Artykuł metodologiczny

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

DOI:

10.3791/63761

⸱

10 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) zostało uznane za kluczowy czynnik ryzyka raka wątrobowokomórkowego. Obecne leczenie może jedynie zmniejszyć miano wirusa, ale nie spowodować całkowitej remisji. Skuteczny model hepatocytów do zakażenia HBV zapewniłby realistyczny cykl życia wirusa, który miałby kluczowe znaczenie dla badań przesiewowych środków terapeutycznych. Większość dostępnych środków anty-HBV jest ukierunkowana na etapy cyklu życiowego po wniknięciu wirusa, ale nie przed jego wniknięciem. Protokół ten szczegółowo opisuje wygenerowanie kompetentnego modelu hepatocytów zdolnego do badań przesiewowych pod kątem środków terapeutycznych ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa. Obejmuje to celowanie w wiązanie polipeptydu kotransportującego taurocholan sodu (NTCP), tworzenie cccDNA, transkrypcję i składanie wirusa na podstawie imHC lub HepaRG jako komórek gospodarza. W tym przypadku test hamowania wnikania HBV wykorzystywał kurkuminę do hamowania funkcji wiązania i transportu HBV za pośrednictwem NTCP. Inhibitory oceniano pod kątem powinowactwa wiązania (K, D) z NTCP za pomocą kalorymetrii izotermicznej miareczkowej (ITC) - uniwersalnego narzędzia do badań przesiewowych leków HBV w oparciu o parametry termodynamiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest uważane za chorobę zagrażającą życiu na całym świecie. Przewlekłe zakażenie HBV wiąże się z ryzykiem marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego1. Obecne leczenie anty-HBV koncentruje się głównie na wniknięciu wirusa po jego wejściu przy użyciu analogów nukleozy (NA) i interferonu alfa (IFN-α)2,3. Odkrycie inhibitora wnikania wirusa HBV, Myrcludex B, zidentyfikowało nowy cel dla czynników anty-HBV4. Połączenie inhibitorów wejścia i NAs w przewlekłym zakażeniu HBV znacznie zmniejszyło wiremię w porównaniu z tymi, które są ukierunkowane na samą replikację wirusa5,6. Jednak klasyczny model hepatocytów do badań przesiewowych inhibitorów wnikania HBV jest ograniczony przez niski poziom receptorów wirusowych (polipeptyd kotransportujący taurocholan sodu, NTCP). Nadekspresja hNTCP w komórkach wątrobiaka (tj. HepG2 i Huh7) poprawia zakaźność HBV7,8. Niemniej jednak te linie komórkowe wyrażają niskie poziomy enzymów metabolizujących leki fazy I i II i wykazują niestabilność genetyczną9. Modele hepatocytów, które mogą pomóc w celowaniu w różne mechanizmy potencjalnych związków anty-HBV, takie jak wnikanie prewirusa, wiązanie NTCP i wnikanie wirusa, przyspieszyłyby identyfikację i rozwój skutecznych schematów skojarzonych. Badanie nad aktywnością kurkuminy przeciwko HBV wyjaśniło hamowanie wnikania wirusa jako nowy mechanizm oprócz przerwania wnikania wirusa. Ten protokół szczegółowo opisuje model gospodarza do badań przesiewowych cząsteczek anty-HBV10.

Celem tej metody jest zbadanie potencjalnych związków anty-HBV do hamowania wnikania wirusa, szczególnie blokowania wiązania i transportu NTCP. Ponieważ ekspresja NTCP jest krytycznym czynnikiem wnikania i infekcji HBV, zoptymalizowaliśmy protokół dojrzewania hepatocytów, aby zmaksymalizować poziomy NTCP11. Ponadto protokół ten może różnicować hamujący wpływ na wnikanie HBV jako hamowanie przyłączenia HBV w porównaniu z hamowaniem internalizacji. Test wychwytu kwasu taurocholowego (TCA) został również zmodyfikowany przy użyciu metody opartej na ELISA zamiast radioizotopu, aby reprezentować transport NTCP12,13. Interakcja receptora i liganda została potwierdzona przez ich struktury 3D14,15. Inhibicję funkcji NTCP można ocenić, mierząc aktywność absorpcji TCA16. Jednak technika ta nie dostarczyła bezpośrednich dowodów na wiązanie NTCP z kandydującymi inhibitorami. W związku z tym wiązanie można badać za pomocą różnych technik, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy17, ELISA, test przesunięcia termicznego oparty na fluorescencji (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen i różne inne metody20. Wśród tych technik, ITC jest standardem w analizie wiązań, ponieważ może obserwować absorpcję lub emisję ciepła w prawie każdej reakcji21. Powinowactwo wiązania (KD) NTCP i związków kandydujących oceniano bezpośrednio za pomocą ITC; Te wartości powinowactwa były bardziej precyzyjne niż te uzyskane przy użyciu modelu predykcji in silico22.

Ten protokół obejmuje techniki dojrzewania hepatocytów, infekcji HBV i badań przesiewowych w kierunku inhibitora wejścia HBV. Krótko mówiąc, opracowano model hepatocytów w oparciu o linie komórkowe imHC i HepaRG. Wyhodowane komórki zróżnicowano w dojrzałe hepatocyty w ciągu 2 tygodni. Regulacja w górę poziomów NTCP została wykryta za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, western blot i cytometrii przepływowej11. Wirus zapalenia wątroby typu B (HBVcc) został wyprodukowany i pobrany z wirusa HepG2.2.15. Zróżnicowany imHC lub HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) leczono profilaktycznie kandydatami anty-HBV na 2 godziny przed inokulacją wirionem HBV. Oczekiwanym rezultatem eksperymentu była identyfikacja czynników zmniejszających komórkową wartość HBV i zakaźność. Aktywność anty-NTCP oceniano za pomocą testu wychwytu TCA. Działanie NTCP może być pomijane przez agentów, którzy konkretnie powiązali protokół NTCP. Technika ITC została wykorzystana do zbadania wykonalności interaktywnego wiązania, które mogłoby przewidywać inhibitory i ich docelowe białka, określając powinowactwo wiązania (KD) liganda do receptora poprzez niekowalencyjne interakcje kompleksu biomolekularnego23,24. Na przykład KD ≥ 1 × 103 mM oznacza słabe wiązanie, KD ≥ 1 ×10 6 μM oznacza umiarkowane wiązanie, a KD ≤ 1 × 109 nM oznacza silne wiązanie. ΔG jest bezpośrednio skorelowane z oddziaływaniami wiążącymi. W szczególności reakcja z ujemnym ΔG jest reakcją egzergoniczną, co wskazuje, że wiązanie jest procesem spontanicznym. Reakcja z ujemnym ΔH wskazuje, że procesy wiązania zależą od wiązań wodorowych i sił Van der Waalsa. Zarówno wychwyt TCA, jak i dane ITC mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych pod kątem obecności czynników anty-HBV. Wyniki tych protokołów mogą stanowić podstawę nie tylko do badań przesiewowych przeciwko HBV, ale także do interakcji z NTCP ocenianej na podstawie powinowactwa wiązania i funkcji transportu. W artykule opisano przygotowanie i charakterystykę komórek gospodarza, projekt eksperymentalny i ocenę wejścia anty-HBV wraz z powinowactwem wiązania NTCP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Następujące procedury muszą być wykonywane w okapie przepływowym klasy II lub okapie z przepływem laminarnym. Postępowanie z HBV zostało etycznie zatwierdzone przez IRB (MURA2020/1545). Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich roztworów, odczynników, sprzętu i linii komórkowych używanych w tym protokole.

1. Przygotowanie komórek gospodarza (dojrzałych hepatocytów)

  1. Hoduj hepatocyty (3,75 × 105 komórek HepaRG lub imHC) i utrzymuj w kolbie hodowlanej o długości 75cm2 z 10 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Poczekaj, aż komórki osiągną zbieżność 80%-90% (w ciągu 1 tygodnia).
  2. Wyrzucić starą pożywkę z kolby i przemyć komórki 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Odessać PBS i dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA.
  4. Inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty i sprawdzić przylegające komórki za pomocą mikroskopu odwróconego z soczewką obiektywową o powiększeniu 10x. Upewnij się, że monowarstwa oderwała się od powierzchni hodowli.
  5. Zahamować działanie trypsyny, dodając do kolby 4 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% FBS i ostrożnie ponownie zawiesić pobrane komórki. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty w temperaturze 300 × g, 25 °C.
  6. Odessać supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić z 1-2 ml podgrzanej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% FBS i antybiotykami.
  7. Wymieszać po 10 μl zawiesiny komórek i trypana niebieskiego i policzyć komórki za pomocą hemekytometru. Upewnij się, że żywotność komórek jest wyższa niż 90% przed przejściem do następnego kroku.
  8. Wysiewaj 1 × 106 komórek na 2 ml w każdym dołku płytki 6-dołkowej i utrzymuj w kompletnym podłożu DME/F12, aż komórki osiągną 100% konfluencję.
  9. Do dojrzewania wątroby przygotuj pożywkę do dojrzewania wątroby (pożywka E Williamsa uzupełniona 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μM hydrokortyzonu, 2 mM L-glutaminy i 2% DMSO).
  10. Wymieniaj pożywkę hodowlaną 2 razy w tygodniu.
  11. Utrzymuj hepatocyty w pożywce dojrzewającej przez 2 tygodnie, aby uzyskać dojrzałe hepatocyty gotowe do zakażenia HBV.

2. Kwantyfikacja komórkowego NTCP

  1. Pomiar ekspresji NTCP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym
    1. Zebrać osad dojrzałych hepatocytów przez trypsynizację (patrz kroki 1.2-1.5).
    2. Ekstrahuj całkowite RNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA z traktowaniem DNazy I.
    3. Zsyntetyzuj cDNA z 200 ng całkowitego RNA przy użyciu startera oligo-dT i systemu odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Rozcieńczyć cDNA do 50 ng/μl i użyć go jako matrycy do reakcji PCR. Wymieszać 2 μl rozcieńczonego cDNA z odczynnikami do mieszania głównego PCR zawierającymi zielony roztwór zestawu SYBR qRT-PCR z 5 μM starterami specyficznymi dla NTCP (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' i 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. Do normalizacji użyj GAPDH jako genu porządkowego ze specyficznymi starterami (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' i 5'-AAATGAGCCCCAGCCCTCTC-3').
    6. Amplifikować próbki cDNA za pomocą termocyklera w następujących warunkach temperaturowych: 1 cykl trwający 3 minuty w temperaturze 95 °C (początkowa denaturacja); 40 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C (denaturacja), 30 s w temperaturze od 60 °C do 65 °C (wyżarzanie), 30 s w temperaturze 72 °C (przedłużenie); 1 cykl trwający 5 minut w temperaturze 72 °C (końcowe rozszerzenie).
    7. Oblicz zmianę krotności NTCP w dojrzałych hepatocytach nad niezróżnicowanymi komórkami, używając GAPDH jako genu kalibracyjnego w oparciu o metodę 2-ΔΔCT.
  2. Kwantyfikacja NTCP za pomocą analizy western blot
    1. Zebrać hepatocyty za pomocą skrobaka do komórek i odwirować je w temperaturze 300 x g, 25 °C przez 5 minut w celu zebrania osadu komórkowego.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta buforu RIPA, aby wyekstrahować białko komórkowe za pomocą 100 μl buforu RIPA zawierającego 1x inhibitor proteazy.
    3. Zmierzyć całkowite stężenie białka metodą kwasu bicinchoninowego (BCA).
    4. Wymieszaj 12,5 μl białka z 2x barwnikiem ładującym w stosunku 1:1 objętościowo.
    5. Gotować mieszaninę białek i standardową drabinkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    6. Dodaj 1x bufor do pracy do komory elektroforezy.
    7. Załadować 5 μl wzorcowej drabinki białkowej lub 20 μl ugotowanej mieszanki białek w 10% (w/v) żelu poliakrylamidowym.
    8. Wykonaj elektroforezę żelową: 50 V przez 30 min, a następnie 90 V przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Przygotuj membranę PVDF, mocząc ją w metanolu przez 30 s, myjąc ją wodą podwójnie destylowaną przez 1-2 minuty i moczyć wraz z dwoma kawałkami bibuły filtracyjnej w buforze transferowym na 10 minut lub do użycia.
    10. Umieścić bibułę filtracyjną na płycie anodowej półsuchej komórki transferowej, a następnie umieścić membranę PVDF, żel i bibułę filtracyjną na wierzchu, w tej kolejności.
    11. Przenieść białka z żelu do membrany PVDF pod napięciem 10 V przez 25 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Zablokować membranę roztworem blokującym balans bieli na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    13. Inkubować błonę z polipeptydem kotransportującym anty-taurocholan sodu (anty-NTCP) (rozcieńczenie 1:100) w temperaturze 4 °C przez noc.
    14. Umyj membranę 3 x 10 min za pomocą TBST.
    15. Inkubować błonę z kozim przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczenie 1:10 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    16. Umyć membranę 3 x 10 min TBST, a następnie 1 x 5 min TBS.
    17. Wykryj NTCP za pomocą podłoża HRP (patrz Tabela materiałów).
    18. Dodać co najmniej 0,1 ml roztworu substratu HRP/cm2 błony i inkubować membranę przez 3-5 minut w ciemności.
    19. Wizualizacja NTCP za pomocą Systemu Dokumentacji Żelu w trybie chemiluminescencji, wybierz opcję znacznika dla membrany, dostosuj czas naświetlania w trybie akumulacyjnym co 1 minutę i zrób zdjęcie z różnymi czasami naświetlania przez 5 minut.
    20. Rozebrać i wysondować blot mysim przeciwciałem anty-GAPDH (rozcieńczenie 1:200 000) i sprzężonym z HRP kozim przeciwciałem anty-mysim (rozcieńczenie 1:10 000).
  3. Pomiar poziomu NTCP za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Zebrać osady komórek dojrzałych hepatocytów, inkubując komórki z 8 mM EDTA przez 15 min.
      UWAGA: Unikaj stosowania trypsyny lub innych proteaz, które mogą zakłócać działanie receptorów na powierzchni komórki. Ponieważ NTCP jest białkiem receptora powierzchniowego komórki, uszkodzenia spowodowane trypsynizacją mogą dawać negatywne wyniki.
    2. Utrwalić hepatocyty za pomocą 300 μl 3,7% paraformaldehydu w 1x PBS przez 15 min. Przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 300 × g, 25 °C.
    3. Przemyć komórki 2x 700 μL 1x PBS z 1% FBS (v/v), odwirować przez 10 minut w temperaturze 300 × g, 25 °C, dodać 300 μL 0,05% Triton X-100 w PBS do osadu komórkowego i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby je przepuszczalne.
    4. Wirować przez 10 minut w temperaturze 300 × g, 25 °C, przemyć osad komórkowy 3 x 1 min 700 μl PBS zawierającego 1% FBS (v/v). Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko NTCP (rozcieńczenie 1:100) w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć komórki 3 x 1 min buforem do trwałej ondulacji/płukania i odwirować przez 10 minut w temperaturze 300 × g, 25 °C.
    5. Wybarwić komórki przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z Alexa Fluor 488 w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przepłukać komórki 3 x 1 min buforem do trwałej ondulacji / płukania i odwirować przez 10 minut w temperaturze 300 × g, 25 °C. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 200 μl PBS z 1% FBS (v/v).
    6. Włącz cytometr przepływowy, rozgrzej laser przez 15 minut i wykonaj rutynowe czyszczenie.
    7. Wybierz parametry pomiaru, w tym rozproszenie do przodu (FSC), rozproszenie boczne (SSC) i izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) lub fikoerytrynę (PE), a następnie ustaw regulację automatycznej kompensacji za pomocą oprogramowania. Uwzględnij próbki kontrolne kompensacji: kontrolę niebarwioną, kontrolę barwioną FITC i kontrolę barwioną PE.
      UWAGA: Parametry FSC i SSC służą do określania wielkości i ziarnistości poszczególnych komórek w celu wybrania populacji komórek do analizy bramkowania. Detektor kanałów fluorescencyjnych posiada kanały FITC i PE. Dla tego protokołu wybierz kanał FITC, aby wykryć Alexa Fluor 488.
    8. Uruchomić niebarwioną próbkę o średnim natężeniu przepływu płynu (60 μl/min), dostosować próg FSC i SSC, aż pokryją populację komórek będących przedmiotem zainteresowania, oznaczyć obszar bramki w tym obszarze i zastosować do wszystkich kontroli kompensacji.
    9. Ustaw lampę fotopowielacza fluorescencji (PMT) za pomocą niezabarwionego elementu sterującego i wyreguluj napięcie PMT FITC lub PE w ujemnym kwadrancie. Uruchomić dodatnio barwioną próbkę i wyregulować FITC lub PE w dodatniej skali kwadrantowej. Uruchom kontrole niebarwione, barwione FITC lub PE, oblicz kompensację i zastosuj ją do ustawień próbki. Uruchom próbkę hepatocytów, aby zmierzyć poziom NTCP.
    10. Analizować barwione hepatocyty za pomocą oprogramowania cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów).
      1. W oknach BD FACSuite kliknij rurkę kontrolną na karcie Źródła danych i poczekaj, aż pojawią się surowe dane.
      2. W zakładce Arkusz roboczy po prawej stronie kliknij przycisk Bramka elipsy, wybierz populację komórek w SSC i wykres punktowy FSC za pomocą kursora myszy i poczekaj, aż pojawi się okrąg P1.
      3. Kliknij przycisk Interval Gate i zaznacz region na histogramie FITC, zaczynając od najwyższej wartości intensywności fluorescencji po prawej stronie. Zwróć uwagę na wyświetloną linię P2.
      4. Kliknij probówkę eksperymentu i obserwuj, że zmieniają się dane na karcie Arkusz roboczy. Kliknij przycisk Statystyki, a następnie puste miejsce w arkuszu. Obserwuj wyświetlane wartości statystyczne populacji NTCP.

3. Produkcja cząsteczek HBV pochodzących z hodowli komórkowych (HBVcc)

  1. Hodowla HepG2.2.15 w kompletnym podłożu (DMEM uzupełniony 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) na 10 cm szalce Petriego przez 24 godziny.
  2. Zastąp całe podłoże uzupełnione 380 μg/ml genetycyny (G418), gdy HepG2.2.15 osiągną zbieżność 60%-70%. Zbieraj kondycjonowane podłoże co 2 dni; Pożywkę zawierającą HBV przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Usunąć resztki komórek, odwirowując supernatant w temperaturze 5 000 × g, 4 °C przez 20 minut. Zebrać kondycjonowane podłoże za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i przefiltrować je przez filtr 0,45 μm o niskiej zawartości wiązań białkowych w celu usunięcia resztek komórkowych.
  4. Aby zagęścić HBV, rozcieńczyć 1 objętość koncentratora 3 objętościami przefiltrowanego supernatantu z kroku 3.3 w stożkowej probówce wirówkowej i ostrożnie wymieszać roztwór przez odwrócenie probówki. Umieścić mieszaninę w temperaturze 4 °C na 1 godzinę. Odwirowywać roztwór przez 1 godzinę w temperaturze 1 500 × g, 4 °C i upewnić się, że widoczny jest białawy osad.
    UWAGA: Na każde 30 ml przefiltrowanego supernatantu z kroku 3.3 dodać 10 ml koncentratora, aby osiągnąć 40 ml całkowitej objętości.
  5. Oceń miano HBV (ekwiwalent genomu) za pomocą replikonu HBV 1.3-mer WT jako krzywej standardowej w zakresie od 1 × 102 do 1 × 1010 przy użyciu bezwzględnego PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej11.
  6. Delikatnie rozpuścić granulat w FBS i przechowywać przez okres do 1 roku w temperaturze -80 °C w jednorazowych porcjach.

4. Test anty-HBV

  1. Utrzymuj 100% zlewającego się imHC lub HepaRG w 6-dołkowych płytkach w pożywce do dojrzewania (2% DMSO w pożywce E Williamsa, 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μM hydrokortyzonu i 2 mM L-glutaminy) przez 2 tygodnie i zmieniaj pożywkę 2 razy w tygodniu.
  2. Odessać pożywkę, a następnie dodać kurkuminę (10-30 μM) lub 4 μM cyklosporynę A (CsA) rozcieńczoną pożywką E Williama przez 2 godziny. Odessać potencjalny inhibitor wnikania HBV i zastąpić go 1 ml pożywki E Williama zawierającej 4% glikolu polietylenowego.
  3. Dodać cząstki HBV do pożywki hodowlanej przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100 na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin. Odrzucić supernatant, dodać 2 ml zimnego PBS i delikatnie zamieszać, aby spłukać starą pożywkę z niezwiązanym HBV.
  4. Dodaj 2 ml kompletnej pożywki William's E i hoduj przez 7 dni. Odessać pożywkę, przemyć komórki 1x PBS i utrwalić komórki 3,7% paraformaldehydem w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przeniknąć i zablokować zakażone komórki roztworem blokującym IF (0,2% Triton X-100 i 3% albuminy surowicy bydlęcej w PBS) i inkubować je przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (antygen rdzeniowy anty-HBV) w rozcieńczeniu 1:200 do roztworu blokującego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 3 x 1 min roztworem myjącym (0,5% Tween 20 w PBS).
  6. Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczenie 1:500) do roztworu blokującego IF, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemyć komórki roztworem myjącym 3 x 1 min.
  7. Połączyć próbkę za pomocą podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Wykryj sygnał fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr DAPI (Ex 352-402 nM i Em 417-477) i filtr PE (Ex 542-582 i Em 604-644) wraz z soczewką obiektywową 20x i określ aktywność anty-HBV związków kandydujących.

5. Test wiązania komórek HBV

  1. Utrzymuj 100% zlewającego się imHC lub HepaRG w 6-dołkowych płytkach w pożywce do dojrzewania (2% DMSO w pożywce E Williamsa, 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μM hydrokortyzonu i 2 mM L-glutaminy) przez 2 tygodnie i zmieniaj pożywkę 2 razy w tygodniu.
  2. Odessać pożywkę, a następnie dodać kurkuminę (10-30 μM) lub cyklosporynę A (4 μM) rozcieńczoną w pożywce E Williama przez 2 godziny. Odessać inhibitor wnikania HBV i zastąpić go 1 ml pożywki E Williama zawierającej 4% glikolu polietylenowego.
  3. Dodać cząsteczki HBV do pożywki hodowlanej przy MOI wynoszącym 100 na studzienkę i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, aby umożliwić wiązanie HBV z hepatocytami. Wyrzucić pożywkę zawierającą niezwiązaną pożywkę HBV, dodać 2 ml zimnego PBS i delikatnie zamieszać, aby usunąć ślady zużytej pożywki.
  4. Zbierz zainfekowane komórki za pomocą skrobaka do komórek i rozbij komórki za pomocą buforu do lizy. Przenieś lizat do probówki zbiorczej i wyekstrahuj całkowite DNA, aby ocenić DNA HBV za pomocą PCR w czasie rzeczywistym ze specyficznymi starterami dla HBV (starter do przodu: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3' i starter odwrotny: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') przy użyciu PRNP (starter do przodu: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', starter odwrotny: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') jako kontrola wewnętrzna.
  5. Amplifikować produkty PCR w termocyklerze, stosując warunki temperaturowe opisane w kroku 2.1.
  6. Obliczyć względne poziomy DNA HBV/1 × 106 komórek w porównaniu z kontrolą przy użyciu PRNP jako genu kalibrującego w oparciu o metodę 2-ΔΔCT.

6. Test wychwytu kwasu taurocholowego (TCA)

  1. Utrzymuj 100% zlewające się komórki imHC i HepaRG w pożywce dojrzewającej przez 14 dni.
  2. Odessać pożywkę i umyć hepatocyty 1x PBS. Dodać kurkuminę lub cyklosporynę A (10-50 μM) rozcieńczone w pożywce William's E przez 2 godziny. Zastąp pożywkę roztworem kwasu taurocholowego sodu (0,5 M hydrat taurocholanu sodu w 1x HEPES) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać roztwór kwasu sodowo-taurocholowego i przemyć 3x zimnym 1x HEPES. Dodaj 300-500 μL zimnego 1x HEPES i zbierz komórki za pomocą skrobaków do komórek na lodzie.
  4. Homogenizować komórki za pomocą ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz przez 20 s i inkubować na lodzie przez 5 minut. Odwirować lizaty przy 10 000 × g przez 20 minut w celu wytrącenia resztek komórkowych. Zebrać supernatant i ocenić wewnątrzkomórkowe stężenie kwasu taurocholowego za pomocą zestawu do oznaczania TCA ELISA (patrz tabela materiałów).

7. Wyznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

UWAGA: Ten system testowy został opracowany w oparciu o MicroCal PEAQ-ITC (oprogramowanie ITC).

  1. Przygotować bufor (50 mM buforu Tris-HCl, pH 7,0).
  2. Przygotować 15 μM NTCP w buforze.
  3. Przygotować 150 μM kandydujące roztwory inhibitora wnikania HBV do buforu.
  4. Umyć próbkę celu, celę referencyjną i strzykawkę w przyrządzie ITC za pomocą buforu (krok 7.1.).
    1. Uruchom oprogramowanie ITC, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania w systemach Windows. Na karcie Uruchom wyróżnienie eksperymentu wybierz metodę microCal dla 19 Injection.itcm i kliknij przycisk Otwórz. Gdy otworzy się nowe okno, kliknij kartę Wyczyść, aw oknie Metoda czyszczenia wybierz przycisk Mycie dla metody czyszczenia komórek i przycisk Płukanie dla metody czyszczenia strzykawki. Kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
      UWAGA: Etap prania może trwać 1.4 godziny.
  5. Załaduj próbkę do ITC; na karcie Uruchom eksperyment kliknij przycisk Załaduj i przeczytaj instrukcje wyświetlane na ekranie. Kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami wideo, aż ten krok ładowania zostanie zakończony.
    1. Napełnić komórkę referencyjną buforem roztworu za pomocą strzykawki. Napełnij próbkę 15 μM NTCP w buforze za pomocą strzykawki i usuń nadmiar roztworu NTCP z celi próbki. Napełnić strzykawkę 150 μM roztworem kurkuminy (liganda), unikając pęcherzyków powietrza w strzykawce.
  6. Uruchom przykład, a następnie na karcie Uruchamianie eksperymentu kliknij przycisk Uruchom . Obserwuj okna po lewej stronie pokazujące informacje eksperymentalne i ustawienia eksperymentalne. Wprowadź stężenia liganda i białka jako 150 μM w [Syr], 15 μM w [Komórka] i 25 °C w temperaturze.
  7. W oprogramowaniu kliknij start, aby wykonać proces wstrzykiwania i poczekaj 1,4 godziny na zakończenie interakcji białko-ligand.
    UWAGA: Wyblakły przycisk analizy pojawia się w oknach oprogramowania.
  8. Zwróć uwagę, że przycisk analizy rozjaśnia się po zakończeniu wstrzyknięcia. Kliknij przycisk analizy w oprogramowaniu sterującym, aby przeanalizować surowe dane za pomocą oprogramowania analitycznego. Kliknij przegląd, aby wyświetlić surowe dane i wybierz model dopasowania jako Jeden zestaw miejsca wiązania.
  9. Upewnij się, że stan powiązania pokazuje dane eksperymentalne (wiązanie, brak wiązania, dane kontrolne lub kontrolne) oraz że wartości eksperymentu (K,D, ΔG, ΔH, TΔS i N) są prezentowane na panelu oprogramowania.
  10. Eksportuj parametry termodynamiczne, które przewidują wiązanie oddziaływania, w tym wiązanie wodorowe, wiązanie van der Waalsa i oddziaływanie hydrofobowe, do formatu tif lub jpeg.
  11. Po zakończeniu eksperymentu umyj próbkę komórki, postępując zgodnie z krokiem 7.4.

8. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadzić wszystkie eksperymenty w trzech niezależnych powtórzeniach (n = 3).
  2. Przedstaw dane eksperymentalne jako środki ± SD i przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu żądanego oprogramowania do analizy statystycznej.
  3. Użyj dwustronnego, niesparowanego testu t-Studentsa, aby porównać dwie średnie wartości lub zastosuj jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) z Dunnettem do wielokrotnych porównań wielu wartości z wartością kontrolną. Ustaw poziom istotności na p ≤ 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaobserwowano cechy dojrzewania wątroby

Zaobserwowano cechy dojrzewania wątroby, w tym komórki dwujądrowe i morfologię w kształcie wielokąta (Rycina 1), szczególnie w zróżnicowanym stadium imHC (Rycina 1A). Duży wzrost ekspresji NTCP zmierzono w d-HepaRG i d-imHC odpowiednio 7-krotnie i 40-krotnie (Figura 1B). Wysoce glikozylowana forma NTCP, postulowana jako nadająca podatność na wnikanie HBV, została wykryta częściej w d-imHC niż w d-HepaRG (Figura 1C). Z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie HBV rozpoczyna się poprzez wiązanie o niskim powinowactwie z proteoglikanami siarczanu heparanu (HSPG) na hepatocytach25, a następnie wiązanie się z NTCP z następczą internalizacją przez endocytozę26. Ponieważ NTCP jest kluczowym receptorem dla wnikania HBV, celowanie w wnikanie HBV może być klinicznie przełożone na zmniejszenie zakażenia de novo , transmisji z matki na dziecko (MTCT) i nawrotu po przeszczepieniu wątroby. Przerwanie wnikania wirusa byłoby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt badawczy jest wspierany przez Uniwersytet Mahidol oraz Tajlandzkie Studia Naukowe i Innowacje (TSRI) oddzielnie przyznane A. Wongkajornsilpowi i K. Sa-ngiamsuntorn. Prace te były wspierane finansowo przez Biuro Krajowego Szkolnictwa Wyższego, Radę ds. Polityki Naukowej, Badawczej i Innowacyjnej za pośrednictwem Jednostki Zarządzania Programem ds. Konkurencyjności (grant nr C10F630093). A. Wongkajornsilp jest stypendystą Wydziału Lekarskiego Szpitala Siriraj Uniwersytetu Mahidol w ramach stypendium Chalermprakiat. Autorzy pragną podziękować Pani Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) za jej pomoc w technice ITC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linie komórkowe< / silne>
komórki hepaRK, kriokonserwowaneThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Ludzka linia komórkowa hepatoblastomaMerckSCC249
Reagents
4% Bufor buforowy fosforanu paraformadehyduFUJIFLIM Wako chemiczny163-20145
BD Bufor do trwałej ondulacji/płukaniaBD Biosciences554723Bufor do trwałej ondulacji/płukania
Cyklosporyna Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 sól dwusiarczanowaMerck108321-42-2
Koktajl inhibitorów proteazy zatrzymujących  Bez EDTA (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
ilustrilustracjeTM Zestawy do izolacji RNAspin Mini RNAGE Healthcare25-0500-71
ilustracja Zestaw do izolacji RNAspin Mini RNAGE Healthcare25-0500-71
System odwrotnej transkrypcji ImProm-IIPromegaA3800
KAPA SYBR Zestaw FAST qPCRKapa BiosystemsKK4600
Koncentrator Lenti-XKoncentratorTakara bioPT4421-2
Luminata crescendo Zachodnie podłoże HRPMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) Uniwersalnyzestaw do ekstrakcji DNA Nucleospin Kapa BiosystemsKK4600
macherey-nagel1806/003
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMerckP3813
Glikol polietylenowy 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
Rekombinowany klon chmury NTCPRPE421Hu02
Bufor do lizy RIPA (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
Zestaw TCA ElisaMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072Rozcieńczony do 0,125%
przeciwciała
      Przeciwciało anty-NTCP1Abcamab131084rozcieńczenie 1:100
      Przeciwciało anty-GAPDHThermo Fisher ScientificAM43001:200 000 rozcieńczenie
    Przeciwciało anty-królikowe kozie sprzężone z HRPAbcamab2057181:10 000 rozcieńczenie
    Przeciwciało wtórne przeciw mysim kozie HRPAbcamab970231:10 000 rozcieńczenie
    Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 rozcieńczenie
Skład odczynnika
1° Bufor do rozcieńczania przeciwciał
        1x TBST&
nbsp;       3% BSASigmaA7906-100GStężenie robocze: 3%
        Azydek soduSigma199931Stężenie robocze: 0,05%
Pożywka wzrostu hepatocytów< / silny>
          DME/F12Gibco12400-024
          10% FBSSigma AldrichF7524
          1% długopis/paciorkowiecHyClonSV30010
          1% GlutaMAXGibco35050-061
Medium do dojrzewania wątrobowego
          Williamsa E średniSigma AldrichW4125-1L
          10% FBSSigma AldrichF7524
          1% długopis/paciorkowiecHyClonSV30010
          1% GlutaMAXGibco35050-061
          5 & mikro; g/mL  InsulinaSigma Aldrich91077C-100MG
          50 &mikro; M hydrokotyzonSigma AldrichH0888-1g
        2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Roztwór blokujący
        1x PBSGibco21300-058
        3% BSASigmaA7906-100GStężenie robocze: 3%
        0,2% Triton X-100SigmaT8787Stężenie robocze: 0,2%
RIPA Liza Roztwór buforowy do lizyMerck20-188Stężenie końcowe: 1X
        Koktajl inhibitorów proteazyThermo Scientific78425Stężenie końcowe: 1X
            Na3VO4Stężenie końcowe: 1 mM
            PMSFStężenie końcowe: 1 mM
            NaFStężenie końcowe: 10 mM
odczynnik Western blot
        10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS)Bio-Rad170-6435Stężenie końcowe: 1X
        Animacja 20Merck9005-64-5
        1x TBST0.1% Animacja 20
        1x PBSGibco21300-058
        Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher ScientificA53225
        Żel poliakrylamidowyBio-Rad161-0183
        Nadsiarczan amonu (APS)Bio-Rad161-0700Stężenie końcowe: 0,05%
      TEMEDBio-Rad161-0800Żel do układania w stosie: 0,1%, Resolwer żel: 0,05%
      2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Stężenie końcowe: 1X
      Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad161-0374
WB Roztwór blokujący/ 2° Bufor do rozcieńczania przeciwciał
        1x TBST&
nbsp;       5% Mleko odtłuszczone (odtłuszczone mleko w proszku)Bio-Rad170-6404Stężenie robocze: 5%
1x Bufor do biegania 1 L
          10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS)Bio-Rad170-6435Stężenie końcowe: 1X
        GlicynaSigmaG889814,4 g
        SDSMerck7910Stężenie robocze: 0,1%
Blot bufor transferowy 500 ml
          10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS)Bio-Rad170-6435Stężenie końcowe: 1X
        GlicynaSigmaG88987,2 g
        MetanolMerck106009100 ml
Łagodny roztwór do usuwania 1 lDostosuj pH do 2,2
      GlicynaSigmaG889815 g
        SDSMerck79101 g
        Tween 20Merck9005-64-510 mL
Equipments
15 mL probówka wirówkowaCorning430052
50 mlCorning430291
Airstream Class IIEsco2010621Komora bezpieczeństwa biologicznego
CelCulture CO2 InkubatorEsco2170002Nawilżany inkubator do hodowli tkankowych
CFX96 Dotykowy detektor PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad1855196
FACSPerse cytometrprzepływowy BD Biosciences651154
Pipety miarowe (10 ml)Pipety miarowe Jet BiofilGSP010010
5 ml)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCMalvernKalorymetry miareczkowania izotermicznego
Mini PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004Komora do elektroforezy
Mini bibuła filtracyjna absorpcyjna Trans-blotBio-Rad1703932
Omega Lum GAplegen8418-10-0005
Kontroler pipetEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052Zasilacz
Membrana PVDFKolba doIPVH00010
T-75Corning431464U
Trans-Blot SD Półsucha komórka transferowaBio-Rad1703940Półsucha komórka transferowa
Procesor ultradźwiękowy (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & Materiały
Wirówka stołowa z chłodzeniem VersatiEscoT1000RWirówka z wahadłowym obrotem kubełkowym
( System obrazowania hodowli komórkowych Merck

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169(2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054(2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125(2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952(2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419(2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796(2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144(2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205(2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115(2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216(2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wi zanie NTCPinhibicja wnikania wirusacytometria przep ywowaizotermiczna kalorymetria miareczkowapobieranie kwasu taurocholowegobarwienie immunofluorescencyjnekom rki HepaRGreakcja a cuchowa polimerazy

Powiązane artykuły