Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Summary

Obecny protokół opisuje badanie interakcji neutrofil-biofilm. Biofilmy Staphylococcus aureus tworzy się in vitro i inkubuje z neutrofilami ludzkimi pochodzącymi z krwi obwodowej. Odpowiedź oksydacyjna neutrofili jest określana ilościowo, a lokalizacja neutrofili w biofilmie jest określana za pomocą mikroskopii.

Abstract

Neutrofile są pierwszą linią obrony wykorzystywaną przez układ odpornościowy podczas infekcji mikrobiologicznej. In vivo neutrofile są rekrutowane do miejsca infekcji, gdzie wykorzystują takie procesy, jak fagocytoza, produkcja reaktywnych form tlenu i azotu (odpowiednio ROS, RNS), NEToza (pułapka zewnątrzkomórkowa neutrofili) i degranulacja w celu zabicia drobnoustrojów i ustąpienia infekcji. Interakcje między neutrofilami a drobnoustrojami planktonowymi zostały szeroko zbadane. W ostatnich latach pojawiło się zainteresowanie badaniem zakażeń wywoływanych przez biofilmy. Biofilmy wykazują właściwości, w tym tolerancję na zabijanie przez neutrofile, odmienne od ich planktonowych odpowiedników. Dzięki pomyślnemu stworzeniu modeli biofilmu zarówno in vitro, jak i in vivo, można teraz badać interakcje między tymi społecznościami drobnoustrojów a różnymi komórkami odpornościowymi. W tym przypadku techniki, które wykorzystują kombinację tradycyjnych modeli biofilmu i dobrze ugruntowanych testów aktywności neutrofili, są dostosowane specjalnie do badania interakcji neutrofili i biofilmu. Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna służy do monitorowania lokalizacji neutrofili w biofilmach. Te biofilmy są hodowane w warunkach statycznych, a następnie dodawane są neutrofile pochodzące z ludzkiej krwi obwodowej. Próbki są barwione odpowiednimi barwnikami przed wizualizacją pod mikroskopem. Dodatkowo produkcja ROS, która jest jedną z wielu odpowiedzi neutrofili na patogeny, jest określana ilościowo w obecności biofilmu. Dodanie komórek odpornościowych do tego uznanego systemu poszerzy wiedzę na temat interakcji gospodarz-patogen, zapewniając jednocześnie wykorzystanie ustandaryzowanych i zoptymalizowanych warunków do dokładnego pomiaru tych procesów.

Introduction

Biofilm to społeczność mikroorganizmów związanych z powierzchnią lub niezwiązanych agregatów zamkniętych w zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS)^1,2. Społeczności te chronią zamknięte mikroorganizmy przed stresorami środowiskowymi, w tym tolerancją na środki przeciwdrobnoustrojowe i układ odpornościowy³. Kilka chorobotwórczych gatunków drobnoustrojów tworzy biofilmy, które są związane z przewlekłymi infekcjami⁴. Rozwój biofilmów to skomplikowany proces obejmujący przyczepianie się do powierzchni, produkcję EPS, proliferację komórek, strukturyzację biofilmu i odrywanie komórek⁵. Gdy komórki rozproszą się, tworząc biofilm, pozostają planktoniczne lub przemieszczają się do nowego podłoża i ponownie inicjują rozwój biofilmu⁶.

Staphylococcus aureus, patogen oportunistyczny, podąża za ogólnym schematem rozwoju biofilmu, w tym przyczepiania, proliferacji, dojrzewania i rozprzestrzeniania się⁷. Proces przyłączania w biofilmach S. aureus jest podyktowany oddziaływaniami hydrofobowymi, kwasami teichojowymi i mikrobiologicznymi składnikami powierzchni rozpoznającymi cząsteczki matrycy adhezyjnej (MSCRAMMs)^8,9. Gdy zaczyna się proliferacja S. aureus, wytwarzany jest EPS, który składa się głównie z polisacharydów, białek, zewnątrzkomórkowego DNA i kwasów tejchojowych⁵. Podczas wytwarzania składników EPS wytwarzane są również różne egzoenzymy i małe cząsteczki, które przyczyniają się do trójwymiarowej struktury biofilmu i pomagają w oderwaniu⁵. S. aureus wykorzystuje ten wysoce skoordynowany styl życia do tworzenia różnych przewlekłych infekcji, w tym infekcji spowodowanych zamieszkaniem urządzeń medycznych¹⁰.

Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) jest jedną z głównych przyczyn infekcji związanych z urządzeniami medycznymi znajdującymi się na stałe, takimi jak cewniki do żył centralnych i dróg moczowych, protezy stawów, rozruszniki serca, mechaniczne zastawki serca i urządzenia wewnątrzmaciczne¹¹. Podczas takich infekcji neutrofile są pierwszymi komórkami odpornościowymi gospodarza rekrutowanymi do miejsca infekcji w celu zwalczania patogenów za pomocą wielu strategii¹². Należą do nich fagocytoza, degranulacja, produkcja reaktywnych form tlenu i azotu (ROS/RNS) lub uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w celu wyeliminowania patogenów¹³.

Wytwarzanie ROS po fagocytozie drobnoustrojów jest jedną z kluczowych reakcji przeciwdrobnoustrojowych wykazywanych przez neutrofile¹⁴. Fagocytoza jest wzmocniona, jeśli drobnoustroje są pokryte opsoninami, w szczególności immunoglobulinami i składnikami dopełniacza znajdującymi się w serum¹⁵. Opsonizowane drobnoustroje są następnie rozpoznawane przez receptory powierzchniowe komórek na neutrofilach i pochłaniane, tworząc przedział zwany phagosome¹⁵. Neutrofile generują i uwalniają ROS w fagosomie za pośrednictwem związanej z błoną oksydazy NADPH¹⁶. Ten wieloskładnikowy kompleks enzymatyczny generuje aniony ponadtlenkowe, przenosząc elektrony do tlenu cząsteczkowego¹⁶. Dodatkowo, neutrofile generują również RNS poprzez ekspresję indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS)¹⁷. Te wysokie rodniki ponadtlenkowe i tlenek azotu w fagosomie mają szerokie działanie przeciwdrobnoustrojowe. Mogą wchodzić w interakcje z centrami metali w enzymach i uszkadzać kwasy nukleinowe, białka i błony komórkowe patogenu^18,19,20,21. Wiele mikroorganizmów przyjmuje styl życia biofilmu i stosuje różne strategie, aby uniknąć zabicia przez ROS^22,23. Tak więc standaryzowane testy, które łączą biofilmy z neutrofilami w celu ilościowego określenia ROS, są korzystne dla spójnych wyników.

Podczas gdy testy, takie jak ilościowe określanie produkcji ROS neutrofili, dostarczają informacji o reakcjach neutrofili na biofilmy, możliwość wizualizacji interakcji neutrofili w biofilmie może również służyć jako potężne narzędzie. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych do mikroskopii często wymaga optymalizacji w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów, które można wykorzystać do analizy obrazowania mikroskopowego. Elastyczność w optymalizacji niektórych warunków jest ograniczona, ponieważ neutrofile mogą ulec śmierci komórkowej po izolacji. Ponadto biofilmy są zwykle płukane w celu usunięcia populacji planktonu z zestawu doświadczalnego przed dodaniem neutrofili. Podczas płukania może wystąpić zmienność między powtórzonymi biofilmami z powodu utraty częściowej biomasy, jeśli biofilmy są luźno przylegające do powierzchni.

Ogólnie rzecz biorąc, obecne metody analizy interakcji między neutrofilami a biofilmami obejmują głównie mikroskopię, cytometrię przepływową i wyliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU)^24,25,26,27. Mikroskopia polega na użyciu barwników, które albo bezpośrednio barwią neutrofile i biofilmy, albo celują w różne reakcje neutrofili przeciwko drobnoustrojom, takie jak tworzenie NET, degranulacja i śmierć komórki^25,28. Podzbiór tych reakcji, takich jak śmierć komórek neutrofilów i degranulacja, może być również analizowany za pomocą cytometrii przepływowej, ale wymaga, aby neutrofile były preferencyjnie niezwiązane z dużymi agregatami drobnoustrojów w biofilmie^28,29. Cytometria przepływowa może również określić ilościowo niektóre parametry biofilmu, takie jak żywotność komórek²⁷. Procesy te wymagają jednak rozerwania biomasy biofilmu i nie byłyby przydatne do wizualizacji innych ważnych interakcji, takich jak przestrzenne rozmieszczenie neutrofili i ich składników w biofilmie^27,29,30.

Obecny protokół skupia się na adaptacji niektórych tradycyjnie stosowanych metod do badania interakcji neutrofil-biofilm na biofilmach, które zostały zoptymalizowane tak, aby zapewnić minimalną zmienność podczas obchodzenia się z nimi. Protokół ten zapewnia zatem ustandaryzowane metody hodowli i ilościowego oznaczania biofilmów, izolowania pierwotnych ludzkich neutrofili z krwi obwodowej, ilościowego określania produkcji ROS i wizualizacji interakcji biofilm-neutrofile za pomocą mikroskopii. Protokół ten można dostosować do różnych systemów, aby zrozumieć interakcje biofilm-neutrofile, biorąc pod uwagę heterogeniczność między pulami dawców.

Protocol

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Uzyskano świadomą pisemną zgodę wszystkich dawców na pobranie krwi obwodowej w celu wyizolowania pierwotnych ludzkich neutrofili. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)³¹ został użyty jako organizm modelowy do przeprowadzenia eksperymentów. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) ze względu na potencjalne narażenie na patogen przenoszony przez krew.

1. Przygotowanie biofilmu in vitro

1. Uzyskaj izolowane kolonie S. aureus z kriokonserwowanego bulionu³¹ przy użyciu techniki płytki smugowej^32,33 na bogatej w składniki odżywcze płycie agarowej, takiej jak Tryptic Soy Agar (patrz Tabela Materiałów).
2. Pokryj poszczególne studzienki 96-dołkowej płytki 100 μl 0,001% (v/v) poli-L-lizyny (PLL) rozcieńczonej w sterylnym_H2Oi inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aseptycznie odessać roztwór PLL za pomocą pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Wszystkie etapy aspiracji w protokole są wykonywane przy użyciu pułapki aspiracyjnej wspomaganej próżnią, chyba że zaznaczono inaczej.
3. Przygotować posiew przez noc, zaszczepiając kolonię S. aureus w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (MEMα) uzupełnionej 2% glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16-18 godzin.
4. Rozcieńczyć kulturę przez noc, przenosząc 50 μl do 5 ml świeżego MEMα uzupełnionego 2% glukozą i inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 200 obr./min, aż do połowy fazy logarytmicznej, zwykle między gęstością optyczną 600 (OD_{600 nm}) 0,5-0,8. Użyj MEMα, aby znormalizować kulturę średniologarytmiczną do OD_600nm 0,1.
5. Przenieś 150 μl znormalizowanej kultury do każdego dołka 96-dołkowej płytki poddanej działaniu PLL. Inkubować statycznie przez 18-20 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Biofilmy mogą być również hodowane w innych formatach, takich jak szkiełka μ-kanałowe (patrz Tabela materiałów).
6. Odessać supernatant w celu usunięcia komórek planktonowych. Delikatnie umyj pozostałą biomasę 150 μl zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodawaj HBSS kroplami, aby uniknąć przerwania biofilmu.
   UWAGA: Podczas zasysania supernatantu i HBSS podczas mycia, należy pozostawić tylko tyle płynu (supernatantu lub HBSS) w studzienkach zawierających biofilm, tak aby biofilm był nadal zanurzony. Zapobiega to przerwaniu struktury biofilmu, gdy HBSS jest dodawany kroplami w celu wypłukania biofilmu.
7. Powtórz krok 1.6 co najmniej dwa razy, aby usunąć wszystkie komórki planktonu. W tym momencie biofilmy są gotowe do natychmiastowych dalszych eksperymentów.
   UWAGA: Jeśli biofilmy nie są wykorzystywane do eksperymentów z neutrofilami, HBSS można zastąpić solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). HBSS jest preferowany w stosunku do PBS, ponieważ HBSS zawiera składniki, w tym glukozę, które zapewniają optymalne warunki do aktywacji neutrofili³⁴.

2. Kwantyfikacja biomasy biofilmu

1. Przygotować zapas 0,1% (w/v) roztworu fioletu krystalicznego (CV) (patrz tabela materiałów), rozpuszczając się w 20% (v/v) etanolu i 80% (v/v)_H2O. Upewnij się, że CV jest całkowicie rozpuszczony w etanolu przed dodaniem_H2O. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór.
2. Dodać 150 μl 0,1% roztworu CV do przemytego biofilmu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyj co najmniej trzech pustych studzienek jako kontrolek tylko dla mediów.
3. Odessać 0,1% roztwór CV z biofilmów i przemyć poplamione biofilmy 200 μl 1x PBS. Powtórz ten proces, w sumie trzy płukania, aby usunąć nadmiar CV z dołków.
4. Dodać 150 μl 33% (v/v) lodowatego kwasu octowego rozcieńczonego_H2O. Inkubować w temperaturze pokojowej na bujaku z prędkością 50 obr./min przez 30 minut, aby umożliwić całkowite rozpuszczenie CV związanego z biomasą.
   UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie z przepływem laminarnym z odpowiednimi środkami ochrony osobistej, ponieważ lodowaty kwas octowy jest substancją chemiczną.
5. W międzyczasie należy skonfigurować czytnik mikropłytek (patrz Tabela materiałów), aby odczytać wartości barwienia CV. Po potraktowaniu lodowatym kwasem octowym odczytać tabliczkę na długości fali 595 nm.
   UWAGA: Długość fali używana do pomiaru średnicy zewnętrznej CV może wynosić od 500 do 600 nm³⁵.

3. Izolacja neutrofili

UWAGA: Neutrofile zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą z niewielkimi zmianami³⁶. Ten protokół izolacji łączy najpierw wirowanie w gradionym gradiacji gęstości, a następnie 3% sedymentację dekstranu. W tej sekcji omówiono tylko ogólny protokół izolacji neutrofili, koncentrując się na zmianach wprowadzonych do opublikowanego protokołu. Co więcej, opisany poniżej protokół jest jedną z wielu metod, które mogą izolować neutrofile i mogą być zastępowane w razie potrzeby. Inne metody izolowania neutrofili obejmują użycie pożywki do separacji komórek lub magnetycznej separacji komórek przeciwciał³⁷.

1. Pobrać krew od dorosłego dawcy poprzez wkłucie żyły, zgodnie z protokołem przedstawionym w instytucjonalnym IRB. Przed pobraniem krwi należy upewnić się, że w strzykawce znajduje się wystarczająca ilość heparyny wolnej od konserwantów, tak aby końcowe stężenie heparyny wynosiło 20 j./ml.
2. Rozcieńczyć krew heparynizowaną 3/4 objętości 0,9% NaCl wolnego od endotoksyn (patrz tabela materiałów) w H₂O w temperaturze pokojowej.
3. Na każde 20 ml rozcieńczonej próbki krwi należy dodać 14 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną próbkę krwi na pożywce o gradiencie gęstości.
4. Odwirować warstwową próbkę krwi o masie 400 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka ma powolną przerwę, aby uniknąć naruszenia warstwy po zakończeniu wirowania.
   UWAGA: Próbka krwi będzie miała pięć warstw zawierających mieszaninę soli fizjologicznej i osocza, warstwę komórek jednojądrzastych, pożywkę gradientu gęstości, neutrofile i erytrocyty.
5. Za pomocą pipety serologicznej odessać wszystkie warstwy powyżej neutrofili i osadu erytrocytów, a następnie delikatnie zawiesić osad w zimnym, wolnym od endotoksyn 0,9% NaCl w_H2O. Dla każdej osadki wytworzonej z 20 ml próbki krwi należy ponownie zawiesić osad z powrotem do całkowitej objętości 20 ml. Dodać 3% dekstranu w stosunku 1:1 (patrz Tabela Materiałów). Inkubować probówkę w pozycji pionowej przez 18-20 minut na lodzie.
   UWAGA: Upewnij się, że 3% dekstran jest wykonany z wolnego od endotoksyn 0,9% NaCl w H₂O.
6. Usunąć 20 ml górnej warstwy zawierającej neutrofile i niektóre erytrocyty na nową stożkową probówkę o pojemności 50 ml i odwirować ją przy 355 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odleć supernatant, pozostawiając czerwoną osadkę.
7. Delikatnie zawiesić osad w 10 ml zimnego, sterylnego_H2Oprzez 30 s w celu lizy pozostałych erytrocytów. Natychmiast dodaj 10 ml zimnej 0,9% soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn do mieszaniny, aby przywrócić toniczność. Odwirować roztwór o stężeniu 233 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
8. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający 95%-97% neutrofili w 1 ml zimnego HBSS na 20 ml próbki krwi.
9. Przenieść 10 μl zawieszonych neutrofili w 90 μl 0,4% barwnika wykluczającego błękit trypanowy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Komórki niezdolne do życia są barwione na niebiesko, ponieważ barwnik wykluczający błękit trypanowy jest nieprzepuszczalny w komórkach żywotnych. Ten protokół zapewnia >99% żywotności komórek^37,38.
10. Dodać dodatkowe HBSS tak, aby końcowe stężenie neutrofili wynosiło 4 x 10⁶ komórek/ml.
    UWAGA: W przypadku <99% żywotności komórek można nadal osiągnąć końcowe stężenie 4 x 10⁶ komórek/ml; jednak całkowita objętość roztworu zawierającego 4 x 10⁶ komórek/ml uzyskana zmniejszy się. Końcowe stężenie neutrofili można dostosować do potrzeb eksperymentalnych użytkownika. Neutrofile zostały ponownie zawieszone w końcowym stężeniu 4 x 10⁶ komórek/ml dla wszystkich eksperymentów opisanych poniżej. Aby uwzględnić zmienność między dawcami, zdecydowanie zaleca się, aby wszystkie eksperymenty związane z neutrofilami były przeprowadzane z udziałem co najmniej trzech różnych dawców.

4. Pomiar ROS wytwarzanych przez neutrofile

1. Dodać kroplami 100 μl 20% normalnej ludzkiej surowicy (rozcieńczonej w HBSS) do przemytego biofilmu (krok 1.6) i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych przez 30 minut w celu opsonizacji biofilmu.
2. Odessać 20% roztwór surowicy i przemyć biofilmy kroplami 150 μl HBSS. Odessać HBSS, pozostawiając studzienki z opsonizowanymi biofilmami.
   UWAGA: Do interpretacji eksperymentu zalecane są co najmniej cztery grupy: (A) neutrofile + biofilm, (B) neutrofile + PMA (kontrola pozytywna, patrz tabela materiałów), (C) tylko neutrofile i (D) tylko biofilm.
3. Dodać luminol (patrz tabela materiałów) do neutrofili zawieszonych w HBSS w stężeniu 4 x 10⁶ komórek/ml tak, aby końcowe stężenie luminolu wynosiło 50 μM. To rozwiązanie jest gotowe do użycia dla grup (A) i (C). Dodaj 4 x 10⁵ neutrofili zmieszanych z luminolem do studzienek z opsonizowanymi biofilmami.
4. W oddzielnej probówce przygotować 50 μM roztwór luminolu w HBSS bez neutrofili i dodać go do studzienki zawierającej biofilm (grupa D).
5. Podwielokrotność 350 μl neutrofili zmieszanych z luminolem i dodać do mieszaniny 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) o końcowym stężeniu 500 ng/ml. Dla grupy (B) dodać 4 x 10⁵ neutrofili z tej mieszaniny do studzienek bez biofilmu. Służy to jako kontrola pozytywna.
   UWAGA: Stężenie PMA wskazane na tym etapie jest stosunkowo wysokie, aby zapewnić silną odpowiedź na impuls, ponieważ neutrofile stymulowane PMA są kontrolą pozytywną. PMA może być stosowany w niższym stężeniu do aktywacji neutrofili, w zależności od eksperymentu.
6. Odwirować płytkę o sile 270 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
7. Upewnij się, że czytnik płytek jest ustawiony na 37 °C wraz z ustawieniem luminescencji i odczytu kinetycznego przez 60 minut w odstępach 3-minutowych. Umieść płytkę w czytniku płytek, aby zmierzyć produkcję ROS przez neutrofile przez 60 min.
   UWAGA: W tym teście biofilmy hodowano na białych płytkach używanych do testów luminescencyjnych. PMA jest znanym agonistą odpowiedzi oksydacyjnej na wybuch³⁹. Podczas wykonywania badań z udziałem PMA należy upewnić się, że PMA jest dodawany na ostatnim etapie, gdy roztwór zawierający neutrofile jest zimny, ponieważ PMA natychmiast inicjuje odpowiedź burst.

5. Obrazowanie interakcji biofilm-neutrofile

1. Stwórz biofilm, wykonując kroki 1.2-1.6. Aby ułatwić obrazowanie biofilmu, należy zastosować fluorescencyjny szczep S. aureus, taki jak USA300 eksprymujący białko zielonej fluorescencji (GFP)^40,41, aby zwiększyć łatwość obrazowania mikroskopowego.
   UWAGA: Zamiast 96-dołkowej płytki użyto 6-μ-kanałowego szkiełka (patrz Tabela materiałów) w celu zademonstrowania modelu biofilmu in vitro (krok 1).
2. Inkubować 4 x 10⁶ komórek/ml neutrofili ze 100 μM niebieskiego barwnika CMAC (7-amino-4-chlorometylokoumaryny) (BCD, patrz tabela materiałów) przez 30 minut w bujaku w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Upewnij się, że próbki są inkubowane w ciemności i ogranicz ekspozycję na światło w pozostałych etapach.
3. Aby wypłukać nadmiar BCD, odwirować neutrofile o stężeniu 270 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w świeżym HBSS. W tym momencie dodać homodimer-1 etydyny (patrz tabela materiałów) do neutrofili barwionych BCD w końcowym stężeniu 4 μM w celu monitorowania śmierci neutrofili i bakterii.
4. Dodać 150 μl neutrofili do biofilmu S. aureus, który został wyhodowany na μ-szkiełkach, tak aby stosunek neutrofili do bakterii wynosił 1:30 (neutrofile: bakterie). Inkubować μ szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut. Liczba komórek bakteryjnych opiera się na liczbie komórek uzyskanej z posiewu biofilmu trwającego 18 godzin.
5. Zobrazuj oddziaływanie neutrofile-biofilm za pomocą kanałów fluorescencyjnych odpowiadających długościom fal wzbudzenia i emisji barwników/białek fluorescencyjnych.
   UWAGA: W niniejszym badaniu BCD wynosi 353/466 nm, homodimer-1 etydyny-1 wynosi 528/617 nm, a GFP wynosi 395/509 nm. Ogranicz ekspozycję próbki na działanie lasera lub światła, aby zapobiec fotowybielaniu próbek.
6. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych lub programów, takich jak FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ i BAIT, między innymi^42,43,44,45.
   UWAGA: Podczas pracy z plamami należy wziąć pod uwagę specyfikę używanych barwników. Niektóre plamy działają na komórki prokariotyczne i eukariotyczne, podczas gdy inne działają tylko na jedną. Jeśli neutrofile i biofilmy są barwione oddzielnie przy użyciu barwników, które mogą barwić oba typy komórek, upewnij się, że zmyłeś pozostały barwnik przed połączeniem neutrofili i biofilmów, aby zapobiec barwieniu krzyżowemu.

Results

Pożywki używane do hodowli biofilmów bakteryjnych wpływają na przetrwanie neutrofili. Przetestowano różne pożywki w celu zmniejszenia wpływu samych pożywek na żywotność neutrofili do badania interakcji neutrofil-biofilm (Rysunek 1). Pożywki do hodowli bakterii, takie jak bulion sojowy tryptyczny, minimalizują żywotność neutrofili, tak że ~60% neutrofili jest żywych po 30-minutowym okresie inkubacji w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Pożywki do hodowli komórek ssaków, takie jak MEMα, nie wpływają na żywotność neutrofili i wspomagają wzrost biofilmów S. aureus. W rzeczywistości minimalna ilość pożywki sprzyja silnemu wzrostowi biofilmów u innych bakterii^46,47.

Aby ocenić wpływ pożywek na wzrost biofilmu i zmienność kwantyfikacji biomasy biofilmu po umyciu biomasy w celu wyeliminowania komórek planktonowych, na 96-dołkowej płytce wyhodowano 18-godzinny biofilm S. aureus, z dołkami traktowanymi lub nietraktowanymi poli-L-lizyną. Zastosowano pożywkę bogatą w składniki odżywcze (Tryptic Soy Bulth (TSB)) i minimalną (MEMα) w stanie, w jakim się znajduje, lub uzupełnioną 2% glukozą. Biomasa biofilmu wybarwiona CV ujawniła, że biofilm S. aureus wyhodowany w MEMα uzupełniony 2% glukozą wytworzył najbardziej wytrzymały biofilm spośród wszystkich badanych pożywek (Rysunek 2A). Ponadto biofilmy wyhodowane w studzienkach poddanych wstępnej obróbce PLL zawierających MEMα + 2% glukozy wykazywały mniejszą zmienność niż biofilmy w studzienkach niepoddanych działaniu PLL zawierających MEM α + 2% glukozy. Te biofilmy wykazywały mniejszą zmienność w kwantyfikacji za pomocą testu CV ³⁵ i CFU/ml po posianiu po dokładnym obchodzeniu się z biofilmami w celu ilościowego oznaczania biomasy. Te biofilmy zawierały, średnio, 1 x 10⁸ CFU/ml, jak wykazano przez posiew biofilmów w ciągu 3 oddzielnych dni (Rysunek 2B). Liczba ta jest przydatna do określenia liczby neutrofili, które należy dodać do biofilmów do testów funkcjonalności neutrofili.

Aby zmierzyć produkcję ROS przez neutrofile w odpowiedzi na biofilmy, biofilmy S. aureus były hodowane statycznie przez 18-20 godzin na 96-dołkowej płytce. Następnie opsonizowano biofilmy i dodano neutrofile. Produkcja ROS była następnie mierzona przez 60 minut (Rysunek 3A). Pole pod krzywą oblicza się na podstawie krzywej kinetycznej w celu ilościowego określenia całkowitej produkcji ROS przez neutrofile. Neutrofile traktowane agonistą, takim jak PMA, stosowane jako kontrola, wykazują zwiększoną produkcję ROS. Przy braku biofilmów neutrofile traktowane PMA wykazywały silną produkcję ROS. W obecności biofilmu S. aureus ogólna produkcja ROS przez neutrofile traktowane PMA zmniejszyła się. W przypadku braku PMA, neutrofile polegają wyłącznie na swojej interakcji z biofilmem, co dodatkowo zmniejsza ilość wytwarzanych ROS (Rysunek 3B).

Aby zobrazować interakcje neutrofil-biofilm za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, użyto szczepu S. aureus z ekspresją GFP, niebieskiego barwnika CMAC i homodimera etydyny-1, który barwi odpowiednio cytoplazmę żywych komórek i DNA martwych komórek. Biofilm S. aureus hodowano przez 18 godzin w 6 μ-kanałowym szkiełku. Niebieskie neutrofile znakowane barwnikiem CMAC dodano wraz z homodimerem etydyny-1 do przemytych biofilmów i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przed obrazowaniem. Mikroskopia fluorescencyjna o szerokim polu widzenia wykazała, że wiele neutrofili było zlokalizowanych na powierzchni biofilmów S. aureus, podczas gdy kilka znajduje się w obrębie biofilmu (Ryc. 4A). Interakcja między komórkami S. aureus w neutrofilach była również widoczna (Ryc. 4C). Większość komórek S. aureus oddziałujących z neutrofilami (cyjan) była martwa (magenta), podczas gdy kilka pozostało żywych (żółtych), jak określono przez barwienie żywych-martwych (Ryc. 4C). Dla porównania, biofilmy S. aureus wykazujące ekspresję GFP wybarwiono homodimerem etydyny-1, co ujawniło frakcję martwej populacji S. aureus w biofilmie (Figura 4B). Nieżywotne neutrofile, które były dodatnie dla homodimeru etydyny-1, oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów) po inkubacji z biofilmami S. aureus. Około 48% neutrofili było już martwych w ciągu 30 minut od inkubacji z biofilmem S. aureus. Podczas optymalizacji protokołu mikroskopowego oceniono również efekt płukania biofilmu i neutrofili po 30 minutach inkubacji w celu usunięcia nieprzylegających neutrofili, ujawniając około 33% martwych neutrofili nadal przyczepionych do biofilmu (Ryc. 4D).

Rysunek 1: Test LIVE-DEAD porównuje przeżywalność neutrofili między pożywką bakteryjną i hodowlaną ssaków. Neutrofile izolowano i inkubowano w HBSS, MEMα, TSB lub 0,1% SDS przez 30 minut. Barwienie LIVE-DEAD przeprowadzono przy użyciu Calcein AM (na żywo) i homodimeru etydyny-1 (martwy). Określono procent żywych neutrofili, przy czym neutrofile inkubowane przez HBSS traktowano jako 100% żywe neutrofile. Wyniki reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech egzemplarzach, z neutrofilami uzyskanymi od dwóch różnych dawców. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001. Jednokierunkowa ANOVA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kwantyfikacja biomasy biofilmu w różnych warunkach i liczba żywotności bakterii biofilmów uprawianych w zoptymalizowanych warunkach. (A) S. aureus wysiewano na 96-dołkowej płytce, pokrytej lub niepokrytej poli-L-lizyną (PLL). Biofilmy hodowano w TSB, MEMα lub w jednym z pożywek uzupełnionych 2% glukozą w warunkach statycznych przez 18 godzin. Barwienie fioletem krystalicznym (CV) przeprowadzono w celu zabarwienia biomasy biofilmu. Wymytą plamę CV rozcieńczono w stosunku 1:10 i odczytano w czytniku mikropłytek. Wyniki reprezentują średnio trzy niezależne eksperymenty przeprowadzone w trzech egzemplarzach. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. SD dla każdej grupy jest pokazane na dole, aby pokazać zmienność różnych warunków wzrostu biofilmu. (B) Liczbę bakteryjnych CFU uzyskano z biofilmów hodowanych w zoptymalizowanym pożywce (MEMα + 2% glukozy). 18-godzinne statyczne biofilmy poddano takiej samej liczbie myć, po których nastąpiła 10-minutowa sonikacja w celu rozluźnienia biomasy biofilmu i przepuszczono przez igłę 22G w celu rozerwania agregatów przed posiewem. Wyniki reprezentują trzy powtórzenia przeprowadzone w trzech powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (ns = nieistotne. Jednokierunkowa ANOVA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja produkcji ROS przez neutrofile za pomocą testu chemiluminescencyjnego. (A) Neutrofile (PMN) inkubowano z biofilmami S. aureus (BF) przemytymi HBSS w obecności (zamknięty szary trójkąt) lub bez (otwarty szary odwrócony trójkąt) PMA w celu zmierzenia produkcji ROS przez neutrofile. Luminol użyto do wykrywania ROS co 3 minuty przez 60 minut w czytniku mikropłytek. Podczas gdy neutrofile traktowane PMA przy braku biofilmu (zamknięte czarne kółko) służyły jako kontrola pozytywna, grupy tylko neutrofili (otwarte czarne kółko) i tylko biofilm (otwarty szary trójkąt) służyły jako kontrole negatywne. Dane reprezentują średnią z dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w trzech egzemplarzach z neutrofilami uzyskanymi od dwóch różnych dawców. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. (B) Obszar pod krzywą z (A) obliczono w celu ilościowego określenia całkowitych ROS generowanych przez neutrofile. Dane są przedstawiane jako średnia ± SD. (***p < 0,0001. Jednokierunkowa ANOVA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wizualizacja interakcji między biofilmem S. aureus a neutrofilami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu. Niebieskie neutrofile znakowane barwnikiem CMAC (cyjan) uzupełniono homodimerem etydyny-1 (magenta; martwy) przed inkubacją z 18-godzinnym biofilmem S. aureus (żółty). Interakcje biofilm-neutrofile zobrazowano za pomocą szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej, a obrazy przetworzono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Eksperymenty przeprowadzono na trzech różnych dawcach. Reprezentatywne obrazy są przedstawione jako (A) widok 3D biofilmu S. aureus z żywymi (cyjan) i martwymi (magenta; kilka oznaczonych białymi strzałkami) neutrofilami, (B) widok 3D biofilmu S. aureus przy braku neutrofili z żywym S. aureus wykazującym ekspresję GFP (żółty) lub martwym S. aureus barwionym etydyną homodimerem-1 (magenta), (C) ortogonalny widok S. aureus i oddziaływanie neutrofili, jak przedstawiono na płaszczyznach xy, yz i xz, oraz (D) kwantyfikacja żywotności neutrofili w obecności biofilmu S. aureus po 30 minutach natychmiast (niemyte) lub po trzech rundach płukania HBSS w celu usunięcia nieprzylegających neutrofili (przemyte). Śmierć komórek neutrofilowych jest przedstawiana jako średnia ± SD (test t-Studenta). Podziałka wskazuje 50 μm w (A) i (B) oraz 10 μm w (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Podjęto liczne wysiłki w celu wyhodowania wytrzymałych i powtarzalnych biofilmów S. aureus do dalszych eksperymentów in vitro 48,49,50. Przedstawiono znormalizowany protokół, który wykorzystuje kationowy charakter PLL, a także uzupełnia pożywkę glukozą w celu wzrostu silnych biofilmów S. aureus in vitro. Dodatek PLL pozwala na lepsze przyłączenie ujemnie naładowanej komórki bakteryjnej do dodatnio naładowanych powierzchni pokrytych PLL. Należy zauważyć, że PLL w stężeniu 10 μg/ml ma działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i S. aureus podczas inkubacji przez 24 godziny⁵¹. To samo stężenie stosuje się do powlekania powierzchni; jednak nadmiar PLL jest zasysany, co sprawia, że stężenie PLL jest niższe niż 10 μg/ml podczas siewu w celu wzrostu biofilmu.

Ważne jest, aby zauważyć, że PLL działał tylko w określonych pożywkach wzrostowych, takich jak MEMα z 2% glukozą, gdzie zaobserwowano, że S. aureus wytwarzał silne biofilmy o minimalnej zmienności (Figura 2A). Stężenie PLL, które miałoby być stosowane w połączeniu z innymi rodzajami mediów, wymagałoby dalszej optymalizacji, takiej jak zastosowanie zwiększonego stężenia PLL do pokrycia studni. Dodatkowo warunki te zostały zoptymalizowane pod kątem monogatunkowego biofilmu S. aureus . Podczas gdy biofilmy ran przewlekłych są często wielomikrobiologiczne, standaryzacja testów w celu zbadania biofilmu jednogatunkowego i jego interakcji z neutrofilami i innymi komórkami odpornościowymi jest kluczem do zrozumienia ich udziału w patogenezie⁵². Te ustandaryzowane protokoły można dalej optymalizować w celu utrzymania i badania biofilmów polimikrobiologicznych i ich interakcji z neutrofilami.

Zaobserwowano również, że bogate pożywki bakteryjne, takie jak TSB, doprowadziły do utraty żywotności neutrofili (ryc. 1). W związku z tym zoptymalizowano warunki wzrostu biofilmów S. aureus w MEMα, stosowanych do hodowli komórek ssaków. W przypadku badań z udziałem neutrofili pożywka ta wspomaga żywotność neutrofili i wspomaga wzrost S. aureus . Chociaż zaobserwowano, że pożywka wpływa na żywotność neutrofili, ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że neutrofile wyizolowane z obwodowej krwi ludzkiej ulegają apoptozie ex vivo z około 70% apoptozą neutrofili do 20 godziny⁵³. Wymaga to odpowiedniego obchodzenia się z neutrofilami, takich jak przechowywanie neutrofili na lodzie podczas przygotowywania się do eksperymentów, stosowanie odczynników wolnych od endotoksyn oraz zapobieganie aktywacji neutrofili poprzez unikanie wirowania próbek z neutrofilami.

Ocena wybuchu oksydacyjnego w neutrofilach jest rutynowo wykonywana w celu określenia zabijającego wpływu neutrofili na patogen 14,54,55. Badania te są często wykonywane na bakteriach planktonowych, do których dodaje się neutrofile, a odpowiedź na wybuch oksydacyjny określa się ilościowo za pomocą chemiluminescencji wzmocnionej luminolem, która wykrywa aniony ponadtlenkowe wytwarzane przez neutrofile. Obecny protokół jest modyfikowany poprzez zastąpienie bakterii planktonowych statycznie rosnącym biofilmem S. aureus 18 h. W związku z tym neutrofile mogą być bezpośrednio dodawane do biofilmu w celu oceny ich aktywacji. Z drugiej strony bakterie w biofilmach wytwarzają enzymy, takie jak katalaza i dysmutaza ponadtlenkowa, w celu detoksykacji ROS^23,56. Biofilmy Staphylococcus epidermidis wytwarzają pod wpływem stresu wyższą katalazę niż jego planktonowy odpowiednik⁵⁷. Całkowita chemiluminescencja neutrofili stymulowanych PMA w biofilmie S. aureus jest znacznie niższa niż w neutrofilach stymulowanych PMA, w których biofilm jest nieobecny (ryc. 2). Może to wynikać z aktywności tych enzymów detoksykujących. Ponadto biofilmy S. aureus wytwarzają kilka toksyn tworzących pory zwanych leukocydynami, które zabijają neutrofile⁵⁸. Zmniejszona reakcja impulsowa jest również prawdopodobnie spowodowana zmniejszoną żywotnością neutrofili w obecności biofilmu S. aureus. Podczas gdy w tym badaniu wykorzystuje się luminol, który wykrywa całkowite ROS wytwarzane zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek, inne odczynniki, takie jak CM-H₂DCFDA (dioctan 5-(i-6)-chlorometylo-2'7'-dichlorodihydrofluoresceiny) lub izoluminol, muszą być brane pod uwagę, jeśli celem pracy jest badanie wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej produkcji ROS 14,53,54 konkretnie.

Możliwość wizualizacji interakcji neutrofile-biofilm za pomocą mikroskopii może dostarczyć informacji o zachowaniu neutrofili i biofilmów w swojej obecności. Widma wzbudzenia i emisji barwników i białek fluorescencyjnych stanowią migawkę interakcji między 18-godzinnym biofilmem S. aureus a neutrofilami po 30-minutowej inkubacji. Aby skutecznie przechwytywać sygnały z barwionych komórek, ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję próbek na źródła światła podczas ustawiania próbek do mikroskopii. Podczas obrazowania uniknięto szybkiego fotowybielania próbek poprzez obniżenie intensywności źródła światła podczas regulacji wszystkich parametrów, takich jak wysokość stosu Z i czas ekspozycji dla różnych kanałów.

Te proste praktyki pozwoliły na prawidłowe obrazowanie mikroskopowe, w którym zaobserwowano, że niewiele neutrofili jest zlokalizowanych w biofilmie (ryc. 4A). Może to być spowodowane przestrzeniami obecnymi w biofilmie, ponieważ biofilm 18 h S. aureus wyhodowany w MEMα z 2% glukozą nie pokrywa równomiernie powierzchni (ryc. 4B). Jednak w innych badaniach wykorzystanie multimediów wykazało jednolity trawnik wzrostu biofilmu S. aureus i leukocytów przenikających przez biofilm^30,58. Ponadto zaobserwowano również, że nastąpiła śmierć komórek neutrofili po 30 minutach inkubacji z biofilmami S. aureus z powodu leukocydyn wytwarzanych przez S. aureus biofilm, które lizują neutrofile⁵⁸ (Figura 4A, D). Dodanie etapu przemywania w celu usunięcia nieprzylegających neutrofili po inkubacji ich z biofilmem przez 30 minut usunęło ~15% martwych neutrofili z systemu w porównaniu z grupą niemytą, w której mikroskopię wykonano natychmiast po 30 minutach inkubacji (Figura 4D). Zaobserwowano również neutrofile oddziałujące z S. aureus (ryc. 4C). Konieczne są dalsze eksperymenty, aby ocenić, czy S. aureus jest pochłonięty przez neutrofile, czy też przyłączony do powierzchni komórek neutrofili⁵⁴. Obrazowanie neutrofili i biofilmów jest pierwszym krokiem do oceny kilku funkcji neutrofili, takich jak fagocytoza i NEToza^54,59. Wpływ neutrofili na biofilmy można również ocenić, określając ilościowo biomasę biofilmu, zmiany strukturalne biofilmu i żywotność biofilmu, między innymi, za pomocą narzędzi do analizy obrazu wymienionych w kroku 5.6. Wreszcie, w neutrofilach występuje zmienność między dawcami; W związku z tym zaleca się, aby do badań z udziałem neutrofili wykorzystano co najmniej trzech różnych dawców.

Ogólnie rzecz biorąc, połączono standaryzowane testy in vitro w celu oceny interakcji między neutrofilami a biofilmami. Chociaż testy te wykorzystują S. aureus, opisane protokoły można łatwo dostosować do badania innych patogenów. Chociaż istnieją różne modele in vivo do badania interakcji gospodarz-patogen, mogą one być kosztowne i pracochłonne, zwłaszcza jeśli warunki nie są zoptymalizowane. Praca ze standaryzowanymi testami in vitro pozwala zoptymalizować warunki eksperymentalne i potwierdzić obserwacje przed przejściem do systemu in vivo. Wreszcie, do badania interakcji biofilm-neutrofile in vivo wykorzystano różne modele infekcji zwierzęcych. Jednak ważne jest, aby wziąć pod uwagę różnice immunologiczne między modelami ludzkimi i zwierzęcymi 60,61,62,63. Wymaga to wykorzystania neutrofili pochodzących od ludzi do badania tych złożonych interakcji gospodarz-patogen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,9% nawadnianie chlorkiem sodu, USP	Baxter	2F7124	Bez endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili
150 mL szybkoprzepływowa jednostka filtrująca	Thermo Scientific	565-0020
200 proof etanol	VWR	89125-188
ml strzykawka	BD	309657	Służy do pobierania krwi
50 ml stożkowe probówki wirówkowe	Thermo Scientific	339652
60 ml strzykawka	BD	309653	Służy do pobierania krwi
Odczynniki Agar	Fisher	BP1423-2
Wacik nasączony alkoholem	BD		Używany do pobierania krwi
Plastry			Używany do pobierania krwi
BD Bacto Tryptyczny bulion sojowy	BD	DF0370-07-5	Połącz z 1,5% agarem, aby zrobić licznik komórek agaru sojowego Tryptic
	Bal Saupply	202C
CellTracker niebieski CMCH	Invitrogen	C2111	Niebieski barwnik CMAC (BCD)
Przezroczyste 96-dołkowe płytki polistyrenowe z płaskim dnem	Costar	3370
Gaza bawełniana	Fisherbrand	13-761-52	Używana do pobierania krwi
Kryształowy fiolet	Acros Organic	40583-0250
Probówki	hodowlane Fisherbrand	14-961-27	Szkło borokrzemianowe 13 x 100 mm
D-(+)- glukoza	Sigma	G-8270
Dekstran z Leuconostoc spp.	Sigma	31392-250G	Służy do izolacji neutrofili
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) 1x	Gibco	14190-144
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	L3224 B
Ficoll-Paque plus	Cytiva	17144003	Służy do izolacji neutrofili (podłoże gradientu gęstości)
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	bez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej
Hemacytometr	Bright Line
Heparyna	Novaplus	NDC 63323-540-57	1000 jednostek USP / ml, Używany do pobierania krwi
IMARIS 9.8	Oxford Instruments Oprogramowanie		do analizy obrazów mikroskopowych
Luminol	Sigma	A8511-5G
Minimalny podstawowe podłoże (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
Igła (23 G1)	BD	305145	Służy do pobierania krwi
Nikon Eclipse Ti2	Nikon
NIS-Elements	Nikon		Kwantyfikacja martwych neutrofili Normalna
ludzka surowica	Technologia dopełniacza	NHS
Szalka Petriego (100 x 15 mm)	VWR	25384-342
12-mirystynian 13-octanu
Roztwór poli-L-lizyny	Sigma	P4707-50ML
Chlorek sodu	Odczynniki	Fisher BP358-10	Używany do izolacji neutrofili
Oprogramowanie SoftMax Pro	Urządzenia molekularne Czytnik		mikropłytek oprogramowanie używane do akwizycji danych
SpectraMax i3x	Urządzenia molekularne Czytnik		mikropłytek
Sterylna woda do nawadniania, USP	Baxter	2F7114	Bez endotoksyn; Służy do izolacji neutrofili
Zestaw do infuzji skrzydełkowej Surflo	Terumo	SC*19BLK	19 G x 3/4", służy do pobierania krwi
Barwienie niebieskim trypanem (0,4%)	Gibco	15250-061
Turnicate			Używany do pobierania krwi
UltraPure woda destylowana	Invitrogen	10977015
Białe nieprzezroczyste płytki 96-dołkowe	Falcon	353296	Hodowla tkankowa poddana działaniu i płaska płyta dolna
μ-Slide VI 0.4	Ibidi	80601	μ-channel slide