Analiza komórek T pomocniczych wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów w mysim modelu nadwrażliwości kontaktowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą i ustandaryzowaną metodę analizy podzbioru T pomocniczego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów in vivo.

Streszczenie

Równolegle do tradycyjnych linii Th1/Th2/Th17/Treg, komórki T pomocnicze (Th-GM) wytwarzające czynniki stymulujące tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów zostały zidentyfikowane jako odrębny podzbiór komórek pomocniczych T (GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- efektorowych limfocytów T CD4⁺) u ludzi i myszy. Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) jest uważana za doskonały model zwierzęcy alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD) u człowieka, objawiający się nienaruszoną odpowiedzią immunologiczną za pośrednictwem limfocytów T. Aby zapewnić standaryzowany i kompleksowy test do analizy podzbioru komórek Th-GM w zależnej od limfocytów T odpowiedzi immunologicznej in vivo, mysi model CHS został wywołany przez uczulenie/prowokację reaktywnym, organicznym haptenem o niskiej masie cząsteczkowej, 2,4-dinitrofluorobenzenem (DNFB). Podzbiór Th-GM w efektorowych limfocytach T CD4 ⁺ powstałych po immunizacji haptenem analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Odkryliśmy, że Th-GM był głównie rozszerzony w zmianach i drenujących węzłach chłonnych w mysim modelu CHS indukowanym przez DNFB. Metoda ta może być stosowana do dalszych badań biologii komórek Th-GM oraz badań farmakologicznych strategii terapeutycznych skoncentrowanych na GM-CSF w różnych stanach, takich jak ACD.

Wprowadzenie

Limfocyty T CD4 wytwarzające czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (GM-CSF) - podzbiór Th-GM - wyłaniają się jako odrębny podzbiór limfocytów pomocniczych T u ludzi i myszy i uważa się, że zawierają "tylko ekspresję GM-CSF" (GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^-) Limfocyty T CD4 zidentyfikowane przez analizę RNA pojedynczej komórki, cytometrię masową i mapowanie losu GM-CSF myszy ^1,2,3. W 2014 roku Sheng i in. opisali programowanie przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji 5 (STAT5) podzbioru Th-GM i po raz pierwszy skonceptualizowali podzbiór "Th-GM" ^4,5. Komórki Th-GM charakteryzują się ekspresją cytokin GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 i receptorami chemokiny C-X-C typu receptora chemokiny (CXCR) 4 lub CXCR6^1,2. STAT i/lub szlak NF-κB są niezbędne do różnicowania linii Th-GM. Opracowano metodę in vitro w celu różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 w komórki Th-GM przy użyciu IL-7 w obecności bodźców TCR⁶. Tymczasem wykazano, że cytokiny IL-23 i IL-1β utrzymują ekspresję i patogenność komórek Th-GM ex vivo^3,7.

Podwyższony poziom komórek Th-GM jest związany z kilkoma chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak stwardnienie rozsiane i reumatoidalne zapalenie stawów^2,8,9, co sugeruje potencjalną rolę w patogenezie autoimmunizacji¹⁰. Coraz więcej dowodów sugeruje, że GM-CSF może działać jako mediator stanu zapalnego. Myszy z genetyczną nadekspresją Csf2 (gen kodujący GM-CSF) w limfocytach T CD4 ⁺ spontanicznie rozwinęły deficyty neurologiczne, którym towarzyszyła infiltracja fagocytów do ośrodkowego układu nerwowego. W modelu zapalenia jelita grubego z transferem limfocytów T adoptywny transfer limfocytów T Csf2^−/− do myszy Rag1^−/− znacznie zmniejszył kliniczne i histopatologiczne cechy choroby. Istnieje jednak niewiele doniesień na temat roli podgrupy Th-GM w chorobach alergicznych, takich jak ACD.

ACD jest jednym z najczęstszych stanów zapalnych dermatologicznych o wysokim rozpowszechnieniu w środowisku pracy i życia^11,12. Jest to reakcja nadwrażliwości typu IV typu opóźnionego, w której pośredniczy nienaruszony obwód immunologiczny, który rozwija się w dwóch czasowo segmentowanych fazach: uczuleniu i wywołaniu. ACD u ludzi jest wywoływane przez narażenie na niektóre chemikalia (hapteny lub metale), które prowadzą do uczulenia. Podczas tej fazy odpowiedź za pośrednictwem limfocytów T jest inicjowana przez kompleksy hapten-białko prezentowane przez komórki prezentujące antygen. Po kolejnym narażeniu na ten sam hapten, specyficzne dla haptenu limfocyty T efektorowe i pamięci są reaktywowane i lokalizują się w skórze, proces obejmujący infiltrację różnych populacji komórek odpornościowych. Ta ostra reakcja zapalna jest znana jako wywołanie, powodująca pełny rozwój zmian chorobowych¹³. ACD u ludzi można badać za pomocą zwierzęcych modeli nadwrażliwości kontaktowej (CHS)¹⁴.

Model CHS indukowany przez reaktywny, organiczny hapten o niskiej masie cząsteczkowej, 2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB), jest powszechnie używanym modelem mysim, który został wykorzystany w badaniach nad patologią, jak również w potencjalnych interwencjach terapeutycznych klasy ACD15^,16. W związku z tym ten model zależny od limfocytów T można zastosować do badania wytwarzania podzbioru Th-GM w chorobie alergicznej. Tutaj wyindukowaliśmy mysi model CHS z DNFB, przeanalizowaliśmy wytwarzanie Th-GM w zmianach chorobowych i drenujących węzłach chłonnych i stwierdziliśmy, że podzbiór Th-GM został głównie rozszerzony po ponownym narażeniu na ten sam hapten. Sugeruje to, że podzbiór Th-GM może być niezbędny do rozwoju ACD i stanowi specyficzny cel terapeutyczny w ACD.

Protokół

Wszystkie myszy wykorzystane w tym protokole były na tle genetycznym C57BL/6, trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów i zaopatrzone w jedzenie i wodę ad libitum. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez organ oceny etycznej dobrostanu zwierząt Centrum Medycznego Zachodnich Chin Uniwersytetu Syczuańskiego (20210302059).

1. Przygotowanie odczynnika i materiału

1. 0,5% roztwór DNFB jako środek uczulający
   1. W celu uczulenia 10 myszy przygotuj 1,1 ml mieszaniny acetonu i oliwy z oliwek w proporcji 4:1 (v/v): mieszając 880 μl acetonu i 220 μl oliwy z oliwek, aby 0,1 ml nadmiaru objętości uwzględniło wszelkie niewielkie ubytki objętości. Dodać 5 μl DNFB do 1,1 ml homogenizowanej mieszaniny acetonu i oliwy z oliwek w proporcji 4:1.
      UWAGA: Przygotować na świeżo w dniu uczulenia. Mieszaninę acetonu i oliwy z oliwek należy przygotować w dygestorium.
2. Rozwiązanie 0,2% DNFB jako pretendent
   1. Aby rzucić wyzwanie 10 myszom, dodaj 0,5 μl DNFB do 0,25 ml homogenizowanej mieszaniny acetonu i oliwy z oliwek w proporcji 4:1 opisanej w kroku 1.1. Użyj mieszaniny acetonu i oliwy z oliwek 4:1 jako nośnika podczas rzucania wyzwania myszom po uczuleniu.
      UWAGA: Mieszaninę acetonu i oliwy z oliwek należy przygotować w dygestorium.
3. Hydrat chloralu jako środek znieczulający
   1. Rozpuścić 4 g wodzianu chloralu w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać 8% roztwór roboczy. Filtrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Użyj 5 μl na g masy ciała dla myszy.
4. 50x kolagenaza IV kolby
   1. Rozpuścić 100 mg kolagenazy dożylnej w 1 ml zasadowej pożywki RPMI 1640 (nieuzupełnionej antybiotykami lub płodową surowicą bydlęcą [FBS]) w celu uzyskania zapasu 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 100 μl przez okres do 6 miesięcy.
5. 1,000x DNase I stock
   1. Rozpuścić 5 mg DNazy I w 1 ml 0,15 M NaCl, aby uzyskać zapas 5 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 100 μl przez okres do 6 miesięcy.
6. Bufor zatrzymania
   1. Rozpuść 1,681 g EDTA w 50 ml podstawowej pożywki RPMI 1640, aby uzyskać 100 mM zapasu. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
7. Medium do mycia
   1. Rozpuścić 0,372 g EDTA do końcowego stężenia 2 mM i 5 ml FBS do końcowego stężenia 1% w 500 ml PBS. Filtrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
8. Bufor do barwienia
   1. Rozpuścić 0,372 g EDTA do końcowego stężenia 2 mM i 10 ml FBS do końcowego stężenia 2% w 500 ml PBS. Filtrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
9. Odczynniki restymulujące
   1. Rozpuścić 1 mg 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) w 20 ml DMSO, aby uzyskać 50 μg/ml bulionu (500x) i przechowywać w temperaturze -20 °C w 50 μl podwielokrotności.
   2. Rozcieńczyć 250 μl jonomycyny w roztworze (4 mg/ml) w 7,75 ml DMSO, aby uzyskać zapas 500 μg/ml (500x) i przechowywać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 50 μl.
   3. Podwielokrotność 1 ml roztworu inhibitora transportu białek (zawierającego brefeldynę A) w 50 μl i przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C.

2. Indukcja CHS u myszy

1. W dniu -5 znieczulij myszy, wstrzykując dootrzewnowo 400 mg/kg hydratu chloralu.
2. Za pomocą golarki dla zwierząt ogol obszar na brzuchu myszy o szerokości 2 cm × 2 cm.
   UWAGA: Unikaj drapania skóry myszy; Utrzymuj integralność bariery skórnej w stanie nienaruszonym.
3. Delikatnie i równomiernie rozsmaruj 100 μl 0,5% roztworu DNFB na ogolonych brzuchach za pomocą mikropipety z jednorazowymi końcówkami. Trzymaj myszy przez 5-10 sekund, aby część rozpuszczalnika odparowała.
4. W dniu -4 powtórz kroki 2.1-2.3 dla kolejnego uczulenia.
   UWAGA: Dwa zdarzenia uczulające działają lepiej niż jedno.
5. W dniu 0 należy przeciągnąć do prawego ucha myszy 20 μl 0,2% DNFB za pomocą mikropipetora z jednorazowymi końcówkami i potraktować lewe ucho taką samą ilością mieszaniny acetonu i oliwy z oliwek w proporcji 4:1 jak w nośniku.
   UWAGA: Rzuć wyzwanie grzbietowej i brzusznej stronie ucha równą objętością DNFB lub nośnika.
6. W ciągu następnych 3 dni codziennie mierz grubość prawego i lewego ucha myszy za pomocą miernika grubości tarczy i oblicz wzrost grubości ucha: grubość prawego ucha - grubość lewego ucha.
   UWAGA: Stopniowy wzrost grubości uszu można zaobserwować w 0,2% uszach myszy z zaburzeniem DNFB w porównaniu z uszami leczonymi nośnikiem.

3. Próbka myszy CHS

1. W dniu 3 znieczulij myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 400 mg/kg hydratu chloralu. Odczekaj 5-10 minut, aż mysz znajdzie się w stanie nieprzytomności i delikatnie uszczypnij obie tylne łapy, aby potwierdzić, że myszy są głęboko znieczulone.
2. Zrób zdjęcie każdego ucha z każdej myszy za pomocą aparatu. Oceń inkrustacja (łuszczenie się na uchu) i zaczerwienienie ucha (rumień na uchu) niezależnie, aby ocenić nasilenie stanu zapalnego w skali od 0 do 5: 0, brak; 1, nieznaczny; 2, umiarkowany; 3, oznaczone; 4, bardzo zaznaczone; 5, najcięższe.
3. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Odetnij całe ucho i wypreparuj równolegle drenujące węzły chłonne myszy za pomocą sterylnych ostrych nożyczek i kleszczy. Umieścić tkanki w jednym dołku 6-dołkowej płytki umieszczonej na lodzie zawierającym 5 ml wstępnie schłodzonego PBS w celu dysocjacji enzymatycznej lub fizycznej w celu wytworzenia zawiesin jednokomórkowych (rysunek uzupełniający S1A i rysunek uzupełniający S2A).
4. W celu analizy histologicznej utrwal próbki ucha w 4% paraformaldehydzie, odwodnij je i zanurz w parafinie w celu barwienia immunohistochemicznego, jak opisano w innym miejscu¹⁷.

4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z uszu

1. Rozłup brzuszną i grzbietową stronę ucha, ściskając i rozrywając odcięte końce dwoma zakrzywionymi kleszczami (rysunek uzupełniający S1B). Umieść je w studzience na 6-dołkowej płytce zawierającej 4,5 ml buforu wytrawiającego, upewniając się, że tkanki te są całkowicie zanurzone w buforze do wytrawiania (rysunek uzupełniający S1C).
   UWAGA: Bufor wytrawiający składał się z RPMI 1640 zawierającego 10% FBS + 25 mM HEPES + 2 mg/ml kolagenazy IV + 5 μg/ml DNazy I.
2. Inkubować listki z uszu w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Wyciąć listki z uszu nożyczkami tak małymi, jak to możliwe, aby ułatwić trawienie tkanek (rysunek uzupełniający S1D) i umieścić próbkę z powrotem w inkubatorze na kolejne 40 minut
   UWAGA: Efektywne trawienie można osiągnąć w ciągu 40-50 minut. Nadmierne trawienie w temperaturze 37 °C wpływa na żywotność komórek.
3. Dodać 0,5 ml buforu zatrzymującego na studzienkę, aby zneutralizować aktywność enzymatyczną kolagenazy IV i DNazy I. Wykonaj kolejne kroki na lodzie.
4. Przenieść fragmenty tkanek ucha za pomocą pary zakrzywionych kleszczyków do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej sitko do komórek o pojemności 70 μm i odpipetować całą objętość pożywki do tego samego sitka do komórek.
5. Rozbić tkanki za pomocą górnego końca tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Dociśnij okrężnymi ruchami do sitka komórkowego o wielkości 70 μm, aż pozostaną tylko białe tkanki łączne (rysunek uzupełniający S1D).
6. Przepłukać sitka dwukrotnie 1 000 μl medium myjącego. Przenieść całą objętość studzienki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml przez sitko o pojemności 40 μm. Trzymaj probówkę na lodzie.

5. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z drenujących węzłów chłonnych (dLNs)

1. Przenieś węzły chłonne za pomocą pary zakrzywionych kleszczy do sitka do komórek o wielkości 70 μm na górze dołka płytki 6-dołkowej (rysunek uzupełniający S2B). Odciąć węzły chłonne za pomocą górnego końca tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Dociskaj okrężnymi ruchami do sitka komórkowego o średnicy 70 μm, aż pozostaną tylko białe zanieczyszczenia (rysunek uzupełniający S2C).
2. Przepłukać sitko komórkowe dwukrotnie 1 000 μl środka myjącego. Przenieść całą objętość studzienki do probówki o pojemności 5 ml. Trzymaj probówki na lodzie.

6. Ponowna stymulacja podzbioru Th-GM za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu (PMA)/jonomycyny w obecności inhibitora transportu białek

1. Odwirować komórki wyizolowane z ucha i próbek węzłów chłonnych drenujących przez 8 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Delikatnie zawiesić osad z 1 000 μl podłoża myjącego.
2. Zbierz niewielką część każdej próbki, aby policzyć całkowitą liczbę komórek pochodzących z ucha i drenującego węzła chłonnego za pomocą hemocytometru. Dodaj 0,04% błękitu trypanowego, aby zmierzyć żywotność komórek.
   UWAGA: Żywotność komórek powinna wynosić ponad 60% dla późniejszej stymulacji i analizy limfocytów T. Gęstość komórek może wynosić 1-5 × 10⁶/ml.
3. Odwirować komórki w kroku 6.1 i odrzucić supernatant. Delikatnie ponownie zawiesić osad z 1 000 μl pożywki RPMI 1640 zawierającej 2% FBS i zasiać 1 ml zawiesiny jednokomórkowej (10⁶ komórek/ml) w 12-dołkowych płaskodennych płytkach do hodowli tkankowych.
4. Dodać 2 μl 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) (końcowe stężenie 100 ng/ml), 2 μl jonomycyny (końcowe stężenie 1 000 ng/ml) i 1 μl inhibitora transportu białek (zawierającego Brefeldinę A) do każdego dołka na 12-dołkowej płytce zawierającej 1 ml zawiesiny jednokomórkowej powyżej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.

7. Analiza podzbiorów Th-GM generowanych in vivo przez barwienie powierzchni komórki i wewnątrzkomórkowe

1. Przenieś stymulowane komórki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Odwirować probówki wirówkowe przez 8 minut w temperaturze pokojowej 400 × g i odrzucić supernatant.
2. Przemyć osad komórkowy raz 1 ml buforu barwiącego i osadzać komórki przez odwirowanie, jak opisano w kroku 7.1. Ponownie zawiesić komórki w temperaturze 1-10 × 10⁶/ml w 0,5 ml buforu barwiącego.
3. Dodać 0,5 μl roztworu podstawowego barwnika żywotności (patrz tabela materiałów) do 0,5 ml zawiesiny komórek i natychmiast odwirować. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml buforu barwiącego i powtórzyć wirowanie w kroku 7.1 w celu osadzenia komórek.
4. Zawiesić osad w 0,1 ml buforu barwiącego. Dodać 1 μl przeciwciała anty-CD4 (sprzężonego z FITC), 1 μl przeciwciała anty-CD44 (sprzężonego z APC) i 1 μl przeciwciała anty-CD62L (sprzężonego PE/cyjaniny7) do trzech podwielokrotności zawiesiny komórkowej po 0,1 ml. Natychmiast wykonać wir i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem.
5. Powtórz mycie i odwirowanie w kroku 7.3.
6. Zawiesić osad w 200 μl buforu utrwalającego IC i inkubować przez 20 minut w ciemności. W międzyczasie przygotuj bufor permeabilizacyjny (1x) rozcieńczając 1 część buforu permeabilizacyjnego (10x) 9 częściami wody destylowanej. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml buforu permeabilizacyjnego (1x) przez odwirowanie przy 600 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Zawiesić osad w 0,1 ml buforu permeabilizacyjnego (1x) z przeciwciałami przeciwko GM-CSF (sprzężony z PE, 1 μL/test), IFN-γ (sprzężony z BV711, 1 μL/test), IL-17A (sprzężony z BV421, 1 μL/test) i IL-22 (PerCP/cyjanina 5,5-sprzężona, 5 μL/test) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
8. Powtórzyć płukanie i odwirowanie w kroku 7.6.
9. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS i przenieść zawiesinę do probówki okrągłodennej. Uruchom wybarwione komórki w cytometrze przepływowym.

8. Strategia bramkowania dla identyfikacji podzbioru Th-GM

1. Przeanalizuj dane cytometrii przepływowej (szczegółowe informacje na temat używanego oprogramowania znajdują się w tabeli materiałów) przy użyciu strategii bramkowania zilustrowanej na rysunku uzupełniającym S1. W przypadku używanego tutaj oprogramowania pobierz je i zainstaluj na komputerze.
2. Zaimportuj dane cytometrii przepływowej, klikając Plik |Otwórz | Zaimportuj pliki FCS do oprogramowania i dodaj adnotacje do grupy i nazwy każdej próbki, wybierając kartę Zmień nazwę.
3. Wybierz limfocyty na wykresie FSC w porównaniu z SSC (FSC ^niski SSC ^niski, P1), aby wykluczyć zanieczyszczenia znajdujące się w lewym dolnym rogu i komórki szpikowe o dużym rozmiarze i dużej ziarnistości, klikając wykres gęstości i pokaż oś X tego wykresu jako FSC-A, a oś Y jako SSC-A.
4. Kliknij dwukrotnie zdarzenia w P1, aby wygenerować kolejny wykres gęstości, a następnie oddziel pojedyncze komórki (pokazane jako skorelowana linia, P2) od agregacji komórek, wybierając wysokość i obszar komórki na tym wykresie (oś X jako FSC-A a oś Y jako FSC-H).
5. Kliknij dwukrotnie zdarzenia w P2, aby wygenerować kolejny wykres gęstości i wyświetlić oś X tego wykresu jako FSC-A, a oś Y jako SSC-A. Bramka żywotnych populacji komórek za pomocą zdarzeń FVS 780^- (P3).
6. Kliknij dwukrotnie zdarzenia w P3, aby wygenerować następny wykres gęstości (oś X jako CD4-A i oś Y jako SSC-A) i rozróżnij limfocyty T CD4, wybierając populację CD4 ⁺ (P4).
7. Kliknij dwukrotnie zdarzenia w P4, aby wygenerować kolejny wykres gęstości (oś X jako CD44-A i oś Y jako CD62L-A) i zdefiniuj komórki pomocnicze T efektora, wybierając populację w prawym górnym rogu tego wykresu (CD62L-CD44⁺, P5).

9. Analiza statystyczna

1. Wykonaj analizy statystyczne, porównując dwie grupy za pomocą niesparowanego testu t. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 i **** P < 0,0001 (średnia ± SD).

Wyniki

CHS (nadwrażliwość kontaktowa) wywołana przez DNFB u myszy
Aby wywołać CHS u myszy, myszy uczulono i prowokowano DNFB nałożonym na skórę ucha, jak pokazano na Rysunek 1A. Grubość ucha, wskaźnik gąbczastej skorbioty naskórka, była znacznie zwiększona u myszy z propozycją DNFB w porównaniu z myszami leczonymi podłożem (Figura 1B, 70 vs 3 μm w dniu 1, 203 vs 7,5 μm w dniu 2, 276 vs 5 μm w dniu 3). Siedemdziesiąt dwie godziny po prowokacji prawe ucho myszy wykazywa...

Dyskusja

Protokół ten zapewnia prosty test in vivo do analizy generowania i rozszerzania podzbioru komórek Th-GM. Niezbędne jest wykorzystanie modelu choroby za pośrednictwem limfocytów T u myszy zainicjowanej przez hapteny lub antygeny, naśladując tę aktywację u człowieka. DNFB jest drobnocząsteczkowym haptenem, który jest bardziej ekonomiczny i oszczędza czas niż antygeny peptydowe lub białkowe w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej limfocytów T in vivo^18,19

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,4-dinitrofluorobenzen	BT ODCZYNNIK	P0001746	NR CAS: 70-34-8
Aceton	CHRON CHEMICALS	/	67-64-1
anty-CD4	Biolegend	300506	1:100 Rozcieńczone
przeciwciało anty-CD44	Biolegend	103012	1:100 Rozcieńczone
przeciwciało anty-CD62L	Biolegend	104417	1:100 Rozcieńczone
przeciwciało anty-GM-CSF	BD Bioscience	554507	1:100 Rozcieńczone
przeciwciało anty-IFN-γ	Biolegend	505836	1:100 Rozcieńczone
przeciwciało anty-IL-17A	BD Bioscience	563354	1:100 Rozcieńczone
przeciwciało anty-IL-22	Biolegend	516411	5 &mikro; L/test
CD45	Biolegend	103101	1:200 Rozcieńczony
hydrat chloralu	CHRON CHEMICALS/		302-17-0
Miernik grubości zegara (typ 0,01 mm)	PEACOCK	G-1A	/
DMSO	LIFESCIENCES	D8371	67-68-5
EDTA Na2	Solarbio	E8030	6381-92-6
F4/80	Biolegend	123102	1:200 Rozcieńczona
plama żywotności do naprawienia 780	BD Bioscience	565388	1:1,000 Rozcieńczony barwnik żywotności
Cytometr przepływowy	BD Bioscience	BD FACS ARIA II Pryzmat SORP	/
GraphPad Oprogramowanie		GraphPad Prism 7	Oprogramowanie do statystyki i wykresów
Zestaw do wewnątrzkomórkowego utrwalania i permeablacji	Thermo Fisher	88-8824-00	świeżo przygotowany
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407951	Nr CAS: 56092-81-0
Ly6G	Biolegend	127602	1:200 Dilutied
NovoExpress	Agilent	/	Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Oliwa z oliwek	YUANYE BIO	S30503	8001-25-0
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	NR CAS: 16561-29-8
Inhibitor transportu białek (zawierający Brefeldin A)	BD Bioscience	555029	1 i mikro; L/ml