Artykuł metodologiczny

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

DOI:

10.3791/63759

⸱

14 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak miastenia (MG), wiąże się z dysfunkcją połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ), która jest trudna do scharakteryzowania w modelach zwierzęcych ze względu na fizjologiczne różnice między zwierzętami a ludźmi. Inżynieria tkankowa oferuje możliwości dostarczania modeli in vitro funkcjonalnych ludzkich NMJ, które można wykorzystać do diagnozowania i badania patologii NMJ oraz testowania potencjalnych środków terapeutycznych. Poprzez włączenie białek optogenetycznych do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), wygenerowaliśmy neurony, które mogą być stymulowane za pomocą określonych długości fal świetlnych. Jeśli NMJ jest zdrowy i funkcjonalny, sygnał neurochemiczny z neuronu ruchowego powoduje skurcz mięśni. Dzięki integracji optogenetyki i mikrofabrykacji z inżynierią tkankową opracowaliśmy bezstronną i zautomatyzowaną metodologię charakteryzowania funkcji NMJ za pomocą analizy wideo. Opracowano ustandaryzowany protokół tworzenia NMJ, stymulacji optycznej z jednoczesnym zapisem wideo oraz wideoanalizy kurczliwości tkanek. Stymulacja optogenetycznych neuronów ruchowych za pomocą światła w celu wywołania skurczów mięśni szkieletowych podsumowuje ludzką fizjologię NMJ i pozwala na wielokrotne pomiary funkcjonalne NMJ w czasie i w odpowiedzi na różne dane wejściowe. Wykazujemy zdolność tej platformy do wykazywania funkcjonalnej poprawy łączności nerwowo-mięśniowej w czasie i charakteryzujemy szkodliwy wpływ przeciwciał MG lub neurotoksyn pacjenta na funkcję NMJ.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to chemiczna synapsa między neuronami ruchowymi (MN) a komórkami mięśni szkieletowych (SkM), która umożliwia skurcz mięśni. Toksyny, takie jak neurotoksyna α-bungarotoksyna (BTX) lub choroby nerwowo-mięśniowe (NMD), takie jak miastenia (MG) mogą prowadzić do zwyrodnienia NMJ i zmniejszenia kontroli mięśni1. Bioinżynieryjne modele tkanek ludzkich lepiej odwzorowują funkcjonalne i fizjologiczne mechanizmy ludzkich NMJ i oferują większy potencjał translacyjny niż modele zwierzęce.

Podczas gdy modele zwierzęce pogłębiły zrozumienie powstawania i funkcji NMJ, istnieją znaczące różnice między ludzkimi i zwierzęcymi synapsami, które ograniczają tłumaczenie wyników na ludzi i sprawiają, że charakterystyka NMJ in vivo jest trudna2,3,4. Badania wykazały wyraźne różnice fizjologiczne między mysim i ludzkim NMJ. Myszy mają większe NMJ i mniejsze zagęszczenie stref aktywnych w porównaniu z ludzkimi NMJs4. Ponadto badania leków prowadzone na modelach zwierzęcych nie zawsze odzwierciedlają efekty stwierdzone w badaniach klinicznych na ludziach. Zmodyfikowane modele tkanek ludzkich dają możliwość badania zdrowego rozwoju NMJ i patologii chorób nerwowo-mięśniowych oraz pozwalają na badania przesiewowe leków. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)5 można różnicować na różne typy komórek, w tym komórki mięśni szkieletowych6,7 i motoneurons8,9. hiPSC można łatwo generować z komórek pacjenta, co pozwala na lepsze modelowanie choroby10 i badanie przesiewowe leków11,12 za pomocą modeli tkanek specyficznych dla pacjenta.

Dwuwymiarowe (2D) jednowarstwowe kokultury SkMs i MN nie mają morfologii, fenotypu, organizacji i funkcjonalnego zachowania fizjologicznych NMJ. NMJ losowo tworzą się w hodowli 2D, co hamuje izolację jednostek motorycznych do analizy, ogranicza dokładne pomiary funkcjonalne i uniemożliwia ich użycie do powtarzalnych, systematycznych eksperymentów13. Trójwymiarowe (3D) modele tkankowe NMJ przezwyciężają wiele z tych ograniczeń, rekapitulując morfologiczne i funkcjonalne cechy fizjologicznych NMJs7,14,15,16,17. Korzystając z tego modelu, oba typy tkanek są opracowywane oddzielnie, a następnie integrowane poprzez kierowanie wzrostem aksonów, co pozwala na rozwój bardziej zorganizowanych NMJ w porównaniu z systemami hodowli 2D.

Nasze poprzednie badanie wykazało, że połączenie optogenetyki z inżynierią tkankową pozwala na dokładną, nieinwazyjną stymulację i ocenę funkcji NMJ18,19. Dzięki inżynierii genetycznej białka wrażliwe na światło mogą zostać zintegrowane z genomem hiPSC. Integracja rodopsyny kanałowej-2 (ChR2), kanału jonowego, który otwiera się w odpowiedzi na niebieskie światło, z błoną pobudliwych komórek, takich jak neurony, pozwala na bezkontaktową kontrolę czasoprzestrzenną nad aktywacją komórek20,21,22. hiPSC przenoszące ChR2 mogą być zróżnicowane na optogenetyczne neurony ruchowe wrażliwe na niebieskie światło, eliminując potrzebę typowych inwazyjnych elektrod, które stymulują neurony i unikając niepożądanej stymulacji komórek mięśniowych przez elektrody23. System ten wykorzystuje optogenetyczne neurony ruchowe do stymulowania skurczów w nieoptogenetycznych komórkach mięśni szkieletowych. Połączenie akwizycji wideo i kontrolowanego oświetlenia światłem niebieskim pozwala na jednoczesną stymulację i rejestrację współhodowanych tkanek pod kątem funkcji NMJ.

MG jest wywoływane przez autoprzeciwciała skierowane przeciwko nikotynowym receptorom acetylocholiny (AChR), co skutkuje zmniejszeniem funkcji NMJ i osłabieniem mięśni24. Rozpoznaje się ją na podstawie przedstawionych objawów, elektrodiagnostyki i wykrywania autoprzeciwciał za pomocą serologicznych badań krwi. Jednak nie wszystkie autoprzeciwciała zaangażowane w MG zostały zidentyfikowane, a u niektórych pacjentów seronegatywnych diagnozuje się MG, ale bez rozpoznanych przeciwciał25,26. Nasz system pozwala na ponowną ocenę funkcjonalną NMJ przed i po dodaniu surowicy od pacjentów z MG, dostarczając bezcennego wglądu w funkcjonalne i biochemiczne zmiany spowodowane przez przeciwciała MG18. Nasz protokół ilustruje, jak tworzyć modele 3D in vitro funkcjonalnego ludzkiego NMJ, które można wykorzystać do diagnozowania i badania patologii NMJ oraz testowania potencjalnych środków terapeutycznych. Demonstrujemy wszechstronność systemu na dwóch platformach, urządzeniu mikroprzepływowym i większej platformie bioreaktora z otwartą studnią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie linie komórkowe do tej pracy zostały stworzone i użyte zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Columbia, NY, USA.

1. Przygotowanie bioreaktora

  1. Wykonaj formy do bioreaktorów
    1. Pobierz plik CAD bioreaktora z dodatkowego pliku CAD lub utwórz własny projekt.
    2. Wygeneruj ścieżkę narzędzia CNC z modelu 3D za pomocą oprogramowania CAM.
    3. Obróbka form acetalowych za pomocą frezarki CNC.
  2. Produkcja bioreaktorów
    1. Wymieszaj mieszaninę bazy 10:1 z utwardzaczem polidimetylosiloksanu (PDMS, 77 g mieszaniny na 4 platformy/formy).
    2. Umieść mieszaninę w komorze próżniowej, zamknij wszystkie zawory, włącz podciśnienie i odgazowuj mieszaninę przez co najmniej 30 minut, aż nie pozostaną pęcherzyki powietrza. Wlej mieszaninę do foremek i odgazuj formy w komorze próżniowej przez 1 godzinę.
    3. Zamknij foremki, tak aby górna połowa formy była we właściwej orientacji. Umieść stalowy sześciokątny pręt na środku i clamp po obu stronach.
    4. Napełnij górę PDMS.
    5. Utwardzać foremki w piekarniku o temperaturze 65 °C przez co najmniej 4 godziny.
    6. Wyjmij platformy z form po schłodzeniu do temperatury pokojowej.
    7. Wyczyść urządzenia w kąpieli ultradźwiękowej za pomocą 1-godzinnych cykli płynu do naczyń, 400 ml 100% izopropanolu i wody destylowanej.
    8. Suszyć przez noc w temperaturze 65 °C.
    9. Namocz szklane szkiełka nakrywkowe w 1% niejonowym poliolu powierzchniowo czynnym przez 30 minut i upewnij się, że szkiełka nakrywkowe nie układają się w stosy, aby wszystkie były odpowiednio pokryte.
    10. Dobrze spłukać wodą destylowaną i wysuszyć przez noc w temperaturze 65 °C.
    11. Użyj myjki plazmowej na wysokim poziomie z 6 l/min tlenu przez 1-2 minuty, aby usunąć szklane szkiełka nakrywkowe i platformę PDMS. Po zabiegu połącz je ze sobą, dociskając PDMS do szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 sekund.
    12. Autoklawuj połączone urządzenia przed dodaniem komórek.

2. Budowanie zestawu do stymulacji optycznej

  1. Używając systemu sześcianów klatkowych 30 mm, przymocuj pośrodku zwierciadło dichroiczne 573 nm. Połącz czerwoną diodę LED 627 nm z filtrem wzbudzenia długoprzepustowym 594 nm i przymocuj ją do górnej części sześcianu, tak aby dioda LED była skierowana w stronę lustra. Następnie przymocuj niebieską diodę LED 488 nm z filtrem wzbudzenia krótkoprzepustowym 546 nm po sąsiedniej stronie kostki, tak aby dioda LED była skierowana w stronę lustra, jak pokazano na schemacie w Rysunek 3A.
  2. Przymocuj przysłonę tęczówki uruchamianą pierścieniowo do dolnej części kostki klatki, aby kontrolować rozmiar oświetlanego obszaru.
  3. Zasilaj każdą diodę LED za pomocą sterownika LED T-Cube i steruj nią za pomocą płytki Arduino Uno Rev3. Podłącz boczne wejście sterownika LED do wtyczki źródła zasilania, podłącz środkowe wyjście do Arduino i podłącz boczne wyjście bezpośrednio do diod LED.
  4. Podłącz Arduino Uno do komputera za pomocą USB.
  5. Pobierz pliki z linku GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Otwórz plik "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" z folderu GitHub.
  7. Ustaw parametry początkowe: Steps = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. Upewnij się, że wyjście pin 4 jest przypisane do sterownika niebieskiej diody LED, a wyjście pinu 2 jest przypisane do sterownika czerwonej diody LED. Sprawdź, czy środkowe przewody sterownika LED są podłączone do masy i do odpowiedniego wyjścia pinowego.
  9. Skompiluj i załaduj program "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" do Arduino.
  10. Podłącz każdy sterownik LED do odpowiedniego kanału.

3. Konfiguracja hodowli komórkowej (dzień -21-0)

  1. Pierwotne komórki mięśni szkieletowych
    1. Rozmrażaj i rozszerzaj pierwotne mioblasty szkieletowe (uzyskane z miozytu Cooka) przez maksymalnie sześć pasaży przy użyciu miotonicznej pożywki wzrostowej (+ suplement). Utrzymuj komórki w inkubatorze w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO2 .
    2. Zmieniaj nośnik co 2 dni.
    3. Gdy komórki zlewają się w około 60%, przechodź je za pomocą 0,05% Trypsyny-EDTA (1x, przez 5 minut w temperaturze 37 °C). Zbierz zdysocjowane komórki i dodaj świeże podłoże, aby zneutralizować trypsynę.
    4. Odwirować komórki przy 300 x g i zassać supernatant powyżej osadu komórkowego.
    5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą MGM i wysiewać nasiona w stosunku 1:3 z 60 ml na kolbę trójwarstwową.
  2. ChR2-hiPSC
    UWAGA: Wszystkie linie komórkowe do tej pracy zostały stworzone i wykorzystane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Columbia University, NY, USA. W tym protokole hiPSC z ekspresją ChR2 zostały wygenerowane poprzez edycję genomu CRISPR-Cas9 przy użyciu wcześniej opisanych metod18, ale w ten sam sposób można użyć dowolnych stabilnych optogenetycznych linii komórkowych (lentiviral, piggyBac itp.). Wybrano konstytutywne promotory ulegające ekspresji zarówno w iPSC, jak i w neuronach ruchowych (CAG). Stwierdzono, że komórki mają zdrowy kariotyp, jak zauważono w poprzednich publikacjach18, 19.
    1. Pokryć płytki 6-dołkowe 1 ml/basenik rozpuszczonej matrycy błony podstawnej rozcieńczonej w DMEM/F12 (1:80) i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Wysiewaj iPSC na powlekanych płytkach 6-dołkowych z 2 ml pożywki do hodowli komórkowych bez podajnika (pożywki iPSC), wymieniając 2 ml pożywki co drugi dzień i pasażując co 5-7 dni. Utrzymuj komórki w inkubatorze ustawionym na 37°C i 5% CO2 .
    3. Przejście
      1. Dysocjację komórek macierzystych należy przeprowadzić przez inkubację z 1 ml bezenzymatycznego odczynnika uwalniającego komórki macierzyste przez 4 minuty i mechaniczne ścinanie pipetą P1000 z szeroką końcówką.
      2. Komórki nasienne w stosunku 1:24 lub 1:48 w pożywce iPSC z 2 μM dichlorowodorku Y-27632 w 2 ml / basenie na powlekane płytki 6-dołkowe.

4. Wysiewanie tkanki mięśni szkieletowych (dzień -3)

  1. Wyizoluj i policz 30 x 106 mioblastów za pomocą automatycznego licznika komórek.
  2. Ponownie zawiesić mioblasty w mieszaninie 4:1 3 mg/ml kolagenu I i rozpuszczonej macierzy błony podstawnej (800 μl mieszaniny kolagenu + 200 μl matrycy błony podstawnej, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml). W przypadku składnika kolagenowego dodać dołączony środek neutralizujący (mieszanina kolagenu z neutralizacją w stosunku 9:1) i rozcieńczyć mieszaninę 1x PBS, aby uzyskać objętość 800 μL.
  3. Dodaj 15 μl zawiesiny kolagenu komórkowego do każdej komory mięśniowej bioreaktora, upewniając się, że zawiesinę rozprowadzisz na obu filarach za pomocą końcówki pipety (Rysunek 2).
  4. Pozostawić mieszaninę komórkowo-żelową do polimeryzacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie napełnić każdy bioreaktor 450 μl miotonicznej pożywki wzrostowej.
  5. Po 3 dniach (po zagęszczeniu żelu) rozpocznij różnicowanie rurki mięśniowej.

5. Różnicowanie Myotube (dni 0-14)

  1. Infuzję rurki należy rozpocząć od zmiany tkanek na 450 μl pożywki indukującej fuzję (FS, Tabela 1) przez 7 dni, zmieniając pożywkę co drugi dzień.
    UWAGA: Spróbuj rozpocząć różnicowanie miotubówki w tym samym dniu, w którym różnicowanie neuronów ruchowych od hiPSC, aby zasiać motoneurony na końcu harmonogramów różnicowania obu typów komórek.
  2. W 7 dniu zmienić pożywkę na 450 μl pożywki dojrzewającej Ia (MMIa, Tabela 1).
  3. W dniu 9 należy zmienić na 450 μl pożywki dojrzewającej Ib (MMIb, Tabela 1).
  4. W 11 dniu zmień pożywkę na 450 μl NbActiv4. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, aż neurony ruchowe zostaną wysiane (krok 7).

6. Różnicowanie motoneuronów (dni 0-14)

UWAGA: Nasz protokół różnicowania motoneuronów został zaadaptowany z Maury et al8.

  1. W dniu 0 przenieś 4 x 106 ChR2- hiPSC na szalkę Petriego o bardzo niskim przyczepie z 15 ml pożywki do hodowli zawiesiny neuronów ruchowych (MSCM, Tabela 1). Uzupełnij MSCM 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydratu i 5 μM dichlorowodorku Y-27632.
  2. W dniu 2 wyizoluj neurosfery (NS) za pomocą odwracalnego sitka 37 μM i ponownie plateruj w 15 ml MSCM z 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydratem i 0,1 μM kwasu retinowego. NS powinien być widoczny na szalce Petriego bez użycia mikroskopu po 2 dniu.
  3. W 4 dniu przenieś komórki i pożywkę do probówki o pojemności 50 ml i pozwól neurosferom osiąść na dnie (5 min). Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 i 0,1 μM kwasu retinowego.
  4. W dniu 7 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 0,5 μM SAG i 0,1 μM kwasu retinowego.
  5. W dniu 9 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 10 μM DAPT.
  6. W dniu 11 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 20 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF.
  7. W dniu 14 umieść motoneurony na platformie.

7. Wywoływanie agregatów motoneuronów w bioreaktorze (dzień 14)

  1. Przygotuj żelową mieszaninę 4:1 2 mg/ml kolagenu I i Matrigelu (800 μl mieszanki kolagenu + 200 μL Matrigel, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml). W przypadku składnika kolagenowego dodać towarzyszący środek neutralizujący (mieszanina kolagenu z neutralizatorem w proporcji 9:1) i rozcieńczyć mieszaninę 1x PBS, aby uzyskać końcową objętość 800 μL.
  2. Użyj sitka komórkowego o długości fali 400 nm, aby wybrać duże neurosfery i ponownie zawiesić je w mieszaninie żelu.
  3. Odessać pożywkę ze zbiornika i ostrożnie z neurosfery dobrze (Rysunek 2).
  4. Dodać 15 μl mieszaniny żelu do kanału neurosfery.
  5. Załaduj pipetę o pojemności 10 μl z 10 μl żelu, a następnie wybierz jedną neurosferę.
  6. Umieść NS w kanale neurosfery i upewnij się, że NS znajduje się w komorze. Powoli podnieś pipetę, jednocześnie uwalniając pozostały żel po nałożeniu NS. Jeśli nie masz pewności, czy NS został prawidłowo zdeponowany, sprawdź jego lokalizację za pomocą mikroskopu.
  7. Pozostawić żel do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Dodać do zbiorników 450 μl NbActiv4 uzupełnionego 20 ng/ml BDNF i 10 ng/mL GDNF.
  9. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aby umożliwić wzrost aksonów od NS do tkanki mięśniowej.

8. Jednoczesna stymulacja optyczna i nagrywanie wideo z funkcją NMJ (dzień 24+)

  1. Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z naukową kamerą typu sCMOS (Complementary metal-oxide-semiconductor).
  2. Ustaw grupowanie oprogramowania aparatu na 2x2, ekspozycję na 20 ms, włączoną migawkę typu rolling shutter, częstotliwość odczytu na 540 MHz, zakres dynamiki: 12-bit i wzmocnienie 1 oraz tryb czujnika: nakładanie się.
  3. Użyj obiektywu 2x na mikroskopie, aby zobrazować mikrotkanki.
  4. Podłączyć komorę z żywymi komórkami (37 °C, 5% CO2 ) do stolika mikroskopu.
  5. Wybierz obszar zainteresowania (ROI), który zawiera unerwioną tkankę tkanek szkieletowych, aby zminimalizować rozmiar pliku i czas przetwarzania.
  6. Umieść długoprzepustowy filtr emisyjny 594 nm między próbką a obiektywem obrazowania, aby odfiltrować impulsy światła niebieskiego z kamery.
  7. Umieść prostokątną 4-dołkową płytkę zawierającą 4 bioreaktory (24 tkanki) w komorze na żywe komórki.
  8. Kliknij opcję Live View (Podgląd na żywo). Wyśrodkuj i ustaw ostrość obrazu z żądanym zwrotem akcji.
  9. Przekaż niestandardowy kod makra z folderu GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis), aby sterować pozycją stołu montażowego, płytą Arduino i akwizycją wideo.
  10. Ustaw film wyjściowy jako: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Uruchom kod makra z żądanymi współrzędnymi X,Y ustawionymi na stole montażowym i uzyskaj szybki upływ czasu z 1700 klatkami przy 50 klatkach / s.
  12. Po obrazowaniu należy wymienić pożywkę i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze. Odczekaj co najmniej 24 godziny między sesjami pozyskiwania obrazu, aby uniknąć zmęczenia tkanek.

9. Przetwarzanie i analiza wsadowa (dzień 24+)

  1. Przetwarzanie filmów
    1. Użyj niestandardowego kodu MATLAB, aby przetworzyć filmy w analizie wsadowej. Pliki można pobrać z folderu GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). Funkcje są wymienione i wyjaśnione w tabeli 2.
      UWAGA: Kod jest kompatybilny z formatami .nd2 i .czi. Wymaga przetwarzania równoległego do aktywacji w MATLAB i potrzebuje pakietu bioformatów.
    2. Uruchom skrypt recursiveOSAnalysis, aby przeanalizować filmy za pomocą przetwarzania równoległego. Umieść wszystkie pobrane filmy w tym samym folderze i wybierz ten folder podczas uruchamiania kodu.
    3. W razie potrzeby dostosuj parametry po analizie.
      1. Zmień baselineTime (opcja 1), jeśli spontaniczny skurcz zostanie wychwycony na początku nagrywania. Spowoduje to pokazanie początkowego odczytu znacznie powyżej 0 i będzie wymagało przesunięcia ramki, aby to skompensować.
      2. Zmień peakThreshold (opcja 2), jeśli skurcze nie są rejestrowane. Kod domyślnie wykryje skurcze, które są powyżej 25% najwyższego szczytu, aby można było zmienić tę wartość.
      3. Zmień wartości minMinProminence i minMinWidth, aby dostosować czułość podczas wykrywania początku każdego szczytu.
    4. Generuj dane wyjściowe wideo i wykresów.
      1. Uruchom recursiveOSMovie, aby wygenerować plik wideo dla każdej tkanki z odpowiednim śladem kurczliwości.

10. Perturbacja funkcji NMJ (dzień 24+)

  1. Przygotować pożywkę zabiegową, dodając efektor zewnętrzny do pożywki podstawowej NbActiv4 uzupełnionej 20 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF.
    1. W eksperymencie z surowicą MG należy użyć 20% surowicy pacjenta MG w NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Do eksperymentu BTX użyj 5 μg/ml BTX w NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stymuluj/obraz, wykonując krok 3.2, aby zarejestrować linię bazową.
  3. Zastąp pożywkę w tkankach pożywką zabiegową (450 μl/tkankę).
  4. Inkubować przez żądany czas (48 godzin dla surowic pacjenta, 20 minut dla BTX).
  5. Ponownie stymuluj/obraz, korzystając z kroku 3.2., aby zarejestrować funkcję po zabiegu.
  6. Usunąć pożywkę zabiegową i pozostawić tkankom na odpoczynek przez żądany czas (48 godzin po usunięciu surowicy)
    UWAGA: Odczekaj co najmniej 24 godziny między stymulacją a obrazowaniem, aby uniknąć zmęczenia tkanek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia nerwowo-mięśniowe zostały wygenerowane przez współkulturowanie optogenetycznych motoneuronów pochodzących z hiPSC z nieoptogenetyczną tkanką mięśni szkieletowych. Ludzkie pierwotne mioblasty szkieletowe (SkM) zostały zasiane w platformach i zróżnicowane w wielojądrowe miotubki przy użyciu protokołu 2-tygodniowego. Optogenetyczne neurony ruchowe różnicowano oddzielnie, ale równolegle z różnicowaniem miotube, a następnie zasiewano na platformie (Ryc. 1). Tkanki zaczęły się kurczyć w odpowiedz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System ten jest zaprojektowanym modelem 3D tkanki ludzkiej, który łączy optogenetykę i przetwarzanie wideo, aby umożliwić zautomatyzowaną i bezstronną ocenę funkcji NMJ. Korzystając ze znormalizowanego protokołu, wykazaliśmy zdolność do pomiaru zmian w funkcji NMJ podczas rozwoju fizjologicznego i scharakteryzowania szkodliwych skutków patologii, takich jak ekspozycja na neurotoksyny i surowice pacjenta z miastenią.

Wcześniejsze badania wykazały możliwość modelowania MG za pomocą optogenetyczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony NIH [numery grantów EB025765 i EB027062], DOD [numer grantu W81XWH-18-1-0095] oraz UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Jesteśmy wdzięczni Columbia University Stem Cell Core za ich pomoc i wskazówki dotyczące przeprogramowywania komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Pożywki i suplementy
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Roztwór albuminy surowicy bydlęcejMillipore SigmaA9576-50ML
Suplement G-5 (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Selektywny antybiotyk Geneticin (siarczan G418) (50 mg/ml)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulina, rekombinowanaludzka milipora Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
Zestaw pożywek MyoTonic Growth KitCook MyositeMK-4444
N-2 SuplementThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mlBrainBits LLCNb4-500
Podłoże neuropodstawoweThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A MediumThermoFisher ScientificA13710-01
klatkowych Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSR StemCell Technologies5872
Plasticware
30 mmThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 i ER2-P4
37 µ m Odwracalny filtr siatkowy, dużyStem Cell Technologies27250
546 nm krótkoprzepustowy filtr wzbudzeniaSemrockFF01-546/SP-25
573 nm lustro dichroiczneSemrockFF573-Di01– Filtr spalinowy długoprzepustowy 25x36
594 nm Filtr wzbudzenia długoprzepustowySemrockBLP01-594R-25
594 nmSemrockBLP01-594R-25
Niebieski (470nm) Rebel LED na podstawie kwadratowej SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Matowa optyka 10 mm z okrągłą wiązką - zintegrowane nogiLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture DishCorning3261
RadiatorLuxeonStarLEDLPD-19-10B
Optics
pluriSitko 400 i mikro; m, 25 szt., sterylnePluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µ m, 25 szt., sterylnePluriSelect43-50500-03
Czerwona (627nm) Rebel LED na podstawie kwadratowej SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
pierścieniowa membrana tęczówkiThorLabsSM1D12D
T-CubeThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Wsporniki sześciokątne z gwintem wewnętrznym,  3 1/2" 10-32, częściowo gwintowany 1/2"McMaster91920A046
niskoprofilowy  C-ClampMcMaster1705A12
Czynniki wzrostu
Adenozyna 3′,5&-cykliczny monofosforanMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR& D Systems2634/10
Human CNTF, klasa badawcza, 5 i mikro; gMiltenyl Biotec130-096-336
Ludzkie białko witronektyny, CFR& D Systems2349-VN-100
Ludzkie białko witronektyny, CFR& D Systems2349-VN-100
IGF1 Rekombinowane białko ludzkieThermoFisher ScientificPHG0078
Białko myszy Laminin, naturalneThermoFisher Scientific23017015
Rekombinowane ludzkie białko grypsyR& D Systems6624-AG-050
Rekombinowane ludzkie białko GDNF, CF 50ugR& D Systems212-GD-050/CF
Rekombinowana ludzka neurotrofina 3  100 ugNauki o komórkachCRN500D
Rekombinowana ludzka neurotrofina-4Nauki o komórkachCRN501B
Rekombinowany ludzki jeż dźwiękowy / Shh (C24II) N-EndusR& D Systems1845-SH-100
Rekombinowany człowiek/mys/szczur BDNF 50 ugPeprotech450-02
Kwas retinowy, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Wygładzony agonistaMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgTechnologie komórek macierzystych72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Witronektyna z ludzkiego osoczaMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dichlorowodorekTocris1254
Przeciwciała
α-aktynina mAb (mysia IgG1)Abcamab9465
Acetylotransferaza choliny (ChAT) (koza)MilliporeAB144P
Desmin mAb (mysz IgG1)DakoM076029-2
Ciężki łańcuch miozyny (MHC) (mysz IgG2b)DSHBMF20
Sprzęt
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Etap zautomatyzowanyStosowane oprzyrządowanie naukoweMS-2000 XYZ
Rozszerzona myjkaplazmowa Harrick PlasmaPDC-001 ( 115V)
Invitrogen Countess Automatyczny licznik komórekMarshal ScientificI-CACC
IX-81 Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator SystemTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS KameraAndor TechnologyZYLA-4.2P-CL10
Software
Oprogramowanie Arduino (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercam Mastercamdla Solidworks
MatlabMatlabR2021b
Elementy NISNikonBadania podstawowe
Solidworks 3D CADSolidworks SolidworksStandard
System sześcianów LED

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326(2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126(2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885(2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27(2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133(2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033(2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Optogenetic Neuromuscular JunctionHuman NMJ ModelTissue EngineeringInduced Pluripotent Stem CellsOptogenetic StimulationMuscle Contraction AnalysisMicrofabrication TechniquesVideo Contractility AnalysisMyasthenia Gravis ModelMotor Neuron Differentiation

Powiązane artykuły