Artykuł metodologiczny

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63773

⸱

8 czerwca 2022

 ,  , 
1Department of Microbiology, The Ohio State University, 2Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje badanie interakcji neutrofil-biofilm. Biofilmy Staphylococcus aureus tworzy się in vitro i inkubuje z neutrofilami ludzkimi pochodzącymi z krwi obwodowej. Odpowiedź oksydacyjna neutrofili jest określana ilościowo, a lokalizacja neutrofili w biofilmie jest określana za pomocą mikroskopii.

Streszczenie

Neutrofile są pierwszą linią obrony wykorzystywaną przez układ odpornościowy podczas infekcji mikrobiologicznej. In vivo neutrofile są rekrutowane do miejsca infekcji, gdzie wykorzystują takie procesy, jak fagocytoza, produkcja reaktywnych form tlenu i azotu (odpowiednio ROS, RNS), NEToza (pułapka zewnątrzkomórkowa neutrofili) i degranulacja w celu zabicia drobnoustrojów i ustąpienia infekcji. Interakcje między neutrofilami a drobnoustrojami planktonowymi zostały szeroko zbadane. W ostatnich latach pojawiło się zainteresowanie badaniem zakażeń wywoływanych przez biofilmy. Biofilmy wykazują właściwości, w tym tolerancję na zabijanie przez neutrofile, odmienne od ich planktonowych odpowiedników. Dzięki pomyślnemu stworzeniu modeli biofilmu zarówno in vitro, jak i in vivo, można teraz badać interakcje między tymi społecznościami drobnoustrojów a różnymi komórkami odpornościowymi. W tym przypadku techniki, które wykorzystują kombinację tradycyjnych modeli biofilmu i dobrze ugruntowanych testów aktywności neutrofili, są dostosowane specjalnie do badania interakcji neutrofili i biofilmu. Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna służy do monitorowania lokalizacji neutrofili w biofilmach. Te biofilmy są hodowane w warunkach statycznych, a następnie dodawane są neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi obwodowej. Próbki są barwione odpowiednimi barwnikami przed wizualizacją pod mikroskopem. Dodatkowo produkcja ROS, która jest jedną z wielu odpowiedzi neutrofili na patogeny, jest określana ilościowo w obecności biofilmu. Dodanie komórek odpornościowych do tego uznanego systemu poszerzy wiedzę na temat interakcji gospodarz-patogen, zapewniając jednocześnie wykorzystanie ustandaryzowanych i zoptymalizowanych warunków do dokładnego pomiaru tych procesów.

Wprowadzenie

Biofilm to społeczność mikroorganizmów związanych z powierzchnią lub niezwiązanych agregatów zamkniętych w zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS)1,2. Społeczności te chronią zamknięte mikroorganizmy przed stresorami środowiskowymi, w tym tolerancją na środki przeciwdrobnoustrojowe i układ odpornościowy3. Kilka chorobotwórczych gatunków drobnoustrojów tworzy biofilmy, które są związane z przewlekłymi infekcjami4. Rozwój biofilmów to skomplikowany proces obejmujący przyczepianie się do powierzchni, produkcję EPS, proliferację komórek, strukturyzację biofilmu i odrywanie komórek5. Gdy komórki rozproszą się, tworząc biofilm, pozostają planktoniczne lub przemieszczają się do nowego podłoża i ponownie inicjują rozwój biofilmu6.

Staphylococcus aureus, patogen oportunistyczny, podąża za ogólnym schematem rozwoju biofilmu, w tym przyczepiania, proliferacji, dojrzewania i rozprzestrzeniania się7. Proces przyłączania w biofilmach S. aureus jest podyktowany oddziaływaniami hydrofobowymi, kwasami teichojowymi i mikrobiologicznymi składnikami powierzchni rozpoznającymi cząsteczki matrycy adhezyjnej (MSCRAMMs)8,9. Gdy zaczyna się proliferacja S. aureus, wytwarzany jest EPS, który składa się głównie z polisacharydów, białek, zewnątrzkomórkowego DNA i kwasów tejchojowych5. Podczas wytwarzania składników EPS wytwarzane są również różne egzoenzymy i małe cząsteczki, które przyczyniają się do trójwymiarowej struktury biofilmu i pomagają w oderwaniu5. S. aureus wykorzystuje ten wysoce skoordynowany styl życia do tworzenia różnych przewlekłych infekcji, w tym infekcji spowodowanych zamieszkaniem urządzeń medycznych10.

Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) jest jedną z głównych przyczyn infekcji związanych z urządzeniami medycznymi znajdującymi się na stałe, takimi jak cewniki do żył centralnych i dróg moczowych, protezy stawów, rozruszniki serca, mechaniczne zastawki serca i urządzenia wewnątrzmaciczne11. Podczas takich infekcji neutrofile są pierwszymi komórkami odpornościowymi gospodarza rekrutowanymi do miejsca infekcji w celu zwalczania patogenów za pomocą wielu strategii12. Należą do nich fagocytoza, degranulacja, produkcja reaktywnych form tlenu i azotu (ROS/RNS) lub uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w celu wyeliminowania patogenów13.

Wytwarzanie ROS po fagocytozie drobnoustrojów jest jedną z kluczowych reakcji przeciwdrobnoustrojowych wykazywanych przez neutrofile14. Fagocytoza jest wzmocniona, jeśli drobnoustroje są pokryte opsoninami, w szczególności immunoglobulinami i składnikami dopełniacza znajdującymi się w serum15. Opsonizowane drobnoustroje są następnie rozpoznawane przez receptory powierzchniowe komórek na neutrofilach i pochłaniane, tworząc przedział zwany phagosome15. Neutrofile generują i uwalniają ROS w fagosomie za pośrednictwem związanej z błoną oksydazy NADPH16. Ten wieloskładnikowy kompleks enzymatyczny generuje aniony ponadtlenkowe, przenosząc elektrony do tlenu cząsteczkowego16. Dodatkowo, neutrofile generują również RNS poprzez ekspresję indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS)17. Te wysokie rodniki ponadtlenkowe i tlenek azotu w fagosomie mają szerokie działanie przeciwdrobnoustrojowe. Mogą wchodzić w interakcje z centrami metali w enzymach i uszkadzać kwasy nukleinowe, białka i błony komórkowe patogenu18,19,20,21. Wiele mikroorganizmów przyjmuje styl życia biofilmu i stosuje różne strategie, aby uniknąć zabicia przez ROS22,23. Tak więc standaryzowane testy, które łączą biofilmy z neutrofilami w celu ilościowego określenia ROS, są korzystne dla spójnych wyników.

Podczas gdy testy, takie jak ilościowe określanie produkcji ROS neutrofili, dostarczają informacji o reakcjach neutrofili na biofilmy, możliwość wizualizacji interakcji neutrofili w biofilmie może również służyć jako potężne narzędzie. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych do mikroskopii często wymaga optymalizacji w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów, które można wykorzystać do analizy obrazowania mikroskopowego. Elastyczność w optymalizacji niektórych warunków jest ograniczona, ponieważ neutrofile mogą ulec śmierci komórkowej po izolacji. Ponadto biofilmy są zwykle płukane w celu usunięcia populacji planktonu z zestawu doświadczalnego przed dodaniem neutrofili. Podczas płukania może wystąpić zmienność między powtórzonymi biofilmami z powodu utraty częściowej biomasy, jeśli biofilmy są luźno przylegające do powierzchni.

Ogólnie rzecz biorąc, obecne metody analizy interakcji między neutrofilami a biofilmami obejmują głównie mikroskopię, cytometrię przepływową i wyliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU)24,25,26,27. Mikroskopia polega na użyciu barwników, które albo bezpośrednio barwią neutrofile i biofilmy, albo celują w różne reakcje neutrofili przeciwko drobnoustrojom, takie jak tworzenie NET, degranulacja i śmierć komórki25,28. Podzbiór tych reakcji, takich jak śmierć komórek neutrofilów i degranulacja, może być również analizowany za pomocą cytometrii przepływowej, ale wymaga, aby neutrofile były preferencyjnie niezwiązane z dużymi agregatami drobnoustrojów w biofilmie28,29. Cytometria przepływowa może również określić ilościowo niektóre parametry biofilmu, takie jak żywotność komórek27. Procesy te wymagają jednak rozerwania biomasy biofilmu i nie byłyby przydatne do wizualizacji innych ważnych interakcji, takich jak przestrzenne rozmieszczenie neutrofili i ich składników w biofilmie27,29,30.

Obecny protokół skupia się na adaptacji niektórych tradycyjnie stosowanych metod do badania interakcji neutrofil-biofilm na biofilmach, które zostały zoptymalizowane tak, aby zapewnić minimalną zmienność podczas obchodzenia się z nimi. Protokół ten zapewnia zatem ustandaryzowane metody hodowli i ilościowego oznaczania biofilmów, izolowania pierwotnych ludzkich neutrofili z krwi obwodowej, ilościowego określania produkcji ROS i wizualizacji interakcji biofilm-neutrofile za pomocą mikroskopii. Protokół ten można dostosować do różnych systemów, aby zrozumieć interakcje biofilm-neutrofile, biorąc pod uwagę heterogeniczność między pulami dawców.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Uzyskano świadomą pisemną zgodę wszystkich dawców na pobranie krwi obwodowej w celu wyizolowania pierwotnych ludzkich neutrofili. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 został użyty jako organizm modelowy do przeprowadzenia eksperymentów. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) ze względu na potencjalne narażenie na patogen przenoszony przez krew.

1. Przygotowanie biofilmu in vitro

  1. Uzyskaj izolowane kolonie S. aureus z kriokonserwowanego bulionu31 przy użyciu techniki płytki smugowej32,33 na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak Tryptic Soy Agar (patrz Tabela Materiałów).
  2. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 μl 0,001% (v/v) poli-L-lizyny (PLL) rozcieńczonej w sterylnymH2Oi inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aseptycznie odessać roztwór PLL za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wszystkie etapy aspiracji w protokole są wykonywane przy użyciu pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią, chyba że zaznaczono inaczej.
  3. Przygotować posiew przez noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 2% glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16-18 godzin.
  4. Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 μl do 5 ml świeżego MEMα uzupełnionego 2% glukozą i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 200 obr./min, aż do połowy fazy logarytmicznej, zwykle między gęstością optyczną 600 (OD600 nm) 0,5-0,8. Użyj MEMα, aby znormalizować kulturę średniologarytmiczną do OD600nm 0,1.
  5. Przenieś 150 μl znormalizowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować statycznie przez 18-20 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Biofilmy mogą być również hodowane w innych formatach, takich jak szkiełka μ-kanałowe (patrz Tabela materiałów).
  6. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodawaj HBSS kroplami, aby uniknąć przerwania biofilmu.
    UWAGA: Podczas zasysania supernatantu i HBSS podczas mycia, należy pozostawić tylko tyle płynu (supernatantu lub HBSS) w studzienkach zawierających biofilm, tak aby biofilm był nadal zanurzony. Zapobiega to przerwaniu struktury biofilmu, gdy HBSS jest dodawany kroplami w celu wypłukania biofilmu.
  7. Powtórz krok 1.6 co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonu. W tym momencie biofilmy są gotowe do natychmiastowych dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Jeśli biofilmy nie są wykorzystywane do eksperymentów z neutrofilami, HBSS można zastąpić solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). HBSS jest preferowany w stosunku do PBS, ponieważ HBSS zawiera składniki, w tym glukozę, które zapewniają optymalne warunki do aktywacji neutrofili34.

2. Kwantyfikacja biomasy biofilmu

  1. Przygotować zapas 0,1% (w/v) roztworu fioletu krystalicznego (CV) (patrz tabela materiałów), rozpuszczając się w 20% (v/v) etanolu i 80% (v/v)H2O. Upewnij się, że CV jest całkowicie rozpuszczony w etanolu przed dodaniemH2O. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór.
  2. Dodać 150 μl 0,1% roztworu CV do przemytego biofilmu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyj co najmniej trzech pustych studzienek jako kontrolek tylko dla mediów.
  3. Odessać 0,1% roztwór CV z biofilmów i przemyć poplamione biofilmy 200 μl 1x PBS. Powtórz ten proces, w sumie trzy płukania, aby usunąć nadmiar CV z dołków.
  4. Dodać 150 μl 33% (v/v) lodowatego kwasu octowego rozcieńczonegoH2O. Inkubować w temperaturze pokojowej na bujaku z prędkością 50 obr./min przez 30 minut, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie CV związanego z biomasą.
    UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie z przepływem laminarnym z odpowiednimi środkami ochrony osobistej, ponieważ lodowaty kwas octowy jest substancją chemiczną.
  5. W międzyczasie należy skonfigurować czytnik mikropłytek (patrz Tabela materiałów), aby odczytać wartości barwienia CV. Po potraktowaniu lodowatym kwasem octowym odczytać tabliczkę na długości fali 595 nm.
    UWAGA: Długość fali używana do pomiaru średnicy zewnętrznej CV może wynosić od 500 do 600 nm35.

3. Izolacja neutrofili

UWAGA: Neutrofile zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą z niewielkimi zmianami36. Ten protokół izolacji łączy najpierw wirowanie w gradionym gradiacji gęstości, a następnie 3% sedymentację dekstranu. W tej sekcji omówiono tylko ogólny protokół izolacji neutrofili, koncentrując się na zmianach wprowadzonych do opublikowanego protokołu. Co więcej, opisany poniżej protokół jest jedną z wielu metod, które mogą izolować neutrofile i mogą być zastępowane w razie potrzeby. Inne metody izolowania neutrofili obejmują użycie pożywki do separacji komórek lub magnetycznej separacji komórek przeciwciał37.

  1. Pobrać krew od dorosłego dawcy poprzez wkłucie żyły, zgodnie z protokołem przedstawionym w instytucjonalnym IRB. Przed pobraniem krwi należy upewnić się, że w strzykawce znajduje się wystarczająca ilość heparyny wolnej od konserwantów, tak aby końcowe stężenie heparyny wynosiło 20 j./ml.
  2. Rozcieńczyć krew heparynizowaną 3/4 objętości 0,9% NaCl wolnego od endotoksyn (patrz tabela materiałów) w H2O w temperaturze pokojowej.
  3. Na każde 20 ml rozcieńczonej próbki krwi należy dodać 14 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na pożywce o gradiencie gęstości.
  4. Odwirować warstwową próbkę krwi o masie 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka ma powolną przerwę, aby uniknąć naruszenia warstwy po zakończeniu wirowania.
    UWAGA: Próbka krwi będzie miała pięć warstw zawierających mieszaninę soli fizjologicznej i osocza, warstwę komórek jednojądrzastych, pożywkę gradientu gęstości, neutrofile i erytrocyty.
  5. Za pomocą pipety serologicznej odessać wszystkie warstwy powyżej neutrofili i osadu erytrocytów, a następnie delikatnie zawiesić osad w zimnym, wolnym od endotoksyn 0,9% NaCl wH2O. Dla każdej osadki wytworzonej z 20 ml próbki krwi należy ponownie zawiesić osad z powrotem do całkowitej objętości 20 ml. Dodać 3% dekstranu w stosunku 1:1 (patrz Tabela Materiałów). Inkubować probówkę w pozycji pionowej przez 18-20 minut na lodzie.
    UWAGA: Upewnij się, że 3% dekstran jest wykonany z wolnego od endotoksyn 0,9% NaCl w H2O.
  6. Usunąć 20 ml górnej warstwy zawierającej neutrofile i niektóre erytrocyty na nową stożkową probówkę o pojemności 50 ml i odwirować ją przy 355 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odleć supernatant, pozostawiając czerwoną osadkę.
  7. Delikatnie zawiesić osad w 10 ml zimnego, sterylnegoH2Oprzez 30 s w celu lizy pozostałych erytrocytów. Natychmiast dodaj 10 ml zimnej 0,9% soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn do mieszaniny, aby przywrócić toniczność. Odwirować roztwór o stężeniu 233 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  8. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający 95%-97% neutrofili w 1 ml zimnego HBSS na 20 ml próbki krwi.
  9. Przenieść 10 μl zawieszonych neutrofili w 90 μl 0,4% barwnika wykluczającego błękit trypanowy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Komórki niezdolne do życia są barwione na niebiesko, ponieważ barwnik wykluczający błękit trypanowy jest nieprzepuszczalny w komórkach żywotnych. Ten protokół zapewnia >99% żywotności komórek37,38.
  10. Dodać dodatkowe HBSS tak, aby końcowe stężenie neutrofili wynosiło 4 x 106 komórek/ml.
    UWAGA: W przypadku <99% żywotności komórek można nadal osiągnąć końcowe stężenie 4 x 106 komórek/ml; jednak całkowita objętość roztworu zawierającego 4 x 106 komórek/ml uzyskana zmniejszy się. Końcowe stężenie neutrofili można dostosować do potrzeb eksperymentalnych użytkownika. Neutrofile zostały ponownie zawieszone w końcowym stężeniu 4 x 106 komórek/ml dla wszystkich eksperymentów opisanych poniżej. Aby uwzględnić zmienność między dawcami, zdecydowanie zaleca się, aby wszystkie eksperymenty związane z neutrofilami były przeprowadzane z udziałem co najmniej trzech różnych dawców.

4. Pomiar ROS wytwarzanych przez neutrofile

  1. Dodać kroplami 100 μl 20% normalnej ludzkiej surowicy (rozcieńczonej w HBSS) do przemytego biofilmu (krok 1.6) i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych przez 30 minut w celu opsonizacji biofilmu.
  2. Odessać 20% roztwór surowicy i przemyć biofilmy kroplami 150 μl HBSS. Odessać HBSS, pozostawiając studzienki z opsonizowanymi biofilmami.
    UWAGA: Do interpretacji eksperymentu zalecane są co najmniej cztery grupy: (A) neutrofile + biofilm, (B) neutrofile + PMA (kontrola pozytywna, patrz tabela materiałów), (C) tylko neutrofile i (D) tylko biofilm.
  3. Dodać luminol (patrz tabela materiałów) do neutrofili zawieszonych w HBSS w stężeniu 4 x 106 komórek/ml tak, aby końcowe stężenie luminolu wynosiło 50 μM. To rozwiązanie jest gotowe do użycia dla grup (A) i (C). Dodaj 4 x 105 neutrofili zmieszanych z luminolem do studzienek z opsonizowanymi biofilmami.
  4. W oddzielnej probówce przygotować 50 μM roztwór luminolu w HBSS bez neutrofili i dodać go do studzienki zawierającej biofilm (grupa D).
  5. Podwielokrotność 350 μl neutrofili zmieszanych z luminolem i dodać do mieszaniny 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) o końcowym stężeniu 500 ng/ml. Dla grupy (B) dodać 4 x 105 neutrofili z tej mieszaniny do studzienek bez biofilmu. Służy to jako kontrola pozytywna.
    UWAGA: Stężenie PMA wskazane na tym etapie jest stosunkowo wysokie, aby zapewnić silną odpowiedź na impuls, ponieważ neutrofile stymulowane PMA są kontrolą pozytywną. PMA może być stosowany w niższym stężeniu do aktywacji neutrofili, w zależności od eksperymentu.
  6. Odwirować płytkę o sile 270 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
  7. Upewnij się, że czytnik płytek jest ustawiony na 37 °C wraz z ustawieniem luminescencji i odczytu kinetycznego przez 60 minut w odstępach 3-minutowych. Umieść płytkę w czytniku płytek, aby zmierzyć produkcję ROS przez neutrofile przez 60 min.
    UWAGA: W tym teście biofilmy hodowano na białych płytkach używanych do testów luminescencyjnych. PMA jest znanym agonistą odpowiedzi oksydacyjnej na wybuch39. Podczas wykonywania badań z udziałem PMA należy upewnić się, że PMA jest dodawany na ostatnim etapie, gdy roztwór zawierający neutrofile jest zimny, ponieważ PMA natychmiast inicjuje odpowiedź burst.

5. Obrazowanie interakcji biofilm-neutrofile

  1. Stwórz biofilm, wykonując kroki 1.2-1.6. Aby ułatwić obrazowanie biofilmu, należy zastosować fluorescencyjny szczep S. aureus, taki jak USA300 eksprymujący białko zielonej fluorescencji (GFP)40,41, aby zwiększyć łatwość obrazowania mikroskopowego.
    UWAGA: Zamiast 96-dołkowej płytki użyto 6-μ-kanałowego szkiełka (patrz Tabela materiałów) w celu zademonstrowania modelu biofilmu in vitro (krok 1).
  2. Inkubować 4 x 106 komórek/ml neutrofili ze 100 μM niebieskiego barwnika CMAC (7-amino-4-chlorometylokoumaryny) (BCD, patrz tabela materiałów) przez 30 minut w bujaku w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło w pozostałych etapach.
  3. Aby wypłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile o stężeniu 270 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. W tym momencie dodać homodimer-1 etydyny (patrz tabela materiałów) do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu 4 μM w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii.
  4. Dodać 150 μl neutrofili do biofilmu S. aureus, który został wyhodowany na μ-szkiełkach, tak aby stosunek neutrofili do bakterii wynosił 1:30 (neutrofile: bakterie). Inkubować μ szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych opiera się na liczbie komórek uzyskanej z posiewu biofilmu trwającego 18 godzin.
  5. Zobrazuj oddziaływanie neutrofile-biofilm za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających długościom fal wzbudzenia i emisji barwników/białek fluorescencyjnych.
    UWAGA: W niniejszym badaniu BCD wynosi 353/466 nm, homodimer-1 etydyny-1 wynosi 528/617 nm, a GFP wynosi 395/509 nm. Ogranicz ekspozycję próbki na działanie lasera lub światła, aby zapobiec fotowybielaniu próbek.
  6. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych lub programów, takich jak FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ i BAIT, między innymi42,43,44,45.
    UWAGA: Podczas pracy z plamami należy wziąć pod uwagę specyfikę używanych barwników. Niektóre plamy działają na komórki prokariotyczne i eukariotyczne, podczas gdy inne działają tylko na jedną. Jeśli neutrofile i biofilmy są barwione oddzielnie przy użyciu barwników, które mogą barwić oba typy komórek, upewnij się, że zmyłeś pozostały barwnik przed połączeniem neutrofili i biofilmów, aby zapobiec barwieniu krzyżowemu.

Wyniki

Pożywki stosowane do hodowli bakteryjnych biofilmów wpływają na przeżywalność neutrofilów. Przetestowano różne pożywki, aby zminimalizować sam wpływ medium na żywotność neutrofilów w badaniach nad oddziaływaniami między neutrofilami a biofilmem (Rysunek 1). Pożywki do wzrostu bakterii, takie jak Tryptic Soy Broth, ograniczają żywotność neutrofilów, w taki sposób, że ok. 60% neutrofilów pozostaje żywych po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Pożywki do hodowli komórek ssaków, takie jak MEMα, nie wpływają na żywotność neutrofilów i wspierają wzrost biofilmów S. aureus. W rzeczywistości pożywki minimalne sprzyjają intensywnemu wzrostowi biofilmów u innych bakterii46,47.

Aby ocenić wpływ pożywek na wzrost biofilmu oraz zmienność w ilościowym określaniu biomasy biofilmu po przemyciu biomasy w celu wyeliminowania komórek planktonicznych, biofilm S. aureus hodowano przez 18 h w płytce 96-dołkowej, w której dołki były traktowane lub nie traktowane poli-L-lizyną. Zastosowano pożywkę bogatą (Tryptic Soy Broth (TSB)) oraz minimalną (MEMα), w formie pierwotnej lub uzupełnione o 2% glukozy. Biomasa biofilmu barwiona CV wykazała, że biofilm S. aureus hodowany w pożywce MEMα uzupełnionej o 2% glukozy wytworzył najsilniejszy biofilm spośród wszystkich testowanych pożywek (Rysunek 2A). Co więcej, biofilmy hodowane w dołkach wstępnie traktowanych PLL, zawierających MEMα + 2% glukozy, wykazały mniejszą zmienność niż biofilmy w dołkach nietraktowanych PLL zawierających MEMα + 2% glukozy. Biofilmy te wykazały mniejszą zmienność w ilościowym określaniu via test CV35 oraz CFU/mL po wysiewaniu, przy zastosowaniu precyzyjnych procedur manipulacji biofilmem podczas kwantyfikacji biomasy. Biofilmy te zawierały średnio 1 x 108 CFU/mL, co wykazano poprzez wysiewanie biofilmów w 3 oddzielnych dniach (Rysunek 2B). Wartość ta jest przydatna przy określaniu liczby neutrofili, które należy dodać do biofilmów w celu przeprowadzenia testów funkcjonalności neutrofili.

W celu pomiaru produkcji ROS przez neutrofile w odpowiedzi na biofilmy, biofilmy S. aureus hodowano statycznie przez 18-20 h w płytce 96-dołkowej. Następnie biofilmy opsonizowano i dodano neutrofile. Następnie mierzono produkcję ROS przez 60 min (Rysunek 3A). Pole pod krzywą oblicza się z krzywej kinetycznej, aby określić całkowitą produkcję ROS przez neutrofile. Neutrofile traktowane agonistą, takim jak PMA, stosowanym jako kontrola, wykazują zwiększoną produkcję ROS. Wobec braku biofilmów neutrofile traktowane PMA wykazywały intensywną produkcję ROS. W obecności biofilmu S. aureus całkowita produkcja ROS przez neutrofile traktowane PMA uległa zmniejszeniu. W przypadku braku PMA neutrofile polegają wyłącznie na oddziaływaniu z biofilmem, co dodatkowo zmniejsza ilość produkowanego ROS (Rysunek 3B).

W celu wizualizacji interakcji między neutrofilami a biofilmem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystano szczep S. aureus wykazujący ekspresję GFP, barwnik Blue CMAC oraz etydium homodimer-1, który barwi odpowiednio cytoplazmę żywych komórek oraz DNA martwych komórek. Biofilm S. aureus hodowano przez 18 h na szkiełku z 6 µ-kanałami. Do przemytych biofilmów dodano neutrofile znakowane barwnikiem Blue CMAC wraz z etydium homodimer-1, a następnie inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przed obrazowaniem. Mikroskopia fluorescencyjna w szerokim polu ujawniła, że wiele neutrofili zlokalizowanych było na powierzchni biofilmów S. aureus, podczas gdy nieliczne znajdowały się wewnątrz biofilmu (Rycina 4A). Widoczna była również interakcja między komórkami S. aureus a neutrofilami (Rycina 4C). Większość komórek S. aureus wchodzących w interakcje z neutrofilami (kolor cyjanowy) była martwa (kolor magenta), podczas gdy nieliczne pozostały żywe (kolor żółty), co określono za pomocą barwienia żywe/martwe (Rycina 4C). Dla porównania, biofilmy S. aureus wykazujące ekspresję GFP zabarwiono etydium homodimer-1, co ujawniło frakcję martwej populacji S. aureus wewnątrz biofilmu (Rycina 4B). Nieżywe neutrofile wykazujące pozytywny wynik barwienia etydium homodimer-1 ilościowo określono za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów) po inkubacji z biofilmami S. aureus. Około 48% neutrofili obumarło w ciągu 30 min inkubacji z biofilmem S. aureus. Podczas optymalizacji protokołu mikroskopowego oceniano również wpływ przemywania biofilmu i neutrofili po 30 min inkubacji w celu usunięcia neutrofili nieprzylegających, co wykazało, że około 33% martwych neutrofili nadal pozostawało przytwierdzonych do biofilmu (Rycina 4D).

Wykres słupkowy przeżywalności neutrofili; porównanie traktowania MEMα, TSB i SDS; istotność oznaczona gwiazdkami.
Rysunek 1: Analiza LIVE-DEAD porównuje przeżywalność neutrofili w bakteriologicznych i ssaczych mediach hodowlanych. Neutrofile wyizolowano i inkubowano w HBSS, MEMα, TSB lub 0,1% SDS przez 30 min. Barwienie LIVE-DEAD wykonano przy użyciu Calcein AM (żywe komórki) i etydium homodimeru-1 (martwe komórki). Wyznaczono procent żywych neutrofili, przyjmując, że neutrofile inkubowane w HBSS stanowią 100% żywych neutrofili. Wyniki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach, z neutrofilami uzyskanymi od dwóch różnych dawców. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001; jednoczynnikowa analiza ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy biomasy biofilmu OD595; wykres porównawczy replikatów biologicznych CFU/ml; TSB vs MEMα.
Rycina 2: Ilościowe oznaczenie biomasy biofilmu w różnych warunkach oraz ocena żywotności bakterii w biofilmach hodowanych w warunkach zoptymalizowanych. (A) S. aureus zasiano na płytce 96-dołkowej, która była albo powlekana, albo niepowlekana poli-L-lizyną (PLL). Biofilmy hodowano w TSB, MEMα lub w którymkolwiek z tych mediów uzupełnionych o 2% glukozy w warunkach statycznych przez 18 h. W celu zabarwienia biomasy biofilmu wykonano barwienie fioletem krystalicznym (CV). Wyeluowany barwnik CV rozcieńczono w stosunku 1:10 i odczytano w czytniku mikroplatek. Wyniki stanowią średnią z trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. SD dla każdej grupy pokazano na dole, aby zobrazować zmienność różnych warunków wzrostu biofilmu. (B) Liczbę CFU bakterii uzyskano z biofilmów hodowanych w medium zoptymalizowanym (MEMα + 2% glukozy). Biofilmy statyczne po 18 h poddano tej samej liczbie przemyć, a następnie 10-minutowej sonikacji w celu rozluźnienia biomasy biofilmu i przepuszczono przez igłę 22G, aby rozbić agregaty przed wysiewaniem. Wyniki reprezentują trzy replikaty wykonane w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (ns = brak istotności statystycznej; jednoczynnikowa analiza ANOVA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki testu luminescencyjnego; wykres luminescencji w funkcji czasu i wykres słupkowy; efekty PMN i BF.
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie produkcji ROS przez neutrofile za pomocą testu chemiluminescencyjnego. (A) Neutrofile (PMN) inkubowano z biofilmem (BF) S. aureus przemytym buforem HBSS w obecności (zamknięty szary trójkąt) lub w nieobecności (otwarty szary trójkąt odwrócony) PMA w celu zmierzenia produkcji ROS przez neutrofile. Do detekcji ROS co 3 min przez 60 min w czytniku mikropłytek wykorzystano luminol. Podczas gdy neutrofile traktowane PMA w nieobecności biofilmu (zamknięte czarne koło) służyły jako kontrola pozytywna, grupy zawierające tylko neutrofile (otwarte czarne koło) oraz tylko biofilm (otwarty szary trójkąt) służyły jako kontrole negatywne. Dane reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech powtórzeniach z neutrofilami uzyskanymi od dwóch różnych dawców. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. (B) Pole pod krzywą z (A) obliczono w celu ilościowego oznaczenia całkowitej ilości ROS wytworzonych przez neutrofile. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. (***p < 0.0001. Jednoczynnikowa analiza ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozkład neutrofili na obrazach mikroskopowych i wykres słupkowy przedstawiający porównanie śmierci komórek.
Rysunek 4: Wizualizacja interakcji między biofilmem S. aureus a neutrofilami przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Neutrofile znakowane niebieskim barwnikiem CMAC (cyjan) zostały uzupełnione o etydium homodimer-1 (magenta; martwe) przed inkubacją z 18-godzinnym biofilmem S. aureus (żółty). Interakcje biofilm-neutrofile obrazowano za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej, a obrazy przetworzono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Eksperymenty przeprowadzono z trzema różnymi dawcami. Reprezentatywne obrazy przedstawiają (A) widok 3D biofilmu S. aureus z żywymi (cyjan) i martwymi (magenta; kilka wskazano białymi strzałkami) neutrofilami, (B) widok 3D biofilmu S. aureus wobec braku neutrofili z żywymi S. aureus wykazującymi ekspresję GFP (żółty) lub martwymi S. aureus zabarwionymi etydium homodimer-1 (magenta), (C) widok ortogonalny interakcji S. aureus i neutrofili przedstawiony w płaszczyznach xy, yz i xz oraz (D) ilościowe oznaczenie żywotności neutrofili w obecności biofilmu S. aureus po 30 min, albo bezpośrednio (nieprzemyte), albo po trzech cyklach płukania HBSS w celu usunięcia nieprzytwierdzonych neutrofili (przemyte). Śmierć komórek neutrofili przedstawiono jako średnia ± SD (test t Studenta). Pasek skali wskazuje 50 µm w (A) i (B) oraz 10 µm w (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Podjęto liczne wysiłki w celu wyhodowania wytrzymałych i powtarzalnych biofilmów S. aureus do dalszych eksperymentów in vitro 48,49,50. Przedstawiono znormalizowany protokół, który wykorzystuje kationowy charakter PLL, a także uzupełnia pożywkę glukozą w celu wzrostu silnych biofilmów S. aureus in vitro. Dodatek PLL pozwala na lepsze przyłączenie ujemnie naładowanej komórki bakteryjnej do dodatnio naładowanych powierzchni pokrytych PLL. Należy zauważyć, że PLL w stężeniu 10 μg/ml ma działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i S. aureus podczas inkubacji przez 24 godziny51. To samo stężenie stosuje się do powlekania powierzchni; jednak nadmiar PLL jest zasysany, co sprawia, że stężenie PLL jest niższe niż 10 μg/ml podczas siewu w celu wzrostu biofilmu.

Ważne jest, aby zauważyć, że PLL działał tylko w określonych pożywkach wzrostowych, takich jak MEMα z 2% glukozą, gdzie zaobserwowano, że S. aureus wytwarzał silne biofilmy o minimalnej zmienności (Figura 2A). Stężenie PLL, które miałoby być stosowane w połączeniu z innymi rodzajami mediów, wymagałoby dalszej optymalizacji, takiej jak zastosowanie zwiększonego stężenia PLL do pokrycia studni. Dodatkowo warunki te zostały zoptymalizowane pod kątem monogatunkowego biofilmu S. aureus . Podczas gdy biofilmy ran przewlekłych są często wielomikrobiologiczne, standaryzacja testów w celu zbadania biofilmu jednogatunkowego i jego interakcji z neutrofilami i innymi komórkami odpornościowymi jest kluczem do zrozumienia ich udziału w patogenezie52. Te ustandaryzowane protokoły można dalej optymalizować w celu utrzymania i badania biofilmów polimikrobiologicznych i ich interakcji z neutrofilami.

Zaobserwowano również, że bogate pożywki bakteryjne, takie jak TSB, doprowadziły do utraty żywotności neutrofili (ryc. 1). W związku z tym zoptymalizowano warunki wzrostu biofilmów S. aureus w MEMα, stosowanych do hodowli komórek ssaków. W przypadku badań z udziałem neutrofili pożywka ta wspomaga żywotność neutrofili i wspomaga wzrost S. aureus . Chociaż zaobserwowano, że pożywka wpływa na żywotność neutrofili, ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że neutrofile wyizolowane z obwodowej krwi ludzkiej ulegają apoptozie ex vivo z około 70% apoptozą neutrofili do 20 godziny53. Wymaga to odpowiedniego obchodzenia się z neutrofilami, takich jak przechowywanie neutrofili na lodzie podczas przygotowywania się do eksperymentów, stosowanie odczynników wolnych od endotoksyn oraz zapobieganie aktywacji neutrofili poprzez unikanie wirowania próbek z neutrofilami.

Ocena wybuchu oksydacyjnego w neutrofilach jest rutynowo wykonywana w celu określenia zabijającego wpływu neutrofili na patogen 14,54,55. Badania te są często wykonywane na bakteriach planktonowych, do których dodaje się neutrofile, a odpowiedź na wybuch oksydacyjny określa się ilościowo za pomocą chemiluminescencji wzmocnionej luminolem, która wykrywa aniony ponadtlenkowe wytwarzane przez neutrofile. Obecny protokół jest modyfikowany poprzez zastąpienie bakterii planktonowych statycznie rosnącym biofilmem S. aureus 18 h. W związku z tym neutrofile mogą być bezpośrednio dodawane do biofilmu w celu oceny ich aktywacji. Z drugiej strony bakterie w biofilmach wytwarzają enzymy, takie jak katalaza i dysmutaza ponadtlenkowa, w celu detoksykacji ROS23,56. Biofilmy Staphylococcus epidermidis wytwarzają pod wpływem stresu wyższą katalazę niż jego planktonowy odpowiednik57. Całkowita chemiluminescencja neutrofili stymulowanych PMA w biofilmie S. aureus jest znacznie niższa niż w neutrofilach stymulowanych PMA, w których biofilm jest nieobecny (ryc. 2). Może to wynikać z aktywności tych enzymów detoksykujących. Ponadto biofilmy S. aureus wytwarzają kilka toksyn tworzących pory zwanych leukocydynami, które zabijają neutrofile58. Zmniejszona reakcja impulsowa jest również prawdopodobnie spowodowana zmniejszoną żywotnością neutrofili w obecności biofilmu S. aureus. Podczas gdy w tym badaniu wykorzystuje się luminol, który wykrywa całkowite ROS wytwarzane zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek, inne odczynniki, takie jak CM-H2DCFDA (dioctan 5-(i-6)-chlorometylo-2'7'-dichlorodihydrofluoresceiny) lub izoluminol, muszą być brane pod uwagę, jeśli celem pracy jest badanie wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej produkcji ROS 14,53,54 konkretnie.

Możliwość wizualizacji interakcji neutrofile-biofilm za pomocą mikroskopii może dostarczyć informacji o zachowaniu neutrofili i biofilmów w swojej obecności. Widma wzbudzenia i emisji barwników i białek fluorescencyjnych stanowią migawkę interakcji między 18-godzinnym biofilmem S. aureus a neutrofilami po 30-minutowej inkubacji. Aby skutecznie przechwytywać sygnały z barwionych komórek, ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję próbek na źródła światła podczas ustawiania próbek do mikroskopii. Podczas obrazowania uniknięto szybkiego fotowybielania próbek poprzez obniżenie intensywności źródła światła podczas regulacji wszystkich parametrów, takich jak wysokość stosu Z i czas ekspozycji dla różnych kanałów.

Te proste praktyki pozwoliły na prawidłowe obrazowanie mikroskopowe, w którym zaobserwowano, że niewiele neutrofili jest zlokalizowanych w biofilmie (ryc. 4A). Może to być spowodowane przestrzeniami obecnymi w biofilmie, ponieważ biofilm 18 h S. aureus wyhodowany w MEMα z 2% glukozą nie pokrywa równomiernie powierzchni (ryc. 4B). Jednak w innych badaniach wykorzystanie multimediów wykazało jednolity trawnik wzrostu biofilmu S. aureus i leukocytów przenikających przez biofilm30,58. Ponadto zaobserwowano również, że nastąpiła śmierć komórek neutrofili po 30 minutach inkubacji z biofilmami S. aureus z powodu leukocydyn wytwarzanych przez S. aureus biofilm, które lizują neutrofile58 (Figura 4A, D). Dodanie etapu przemywania w celu usunięcia nieprzylegających neutrofili po inkubacji ich z biofilmem przez 30 minut usunęło ~15% martwych neutrofili z systemu w porównaniu z grupą niemytą, w której mikroskopię wykonano natychmiast po 30 minutach inkubacji (Figura 4D). Zaobserwowano również neutrofile oddziałujące z S. aureus (ryc. 4C). Konieczne są dalsze eksperymenty, aby ocenić, czy S. aureus jest pochłonięty przez neutrofile, czy też przyłączony do powierzchni komórek neutrofili54. Obrazowanie neutrofili i biofilmów jest pierwszym krokiem do oceny kilku funkcji neutrofili, takich jak fagocytoza i NEToza54,59. Wpływ neutrofili na biofilmy można również ocenić, określając ilościowo biomasę biofilmu, zmiany strukturalne biofilmu i żywotność biofilmu, między innymi, za pomocą narzędzi do analizy obrazu wymienionych w kroku 5.6. Wreszcie, w neutrofilach występuje zmienność między dawcami; W związku z tym zaleca się, aby do badań z udziałem neutrofili wykorzystano co najmniej trzech różnych dawców.

Ogólnie rzecz biorąc, połączono standaryzowane testy in vitro w celu oceny interakcji między neutrofilami a biofilmami. Chociaż testy te wykorzystują S. aureus, opisane protokoły można łatwo dostosować do badania innych patogenów. Chociaż istnieją różne modele in vivo do badania interakcji gospodarz-patogen, mogą one być kosztowne i pracochłonne, zwłaszcza jeśli warunki nie są zoptymalizowane. Praca ze standaryzowanymi testami in vitro pozwala zoptymalizować warunki eksperymentalne i potwierdzić obserwacje przed przejściem do systemu in vivo. Wreszcie, do badania interakcji biofilm-neutrofile in vivo wykorzystano różne modele infekcji zwierzęcych. Jednak ważne jest, aby wziąć pod uwagę różnice immunologiczne między modelami ludzkimi i zwierzęcymi 60,61,62,63. Wymaga to wykorzystania neutrofili pochodzących od ludzi do badania tych złożonych interakcji gospodarz-patogen.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (R01AI077628) dla DJW oraz American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) dla ESG. Dziękujemy dr Paulowi Stoodleyowi za dostarczenie nam szczepu USA 300 LAC GFP. Ponadto doceniamy zasoby z Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) oraz OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR) The Ohio State University. Dziękujemy również Amelii Staats, Peterowi Burbackowi i Lisie Coleman z laboratorium Stoodley za pobranie krwi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% nawadnianie chlorkiem sodu, USPBaxter2F7124Bez endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili
150 mL szybkoprzepływowa jednostka filtrującaThermo Scientific565-0020
200 proof etanolVWR89125-188
ml strzykawkaBD309657Służy do pobierania krwi
50 ml stożkowe probówki wirówkoweThermo Scientific339652
60 ml strzykawkaBD309653Służy do pobierania krwi
Odczynniki AgarFisherBP1423-2
Wacik nasączony alkoholemBDUżywany do pobierania krwi
PlastryUżywany do pobierania krwi
BD Bacto Tryptyczny bulion sojowyBDDF0370-07-5Połącz z 1,5% agarem, aby zrobić licznik komórek agaru sojowego Tryptic
Bal Saupply202C
CellTracker niebieski CMCHInvitrogenC2111Niebieski barwnik CMAC (BCD)
Przezroczyste 96-dołkowe płytki polistyrenowe z płaskim dnemCostar3370
Gaza bawełnianaFisherbrand13-761-52Używana do pobierania krwi
Kryształowy fioletAcros Organic40583-0250
Probówkihodowlane Fisherbrand14-961-27Szkło borokrzemianowe 13 x 100 mm
D-(+)- glukozaSigmaG-8270
Dekstran z Leuconostoc spp.Sigma31392-250GSłuży do izolacji neutrofili
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) 1xGibco14190-144
Ethidium homodimer-1InvitrogenL3224 B
Ficoll-Paque plusCytiva17144003Służy do izolacji neutrofili (podłoże gradientu gęstości)
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1xCorning cellgro21-022-CVbez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej
HemacytometrBright Line
HeparynaNovaplusNDC 63323-540-571000 jednostek USP / ml, Używany do pobierania krwi
IMARIS 9.8Oxford Instruments Oprogramowaniedo analizy obrazów mikroskopowych
LuminolSigmaA8511-5G
Minimalny podstawowe podłoże (MEM) Alpha 1xGibco41061-029
Igła (23 G1)BD305145Służy do pobierania krwi
Nikon Eclipse Ti2Nikon
NIS-ElementsNikonKwantyfikacja martwych neutrofili Normalna
ludzka surowicaTechnologia dopełniaczaNHS
Szalka Petriego (100 x 15 mm)VWR25384-342
12-mirystynian 13-octanu
Roztwór poli-L-lizynySigmaP4707-50ML
Chlorek soduOdczynnikiFisher BP358-10Używany do izolacji neutrofili
Oprogramowanie SoftMax ProUrządzenia molekularne Czytnikmikropłytek oprogramowanie używane do akwizycji danych
SpectraMax i3xUrządzenia molekularne Czytnikmikropłytek
Sterylna woda do nawadniania, USPBaxter2F7114Bez endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili
Zestaw do infuzji skrzydełkowej SurfloTerumoSC*19BLK19 G x 3/4", służy do pobierania krwi
Barwienie niebieskim trypanem (0,4%)Gibco15250-061
TurnicateUżywany do pobierania krwi
UltraPure woda destylowanaInvitrogen10977015
Białe nieprzezroczyste płytki 96-dołkoweFalcon353296Hodowla tkankowa poddana działaniu i płaska płyta dolna
μ-Slide VI 0.4Ibidi80601μ-channel slide
3 forbolu

Bibliografia

  1. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
  2. Alhede, M., et al. Phenotypes of non-attached Pseudomonas aeruginosa aggregates resemble surface attached biofilm. PLoS One. 6 (11), 27943(2011).
  3. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews: Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
  4. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  5. Schilcher, K., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm development: structure, regulation, and treatment strategies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (3), 0002(2020).
  6. Kaplan, J. B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. Journal of Dental Research. 89 (3), 205-218 (2010).
  7. Otto, M. Staphylococcal Biofilms. Microbiology Spectrum. 6 (4), 10(2018).
  8. Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
  9. Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infection and Immunity. 69 (5), 3423-3426 (2001).
  10. Zheng, Y., He, L., Asiamah, T. K., Otto, M. Colonization of medical devices by staphylococci. Environmental Microbiology. 20 (9), 3141-3153 (2018).
  11. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerging Infectious Diseases. 7 (2), 277-281 (2001).
  12. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  13. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  14. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  15. van Kessel, K. P., Bestebroer, J., van Strijp, J. A. Neutrophil-mediated phagocytosis of Staphylococcus aureus. Frontiers in Immunology. 5, 467(2014).
  16. Nguyen, G. T., Green, E. R., Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH oxidase activation and bacterial resistance. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 373(2017).
  17. Saini, R., Singh, S. Inducible nitric oxide synthase: An asset to neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 105 (1), 49-61 (2019).
  18. Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
  19. Segal, A. W. The function of the NADPH oxidase of phagocytes and its relationship to other NOXs in plants, invertebrates, and mammals. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (4), 604-618 (2008).
  20. Fang, F. C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nature Reviews Microbiology. 2 (10), 820-832 (2004).
  21. Bogdan, C. Nitric oxide and the immune response. Nature Immunology. 2 (10), 907-916 (2001).
  22. Chua, S. L., et al. Reactive oxygen species drive evolution of pro-biofilm variants in pathogens by modulating cyclic-di-GMP levels. Open Biology. 6 (11), 160162(2016).
  23. El Haj, C., Lichtenberg, M., Nielsen, K. L., Bjarnsholt, T., Jensen, P. O. Catalase protects biofilm of Staphylococcus aureus against daptomycin activity. Antibiotics. 10 (5), 511(2021).
  24. Ghimire, N., et al. Direct microscopic observation of human neutrophil-Staphylococcus aureus interaction in vitro suggests a potential mechanism for initiation of biofilm infection on an implanted medical device. Infection and Immunity. 87 (12), 00745(2019).
  25. Bhattacharya, M., et al. Leukocidins and the nuclease nuc prevent neutrophil-mediated killing of Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 88 (10), 00372(2020).
  26. Bogachev, M. I., et al. Fast and simple tool for the quantification of biofilm-embedded cells sub-populations from fluorescent microscopic images. PLoS One. 13 (5), 0193267(2018).
  27. Kerstens, M., et al. A flow cytometric approach to quantify biofilms. Folia Microbiologica. 60 (4), 335-342 (2015).
  28. Meyle, E., et al. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation. The International Journal of Artificial Organs. 33 (9), 608-620 (2010).
  29. Oveisi, M., et al. Novel assay to characterize neutrophil responses to oral biofilms. Infection and Immunity. 87 (2), 00790(2019).
  30. Leid, J. G., Shirtliff, M. E., Costerton, J. W., Stoodley, P. Human leukocytes adhere to, penetrate, and respond to Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 70 (11), 6339-6345 (2002).
  31. Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), 00537(2013).
  32. Cody, W. L., et al. Skim milk enhances the preservation of thawed -80 degrees C bacterial stocks. Journal of Microbiological Methods. 75 (1), 135-138 (2008).
  33. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, 3064(2012).
  34. Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L., Fernandes, E. Optimization of experimental settings for the analysis of human neutrophils oxidative burst in vitro. Talanta. 78 (4-5), 1476-1483 (2009).
  35. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1 Unit 1B 1 (2005).
  36. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
  37. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  38. Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunology Research. 2017, 1254792(2017).
  39. Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
  40. Staats, A., et al. Rapid aggregation of Staphylococcus aureus in synovial fluid is influenced by synovial fluid concentration, viscosity, and fluid dynamics, with evidence of polymer bridging. mBio. , 0023622(2022).
  41. Chiu, I. M., et al. Bacteria activate sensory neurons that modulate pain and inflammation. Nature. 501 (7465), 52-57 (2013).
  42. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. 102 (1), 14-15 (2013).
  43. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  44. Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
  45. Luo, T. L., et al. Introducing BAIT (Biofilm Architecture Inference Tool): a software program to evaluate the architecture of oral multi-species biofilms. Microbiology. 165 (5), 527-537 (2019).
  46. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. Journal of Applied Microbiology. 105 (2), 585-590 (2008).
  47. Eze, E. C., El Zowalaty, M. E. Combined effects of low incubation temperature, minimal growth medium, and low hydrodynamics optimize Acinetobacter baumannii biofilm formation. Infection and Drug Resistance. 12, 3523-3536 (2019).
  48. Harris, L. G., Tosatti, S., Wieland, M., Textor, M., Richards, R. G. Staphylococcus aureus adhesion to titanium oxide surfaces coated with non-functionalized and peptide-functionalized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials. 25 (18), 4135-4148 (2004).
  49. Miao, J., et al. Biofilm formation of Staphylococcus aureus under food heat processing conditions: first report on cml production within biofilm. Scientific Reports. 9 (1), 1312(2019).
  50. Lade, H., et al. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates is differentially affected by glucose and sodium chloride supplemented culture media. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1853(2019).
  51. Guzel Kaya, G., et al. Antibacterial activity of linezolid against gram-negative bacteria: utilization of epsilon-Poly-l-Lysine capped silica xerogel as an activating carrier. Pharmaceutics. 12 (11), 1126(2020).
  52. Clinton, A., Carter, T. Chronic wound biofilms: pathogenesis and potential therapies. Laboratory Medicine. 46 (4), 277-284 (2015).
  53. Scheel-Toellner, D., et al. Reactive oxygen species limit neutrophil life span by activating death receptor signaling. Blood. 104 (8), 2557-2564 (2004).
  54. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006842(2018).
  55. Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1005-1010 (2016).
  56. Suo, Y., Huang, Y., Liu, Y., Shi, C., Shi, X. The expression of superoxide dismutase (SOD) and a putative ABC transporter permease is inversely correlated during biofilm formation in Listeria monocytogenes 4b G. PLoS One. 7 (10), 48467(2012).
  57. Olwal, C. O., Ang'ienda, P. O., Ochiel, D. O. Alternative sigma factor B (sigma(B)) and catalase enzyme contribute to Staphylococcus epidermidis biofilm's tolerance against physico-chemical disinfection. Scientific Reports. 9 (1), 5355(2019).
  58. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  59. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  60. Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
  61. Pletzer, D., Mansour, S. C., Wuerth, K., Rahanjam, N., Hancock, R. E. New mouse model for chronic infections by gram-negative bacteria enabling the study of anti-infective efficacy and host-microbe interactions. mBio. 8 (1), 00140(2017).
  62. Davis, M. M. A prescription for human immunology. Immunity. 29 (6), 835-838 (2008).
  63. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcja neutrofili z biofilmembiofilm Staphylococcus aureusreaktywne formy tlenuszerokopolowa mikroskopia fluorescencyjnatest fagocytozyzewnątrzkomórkowe pułapki neutrofiloweopsonizowany biofilmbarwienie LIVE DEAD
Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.