieszczony w kolumnie elektronowej nad nabiegunnikiem soczewki obiektywu oraz laser, regulowane źródło światła, zostały użyte do wytworzenia urządzenia. Po skalibrowaniu oświetlacza za pomocą zewnętrznego układu pomiarowego, pozwala on na dostosowanie natężenia oświetlenia do potrzeb obserwowanego procesu. Ten system oświetlenia został wykorzystany do zobrazowania zjawisk przeciwdrobnoustrojowej terapii fotodynamicznej, które są obecnie przedmiotem intensywnych badań. Próbkę przygotowano przez namiastkę zawiesiny bakterii na podłożu z węgla, grafenu lub azotku krzemu, osuszenie nadmiaru roztworu, wykrycie roztworu fotouczulacza, ponowne osuszenie nadmiaru cieczy, a następnie złożenie ciekłej komórki z drugim substratem lub folią grafenową. Sam proces eksperymentu obrazowego obejmuje wybór odpowiedniego miejsca do obserwacji z wykorzystaniem małego powiększenia i minimalnej dawki elektronów, a następnie cykliczne aktywowanie źródła światła w celu przechwytywania kolejnych obrazów w określonych odstępach czasu z minimalną ilością niezbędnych elektronów. Dawka elektronów każdej ekspozycji oraz czas i intensywność użytego oświetlenia muszą być dokładnie rejestrowane ze względu na złożoność obserwowanych zjawisk, ponieważ jednocześnie proces ten jest napędzany zarówno światłem, jak i elektronami. Po przeprowadzeniu właściwego eksperymentu należy przeprowadzić dodatkowe obserwacje kontrolne, w których stosuje się te same dawki elektronów, ale bez dodatkowego wpływu światła, a do wyższych dawek światła stosuje się mniejsze dawki elektronów. Umożliwia to odróżnienie efektów mikrostrukturalnych wywołanych światłem od tych powodowanych przez elektrony zarówno w dziedzinie nauk przyrodniczych, jak i materiałoznawstwa.

Wprowadzenie

Zjawiska wywołane światłem w wysokiej rozdzielczości są interesujące w wielu dziedzinach, takich jak nanoinżynieria1,2,3, kataliza4,5 i biofotonika6. Niektóre oryginalne projekty, które pozwalają na takie eksperymenty, można znaleźć w literaturze, w tym modyfikacje uchwytów na próbki1,4,7,8,9 oraz światłowód podłączony do mikroskopu10,11.

Połączenie oświetlenia światłem, płynnego środowiska i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) daje doskonałą okazję do szczegółowych, dynamicznych badań procesów wywołanych światłem. Jednak warunki wysokiej próżni wewnątrz mikroskopu są raczej niekorzystne dla wielu cieczy, zwłaszcza roztworów wodnych. Enkapsulacja cieczy, która chroni ją przed środowiskiem, może być osiągnięta za pomocą kilku technik opartych głównie na podłożach grafenowych12, krzemu nitride13, lub carbon14. Oprócz badań w dziedzinie materiałoznawstwa2, tak zwane komórki płynne oferują możliwości prowadzenia niekonwencjonalnych obserwacji mikroskopowych na próbkach biologicznych w pobliżu ich rodzimych warunków15. Takie obserwacje są niezwykle wymagające, zwłaszcza dla żywych mikroorganizmów, takich jak komórki bakteryjne. Wiązka elektronów jako promieniowanie jonizujące powoduje nieodwracalne uszkodzenia uwodnionych próbek, dlatego dawka elektronów musi być określona16. Jest to konieczne, aby zminimalizować niekorzystne efekty, kontrolować uszkodzenia i uniknąć mylących artefaktów. Optymalna maksymalna dawka elektronów, która pozwala na obserwacje żywych komórek, jest nadal wątpliwym tematem16, ale dawka 30 e−/nm2 wydaje się być wartością progową, przynajmniej dla bakterii17.

Niektóre z tematów interesujących dla takich badań mikroskopowych to procesy zachodzące podczas przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (APDT)18. Krótko mówiąc, terapia przebiega w następujący sposób. Komórki bakteryjne są otoczone światłoczułą cieczą zwaną fotouczulaczem. Gdy oświetlenie świetlne jest nadawane na określonej długości fali, cytotoksyczne reaktywne formy tlenu (ROS) są generowane w wyniku przeniesienia energii lub ładunku ze wzbudzonych cząsteczek fotouczulacza do tlenu naturalnie występującego w roztworze. Patogeny wystawione na działanie ROS są szybko inaktywowane z bardzo wysoką skutecznością, bez skutków ubocznych19. Odpowiedź na terapię jest różna dla różnych drobnoustrojów – na przykład wpływ tego samego fotouczulacza może być zupełnie inny dla bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych20. Ogólnie rzecz biorąc, ustalono, że głównym celem ROS są zewnętrzne struktury komórek, gdzie uszkodzenie skutkuje zaburzeniami funkcjonalnymi błony komórkowej, a w konsekwencji prowadzi do śmierci bakterii21,22. Jednak uszkodzenie kwasów nukleinowych i białek może być również uważane za przyczynę inaktywacji18, więc nadal nie wiadomo, które struktury komórkowe są głównymi celami podczas tego procesu19. Głębsze zrozumienie szkodliwych procesów może pomóc w ulepszeniu tej ostatecznej terapii. W porównaniu z metodami mikroskopii świetlnej stosowanymi w badaniach APDT23, techniki TEM dają więcej możliwości przyjrzenia się mechanizmowi APDT z wyższą rozdzielczością i powiększeniem24. TEM został już z powodzeniem wykorzystany do obserwacji komórek w trakcie trwającej terapii, co pozwoliło nam na zbadanie uszkodzeń bakterii Gram-dodatnich i szczegółowe opisanie zmian zachodzących w obrębie ściany komórkowej6,25.

Obecny protokół przedstawia odpowiednią konfigurację eksperymentalną do obrazowania w wysokiej rozdzielczości inaktywacji bakterii wywołanych światłem za pomocą TEM, co wymaga odpowiedniego systemu oświetlenia światłem, hermetyzacji komórek cieczą i ścisłej kontroli dawki elektronów. Bakterią użytą do obserwacji był Staphylococcus aureus, a jako fotouczulacz użyto roztworu błękitu metylenowego. Specjalny zestaw oświetlenia świetlnego składa się z przestrajalnego lasera półprzewodnikowego połączonego bezpośrednio z kolumną mikroskopu za pomocą światłowodu. Taka konstrukcja zapewnia równomierne napromieniowanie w całej próbce ze względu na prawie równoległe ułożenie światłowodu do osi mikroskopu. Monochromatyczne światło o dużym natężeniu generowane przez laser można następnie wykorzystać do badania różnych efektów fotochemicznych. Światło użyte w eksperymencie miało długość fali równą 660 nm, ponieważ w obszarze widzialnym błękit metylenowy ma piki absorpcyjne przy 613 nm i 664 nm26. Protokół enkapsulacji płynów oparty jest na substratach węglowych, co sprawia, że zabieg jest szybki i nieskomplikowany. Na koniec przedstawiono metodę niskodawkowej obserwacji in situ komórek w cieczy. Omówiono trudności związane z przygotowaniem próbki, wpływem dawki elektronów na wrażliwą próbkę oraz rozsądną interpretacją obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Modyfikacja transmisyjnego mikroskopu elektronowego

  1. Zmodyfikuj transmisyjny mikroskop elektronowy, podłączając światłowód (patrz Tabela materiałów) do kolumny mikroskopu w górnej części soczewki obiektywu. Pozostaw kilka centymetrów wolnej przestrzeni między soczewką obiektywu a soczewką kondensatora oraz wolną szczelinę na akcesoria.
    UWAGA: Można również zastosować dedykowany uchwyt na próbki4 lub uchwyt do obserwacji katodowych w odwrotnej konfiguracji1.
  2. Sprawdź system pod kątem wycieków za pomocą pomp próżniowych. Jeśli system nie wykazuje wycieku podciśnienia, przetestuj system w wysokiej próżni.
    1. Sprawdź, czy uruchomienie układu próżniowego nie odbiega od standardowego rozruchu mikroskopu z wentylacją. W przypadku problemów z wykonaniem, montażem lub uruchomieniem modułu należy skontaktować się z autoryzowanym serwisem lub producentem urządzenia.
      UWAGA: Prawidłowo wykonany i zamontowany iluminator nie będzie zasłaniał wiązki elektronów. Jeśli wiązka przesuwa się kolejno podczas pracy mikroskopu, światłowód nieprzewodzący nie będzie wystarczająco pokryty metalową osłoną i będzie gromadził ładunek elektryczny. W takim przypadku wsuń światłowód głęboko w płaszcz przewodzący.
  3. Zmierz natężenie światła za pomocą czujnika mocy fotodiody (patrz Tabela materiałów). Jeśli przestrzeń między biegunami soczewki obiektywu nie pozwala na pomiar wewnątrz mikroskopu, zmierz geometrię próbki i iluminatora i odtwórz te warunki w zewnętrznym zestawie pomiarowym.
  4. Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w system pomiaru dawki elektronów, należy przeprowadzić kalibrację, mierząc prąd wiązki za pomocą kubka Faradaya (patrz Tabela materiałów) i obliczając numerycznie gęstość elektronów uderzających w próbkę27.

2. Enkapsulacja bakterii za pomocą fotosensybilizatora

  1. Umieść dwie nieobrobione siatki TEM pokryte amorficznym węglem między dwiema skrzyżowanymi pęsetami skierowanymi w stronę pokrytą węglem do góry. Trzymaj siatki jak najbliżej krawędzi.
    UWAGA: W przypadku niektórych kombinacji substratów, roztworów i próbek korzystne może być użycie wyładowań jarzeniowych na jednej lub obu siatkach w celu usunięcia zanieczyszczeń fabrycznych i uzyskania maksymalnej powierzchni hydrofilowej28. Na przykładzie bakterii S. aureus i roztworu błękitu metylenowego stwierdzono, że najlepsze i najbardziej powtarzalne wyniki uzyskano na nowym, nieobrobionym węglu na siatkach miedzianych bez dodatkowego wyładowania jarzeniowego czy czyszczenia plazmowego6.
  2. Umieść 4 μl roztworu bakterii na jednej z kratek. Gęstość optyczna próbki musi mieścić się w zakresie 5-10,
    UWAGA: Bakterie użyte w badaniu zostały oczyszczone z kultury i rozproszone w buforze PBS. Zdecydowanie zaleca się sprawdzanie stężenia bakterii w świeżej próbce za każdym razem, gdy jest ona używana, np. przy użyciu metod barwienia ujemnego, zgodnie z dostępnymi ustalonymi protokołami29,30,31.
  3. Odczekaj 60 s i ostrożnie osusz płyn za pomocą bibuły filtracyjnej. Podczas tego procesu spróbuj rozprowadzić płyn po całej powierzchni siatki.
  4. Umieść 4 μl fotosensybilizatora na tej samej siatce.
    UWAGA: Jako fotouczulacz w niniejszym badaniu zastosowano błękit metylenowy w stężeniu 2 μg/ml.
  5. Po 5 s wytrzyj płyn. Pozostawić bardzo cienką warstwę płynu na podłożu.
  6. Szybko umieść suchą siatkę na tej pokrytej płynem.
  7. Delikatnie przesuń górną siatkę do krawędzi drugiej i ściśnij podłoża na krawędziach za pomocą pęsety.
    UWAGA: Na tym etapie z próbki może wypłynąć pewna ilość cieczy, co oznacza, że nie odsączono wystarczającej ilości płynu. Nie musi to jednak oznaczać, że tworzenie się płynnej komórki zakończy się niepowodzeniem.
  8. Ostrożnie powtórz ściskanie.
    UWAGA: Łatwiej jest wykonać ten krok, obracając pęsetę o 90° tak, aby leżały prostopadle do stołu, a obie końcówki pęsety pozostawały na tej samej wysokości, niezależnie od pozycji otwarcia/zamknięcia.
  9. Pozostaw płynną komórkę między pęsetą na 1 minutę.
  10. Próbkę należy umieścić w uchwycie TEM zaraz po zakończeniu przygotowania.
    UWAGA: Napięcie płyty/pierścienia montażowego uchwytu pomoże podłoża przylegać i utrzymać płyn w środku.
    1. Jeśli to możliwe, przepompuj uchwyt próbki do zewnętrznej przepompowni, aby zmniejszyć zanieczyszczenie mikroskopu przez odparowanie cieczy.

3. Obserwacje in situ TEM komórek bakteryjnych w efekcie dawki ciekłych elektronów

  1. Włóż próbkę do mikroskopu.
  2. Rozpocznij obserwacje w trybie małego powiększenia, aby znaleźć odpowiedni obszar obserwacji.
    UWAGA: Ciemniejsze obszary najprawdopodobniej są płynne z powodu rozpraszania wiązki elektronów.
    1. Podczas obserwacji utrzymuj dawkę elektronów na jak najniższym poziomie. Wydłuż czas naświetlania (do 2 s dla napięcia przyspieszającego 150 kV i powiększenia 5 000x). Powiększenie 5 000x dla kamery montowanej od dołu (przybliżone pole widzenia to 10 μm) jest wystarczające do zobrazowania bakterii o średnicy ~1 μm.
      UWAGA: Czasami nie jest łatwo odróżnić ciecz, dlatego na początku obserwacji pomocne jest skupienie wiązki elektronów w miejscu, w którym prawdopodobnie jest ona cieczą. Ciecz powinna poruszać się po skupionej wiązce elektronów, a pojawią się pęcherzyki. Po tej weryfikacji konieczne jest znalezienie kolejnego obszaru do dalszych obserwacji.
  3. Znajdź komórki otoczone cieczą w odpowiednim powiększeniu z wydłużonym czasem naświetlania i natychmiast uchwyć pierwszy obraz. Utrzymuj stałą dawkę elektronów i zbieraj obrazy co 30 sekund, aby zaobserwować zmiany.
  4. Dokładnie przyjrzyj się obrazom i oblicz całkowitą dawkę elektronów27, która odpowiada pierwszym widocznym zmianom w komórkach.

4. Obserwacje in situ TEM procesów wywołanych światłem między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ustawić natężenie światła lasera, dostosowując aktualną wartość. Wybierz odpowiednią długość fali zgodnie z widmem absorpcji fotouczulacza. Zgodnie z poprzednim wykresem kalibracyjnym (krok 1.4.) należy wybrać aktualną wartość odpowiadającą najmniejszemu natężeniu światła.
    UWAGA: Długość fali światła użyta w tym badaniu wynosiła 660 nm.
  2. Włóż próbkę do mikroskopu i znajdź obszar obserwacji, wykonując krok 3.2. w poprzednim rozdziale.
  3. Uchwyć pierwszy obraz komórki przed rozpoczęciem oświetlenia próbki i użyj wygaszacza wiązki, aby wyłączyć wiązkę elektronów, aby uniknąć skutków napromieniowania elektronów.
  4. Włącz laser. Zacznij od krótkiego czasu świecenia (tutaj 30 s), ponieważ światło lasera ma stosunkowo dużą intensywność. Po tym czasie wyłącz źródło światła.
  5. Wyłącz wygaszacz wiązki i natychmiast uchwyć obraz. Jeśli to możliwe, użyj automatycznego algorytmu, aby naświetlić próbkę tylko na czas potrzebny do wykonania obrazu. Dokładnie zmierz czas napromieniowania elektronów, aby obliczyć dawkę elektronów27 używaną do obrazowania.
  6. Powtórz kroki 4.4 i 4.5, aby uzyskać oczekiwany czas oświetlenia światłem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperymentalny układ został zaprojektowany do obserwacji procesów wywołanych światłem zachodzących w cieczy z wysoką rozdzielczością. Konkurencyjna analiza obrazów pozwoliła na odróżnienie uszkodzeń spowodowanych przez wiązkę elektronów od zmian związanych z reakcją fotochemiczną. Wpływ wiązki elektronów na wrażliwą próbkę (w tym przypadku ogniwa zamknięte cieczą) był widoczny na całym napromieniowanym obszarze, ponieważ elektrony przenikały przez niego równomiernie. Oczywiście efekt zależy od dawki elektronów, więc bar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Instalacja i uruchomienie iluminatora wymaga podstawowej wiedzy serwisowej i może spowodować uszkodzenie mikroskopu. Najprostszym sposobem wprowadzenia światła do mikroskopu jest podłączenie światłowodu od góry soczewki obiektywu, gdzie zwykle jest miejsce na cewki odchylające TEM i dodatkowe detektory. Więcej wolnej przestrzeni można również oczekiwać od starszych urządzeń z wejściem od góry, w których w tym samym miejscu znajduje się blokada próżniowa próbki i mechanizm instalacji próbki. Konfiguracja ta jest szeroko o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania były wspierane przez grant Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Narodowe Centrum Nauki, Polska).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Folia węglowa na siatce miedzianej o siatce 200Agar ScientificAGS160Standardowe siatki TEM do obserwacji i przygotowania komórek cieczy
Pęseta krzyżowaDumontN5Pęseta jest niezbędna do przygotowania komórek płynnych
Czujnik mocy fotodiodyThorLabsS130CCzujnik używany do pomiaru natężenia światła
Włókno wielomodowe powlekane poliimidemThorlabsFG400UEPMusi być wbudowany w mikroskop za pomocą adaptera wbudowanego na miejscu, zgodnie z 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmisyjny mikroskop elektronowyHitachiH-800Można go zastąpić dowolnym mikroskopem z bocznym wejściem, dostępnym do modyfikacji
Regulowany laser diodowyCNIMRL-III-660DDługość fali światła należy dobrać na podstawie widma absorpcyjnego fotouczulacza

Bibliografia

  1. Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
  2. Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
  3. Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
  4. Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705(2012).
  5. Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308(2019).
  6. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463(2021).
  7. Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
  8. Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
  9. Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
  10. Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
  11. Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
  12. Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  13. Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
  14. Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
  15. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  16. De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
  17. Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
  18. Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
  19. Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
  20. Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
  21. Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
  22. Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
  23. Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
  24. Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185(2020).
  25. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388(2021).
  26. Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
  27. Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058(2021).
  28. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
  29. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  30. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  31. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  32. Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
  33. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  34. Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

TEM in situTEM indukowany wiat emTEM z komork cieczowenkapsulacja fotouczulaczaprzeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamicznapomiar dawki elektron wobserwacja bakteriipod o e grafenowereaktywne formy tlenureakcje fotochemiczne

Powiązane artykuły