Artykuł metodologiczny

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63778

⸱

19 maja 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

W tym artykule

Podsumowanie

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Streszczenie

Błona podstawna (BM) - wyspecjalizowany arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej obecny po stronie podstawy komórek nabłonkowych - jest kluczowa dla ustanowienia i utrzymania morfologii tkanki nabłonkowej oraz morfogenezy narządów. Co więcej, BM jest niezbędny do modelowania tkanek, służy jako platforma sygnalizacyjna i dostarcza sił zewnętrznych do kształtowania tkanek i narządów. Pomimo wielu ważnych ról, jakie BM odgrywa podczas normalnego rozwoju i stanów patologicznych, szlaki biologiczne kontrolujące wewnątrzkomórkowy transport pęcherzyków zawierających BM oraz sposób, w jaki wydzielanie podstawowe prowadzi do spolaryzowanego odkładania się białek BM, są słabo poznane. Nabłonek pęcherzykowy jajnika Drosophila jest doskonałym systemem modelowym do badania podstawowego odkładania się białek błonowych BM, ponieważ wytwarza i wydziela wszystkie główne składniki BM. Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze w połączeniu z przetwarzaniem obrazu w utrwalonych tkankach pozwala na identyfikację i charakterystykę czynników komórkowych specyficznie zaangażowanych w transport wewnątrzkomórkowy i odkładanie białek BM. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół barwienia i obrazowania pęcherzyków zawierających BM i zdeponowanego BM za pomocą endogennie znakowanych białek w nabłonku pęcherzykowym jajnika Drosophila. Protokół ten może być stosowany zarówno do rozwiązywania problemów jakościowych, jak i ilościowych i został opracowany w celu dostosowania do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, co pozwala na szybką i skuteczną identyfikację czynników zaangażowanych w spolaryzowany transport wewnątrzkomórkowy i wydzielanie pęcherzyków podczas rozwoju tkanki nabłonkowej.

Wprowadzenie

Błona podstawna (BM) to cienki arkusz warstwowej przylegającej do komórek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) krytycznej dla struktury i morfogenezy nabłonka1. Składa się z ~50 białek i występuje powszechnie pod komórkami nabłonka i śródbłonka oraz obejmuje komórki mięśnia szkieletowego, gładkiego i mięśnia sercowego oraz adipocyty1,2,3. Trzy główne składniki BM po stronie podstawy komórek nabłonka to kolagen IV, perlekan i lamininy. BM leży u podstaw komórek nabłonkowych i jest odpowiedzialny za wiele funkcji, w tym separację i barierę tkankową, wzrost i wsparcie oraz polaryzację komórek2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Jego rola jako platformy sygnalizacyjnej reguluje morfologię i różnicowanie komórek i tkanek nabłonka podczas rozwoju3,13,14. Co więcej, nieprawidłowa regulacja BM i/lub naruszenie jego integralności są głównymi przyczynami wielu stanów patologicznych, w tym przerzutów nowotworowych2,15,16. Pomimo podstawowych funkcji pełnionych przez BM podczas morfogenezy tkanek i narządów, składniki szlaku biologicznego dedykowanego spolaryzowanemu transportowi wewnątrzkomórkowemu i wydzielaniu białek BM są niejasno znane.

Aby badać wewnątrzkomórkowy transport pęcherzyków zawierających BM i wydzielanie białek BM przez komórki nabłonkowe, nabłonek pęcherzykowy (FE) jajnika Drosophila jest potężnym systemem modelowym (Rysunek 1). Jajnik Drosophila składa się z 16-20 długich, rurkowatych struktur, zwanych jajnikami (Rysunek 1A,B)17,18,19. Każdy jajnik można traktować jako linię montażową jaja, z postępem wieku komór jajowych (z których każda daje początek jaju), która zaczyna się na przednim końcu i przesuwa się do tyłu, aż dojrzałe jajo wyjdzie przez jajowód. Każda komora jajowa jest otoczona FE, monowarstwą komórek pęcherzyków somatycznych (FC), która otacza centralne komórki linii rozrodczej (GC). FE jest silnie spolaryzowany z wyraźną polaryzacją wierzchołkowo-podstawną, w której domena wierzchołkowa jest skierowana w stronę linii zarodkowej, a białka BM są wydzielane zasadniczo18,19. FC aktywnie wydzielają wszystkie główne składniki BM, w tym kolagen IV, perlekan i Lamininy20,21. W komórkach nabłonkowych, takich jak FC, wytwarzane są składniki BM, które wymagają wyspecjalizowanego spolaryzowanego szlaku wydzielania do ich odkładania poza komórką. Na przykład w przypadku najobficiej występującego składnika BM, kolagenu IV (Coll IV), szczegóły dotyczące jego spolaryzowanego transportu i wydzielania wewnątrzkomórkowego są niejasne, mimo że jego produkcja i odkładanie są przedmiotem wielu badań. Coll IV ulega translacji w retikulum endoplazmatycznym (ER), gdzie każde fibryle - złożone z trzech polipeptydów (dwa łańcuchy α1 i jeden łańcuch α2) - jest składane w potrójną helisę22. Prawidłowe fałdowanie i funkcja Coll IV wymagają białek opiekuńczych i enzymów ER, w tym hydroksylaz lizylowych i prolilowych, takich jak Plod i PH4αEFB20,22,23,24,25,26. Te enzymy potranslacyjne regulują sortowanie ER Coll IV, ponieważ utrata każdego z nich powoduje, że Coll IV jest uwięziony w podstawowej klasie ER20,23,24,25,26. Następnie nowo zsyntetyzowany Coll IV opuszcza ER dla Golgiego w pęcherzykach pokrytych COPII. Receptor ładunku Tango1 pomaga w pakowaniu kolagenów w spore pęcherzyki związane z Golgiego, które mogą pomieścić duże białka multimeryczne20,27. Gdy Coll IV zostanie upakowany w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach egzocytarnych, jest specyficznie wydzielany zasadniczo z komórek nabłonkowych. Aby skierować odkładanie się BM na stronę podstawną, komórki nabłonkowe wymagają innego zestawu czynników specjalnie dedykowanych do spolaryzowanego wydzielania BM. Korzystając z FE jajnika Drosophila, scharakteryzowano kilka składników tego nowego procesu komórkowego, w tym czynniki wymiany nukleotydów (GEF) Crag i Stratum, GTPazy Rab8 i Rab10, a także poziomy fosfoinozytolu PI(4,5)P2 oraz białek motorycznych kinezyny 1 i 320,28,29,30,31. Składniki te mają kluczowe znaczenie w zapewnieniu spolaryzowanej dystrybucji białek BM.

Do monitorowania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek BM w FE można użyć endogennie oznaczonych białek błony podstawnej (pułapek białkowych), takich jak Viking-GFP (Vkg-GFP lub α2 Coll IV-GFP) i Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. Wykazano, że te linie pułapek białkowych dokładnie odzwierciedlają endogenną dystrybucję białek BM i pozwalają na bardziej czułe wykrywanie transportu pęcherzykowego28,30. Składniki biorące udział w spolaryzowanym osadzaniu się BM w FE zostały po raz pierwszy scharakteryzowane przy użyciu linii pułapek białkowych dla Vkg-GFP i Pcan-GFP20,28,29,30. Pułapki białkowe mogą być używane w różnych tłach genetycznych, w tym mutantów i linii Gal434. Co więcej, pułapki białkowe mogą być stosowane w połączeniu z barwnikami fluorescencyjnymi i/lub immunobarwieniem fluorescencyjnym, co pozwala na precyzyjne scharakteryzowanie lokalizacji białek BM podczas porównywania warunków typu dzikiego i zmutowanego35.

Aby dokładnie i efektywnie ocenić rozmieszczenie i lokalizację pęcherzyków zawierających białko BM, konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) i techniki obrazowania super-rozdzielczościowego stanowią znaczącą przewagę nad innymi podejściami do obrazowania. Podejścia te łączą obrazowanie w wysokiej rozdzielczości ze względną łatwością użycia. CLSM to technika mikroskopowa, która pozwala na poprawę rozdzielczości optycznej poprzez skanowanie próbki laserem w sposób skanowania rastrowego przy użyciu galwanometrów. Otwór otworkowy jest podstawowym elementem mikroskopu konfokalnego. Blokując nieostre sygnały dochodzące z góry lub poniżej płaszczyzny ogniskowej, przysłona otworkowa zapewnia znacznie lepszą rozdzielczość w osi z36. Umożliwia to również uzyskanie serii obrazów w płaszczyźnie z, zwanej stosem z, odpowiadającej serii przekrojów optycznych. Stosy z tworzą następnie obraz 3D próbki poprzez rekonstrukcję 3D za pomocą oprogramowania do obrazowania. Konwencjonalne mikroskopy epifluorescencyjne (szerokokątne), w przeciwieństwie do mikroskopów konfokalnych, pozwalają na to, aby nieostre światło przyczyniało się do poprawy jakości obrazu, zmniejszając rozdzielczość obrazu i kontrast36,37. To sprawia, że mikroskopia epifluorescencyjna jest mniej atrakcyjnym kandydatem do badania lokalizacji lub kolokalizacji białek.

Chociaż CLSM jest odpowiednim podejściem do różnych zastosowań, w tym obrazowania i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu białek BM, nadal stanowi problem podczas obrazowania próbek poniżej granicy dyfrakcji światła Abbego (200-250 nm). Podczas obrazowania takich próbek mikroskopia konfokalna, zwłaszcza w przypadku korzystania z obiektywu olejowego, może skutkować wysoką rozdzielczością. Jednak techniki superrozdzielczości przewyższają granice mikroskopii konfokalnej. Istnieją różne podejścia do uzyskania mikroskopii superrozdzielczej, z których każde ma określone limity rozdzielczości i każde jest odpowiednie dla różnych analiz. Podejścia te obejmują fotoaktywowaną mikroskopię lokalizacyjną (PALM) lub stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej (STORM), mikroskopię zubożenia emisji wymuszonej (STED), mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM) i mikroskop38,39,40,41,42,43,44,45,46. Chociaż Airyscan ma grubszą rozdzielczość niż PALM/STORM, STED i SIM, nadal może osiągnąć rozdzielczość do ~120 nm (około dwukrotnie większą rozdzielczość niż CLSM). Co więcej, wykazano, że to podejście do mikroskopii superrozdzielczej ma przewagę nad SIM i innymi technikami superrozdzielczości podczas obrazowania grubych próbek i próbek o niskim stosunku sygnału do szumu47,48.

Airyscan to stosunkowo nowa technologia mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości46. W przeciwieństwie do tradycyjnych CLSM, które wykorzystują detektory otworkowe i jednopunktowe do odrzucania nieostrego światła, to podejście o wysokiej rozdzielczości wykorzystuje 32-kanałowy detektor obszaru fotopowielacza z fosforku arsenku galu (GaAsP), który zbiera całe światło w każdej pozycji skanowania45. Każdy z 32 detektorów działa jak mały otwór otworkowy, zmniejszając rozmiar otworka z tradycyjnej jednostki 1,0 Airy (A.U.) do ulepszonego 0,2 A.U., umożliwiając jeszcze wyższą rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu, przy jednoczesnym zachowaniu wydajności 1,25 A.U. diameter45. Co więcej, liniowa dekonwolucja stosowana przez Airyscan powoduje nawet 2-krotny wzrost rozdzielczości45. Biorąc to pod uwagę, CLSM, a w szczególności mikroskopia superrozdzielcza, dobrze nadają się do badania białek BM i białek, które regulują podstawowe odkładanie białek BM, ponieważ mogą generować obrazy o bardzo wysokiej rozdzielczości do badań lokalizacji i kolokalizacji, dostarczając w ten sposób nowych informacji na temat zdarzeń przestrzennych, czasowych i molekularnych, które kontrolują te procesy.

Alternatywnym podejściem do mikroskopii konfokalnej, które może być użyte do przeprowadzenia eksperymentów lokalizacyjnych, jest dekonwolucja obrazu. Ponieważ mikroskopia szerokokątna umożliwia dotarcie nieostrego światła do detektorów, matematyczne i obliczeniowe algorytmy dekonwolucji mogą być stosowane do usuwania lub ponownego przypisywania nieostrego światła z obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopii szerokokątnej, poprawiając w ten sposób rozdzielczość i kontrast obrazu49. Algorytmy dekonwolucji mogą być również stosowane do obrazów konfokalnych, aby jeszcze bardziej zwiększyć rozdzielczość i kontrast, uzyskując końcowe obrazy prawie porównywalne z mikroskopią superrozdzielczą50. Airyscan wykorzystuje dekonwolucję opartą na filtrze Weinera wraz z reprzypisacją pikseli Shepparda, co skutkuje znacznie lepszą rozdzielczością przestrzenną i stosunkiem sygnału do szumu. W porównaniu z mikroskopią konfokalną, przy użyciu tej ><>

Ten manuskrypt dostarcza szczegółowych i zoptymalizowanych protokołów barwienia, pozyskiwania i wizualizacji wewnątrzkomórkowego transportu i depozycji białek BM przy użyciu FE jajnika Drosophila jako systemu modelowego połączonego z mikroskopią konfokalną i superrozdzielczą. Linie Drosophila wyrażające endogennie znakowane białka błony podstawnej, np. Vkg-GFP i Pcan-GFP, są wydajnymi i dokładnymi narzędziami do wizualizacji transportu i wydzielania białek BM. Ponadto mogą być łatwo używane w różnych tłach genetycznych, w tym w liniach mutantów i Gal4/UAS34. Chociaż endogennie znakowane białka błony podstawnej są zalecane, stosowanie przeciwciał przeciwko specyficznym białkom BM jest również zgodne z opisanymi protokołami. Protokoły te są szczególnie przydatne dla naukowców, którzy są zainteresowani badaniem transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek BM w nienaruszonej tkance nabłonkowej za pomocą obrazowania konfokalnego i superrozdzielczego. Co więcej, możliwość połączenia analizy tkanki nabłonkowej z ekspansywnymi narzędziami genetyki Drosophila sprawia, że podejście to jest szczególnie skuteczne. Wreszcie, protokoły te można łatwo zaadaptować do badania transportu pęcherzykowego i sortowania innych interesujących białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie muchy do wycięcia jajników

  1. Umieścić 10-15 samic much Drosophila melanogaster (w wieku 1-2 dni) o pożądanym genotypie w wąskiej fiolce zawierającej ~8 ml pożywki muchowej Drosophila posypanej niewielką ilością granulowanych drożdży piekarskich na 2-3 dni przed preparacją w temperaturze 25 °C. Dodanie kilku samców do fiolki może zwiększyć wydajność komory jajowej. Należy jednak upewnić się, że łączna liczba much nie przekracza 20, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na rozwój jajników.
    UWAGA: Opis samców i samic Drosophila oraz przydatne wskazówki i porady dla naukowców bez wcześniejszego doświadczenia z Drosophila można znaleźć w cytowanych artykułach34,52. Dodanie drożdży pobudzi produkcję jaj i wygeneruje jajniki o różnych etapach. Co więcej, utuczony zostanie również jajnik i ułatwi ich wycinanie. Zamiast drożdży granulowanych można również użyć drożdży mokrych, jednak w przypadku słabszych stad muchy mogą utknąć i umrzeć.

2. Rozwarstwienie i unieruchomienie jajnika

UWAGA: Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat rozwarstwiania i barwienia jajników, czytelnicy są kierowani do cytowanych protokołów53,54,55.

  1. W dniu rozbioru należy przygotować świeży roztwór utrwalający o końcowym stężeniu 4% paraformaldehydu (PFA), rozcieńczając roztwór podstawowy PFA w 1x roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
  2. Znieczulij muchy za pomocą CO2 i umieść je na podkładce muchowej. Utrzymuj muchy w znieczuleniu do czasu rozbioru. Rozważ, że muchy są odpowiednio znieczulone po ustaniu ich ruchów, co zwykle zajmuje 10-20 s.
    UWAGA: Chociaż stosowanie CO2 jest zalecane jako bezpieczniejsza i szybsza opcja, muchy można znieczulić za pomocą lodu.
  3. Umieść szklane wklęsłe szkiełko lub naczynie barwiące z płytkimi studzienkami wgłębieniowymi pod mikroskopem preparacyjnym i napełnij studzienki 1x PBS.
  4. Chwyć samicę muchy w dolnej części klatki piersiowej za pomocą kleszczy. Upewnij się, że płeć much jest nieobecna w męskich narządach płciowych na tylnym końcu brzucha i brak grzebieni płciowych na ich przednich kończynach jako cecha drugorzędna52. Przeprowadzaj sekcje much pojedynczo za pomocą innej pary kleszczy (krok 2.5), zanurzając je w studzienkach wypełnionych 1x PBS pod mikroskopem preparacyjnym (zalecane jest powiększenie 20x).
  5. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, użyj innej pary kleszczy, aby pociągnąć tylną część brzucha muchy, uwidaczniając narządy wewnętrzne (np. jajniki, jelita).
  6. Delikatnie ściśnij przednią część brzucha muchy (jak w przypadku tubki pasty do zębów), aby wypchnąć jajniki z brzucha. Ta metoda powinna utrzymać jajniki w stanie nienaruszonym. Odłącz i ostrożnie usuń inne narządy i odłamki much.
  7. Za pomocą kleszczy lub igieł preparacyjnych oddziel jajniki jajnika, zachowując nienaruszoną całą strukturę jajnika. Celem tego etapu jest przerwanie osłonki mięśniowej pokrywającej jajniki i umożliwienie bardziej wydajnego i jednorodnego barwienia.
  8. Szybko przenieś jajniki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1x PBS i trzymaj probówkę na lodzie, aż wszystkie muchy zostaną wycięte. Nie trzymaj probówki na lodzie, jeśli mają być uwidocznione mikrotubule lub mikrofilamenty (lub pęcherzyki transportowane przez te składniki cytoszkieletu), ponieważ może to spowodować depolimeryzację.
  9. Po wypreparowaniu wszystkich jajników i przeniesieniu ich do probówki do mikrowirówki, pozwól im opaść na dno probówki i usuń wszystko oprócz ~ 50 μl PBS. Dodaj 1 ml 4% PFA i umieść na kołysce platformy nutującej na 15 minut. Co ważne, sprawdź, czy jajniki poruszają się do przodu i do tyłu w roztworze do stabilizacji, aby umożliwić prawidłowe utrwalenie, ponieważ niepełne utrwalenie może prowadzić do problemów z barwieniem i obrazowaniem.
    UWAGA: Szybkość nutatora nie jest kluczowa. Podczas gdy niektóre nutatory mają regulację prędkości, inne mają zaprogramowaną prędkość. Ustawiona prędkość jest wystarczająca, a jeśli jest regulowana, ustaw ją na 40-50 obr./min.
  10. Usuń roztwór utrwalający (jak w kroku 2.9), a następnie wykonaj dwa szybkie płukania 1 ml 1x PBS zawierającego 0,1% Triton-X 100 (1x PBST), delikatnie odwracając probówki do mikrofuge 5-6 razy. Następnie wykonaj cztery 10-15 minutowe pranie (długie pranie) z 1 ml 1x PBST (łącznie 40-60 minut).
    UWAGA: Zaleca się stosowanie 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 do prania, ponieważ zwiększenie procentowej zawartości detergentu może spowodować denaturację GFP, prowadząc do zmniejszenia fluorescencji i wykrywania białek BM znakowanych GFP.
  11. W przypadku barwienia barwnikiem, np. barwienia DNA i F-aktyny, przejdź do kroku 3. W przypadku barwienia immunologicznego przejdź do kroku 4. Jajniki można przechowywać w 1x PBST w temperaturze 4 °C do 24 godzin przed kontynuacją.

3. Standardowe barwienie DNA/F-aktyny

  1. Po utrwaleniu i umyciu usuń PBST. Dodać 500 μl roztworu barwiącego DNA i F-aktynę. Aby przygotować roztwór DNA/F-aktyny, zmieszaj Hoechst (barwienie DNA; rozcieńczenie 1:1000 1 mg/ml roztworu podstawowego) i znakowaną fluoroforem falloidynę (barwienie F-aktyną; rozcieńczenie 1:500 dla Alexa Fluor 546 lub rozcieńczenie 1:100 dla Alexa Fluor 647, każdy z 66 μM roztworu podstawowego) w 500 μL PBST.
  2. Przykryj probówki folią aluminiową, aby utrzymać jajniki i barwniki w ciemności, aby utrzymać fluorescencję w celu wydajnego obrazowania i inkubować na kołysce platformy nutacyjnej przez 15 minut.
  3. Po inkubacji usunąć roztwór DNA/F-aktyny (jak w kroku 2.9). Wykonaj dwa szybkie prania i trzy długie (10-15 min) prania w 1x PBST zgodnie z opisem w kroku 2.10. Przejdź do montażu zgodnie z opisem w kroku 5.

4. Barwienie immunologiczne fluorescencji

UWAGA: Jest to standardowy protokół barwienia immunologicznego dla obrazowania fluorescencyjnego i jest kompatybilny z większością pierwotnych przeciwciał.

  1. Blokowanie i pierwszorzędowe barwienie immunologiczne przeciwciał (dzień 1)
    1. Po utrwaleniu i umyciu usuń PBST zgodnie z opisem w kroku 2.9. Dodać 1 ml roztworu blokującego (PBS + 5% BSA) i zablokować jajniki na kołysce platformy nutacyjnej na minimum 1 godzinę.
      UWAGA: Oprócz BSA do roztworu blokującego można dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS) lub normalną surowicę kozią (NGS). Alternatywnie, jajniki mogą zostać zablokowane na noc na kołysce platformy nutacyjnej w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć roztwór blokujący, jak w kroku 2.9, i dodać 300 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w ich odpowiednich stężeniach (specyficznych dla zastosowanego przeciwciała) do roztworu blokującego. Inkubować przez noc na kołysce platformy nutacyjnej w temperaturze 4 °C. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała pierwotnego i przystąp do barwienia immunologicznego przeciwciał wtórnych.
      UWAGA: Niektóre przeciwciała pierwszorzędowe można zachować i ponownie wykorzystać. W niektórych przypadkach ponownie użyte przeciwciała pierwszorzędowe mogą zmniejszyć barwienie tła, co skutkuje lepszym obrazowaniem. Jednak ponowne użycie powinno być testowane dla każdego przeciwciała, aby zapewnić skuteczność.
  2. Wtórne barwienie immunologiczne przeciwciał (dzień 2)
    1. Po wyjęciu pierwszorzędowego roztworu przeciwciała wykonaj dwa szybkie płukania i cztery długie (10-15 min) płukania, jak w kroku 2.10. Starannie wykonane, powtarzalne mycie przy użyciu świeżego 1x PBST zmniejszy niespecyficzne tło i doprowadzi do optymalnego obrazowania.
    2. Usunąć PBST jak w kroku 2.9 i dodać 500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych zawierających fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe, które wykryją użyte przeciwciała pierwszorzędowe. Chroń rurkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową od tego momentu, aby uzyskać optymalną ochronę fluorescencji, co ma kluczowe znaczenie dla akwizycji i analizy obrazu.
      UWAGA: Roztwór przeciwciała drugorzędowego powinien zawierać przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforami, które nie pokrywają się z endogennie znakowanymi białkami. Na przykład, w przypadku stosowania białek znakowanych GFP, zaleca się stosowanie przeciwciał drugorzędowych Alexa Fluor na długościach fal czerwonych lub dalekiej czerwieni (np. 546, 568 lub 647 nm). Do roztworu wtórnego można dodać barwniki fluorescencyjne, takie jak sprzężona falloidyna Hoechst i Alexa Fluor 546 lub 647. Te plamy mogą być pomocne w oznaczeniu ogólnej struktury komórki (tj. jąder i F-aktyny). Patrz krok 3.1, aby zapoznać się ze stężeniami.
    3. Inkubować jajniki w roztworze przeciwciała wtórnego na kołysce platformy nutacyjnej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Wykonaj dwa szybkie mycia i cztery długie (10-15 min) prania w 1x PBST, jak w kroku 2.10. Przejdź do montażu jak w kroku 5.

5. Montaż poplamionych jajników

UWAGA: Ta metoda działa bardzo dobrze, jeśli jajniki są dobrze rozwinięte i obfite. Staranne zamontowanie jajników na szkiełku ma kluczowe znaczenie dla optymalnego obrazowania.

  1. Po ostatnim myciu użyj pipety p1000, aby delikatnie pipetować jajniki w górę iw dół w probówce, aby oddzielić komory na jaja. Pozwól, aby komory na jajka opadły na dno, trzymając rurkę w pozycji pionowej przez 5-10 minut. Staranne oddzielenie poszczególnych komór jajowych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnego uzyskania obrazu.
  2. Usunąć PBST za pomocą pipety Pasteura, pozostawiając ~50 μL. Usunąć jak najwięcej pozostałego PBST za pomocą pipety p200. Dodaj dwie krople podłoża montażowego, wystarczające do równomiernego rozprowadzenia na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 22 mm. Jajniki mogą być przechowywane w podłożu montażowym w probówkach do mikrowirówek w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca przed montażem.
    UWAGA: Na rynku dostępnych jest kilka różnych nośników montażowych; W celu uzyskania optymalnych warunków obrazowania zaleca się stosowanie twardych mocowań, takich jak Aqua-Poly/Mount lub ProLong Glass Antifade Mountant. Odradza się stosowanie glicerolu jako podłoża montażowego, ponieważ może to prowadzić do złych warunków obrazowania (np. niestabilności fluoroforu). W przypadku nośników montażowych, które nie polimeryzują, należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe za pomocą uszczelniacza do szkiełek nakrywkowych/lakieru do paznokci, aby zabezpieczyć je na miejscu.
  3. Oznacz szklane szkiełko i przetrzyj je miękkim, bezpyłowym papierem, aby usunąć kurz i odciski palców. Odetnij koniec końcówki pipety p200, aby umożliwić łatwe przenoszenie lepkiego medium mocującego do szkiełka z probówki mikrowirówkowej. Następnie powoli przenieś wszystkie komory na jajka w podłożu montażowym do szkiełka podstawowego, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie rozprowadź podłoże montażowe i oddziel komory na jajka za pomocą nowej końcówki p200 lub kleszczyków, aby pokryć obszar o przybliżeniu wielkości szkiełka nakrywkowego.
  5. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe (oczyszczone papierem bezpyłowym) na komorach na jajka pod kątem, aby uniknąć pęcherzyków.
  6. Przechowuj szkiełko w temperaturze pokojowej na płaskiej powierzchni w ciemności przez 2 dni w celu polimeryzacji. Po utwardzeniu nośnika montażowego szkiełko można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez kilka tygodni w celu obrazowania.
    UWAGA: Ważne jest, aby twarde podłoże montażowe uległo polimeryzacji przed obrazowaniem. Jeśli podłoże nie uległo jeszcze polimeryzacji, jajniki będą unosić się pod szkiełkiem nakrywkowym, wpływając na akwizycję obrazu. Co więcej, optymalny współczynnik odbicia mediów montażowych uzyskuje się dopiero po jego całkowitym związaniu (szczegóły w informacjach producenta).
  7. Alternatywna metoda montażu: Ta metoda jest zalecana w celu zmniejszenia utraty tkanek, jeśli jajniki nie są obfite. W tej metodzie (opisanej poniżej) należy oddzielić jajniki i komory jajowe na szkiełku podczas montażu, zamiast rozdzielać je w probówce mikrowirówkowej przez pipetowanie, jak opisano w kroku 5.1.
    1. Po ostatnim praniu usuń wszystkie oprócz ~100 μl roztworu myjącego. Za pomocą pipety Pasteura lub pipety p1000 przenieś nienaruszone jajniki z PBS na szkiełko. Za pomocą pipety p200 ostrożnie usuń jak najwięcej PBST z szkiełka. W razie potrzeby użyj papieru bezpyłowego, aby wytrzeć PBST. Nie dotykaj jajników.
    2. Dodaj dwie krople nośnika montażowego. Ostrożnie oddziel jajniki i komory na jaja za pomocą kleszczy lub igieł preparacyjnych. Usuń i wyrzuć obcą tkankę, a następnie rozłóż komory jajowe i jajniki w podłożu montażowym. Przejdź do kroków 5.5-5.6.

6. Akwizycja obrazu konfokalnego

UWAGA: Ta sekcja zawiera kluczowe parametry pozwalające osiągnąć optymalną akwizycję obrazu przy użyciu dowolnego mikroskopu konfokalnego (Rysunek 2).

  1. Ustaw mikroskop i zlokalizuj próbkę zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przed obrazowaniem ważne jest, aby zlokalizować obszar zainteresowania (ROI) za pomocą okularu mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj obiektywu o małym powiększeniu (20x) lub obiektywu, który ma być używany do robienia zdjęć (np. 40x lub 63x). Wybierz komorę jajową do obrazu.
      UWAGA: Do pozyskiwania obrazu zaleca się używanie obiektywów o dużym powiększeniu, takich jak 40x lub 63x (patrz 6.2.1).
    2. Po wybraniu ROI przejdź do akwizycji obrazu; przejdź do kroku 6.2 dla obrazowania konfokalnego i kroku 7 dla obrazowania w super rozdzielczości.
  2. Wybierz kluczowe parametry optymalnej akwizycji obrazu, jak opisano poniżej (przykłady kluczowych parametrów dla reprezentatywnych obrazów podano w Tabeli 1).
    1. Wybór obiektywu: Do konfokalnej akwizycji obrazu transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek BM w FE należy użyć obiektywu 40x lub 63x.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepszą możliwą rozdzielczość, zdecydowanie zaleca się stosowanie obiektywów planapochromatycznych o dużej aperturze numerycznej (NA), które zapewniają najwyższą korekcję achromatyczną.
    2. Wybór laserów dla każdego kanału/ścieżki: Dla GFP użyj lasera 488 nm; dla DAPI lub Hoechst użyj lasera 405 nm; dla Alexa Fluor 546 lub 568 użyj lasera 561 nm; a dla Alexa Fluor 647 użyj lasera 640 nm.
      UWAGA: Każdy wybór lasera spowoduje utworzenie innego kanału/ścieżki. W tym przypadku termin kanał odnosi się do obrazu utworzonego przez zarejestrowany rozkład intensywności dla wzbudzonych fluoroforów dla wybranego ROI na określonej długości fali każdego kanału.
    3. Ustawienie otworka: Aby zredukować nieostre światło podczas akwizycji obrazu, ustaw otwór dla każdego kanału na 1 AU.
    4. Ustawienia intensywności lasera i wzmocnienia detektora: Aby precyzyjnie dostroić czułość obrazu, należy użyć zarówno głównego wzmocnienia detektora, jak i mocy lasera. Aby prawidłowo ustawić czułość obrazu, zalecany jest wskaźnik zasięgu. Ustaw zarówno wzmocnienie główne, jak i moc lasera tak, aby miały odpowiednią czułość, w której struktury będące przedmiotem zainteresowania (np. pęcherzyki zawierające BM) są wyraźnie widoczne, unikając nasycenia detektora.
      UWAGA: Aby uniknąć fotowybielania, użyj minimalnej niezbędnej mocy lasera. Zaleca się, aby najpierw zwiększyć zysk detektora przy użyciu najmniejszej możliwej mocy lasera. Jeśli zwiększenie wzmocnienia detektora nie może osiągnąć pożądanej intensywności, należy zwiększyć moc lasera. Zalecana jest intensywność mocy lasera w zakresie 0,5%-1,2%.
    5. Rozmiar klatki: zaleca się użycie optymalnego rozmiaru obrazu określonego przez oprogramowanie do akwizycji. W przypadku większości zastosowań należy użyć maksymalnej rozdzielczości 1024 x 1024. Wyższa rozdzielczość znacznie wydłuży czas akwizycji.
    6. Szybkość skanowania: Użyj szybkości skanowania w zakresie od 6 do 9, która jest bezpieczna dla większości próbek. Jeśli próbka jest zaszumiona, użyj mniejszej prędkości skanowania, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Jednak niskie prędkości skanowania wydłużają czas fotowybielania i akwizycji.
    7. Uśrednianie średniej intensywności: Aby poprawić jakość obrazu, użyj uśredniania średniej intensywności poprzez kolejne skany z identycznymi ustawieniami. W większości przypadków należy użyć uśrednienia dwóch, aby poprawić stosunek sygnału do szumu bez fotowybielania próbki.
    8. Powiększenie: Dostosuj obszar skanowania za pomocą funkcji powiększania. Użyj zoomu od 2xdo 4x z obiektywami 40x i 63x jako najskuteczniejszej wartości, aby wyraźnie uwidocznić pęcherzyki zawierające BM w FE. Ostrożnie wybierz minimalny zwrot z inwestycji, aby skrócić czas akwizycji.
  3. Aby uzyskać stos z za pomocą oprogramowania Zeiss Zen, użyj następujących parametrów przekroju Z i ustaw je zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Pęcherzyki i inne struktury wewnątrzkomórkowe zawierające białka BM są strukturami trójwymiarowymi (3D). Uzyskanie z-stacka za pośrednictwem FE znacznie poprawi jakość i rozdzielczość obrazu. Zwykle zakres obejmujący grubość/głębokość tkanki jest wystarczający, aby skutecznie uwidocznić lokalizację wewnątrzkomórkową. W celu optymalnej rekonstrukcji 3D zaleca się stosowanie optymalnego interwału określonego przez oprogramowanie. W przypadku obiektywów 40x i 63x należy unikać odstępów większych niż 0,5 μm między każdym przekrojem z, aby umożliwić optymalną rekonstrukcję 3D.
    1. Kliknij pole wyboru z-Stack w obszarze głównym na karcie Akwizycja. Wybierz tryb skanowania Wszystkie ścieżki na plasterek dla stosu z. Spowoduje to zmianę ścieżek kanałów dla każdego wycinka pozycji z.
    2. Wybierz żądany kanał, aby obserwować próbkę i kliknij na Na żywo, aby rozpocząć skanowanie na żywo. Zaleca się użycie kanału potrzebnego do wykrycia białka BM znakowanego GFP.
    3. Ustaw zakres dla stosu z zgodnie z opisem. Za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji na mikroskopie znajdź położenie Z na jednym końcu preparatu i kliknij przycisk Ustaw najpierw. Podobnie znajdź lokalizację z dla drugiego końca próbki i kliknij Ustaw ostatnią.
    4. Dla każdej lokalizacji w stosie z kliknij każdy kanał osobno z wybranym wskaźnikiem zasięgu i dostosuj intensywność lasera i wzmocnienie główne zgodnie z potrzebami, zgodnie z opisem w kroku 6.2.4.
    5. Ustaw interwał dla stosu z, aby przypisać rozmiar kroku zgodnie z zaleceniami w UWAGA poniżej kroku 6.3. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć akwizycję z-stack.

7. Akwizycja obrazów w super rozdzielczości

  1. Wybierz obiektyw kompatybilny z Airyscan. Aby zobrazować wewnątrzkomórkową lokalizację białka BM, optymalne jest użycie 63-krotnego obiektywu olejowego (Rysunek 3). Ustaw obiektyw na 63x i delikatnie nałóż kroplę olejku immersyjnego na jego soczewkę. Umieść szkiełko na obiektywie tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę obiektywu, aby zlokalizować próbkę.
  2. Wybierz konfigurację z odpowiednimi ustawieniami dla obrazu fluoroforu, jak opisano poniżej.
    1. Kliknij przycisk Smart Setup (Inteligentna instalacja) na karcie Acquisition (Pozyskiwanie), aby skonfigurować nowy eksperyment. Wybierz Airyscan (super rozdzielczość); po wybraniu tej opcji wymagany będzie dalszy wybór między rozdzielczością (Airyscan SR), SNR/czułością (Airyscan Confokal) i szybkością (Multiplex SR-2Y). W przypadku tkanki stałej wybierz opcję Rozdzielczość, ponieważ spowoduje to najlepsze pobranie.
    2. Kliknij + w polu Konfiguruj eksperyment, aby dodać ścieżki/kanały. Wybierz ścieżki dla określonych barwników z bazy danych barwników. W przypadku eksperymentu wielokanałowego dodaj każdą ścieżkę zgodnie z potrzebami, wybierając odpowiednie barwniki.
    3. Po dodaniu wszystkich ścieżek wybierz jedną z propozycji eksperymentów dostarczonych przez oprogramowanie. W tym eksperymencie użyj najlepszego sygnału, ponieważ chociaż prędkość będzie nieco mniejsza w porównaniu z propozycją najmądrzejszej (liniowej), stworzy najlepsze ustawienia sprzętowe dla każdego barwnika, co zaowocuje maksymalnym wzmocnieniem sygnału i minimalnym przesłuchem emisyjnym. Po ustawieniu i załadowaniu eksperymentu pojawi się on w oknie Imaging Setup (Ustawienia obrazowania) na karcie Acquisition (Akwizycja).
    4. Po wybraniu inteligentnej konfiguracji, zakres długości fal dla detektora GaAsP-PMT zostanie automatycznie wybrany. Dostosuj zakres, przesuwając pasek przewijania na dole, aby zwiększyć lub zmniejszyć zakres lub całkowicie przenieść zakres do innego regionu zgodnie z wymaganiami. Użyj tego, aby upewnić się, że zakresy dwóch różnych kanałów nie nakładają się na siebie, aby uniknąć przesłuchów. Zapisz konfigurację do ponownego użycia w przyszłości.
  3. Po ustawieniu konfiguracji przystąp do regulacji powiększenia i obszaru skanowania, jak w kroku 6.2.8. Zoptymalizuj obszar skanowania, aby skupić się na obszarze zainteresowania, aby skrócić czas skanowania i zmniejszyć ilość miejsca w pamięci. Przejdź do pobierania obrazów.
  4. Dla każdego kanału wybierz utwór w obszarze Kanał i kliknij Na żywo. Dostosuj wzmocnienie główne i moc lasera za pomocą wskaźnika zasięgu, jak opisano w kroku 6.2.4 i postępuj zgodnie ze wszystkimi opisanymi wskazówkami, aby uniknąć nasycenia pikseli. Upewnij się, że sześciokątny widok detektora jest wyśrodkowany i wyrównany, klikając przycisk Airyscan Detector View. W większości przypadków sześciokątny widok detektora jest automatycznie wyśrodkowany i wyrównany. Powtórz tę czynność dla dodatkowych kanałów.
  5. W oknie przełączania Tryb akwizycji, w obszarze Rozmiar obrazu, kliknij SR (liczba pikseli ograniczona rozdzielczością), aby zmaksymalizować możliwości detektora. Spowoduje to automatyczne dostosowanie rozmiaru ramki.
  6. Zachowaj uśrednianie na Brak, ponieważ zwykle nie jest to konieczne, a to skróci czas skanowania. W niektórych przypadkach uśrednienie 2x może poprawić stosunek sygnału do szumu.
  7. Zbieraj nieprzetworzone dane z 8-bitową głębokością danych. Kliknij Snap, aby uzyskać obraz. Aby uzyskać stos z, wykonaj krok 6.3.
  8. Wykonaj przetwarzanie obrazu w sposób opisany poniżej. W ten sposób utworzony zostanie obraz 16-bitowy.
    1. Po uzyskaniu obrazu lub stosu z kliknij Metoda > przetwarzania i wybierz Przetwarzanie Airyscan.
    2. Na początek wykonaj filtr automatyczny i przeprowadź dalsze przetwarzanie ręczne, zmieniając wartość SR, aby uzyskać najlepsze wyniki dla próbki. Po ustaleniu optymalnej wartości SR kliknij Zastosuj, aby wygenerować przetworzony obraz. W przypadku obrazów z-stack, przetwarzaj jako jeden z-slice (Bieżący obraz [2D]) lub jako cały z-stack, klikając pole Przetwarzanie 3D.

8. Przetwarzanie obrazu i analiza danych (projekcja ortogonalna, rekonstrukcja 3D i profil intensywności)

UWAGA: Dla tej metody, kroki używane do generowania rzutów ortogonalnych, rekonstrukcji 3D i profili intensywności są opisane w oprogramowaniu Zen (patrz Tabela Materiałów). Podobne analizy danych można również przeprowadzić za pomocą oprogramowania ImageJ56.

  1. Wykonaj rzut ortogonalny zgodnie z opisem poniżej (Rysunek 4).
    1. Po uzyskaniu stosu z za pomocą mikroskopii konfokalnej lub superrozdzielczej, wygeneruj projekcję ortogonalną, aby wyświetlić pęcherzyki w osi z komórki w widoku 2D (w porównaniu z rekonstrukcją 3D). Aby to zrobić, kliknij Metoda przetwarzania > i wybierz Projekcja ortogonalna.
    2. W obszarze Parametry wybierz wymaganą płaszczyznę rzutowania. Aby uzyskać rzut osi z (z-stack), wybierz płaszczyznę czołową (XY). W obszarze Metoda wybierz opcję Maksimum, aby uzyskać projekcję najwyższej jakości.
    3. Następnie określ grubość rzutu, wybierając pozycję początkową (początkowy plasterek z) i określ grubość (całkowitą liczbę plasterków z) w rzucie. Idealnie jest wybrać grubość równą grubości jednej komórki w osi z.
    4. Po ustawieniu parametrów kliknij Zastosuj, aby utworzyć rzut stosu z w płaszczyźnie XY.
      UWAGA: Podczas tworzenia ortogonalnych rzutów wielu stosów z w celu porównania ilości określonego obiektu zainteresowania, konieczne jest utrzymanie grubości rzutu na tym samym (lub jak najbliższym) w celu zapewnienia dokładności danych.
  2. Wykonaj rekonstrukcję 3D zgodnie z poniższym opisem (Rysunek 5).
    1. Twórz rekonstrukcje 3D stosów z, aby obserwować lokalizację i kształt konstrukcji. Zrób to dla stosów z uzyskanych przy użyciu podejść konfokalnych i superrozdzielczościowych. Najpierw przetwarzaj stosy z o superrozdzielczości, korzystając z przetwarzania 3D, tak jak w kroku 7.8 w celu rekonstrukcji 3D.
    2. Aby wygenerować obraz 3D, kliknij ikonę 3D w oknie podglądu. Po kliknięciu w sekcji sterowania wyświetlaczem w dolnej połowie ekranu pojawi się zakładka 3D. Widoki 3D, takie jak Przezroczystość, Objętość, Maksimum, Powierzchnia i Mieszane, będą widoczne. Użyj widoku Powierzchnia lub Mieszany podczas przeglądania struktury pęcherzyków (preferowane).
    3. Aby uzyskać obraz o najwyższej jakości, wybierz ustawienie Precyzyjne, ponieważ najszybsze ustawienie będzie mniej dokładne i doprowadzi do słabego renderowania 3D.
    4. Po wygenerowaniu obrazu manipuluj nim, obracając i powiększając, aby ustawić ostrość na preferowanej lokalizacji, aby wyświetlić interesujące Cię obiekty. Manipuluj obrazem 3D na karcie Wygląd.
    5. Po uzyskaniu zadowalającego widoku, na karcie 3D wybierz Wyświetlana rozdzielczość, a następnie kliknij Utwórz obraz. Spowoduje to utworzenie migawki obrazu w tej samej orientacji, w jakiej był wyświetlany, i można go zapisać i wyeksportować w różnych formatach plików.
  3. Wygeneruj profil intensywności zgodnie z poniższym opisem (Rysunek 7).
    UWAGA: Profile rozkładu i intensywności pikseli związanych z różnymi sygnałami fluorescencyjnymi można wyświetlić jako obraz nakładany w celu określenia ich kolokalizacji.
    1. Po uzyskaniu optymalnego obrazu za pomocą obrazowania konfokalnego lub superrozdzielczościowego, w panelu Widok w oknie Podgląd kliknij Profil. W oknie podglądu pojawi się histogram przedstawiający profil intensywności w funkcji odległości, a także tabelę przedstawiającą odległości i wartości intensywności.
    2. W obszarze elementów sterujących wyświetlaniem u dołu ekranu kliknij narzędzie Strzałka na karcie Definicja profilu. Narysuj strzałkę wzdłuż długości obiektu, dla którego należy ocenić profil intensywności różnych pikseli. Aby narysować strzałkę, powiększ obraz.
    3. Profil intensywności pojawi się po lewej stronie podglądu obrazu, gdzie zostanie wyświetlona odległość i odpowiadające jej szczyty wzdłuż ścieżki strzałki. Aby usunąć histogram wyświetlany na samym obrazie, odznacz pole Pokaż profil w grafice.
    4. Na karcie Wymiary w obszarze sterowania wyświetlaniem usuń zaznaczenie wszystkich kanałów, które nie mają być uwzględnione w profilu intensywności.
    5. Na karcie Grafika kliknij dwukrotnie Profil pokazany w polu Adnotacje/Pomiary, aby otworzyć wyskakujące okienko Formatuj elementy graficzne. Użyj tego, aby zmienić kolor strzałki, a także jej styl i grubość obrysu. Zamknij okno po wybraniu żądanych ustawień.
    6. Kliknij zakładkę Widok profilu. W sekcji nowego obrazu kliknij Bieżący widok, a następnie Zapisz jako, aby zapisać plik. Zaleca się zapisanie pliku jako pliku .tif, aby uniknąć kompresji i utraty danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane tutaj metody mogą być wykorzystane do wydajnego i dokładnego obrazowania oraz charakteryzacji wewnątrzkomórkowego transportu i sekrecji białek błony podstawnej (BM) w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych, takich jak nabłonek folikularny (FE) jajnika Drosophila. Następnie przedstawiamy przewidywane wyniki uzyskane przy użyciu opisanych metod, a także przydatne wskazówki i potencjalne pułapki. W tym celu zastosowano Vkg-GFP, endogennie oznakowane białko Vkg (Drosophila Col IV). Te same wyniki mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

BM ma kluczowe znaczenie dla morfogenezy embrionalnej i narządowej oraz funkcji fizjologicznych dorosłych. Ponadto BM działa jako platforma sygnalizacyjna do ustanawiania i utrzymywania polaryzacji nabłonka oraz zapewnia wsparcie tkankom2. Jednak mechanizmy, które regulują prawidłowe rozmieszczenie białek BM, są słabo poznane. Lepsze zrozumienie szlaków biologicznych dedykowanych do transportu wewnątrzkomórkowego i spolaryzowanego wydzielania białek BM wymaga dokładnej analizy składników tych szla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Julie Merkle za jej pomocne komentarze na temat rękopisu. Praca ta była wspierana przez grant NIH R15GM137236 dla O.D. Obrazy konfokalne i superrozdzielcze uzyskano za pomocą aparatu Zeiss LSM 900 z Airyscan 2, zakupionego w ramach grantu NSF MRI 2018748.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 546 falloidynaInvitrogenA22283Barwnik F-aktynowy (1/500 z 66&mikro; M)
Alexa Fluor 647 falloidynaInvitrogenA22287Barwnik F-aktynowy (1/100 z 66 i mikro; M) ) Przeciwciało
anty-GM130abcamab30637Dla barwienia Golgiego (kolokalizacja); stosować jako stężenie 7&mikro; g / uL
Aqua-PolymountPolysciences, Inc.1860620Podłoże
montażowe Drożdże piekarskie (aktywne suche drożdże)Genesee Scientific62-103Aby utuczyć nadmiary do sekcji
Albumina surowicy bydlęcej (30% roztwór)Sigma-AldrichA7284Do roztworu blokującego
Studnie depresyjneMikroskopia elektronowa Nauki7156101Do rozwarstwienia (zamiast tego można użyć szkiełka wklęsłego)
Igła preparcyjnaFisher scientifc13-820-024
Inkubator DrosophilaGenesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)Bloomington Drosophila Stock Center33594RNAi przeciwko Crag
Stado muchowe: linia Viking-GFP Drosophila (CC00791)Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4Devergne et al., 2017. Steruj ekspresją Crag RNAi w
kleszczach FE (Dumont 5)Fine Science Tools11251-30Do rozwarstwiania
Szklany szkiełko wklęsłe Mikroskopiaelektronowa Nauki7187804Do sekcji (zamiast tego można użyć studzienek depresyjnych)
Kozia anty-królik IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11036Przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało GM130) (5 &mikro; g/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)Barwnik DNA InvitrogenH3570(1 ug/mL)
ChusteczkiKimtechFisher Scientific: 06-666Delikatne wycieraczki do zadań
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Leica  M165 FCLeicaDo obrazowania jajników
Szkiełka mikroskopoweCorning294875X25Szkiełka mikroskopowe
Platforma nutacyjna RockerCorning Life Sciences6720Do utrwalania i barwienia jajników
Nutri-Fly BFGenesee Scientific66-121Pokarm dla much
Paraformaldehyd 20%roztwór Mikroskopia elektronowa SciencesFisher Naukowy: 15713Do 4%
tabletek soli fizjologicznej buforowanych fosforanemFisher scientificBP2944100Do roztworu PBS
ProLong Glass Antifade MountantInvitrogenP36980Montaż Średnia
kwadratowa szklana osłonaCorning285022Szkło nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych
Triton x-100Sigma-Aldrich9036-19-5Do PBST
Zeiss LSM 900 z Airyscan 2konfokalny i superrozdzielczyZeiss
Mikroskop stereoskopowy Zeiss Stemi 305Mikroskop preparacyjnyZeiss
Oprogramowanie Zen w wersji 3.3 (Blue Edition)Akwizycja i przetwarzanie obrazówZeiss
PFA Mikroskop

Bibliografia

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660(2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77(2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59(2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050(2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377(2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648(2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754(2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41(2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52(2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629(2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnasekrecja spolaryzowananab onek p cherzykowylokalizacja p cherzyk wbarwienie przeciwcia amirekonstrukcja 3D

Powiązane artykuły