Artykuł metodologiczny

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63745

⸱

25 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Cleveland Clinic, 2Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę generowania organoidów glejaka (GBM) z pierwotnych próbek pacjentów lub hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów i utrzymywania ich do dojrzałości. Te organoidy GBM zawierają fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i odtwarzają mikrośrodowiska guza ex vivo.

Streszczenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęściej występującym pierwotnym złośliwym nowotworem mózgu o bardzo złym rokowaniu. Wewnątrznowotworowa różnorodność komórkowa i molekularna, a także złożone interakcje między mikrośrodowiskami nowotworu, mogą sprawić, że znalezienie skutecznych metod leczenia może być wyzwaniem. Tradycyjne metody hodowli adherentowej lub sferycznej mogą maskować taką złożoność, podczas gdy trójwymiarowa hodowla organoidów może podsumowywać regionalne gradienty mikrośrodowiskowe. Organoidy to metoda trójwymiarowej hodowli GBM, która lepiej naśladuje architekturę guza pacjenta, zawiera fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i może być stosowana w eksperymentach o średniej przepustowości. Chociaż trójwymiarowa hodowla organoidów jest bardziej pracochłonna i czasochłonna w porównaniu z kulturą tradycyjną, oferuje wyjątkowe korzyści i może służyć do wypełnienia luki między obecnymi systemami in vitro i in vivo. Organoidy stały się nieocenionymi narzędziami w arsenale biologów nowotworowych, aby lepiej zrozumieć zachowanie guza i mechanizmy oporności, a ich zastosowania wciąż rosną. Tutaj znajdują się szczegółowe informacje na temat metod generowania i utrzymywania organoidów GBM. Opisano również instrukcje dotyczące zatapiania i cięcia próbek organoidów przy użyciu technik zatapiania zarówno zamrożonych, jak i parafinowych, a także zalecenia dotyczące protokołów immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych na skrawkach organoidów oraz pomiaru całkowitej żywotności komórek organoidowych.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęściej występującym pierwotnym nowotworem mózgu, którego rokowanie wynosi około 15 miesięcy od diagnozy1. Terapie, które są skuteczne w badaniach przedklinicznych, często mogą być słabo skuteczne u pacjentów2,3. Słaba odpowiedź kliniczna jest przypisywana wielu czynnikom, w tym niejednorodności mikrośrodowiskowej GBM i złożonym interakcjom wewnątrznowotworowym. Mogą one być trudne do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych przy użyciu tradycyjnych metod hodowli przylegającej lub sferycznej4. Obecność podzbioru samoodnawiających się nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w GBM może również przyczyniać się do tej złożoności5,6. CSC mają kluczowe znaczenie dla propagacji guza i utrzymania wzrostu guza poprzez promowanie aktywnej angiogenezy, inwazji raka i oporności na terapie, w tym radioterapię7,8,9. CSC nie są równomiernie rozmieszczone w guzach, ale są wzbogacone w określonych mikrośrodowiskach, w tym w niszy okołonaczyniowej i regionach okołonaczyniowych, z których każdy zapewnia odrębną molekularną regulację swoich stanów komórkowych10,11,12,13,14. CSC nie są biernymi odbiorcami sygnałów mikrośrodowiskowych, ale posiadają zdolność do przebudowy własnych mikrośrodowisk7,15,16. Mikrośrodowisko CSC może sprzyjać utrzymaniu stanu komórek macierzystych w odpowiedzi na presje, takie jak niedobór składników odżywczych, pH i niedotlenie17,18,19,20, co sugeruje znaczenie tych warunków w systemie modelowym. Rekapitulacja zróżnicowanego mikrośrodowiska komórkowego w obrębie nowotworów ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia oporności terapeutycznej i zidentyfikowania nowych terapii.

Kultura trójwymiarowa zyskała na popularności w ostatnich latach21,22. Organoidy były stosowane w innych typach nowotworów, a głównym celem utrzymania komórek jako organoidów jest umożliwienie wzrostu heterogenicznych populacji komórek (z których wiele może być normalnie prześcigniętych w bardziej jednorodnej kulturze sferycznej) i różnorodności przestrzennej, postrzeganej jako regionalne mikrośrodowiska guza o swoistości genetycznej4,23,24,25,26. Istnieje wiele metod trójwymiarowej hodowli komórek nowotworowych, z których każda ma zalety i wady27,28,29. Hodowla organoidów nie ma na celu zastąpienia tradycyjnej kultury przylegającej lub sferycznej. Najlepiej stosować ją jako technikę uzupełniającą metody dwuwymiarowe, gdy istnieją konkretne pytania, w których interakcja między mikrośrodowiskiem komórki a odpowiedziami komórek nowotworowych jest krytyczna.

Ten artykuł opisuje niezawodne i powtarzalne metody generowania organoidów GBM zarówno z pierwotnych próbek pobranych od pacjentów, jak i z kultur pochodzących od pacjentów. Zajmujemy się dwoma różnymi celami trójwymiarowej hodowli organoidów: (1) tworzenie organoidów z pierwotnej tkanki pacjenta, z maksymalnym potencjałem wszczepienia niezależnie od jednorodności, lub (2) hodowanie jednolitych organoidów do bardziej ilościowego zastosowania eksperymentalnego. Przy ustalaniu próbki pierwotnej jako organoidów nie jest konieczne filtrowanie w poszukiwaniu pojedynczych komórek ani liczenie komórek, ponieważ priorytetem jest utrzymanie maksymalnej liczby i typów komórek w celu ustalenia początkowej hodowli. Jednak w przypadku hodowli organoidów do eksperymentów porównawczych konieczna jest filtracja jednokomórkowa i zliczanie komórek, aby zapewnić, że powtórzone organoidy są porównywalne pod względem spójności eksperymentalnej. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób ustanawiać hodowle organoidów i tworzyć jednolite organoidy, a także wyrafinowane metody osadzania i konserwowania organoidów oraz standardowe eksperymenty z hodowlami komórkowymi, w tym immunohistochemię, immunofluorescencję i ocenę całkowitej żywotności komórek w organoidach GBM.

Protokół

Wszystkie kroki opisanego poniżej protokołu (protokołów) zostały opracowane i przeprowadzone zgodnie z Protokołem #2559 Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB) i zatwierdzeniem Institutional Biosafety Committee (IBC) #1711. Kule i organoidy są hodowane w "Neurobasal Media Complete" (NBMc). Instrukcje znajdują się w Tabeli 1.

1. Wykonywanie form organoidowych

  1. Zdejmij papier woskowany z arkusza parafilmu (o wymiarach około 4 cm x 4 cm) i umieść go między dwiema sterylnymi 96-dołkowymi płytkami reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
    1. Wykonaj te czynności w kapturze hodowlanym i zwróć szczególną uwagę, aby "wnętrze" parafilmu (strona pokryta papierem) było czyste. Ta czysta strona powinna tworzyć wklęsłość wgłębień.
  2. Zastosuj równomierny nacisk na górną 96-dołkową płytkę PCR, aby utworzyć małe wgłębienia w parafilmie. Celem jest, aby wgłębienia miały głębokość około 2 mm bez tworzenia w parafilmie.
  3. Delikatnie oddziel dwie 96-dołkowe płytki do PCR. Parafilm z wgłębieniami przyklei się do górnej płyty. Umieść to na suchym lodzie na około 30 sekund.
  4. Po tym, jak parafilm znajduje się na suchym lodzie przez 30 s, użyj sterylnych kleszczy, aby ściągnąć parafilm z górnej 96-dołkowej płytki PCR.
    1. Podczas usuwania parafilmu używaj szybkich ruchów, zamiast być bardzo "ostrożnym". Zamrożony parafilm jest łatwiejszy do usunięcia niż podgrzany parafilm, co może spowodować odwrócenie się wgłębień.
  5. Umieść gotową formę parafilmową w przykrytym, sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm. Formy można wykonać z wyprzedzeniem i przechowywać, jeśli zachowana jest sterylność.

2. Makrodysekcja próbki tkanki pacjenta

  1. W sterylnym naczyniu do hodowli (10 cm płytki do hodowli komórkowych) użyj dwóch sterylnych żyletek, aby drobno zmielić próbkę pacjenta, wywierając równomierny nacisk.
    UWAGA: Najłatwiej jest zmielić próbkę przy około 500 μl NBMc na szalce hodowlanej. Spróbuj za pomocą żyletek zmielić kawałki tak drobno, jak to możliwe; Idealnie, pojedyncze kawałki mają 1mm3 lub mniej.
  2. Przenieś drobno zmielone kawałki guza do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą przeciętej końcówki pipety p1000.
    UWAGA: Podczas pracy z organoidami ważne jest, aby używać wyłącznie końcówek do pipet Cut p1000. Można je przyciąć ostrą brzytwą do żądanego rozmiaru otworu (około 5 do 8 mm) i sterylizować w autoklawie.
  3. Dodać 2 ml roztworu do odrywania komórek o temperaturze pokojowej (RT) (tabela materiałów) i umieścić go w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na około 10 minut
    UWAGA: Obserwuj i mieszaj co kilka minut. Niektóre roztwory lub próbki do oddzielania komórek mogą wymagać różnych czasów inkubacji. Jeśli pojawi się zbrylanie, które może wskazywać na uwolnienie DNA w wyniku lizy komórek, natychmiast przejdź do następnego kroku.
  4. Dodać 8 ml pożywki NBMc, aby zneutralizować roztwór do odrywania komórek i wirować przez 3 minuty w temperaturze 65 x g.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić tkankę w 1-2 ml NBMc.

3. Generowanie organoidów z pierwotnej tkanki pacjenta

UWAGA: Celem tworzenia organoidów z pierwotnej tkanki pacjenta jest stworzenie trójwymiarowej hodowli. Nie filtruj pojedynczych komórek ani nie zliczaj komórek, ale utrzymuj początkowe obciążenie komórek tak równomiernie, jak to możliwe, za pomocą kontroli wizualnej. To normalne, że występuje niejednorodność we wzroście i tworzeniu początkowych organoidów. Każdy organoid będzie miał objętość 20 μl (16 μl bogatej w lamininę macierzy zewnątrzkomórkowej (lrECM) i 4 μl tkanki zawieszonej w NBMc, od kroku 2.5). Instrukcje mogą być dostosowane do przeznaczonej liczby organoidów; Celem jest zazwyczaj uformowanie około 20-30 organoidów z pierwotnych próbek pacjentów.

  1. W wiaderku na lód lub zimnym bloku umieść lrECM i małą probówkę wirówkową. Umieścić odpowiednią ilość lrECM (16 μl x X liczba przeznaczonych organoidów) do małej probówki wirówkowej.
  2. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny tkankowej z kroku 2.5 (4 μl x liczba zamierzonych organoidów) do probówki wirówkowej na lodzie.
  3. Ostrożnie odpipetować 20 μl mieszaniny lrECM/zawiesiny komórek na formy parafilmowe; w ten sposób utworzy się perłowa kropla.
    1. Należy pamiętać o dokładnym wymieszaniu mieszaniny lrECM/zawiesiny komórkowej; komórki mają tendencję do łatwego osadzania się w lrECM, co skutkuje powstawaniem niejednorodnych organoidów.
    2. Mieszaninę lrECM/zawiesiny komórkowej należy przechowywać na lodzie. Jeśli lrECM się ogrzeje, może polimeryzować i zagrozić tworzeniu organoidów. Pamiętaj, aby schłodzić końcówkę pipety co dwa do trzech organoidów, aby zapobiec polimeryzacji lrECM. Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza do organoidów (unikaj "podwójnego wciskania" pipety).
  4. Po odpipetowaniu żądanej liczby organoidów na formę parafilmową na 10-centymetrowej płytce do hodowli komórkowej, przykryć pokrywką płytki i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-2 godziny.
  5. Po zestaleniu się organoidów użyj pożywki NBMc, aby delikatnie wypłukać je z formy parafilmu i umieścić na nowej, sterylnej 10 cm płytce hodowlanej z 20 ml NBMc ogółem. Użycie końcówki p1000 najlepiej sprawdza się do wypłukania organoidów z formy; będą się delikatnie zsuwać.
    UWAGA: Kiedy organoidy są wypłukiwane z pleśni do płytek do kultur komórkowych, powinny być widoczne w pożywce jako małe różowe kulki. Jeśli wydaje się, że organoidy rozpadły się lub rozpadły w pożywce, wskazuje to na wcześniejszy problem z polimeryzacją lrECM, a organoidy mogą nadal rosnąć, ale jest bardzo mało prawdopodobne, aby były jednorodne pod względem wielkości.
  6. Umieścić 10 cm naczynie do hodowli w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (bez wstrząsania) na 4 dni.
    UWAGA: Umieszczenie organoidów na wytrząsarce orbitalnej w pierwszych dniach może spowodować ich rozpad. Upewnij się, że nie trzęsą się do 4 dnia.
  7. Po 4 dniach wymienić pożywkę i umieścić na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 80 obr./min w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    1. Wymiana pożywek z niedojrzałymi organoidami jest trudna, ponieważ są one trudne do wizualizacji. Przechyl naczynie do hodowli komórkowych i odczekaj co najmniej 20 sekund; organoidy osiądą na dnie i pozwolą na powolne usuwanie pożywki z góry za pomocą szklanej lub plastikowej pipety o pojemności 10-20 ml.
    2. Zwróć szczególną uwagę na zbiór organoidów na dole; jeśli wydają się one poruszone siłą usuwania pożywki, najlepiej zatrzymać się i pozwolić im się ponownie zasiedlić. W miarę dojrzewania organoidów i ich łatwiejszego do wizualizacji proces ten staje się mniej zniuansowany.
      UWAGA: Czasami umieszczenie kawałka ciemnego papieru pod płytką do hodowli komórkowej może pomóc w wizualizacji niedojrzałych organoidów. Zaleca się, aby nie używać pipety Pasteura z odsysaniem próżniowym do usuwania pożywki, ponieważ w ten sposób organoidy bardzo łatwo są zassane i utracone.
    3. Kiedy organoidy są zakładane po raz pierwszy, nie zużywają pożywki tak szybko, jak dojrzałe organoidy. Począwszy od 50% wymiany pożywek, zmniejsza się niepotrzebne zużycie pożywek i zmniejsza się ryzyko przypadkowego uszkodzenia lub aspiracji nowych organoidów podczas procesu wymiany pożywki.

4. Generowanie organoidów z ustalonej sfery GBM, przylegającej lub hodowli organoidów

UWAGA: Celem tutaj jest stworzenie organoidów o jednakowej wielkości i ilości komórek do wykorzystania w eksperymentach porównawczych, więc użyj filtra jednokomórkowego i policz komórki, aby to zapewnić.

  1. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z hodowli sferycznej GBM.
    UWAGA: Hodowle sferyczne komórek GBM są utrzymywane w pożywkach NBMc.
    1. Umieść kulki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i wiruj z prędkością 120 x g przez 5 minut.
    2. Usunąć supernatant i dodać 2 ml roztworu do odrywania komórek RT. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 minuty.
    3. Dodaj 8 ml pożywki NBMc, aby zneutralizować roztwór do odrywania komórek. Przecedzić przez sitko jednokomórkowe (70 μm) i wirować przez 5 minut w masie 120 x g.
    4. Usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić pozostałe komórki w ~1 ml NBMc. Policz komórki (używając nieprzewidzianego barwienia komórek) i przejdź do kroku 4.4.
  2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z hodowli adherentnej GBM.
    1. Usunąć zużytą pożywkę z płytki, dodać do płytki 2 ml roztworu do odrywania komórek RT i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 minuty.
    2. Potwierdzić pod mikroskopem, że komórki są odłączone od płytki.
    3. Dodaj 8 ml pożywki NBMc, aby zneutralizować roztwór do odrywania komórek. Przecedzić przez sitko jednokomórkowe (70 μm).
      UWAGA: Odcedzanie pojedynczych komórek jest opcjonalne podczas pracy z przylegającą hodowlą.
    4. Wirować przez 5 minut przy 120 x g. Usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić pozostałe komórki w ~1 ml NBMc. Policz komórki (używając nieprzewidzianego barwienia komórek) i przejdź do kroku 4.4.
  3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z hodowli organoidów GBM.
    1. Przenieść organoidy za pomocą przeciętej końcówki pipety p1000 na 10-centymetrową płytkę hodowlaną i ostrożnie usunąć jak najwięcej pozostałej pożywki.
    2. Używając dwóch sterylnych maszynek do golenia, ostrożnie drobno zmiel organoidy. Za pomocą przeciętej końcówki p1000 przenieś zmielone organoidy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj ~2-3 ml pożywki NBMc.
    3. Wirować z prędkością 120 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant (zaleca się użycie końcówki do pipety zamiast odsysania próżniowego w przypadku tej części).
    4. Dodać 2 ml roztworu do odklejania zimnych komórek przez 10 min.
      UWAGA: Roztwór do odrywania komórek należy stosować bezpośrednio od 4 °C, nie podgrzewać go upierd. Wydaje się, że zmiękcza to pozostały matrigel i pomaga w regeneracji komórek.
    5. Następnie przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C na 10-20 minut, obserwując i mieszając co kilka minut. Jeśli pojawi się zbrylanie, które może wskazywać na lizę komórek, natychmiast przejdź do następnego kroku.
    6. Dodać 8 ml pożywki NBMc, aby rozcieńczyć roztwór do oddzielania komórek. Przecedzić przez sitko jednokomórkowe (70 μm) i wirować przez 5 minut w temperaturze 120 x g.
    7. Usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić pozostałe komórki w ~1 ml NBMc. Policz komórki (używając barwienia nieprzeznaczonego do oznaczania komórek) i przejdź do kroku 4.4.
  4. Wytwarzanie organoidów z zawiesiny jednokomórkowej
    1. W wiaderku na lód lub zimnym bloku umieść lrECM i małą probówkę wirówkową. Umieścić odpowiednią ilość lrECM (16 μl x X liczba przeznaczonych organoidów) do małej probówki wirówkowej.
    2. Stwórz mieszaninę komórek o całkowitej objętości (4 μl x X liczba zamierzonych organoidów), która będzie zawierać 20 000 komórek/organoid i dodaj ją do małej probówki wirówkowej z lrECM na lodzie.
    3. Ostrożnie odpipetować 20 μl mieszaniny lrECM/zawiesiny komórek na formy parafilmowe; w ten sposób utworzy się perłowa kropla.
      1. Należy pamiętać o dokładnym wymieszaniu mieszaniny lrECM/zawiesiny komórkowej, ponieważ komórki mają tendencję do łatwego osadzania się w lrECM, co spowoduje powstanie niejednorodnych organoidów.
      2. Mieszaninę lrECM/zawiesiny komórkowej należy przechowywać na lodzie. Jeśli lrECM się ogrzeje, może polimeryzować i zagrozić tworzeniu organoidów.
      3. Pamiętaj, aby schłodzić końcówkę pipety co dwa do trzech organoidów, aby zapobiec polimeryzacji lrECM. Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza do organoidów (unikaj "podwójnego wciskania" końcówki pipety).
    4. Po odpipetowaniu żądanej liczby organoidów na formę parafilmową na 10 cm płytce hodowlanej, inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    5. Po zestaleniu się organoidów należy użyć pożywek NBMc, aby delikatnie wypłukać je z formy parafilmu i umieścić na nowej, sterylnej 10 cm płytce hodowlanej z 20 ml NBMc ogółem. Użycie końcówki p1000 najlepiej sprawdza się do wypłukiwania organoidów z formy; będą się delikatnie zsuwać.
      UWAGA: Zaleca się około 15-20 organoidów na 10 cm naczynie hodowlanej.
    6. Umieść 10 cm naczynie hodowlane w inkubatorze (bez wstrząsania) na 4 dni.
    7. Po 4 dniach wymienić pożywkę i umieścić na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 80 obr./min w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie wymieniaj nośniki co 2-3 dni.
      1. Wymiana pożywek z niedojrzałymi organoidami jest trudna, ponieważ są one trudne do wizualizacji. Przechyl naczynie do hodowli komórkowych i odczekaj co najmniej 20 sekund; Organoidy osiądą na dnie i pozwolą na powolne usuwanie pożywki z góry za pomocą szklanej pipety o dużym otworze.
      2. Zwróć szczególną uwagę na zbiór organoidów na dole; jeśli wydają się one poruszone siłą usuwania pożywki, zatrzymaj się i pozwól im się ponownie zadomowić. W miarę dojrzewania organoidów i ich łatwiejszego do wizualizacji proces ten staje się mniej zniuansowany.
        UWAGA: Czasami umieszczenie kawałka ciemnego papieru pod płytką do hodowli komórkowej może pomóc w wizualizacji niedojrzałych organoidów. Nie używaj pipety Pasteura z odsysaniem próżniowym do usuwania pożywki, ponieważ w ten sposób organoidy bardzo łatwo mogą zostać zassane i utracone.
      3. Kiedy organoidy są zakładane po raz pierwszy, nie zużywają pożywki tak szybko, jak dojrzałe organoidy. Zacznij od 50% wymiany pożywek, aby ograniczyć niepotrzebne zużycie pożywek i zmniejszyć ryzyko przypadkowego uszkodzenia lub aspiracji nowych organoidów podczas procesu wymiany pożywki.

5. Osadzanie krioemów

  1. Umieść każdy organoid w osobnej probówce o pojemności 1,5 ml (za pomocą naciętej końcówki p1000) zawierającej 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Organoidy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku zatapiania organoidów w parafinie należy przejść do sekcji 6.
  2. Po utrwaleniu przez noc w 4% PFA, trzykrotnie umyć organoidy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Przenieść organoid do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (za pomocą odciętej końcówki pipety p1000) zawierającej 1 ml 30% sacharozy w wodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Dodaj niewielką ilość (zwykle 1-2 ml) związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do krioformy, przykrywając dno i wypełniając około 1/3 do 1/2 głębokości formy.
  5. Przenieś pojedynczy organoid do kriomoldu za pomocą przeciętej końcówki pipety p1000. Spowoduje to przeniesienie niektórych pożywek z organoidem, co jest nieuniknione. Użyj mniejszej końcówki pipety, aby ostrożnie usunąć otaczające podłoże, nie naruszając organoidu.
    UWAGA: Może to być trudne do zobrazowania, ale powolne pipetowanie wykaże wyraźną różnicę w gęstości między pożywką a OCT, więc do pewnego stopnia odbywa się to "na wyczucie").
  6. Umieść kriomold na tacy z suchym lodem. OCT zacznie zamrażać, stając się w tym procesie nieprzezroczysty.
  7. Dodaj dodatkowe OCT, aby całkowicie pokryć organoid, wypełniając resztę objętości krioformy. Bloki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania przez kilka dni lub w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania przez czas nieokreślony.

6. Osadzanie parafiny

  1. Sortuj organoidy według wielkości (małe organoidy mają poniżej 3 mm, duże organoidy mają ponad 3 mm). Przenieść każdy organoid do kasety histologicznej za pomocą przeciętej końcówki pipety p1000 i przetworzyć na wosk parafinowy zgodnie z tabelą 2 lub tabelą 3.
    UWAGA: Rozmiar/konfiguracja kasety histologicznej zależy od użytkownika.
  2. Przenieś organoidy z kaset do form do zatapiania z 1-2 ml stopionego wosku parafinowego i schładzaj, aż wosk stanie się półstały.
  3. Gdy wosk częściowo zastygnie, dodaj więcej wosku na wierzch formy. Umieść oznaczoną górną część kasety na formie i przenieś ją na zimną płytę. Kontynuuj chłodzenie, aż wosk całkowicie zestali.
  4. Gdy wosk zastygnie, podziel blok na sekcje za pomocą mikrotomu. Alternatywnie przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C w celu późniejszego cięcia.

7. Immunofluorescencja (IF)

  1. Odparafinować i ponownie uwodnić skrawki tkanek zatopione w parafinie o wielkości 5-12 μm za pomocą naczynia do barwienia szkiełek, zgodnie z poniższymi krokami.
    UWAGA: W przypadku stosowania skrawków organoidów osadzonych w OCT zalecamy użycie skrawków 12 μm. Usunąć OCT, potrząsając szkiełkiem w PBS przez 30 minut. Przejdź do kroku 7.2.
    1. Inkubować przez 5 minut w ksylenie. Powtórz to jeszcze dwa razy. Następnie inkubować przez 10 minut w 100% etanolu. Powtórz to jeszcze raz.
    2. Inkubować przez 10 minut w 95% etanolu. Powtórz jeszcze raz. Umyj sekcje w wodzie destylowanej przez 5 minut, dwa razy.
  2. W celu zdemaskowania antygenu zanurz szkiełka w 1x roztworze demaskującym cytrynian (tabela materiałów) i mikrofaluj w temperaturze poniżej wrzenia na 10 minut. Upewnij się, że nie pozwól, aby roztwór się zagotował.
    UWAGA: Najlepiej osiągnąć to, jeśli początkowo podgrzewa się w kuchence mikrofalowej przez ~ 2 minuty, aż nastąpi wrzenie, a następnie zmniejsza moc i obserwuje, czy roztwór nie wykipi. Preferowana temperatura demaskowania to nieco poniżej 100 °C, a najlepiej 98 °C.
  3. Pozwól szkiełkom ostygnąć przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 1x roztworze demaskującym cytrynian.
    UWAGA: To jest ten sam 1x roztwór cytrynianu; Na tym etapie nie trzeba wymieniać roztworu.
  4. Myj szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 minut, dwa razy.
  5. Myj szkiełka w 1x TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem z 0,1% Tween 20) przez 5 minut.
  6. Wyjmij szkiełka z TBST i ostrożnie osusz je wokół skrawków tkanek za pomocą laboratoryjnej chusteczki czyszczącej, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia sekcji tkanki. Gdy szkiełko jest wystarczająco suche, zakreśl skrawki tkanek za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
  7. Zablokuj każdą sekcję 100-400 μl 10% roztworu blokującego surowicę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wybierz roztwór blokujący surowicę na podstawie przeciwciała drugorzędowego. Na przykład, jeśli używasz przeciwciała drugorzędowego wytworzonego u osła, użyj 10% normalnej surowicy osła w 1x TBST.
  8. Usunąć roztwór blokujący, a następnie dodać 100-400 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego do pożądanego stężenia w roztworze blokującym.
  9. W temperaturze 4 °C inkubować skrawki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc.
  10. Usunąć roztwór przeciwciała pierwotnego i umyć szkiełka w 1x TBST przez 5 minut, trzy razy.
  11. Dodać 100-400 μl przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczenie 1:1000 w roztworze blokującym lub zgodnie ze wskazówkami producenta) do każdej sekcji i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  12. Myj szkiełka w 1x TBST przez 5 minut, dwa razy. Następnie umyj szkiełka w 1x PBS przez 5 minut.
  13. Wyjmij szkiełka z PBS i osusz je wokół skrawków tkanek za pomocą laboratoryjnej chusteczki czyszczącej. Dodaj kilka kropel płynnego utwardzacza i ostrożnie zamontuj szklane szkiełko nakrywkowe. Po wyschnięciu szkiełek przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem, aż będą gotowe do obrazowania.

8. Immunohistochemia

  1. Odparafinować i ponownie nawodnić skrawki tkanek zatopionych w parafinie za pomocą naczynia do barwienia szkiełkowego, zgodnie z poniższymi krokami.
    UWAGA: Jeśli używasz skrawków organoidów osadzonych w OCT, usuń OCT, potrząsając szkiełkiem w PBS przez 30 minut. Przejdź do kroku 8.2.
    1. Inkubować przez 5 minut w ksylenie. Powtórz jeszcze dwa razy.
    2. Inkubować przez 10 minut w 100% etanolu. Powtórz jeszcze raz.
    3. Inkubować przez 10 minut w 95% etanolu. Powtórz jeszcze raz.
    4. Myj sekcje w wodzie destylowanej przez 5 minut, dwa razy.
  2. W celu zdemaskowania antygenu zanurz szkiełka w 1x roztworze demaskującym cytrynian i mikrofaluj w temperaturze poniżej wrzenia na 10 minut. Upewnij się, że nie dopuścić do wrzenia roztworu.
  3. Pozostaw szkiełka do ostygnięcia przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 1x roztworze demaskującym cytrynian.
  4. Myj szkiełka przez 5 minut w wodzie destylowanej, trzy razy.
  5. Inkubować szkiełka przez 10 minut w 3% nadtlenku wodoru.
  6. Myj szkiełka przez 5 minut dwukrotnie w wodzie destylowanej.
  7. Myj szkiełka przez 5 minut w 1x TBST.
  8. Wyjmij szkiełka z 1x TBST, a następnie użyj rogu laboratoryjnej chusteczki do czyszczenia, aby dokładnie wysuszyć wokół skrawków tkanki.
  9. Po wyschnięciu szkiełka zakreśl skrawki tkanki hydrofobowym pisakiem barierowym.
  10. Umieścić 100-400 μl roztworu blokującego na każdej sekcji w kręgu długopisu bariery hydrofobowej w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Użyj 10% normalnej surowicy osła (NDS) lub 0,75% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w 1x TBST.
  11. Następnie usuń roztwór blokujący i dodaj 100-400 μl przeciwciała pierwszorzędowego do każdej sekcji. Rozcieńczyć to pierwszorzędowe przeciwciało do pożądanego stężenia za pomocą odpowiedniego rozcieńczalnika producenta.
  12. Inkubować skrawki w temperaturze 4 °C przez noc. Usunąć roztwór przeciwciała pierwotnego i umyć szkiełka w 1x TBST przez 5 minut, trzy razy.
  13. Dodać 100-400 μl odczynnika do wykrywania IHC do każdej sekcji i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wybierz odczynnik do wykrywania IHC zgodnie z przeciwciałem pierwszorzędowym.
  14. Umyj każdą sekcję 1x TBST przez 5 minut, dwa razy, a następnie 1x PBS przez 5 minut raz.
  15. Przygotować roztwór 3,3-diaminobenzydyny (DAB) zgodnie ze wskazówkami producenta. Dodaj 100-400 μl roztworu DAB do każdej sekcji tkanki i uważnie monitoruj pod mikroskopem. Od 1 do 10 minut zapewni akceptowalną intensywność barwienia; Pamiętaj, aby zanotować ten czas i zachować spójność dla wszystkich odcinków tkanki.
  16. Po osiągnięciu pożądanej intensywności barwienia zanurz szkiełka w wodzie destylowanej.
  17. Wykonać barwienie przeciwbarwiące hematoksyliną i odwodnienie szkiełka do montażu zgodnie z instrukcjami w Tabeli 4.
  18. Zdjąć szkiełko z substytutu ksylenu (tabela materiałów) i zetrzeć nadmiar płynu wokół sekcji tkanki za pomocą laboratoryjnej chusteczki czyszczącej. Użyj niewielkiej ilości trwałego podłoża montażowego, aby zamocować szkiełko nakrywkowe na sekcji tkanki i pozostawić do wyschnięcia.

9. Pomiar całkowitej żywotności komórek

  1. Przenieś każdy organoid do probówki o pojemności 2 ml i za pomocą małej końcówki pipety ostrożnie usuń cały nadmiar pożywki wokół organoidu (patrz Rysunek 3 dla schematu tej procedury).
    UWAGA: Testy żywotności komórek muszą być wykonywane na organoidach, które zostały wykonane z identycznej liczby komórek. Eksperyment ten nie powinien być przeprowadzany na organoidach wykonanych bezpośrednio z próbek pobranych od pacjentów po operacji, z cięcia organoidów o różnych formach lub w innych przypadkach, w których pojedyncze komórki nie zostały przefiltrowane i policzone.
  2. Przygotować odczynnik do oznaczania żywotności komórek luminescencyjnych i 1x PBS w stosunku 1:1 i dodać 500 μl do każdej probówki.
  3. Użyj końcówki do pipety p1000, aby agresywnie pipetować w górę iw dół, aby rozbić organoid i odstawić na 5 minut. Organoid powinien być już nieco zdysocjowany i bardziej miękki; Powtórz mieszanie z końcówką pipety P1000.
  4. Celem jest uzyskanie 100 μl całkowitej objętości na studzienkę na płytkę 96-dołkową. Dodać 25 μl mieszaniny z etapu 9.3 (wystarczy na wiele kontrprób technicznych) i dodać 75 μl pozostałej próby żywotności komórek luminescencyjnych i mieszaniny PBS.
  5. Umieść płytkę na wytrząsarce na 2 minuty, a następnie inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odczytaj płytkę za pomocą ustawienia luminescencji na czytniku płytek i zbierz dane (patrz Rysunek 4).

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia wczesny wzrost organoidów obserwowany za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 10x. Rysunek 1A pokazuje migrację i inwazję pojedynczych komórek przez lrECM w widoku centralnym. Komórki będą nadal namnażać się i „kolonizować” lrECM, stając się gęstszymi i w końcu nieprzezroczystymi w ocenie wizualnej. Rysunek 1B przedstawia kilka dojrzałych organoidów (w 7. tygodniu) bez powiększenia, w odniesieniu do rozmiaru monety o nominale 10 centów.

Rysunek 2 przedstawia barwienie immunohistochemiczne organoidów GBM na fosfo-histon H3, będący markerem aktywnej proliferacji. Większość komórek o wysokiej zdolności do proliferacji widoczna jest na obwodzie organoidu w porównaniu z jego rdzeniem. Barwienie pozytywne będzie miało brązowy/miedziany kolor.

Rycina 3 opisuje proces homogenizacji i pomiaru całkowitej liczby komórek w organoidach GBM przy użyciu luminescencyjnego testu żywotności komórek dedykowanego strukturą 3D. Ze względu na wysoką liczbę komórek obecnych w organoidach GBM, większa struktura organoidu jest początkowo homogenizowana poprzez triturację w odczynniku do testu luminescencyjnego. Następnie frakcje całkowitego lizatu organoidu są przenoszone do poszczególnych studzienek i rozcieńczane dodatkowym odczynnikiem do testu luminescencyjnego przed inkubacją i odczytem na odpowiednim czytniku płytek wielodołkowych.

Rysunek 4 przedstawia dane kontrolne dla organoidów z użyciem DMSO (powszechny nośnik). Wykreślone dane wykazują spójność wewnątrzorganoidową oraz międzyorganoidową. Przy generowaniu danych eksperymentalnych dane dotyczące żywotności luminescencyjnej będą zazwyczaj normalizowane względem kontroli dla każdego preparatu.

Mikroskopowy wzrost grzybni; porównanie rozmiaru z monetą, schemat; badanie morfologii i wielkości grzybni.
Rysunek 1: Obraz z mikroskopu świetlnego (10x). (A) Wczesny wzrost organoidów wykazujący migrację/inwazję komórek GBM w bogatej w lamininę macierzy zewnątrzkomórkowej. (B) Dojrzałe organoidy w odniesieniu do rozmiaru monety. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przekrój histologiczny, barwiona tkanka, analiza mikroskopowa, struktura komórkowa, powiększony widok wstawkowy.
Rysunek 2: Immunohistochemia organoidów GBM. (A, B) Organoidy GBM wykazujące komórki barwione na fosfo-histon H3 w celu oceny aktywnej proliferacji. Paski skali wynoszą odpowiednio 600 µm dla A i 300 µm dla B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat testu żywotności organoidów: hodowla, tryturacja, rozcieńczanie odczynników, pomiar luminescencji.
Rycina 3: Protokół luminescencyjnego pomiaru żywotności komórek dla organoidów. (A) Przenieść poszczególne organoidy do małych probówek wirówkowych i usunąć nadmiar pożywki. (B) Do każdej probówki dodać 500 µL mieszaniny PBS i odczynnika do luminescencyjnego testu żywotności komórek w stosunku 1:1, a następnie intensywnie pipetować w celu rozbicia organoidu. (C) Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodać 25 µL tak przygotowanej mieszaniny organoidów oraz 75 µL tej samej mieszaniny PBS i odczynnika do luminescencyjnego testu żywotności komórek w stosunku 1:1. (D) Umieścić na wytrząsarce na 2 min, następnie inkubować przez 20 min w RT, a potem zmierzyć luminescencję za pomocą czytnika płytek. Rycina wykonana przy użyciu BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres żywotności komórek organoidów w 0,1% DMSO; analiza danych dotycząca relatywnych jednostek światła.
Rycina 4: Żywotność komórek. Dane dotyczące żywotności komórek organoidów w 0,1% dimetylosulfotlenku (DMSO) dla sześciu powtórzeń technicznych czterech organoidów z próbek pochodzących od czterech pacjentów. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

KomponentIlość
pożywka Neurobasal bez czerwieni fenolowej500 mL
suplement B-27 bez witaminy A (50x)10 ml
Antybiotyk-antymykotyk (100x)5 ml
pirowinian sodu (100 mM)5 ml
Glutamina w 0,85% NaCl (200 mM)5 mL
Rekombinowany ludzki FGF podstawowy (250 µg/mL)20 µL
Rekombinowane ludzkie białko EFG (250 µg/mL)20 µL
Czerwony fenol500 µL

Tabela 1: Skład kompletnego medium Neurobasal (NBMc)

OdczynnikCzas
50% etanol3 min
75% etanol3 min
95% etanol3 min
95% etanol4 min
100% etanol2 min
100% etanol3 min
Etanol 100%4 min
Zamiennik ksylenu2 min
Zamiennik ksylenu3 min
Zamiennik ksylenu4 min
Parafina15 min
Wosk parafinowy15 min

Tabela 2: Harmonogram przetwarzania małych organoidów (o średnicy poniżej 3 mm)

OdczynnikCzas
50% etanol6 min
75% etanol6 min
95% etanol5 min
95% etanol8 min
100% etanol5 min
100% etanol5 min
100% etanol8 min
Zamiennik ksylenu5 min
Zamiennik ksylenu5 min
Zamiennik ksylenu8 min
Wosk parafinowy30 min
Wosk parafinowy30 min

Tabela 3: Harmonogram przetwarzania dużych organoidów (o średnicy powyżej 3 mm)

OdczynnikCzas
Hematoksylina2 min
Bieżąca diH2O2 min
Odczynnik do klarowania hematoksyliny jądrowej1 min
Bieżąca diH2O1 min
Odczynnik do błękitnienia1 min
Bieżąca diH2O2 min
70% etanol1 min
100% etanol1 min
100% etanol1 min
Zamiennik ksylenu2 min
Zamiennik ksylenu2 min

Tabela 4: Kontrastowanie hematoksyliną

Dyskusja

Organoidy GBM są metodą hodowli komplementarną do tradycyjnych sfer, która obejmuje większą heterogeniczność komórkową i mikrośrodowiskową 4,22,30. Chociaż hodowla organoidów jest bardziej czasochłonna i zasobożerna, może dostarczyć cennych informacji na temat zachowania wewnątrz guza i mechanizmów oporności na leki.

GBM jest napędzany przez populację CSC 5,31, a metody te zostały opracowane, aby umożliwić ciągły wzrost i samoodnowę tej populacji CSC. Wiadomo, że naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) poprawiają utrzymanie i wzrost komórek macierzystych oraz zapewniają sygnalizację aktywnej receptorowej kinazy tyrozynowej (RTK). Tworzenie heterogenicznych populacji komórkowych i odrębnych mikrośrodowisk nowotworowych w obrębie guzów GBM opiera się na wspieraniu zachowań CSC. Wybór lrECM naśladuje bogate w lamininę środowisko mózgu i wspiera komórki w hodowli organoidów w samoorganizacji i migracji przez inwazję. Chociaż niektóre grupy ustaliły hodowlę organoidów bez użycia pożywki wzbogaconej o lrECM lub EGF/FGF24,28, które mogą oferować bardziej efektywny czasowo sposób tej metody hodowli i silniejszą selekcję sygnalizacji onkogennej w celu stymulowania wzrostu, metody te zostały wybrane w celu optymalizacji środowiska komórek macierzystych, aby jak najlepiej ustalić heterogeniczność komórkową organoidów. Zarówno organoidy mózgowe, jak i organoidy GBM zostały wykonane z lrECM w literaturze wcześniej 21,32,33. Chociaż ustaliliśmy dane dotyczące populacji guzów znalezionych w organoidach i zmienności przestrzennej, mniej wiadomo o populacjach nienowotworowych w organoidach i o tym, jak długo przeżywają one od oryginalnych próbek pacjentów. Niektóre barwniki IHC (takie jak CD45) mogą dostarczyć tych danych i mogą być interesującym punktem badań w przyszłości nad organoidami.

Znajomość przeznaczenia hodowli organoidów jest ważna dla wyboru odpowiednich metod. Tworzenie organoidów z próbek pierwotnych w porównaniu z hodowlą jednolitych organoidów do określonych eksperymentów ma nieco inne procedury. Zrozumienie tego, w jaki sposób organoidy dojrzewają i wizualnie wypełniają rusztowanie lrECM, jest ważne, aby móc przeznaczyć odpowiedni czas i zasoby na hodowlę organoidów. Rzadkie regiony komórek w organoidach będą się powoli rozszerzać i rosnąć, aby wypełnić lrECM, co może zająć od 2 do 8 tygodni, w zależności od zachowania próbki. To tempo wzrostu jest w pewnym stopniu nieodłączne od każdego okazu; Jest zachowany w różnych partiach organoidów i dość zgodny ze względnym tempem wzrostu kuli. Organoidy mogą być utrzymywane przez ponad 1 rok i zachowują zdolność do tworzenia guza na ksenoprzeszczepie u myszy; Zaleca się jednak ich uprawę w określonym celu, aby nie marnować zasobów laboratoryjnych (zarówno materiałów, jak i czasu)4. Wzrost organoidów został przetestowany w wielu rozmiarach i formatach dołków i pokazuje, że płytka o średnicy 10 cm jest idealnym miejscem do utrzymania optymalnej żywotności komórek, a następnie płytka 6-dołkowa z trzema organoidami na studzienkę34. Organoidy zużywają więcej pożywek w porównaniu z ich dwuwymiarowymi odpowiednikami z kultur, a użycie mniejszego formatu studzienki nie prowadzi do właściwej konserwacji. Na przykład jedna studzienka z 96-dołkową płytką nie ma wystarczającej ilości miejsca lub objętości podłoża w stosunku do wielkości organoidu, aby podtrzymać wzrost organoidów.

Jak pokazują organoidy, bycie spostrzegawczym jest ważne dla zwiększenia sukcesu. Początkowo organoidy będą zużywać pożywkę powoli, ale gdy staną się gęstsze i bardziej dojrzałe, będą zużywać pożywkę szybciej. Dodanie czerwieni fenolowej do pożywki może służyć jako wskaźnik zużycia mediów. Kiedy pożywka jest bardziej żółta, może to skłonić nas do dostosowania wzorca karmienia, niezależnie od tego, czy chodzi o wymianę większej objętości pożywki, zwiększenie całkowitej ilości pożywki na płytce, podzielenie organoidów na wiele płytek do hodowli komórkowych, aby nadążyć za ich wzrostem, czy nawet dostosowanie harmonogramu eksperymentów.

Pod wieloma względami organoidy są nieefektywnym sposobem prowadzenia badań nad rakiem. Wiążą się one z długimi skalami czasowymi, są kosztowne i wymagają dużych zasobów w porównaniu z kulturą sfery GBM. Jednak w porównaniu z ksenoprzeszczepami pochodzącymi od pacjentów, alternatywną metodą odtwarzania różnorodności komórkowej i mikrośrodowiskowej, są one prostsze, tańsze i łatwiejsze do kontrolowania. Wybór najlepszych metod stosowania organoidów jest ważny dla badaczy nowotworów. Nie mają one na celu zastąpienia tradycyjnej sfery lub kultury przylegającej, ani nie mają na celu zastąpienia modeli ksenoprzeszczepów. Organoidy mogą, jeśli zostaną zastosowane do właściwego pytania naukowego, połączyć korzyści z obu tych systemów i mogą pozwolić nam obserwować biologię komórek nowotworowych, która w przeciwnym razie pozostałaby ukryta. Społeczność naukowa dopiero zaczyna rozumieć, jakie możliwości uczenia się oferują organoidy, ale jasne jest, że w przyszłości będą one nieocenionym narzędziem do zrozumienia złożonej biologii GBM.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Justinowi Lathii za jego nieocenione rady i nieustające wsparcie. Dziękujemy również Katrinie Fife, Lisie Wallace i Mayi Camhi za ich doskonałe wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabletki 3,3-diaminobenzydyny (DAB)MP Biomedicals08980681Tabletki 3,3-diaminobenzydyny (DAB)
96-dołkowe płytki PCRThermoFisher Scientific96-dołkowe płytki PCR
AccutaseThermoFisher ScientificSCR005Roztwór do odrywania komórek
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczyThermoFisher Scientific15240062Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy
suplement B-27 minus witamina AThermoFisher Scientific12587001Suplement B-27 minus witamina A (50x)
Odczynnik GelCode Blue StainThermoFisher Scientific24590Odczynnik do niebieszczenia
Sitko do komórek (70 &mikro; m)CellTreat Scientific229483Sitko do komórek (70 &mikro; m)
CellTiter-Glo 3DPromegaG9681Test żywotności komórek luminescencyjnych
Clarifier 2ThermoFisher Scientific7301Odczynnik do klarowania hematoksyliny jądrowej
Clear-Rite 3Substytut ksylenuThermoFisher Scientific6901
Epredia Gill 2 HematoxylinThermoFisher Scientific72504Glutamina hematoksyliny
w 0,85% NaClThermoFisher Scientific35050061Glutamina w 0,85% NaCl (200 mM)
MatrigelThermoFisher Scientific354234Macierz zewnątrzkomórkowa wzbogacona w lamininę
Mini długopis PAPThermoFisher Scientific008877Hydrofobowy długopis barierowy
Podłoże montażoweThermoFisher Scientific22-050-102Podłoże montażowe
Neurobasal podłoże bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific12349015Pożywka neurobazalna minus czerwień fenolowa (500 ml)
Normalna surowica osła (NDS)Jackson ImmunoResearch017-000-121Normalna surowica osła (NDS)
Paraformaldehyd 4% w PBSThermoFisher ScientificAAJ19943K2Paraformaldehyd 4% w PBS
Czerwień fenolowaSigmaP0290Czerwień fenolowa (0,5%)
ProLong Gold Antifade Mountant z DAPIThermoFisher ScientificP10144Płynny utwardzany uchwyt
Rekombinowane ludzkie białko EGFR& Systemy D236-EG-01MRekombinowane ludzkie białko EGF (250 &mikro; g / mL)
Rekombinowany ludzki FGF zasadowyR& Systemy D4144-TC-01Rekombinowany ludzki FGF zasadowy (250 &mikro; g / mL)
SignalStain Rozcieńczalnikprzeciwciał Sygnalizacja komórkowa8112Rozcieńczalnik przeciwciał
SignalStain Boost Odczynnik do wykrywania IHCSygnalizacja komórkowa8114Odczynnik do wykrywania immunohistochemii
Roztwór demaskujący cytrynian SignalStainSygnalizacja komórkowa14746Roztwór demaskujący cytrynian
Żyletka jednokrawędziowaUlineH-595BPojedyncza krawędź żyletka
Pirogronian soduThermoFisher Scientific11360070Pirogronian sodu (100 mM)
Tissue-Tek CryomoldsVWR25608-916Jednorazowe krioformy
Tissue-Tek O.C.T. CompoundVWR25608-930Mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificT10282Barwnik nieprzepuszczalny komórkowy (0,4%)
KsylenThermoFisher ScientificX3P-1GALKsylen

Bibliografia

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7(2018).
  3. Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
  4. Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
  5. Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
  6. Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
  7. Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
  8. Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
  9. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  10. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).
  11. Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
  12. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
  13. Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
  14. Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
  15. Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
  16. Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
  17. Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
  18. Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
  19. Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
  20. Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
  21. Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416(2021).
  22. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
  23. da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
  24. Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  25. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  26. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  27. Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  28. Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322(2021).
  29. Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255(2021).
  30. Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101(2021).
  31. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  32. Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
  33. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  34. Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy glejaka wielopostaciowegomikro rodowisko guzaimmunohistochemiaimmunofluorescencjaywotno kom rekzawiesina jednokom rkowaanaliza FACS
Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.