Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń i ich pochodnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63785

⸱

22 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Center for Cardiovascular Experimental Study and Evaluation, National Center for Cardiovascular Diseases, Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, Animal Experimental Center, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł omawia metodę izolacji i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń (pBM-MSC) i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z nich, dostarczając metodologicznej podstawy do przedklinicznej oceny skuteczności transplantacji BM-MSC i ich pochodnych EV.

Streszczenie

Wraz z rozwojem terapii komórkami macierzystymi w badaniach translacyjnych i medycynie regeneracyjnej, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BM-MSC), jako rodzaj pluripotencjalnych komórek macierzystych, są preferowane ze względu na ich natychmiastową dostępność i udowodnione bezpieczeństwo. Doniesiono, że przeszczepienie BM-MSC jest bardzo korzystne w naprawie uszkodzonych tkanek w różnych chorobach, co może być związane z modulacją odpowiedzi immunologicznej i zapalnej za pomocą mechanizmów parakrynnych. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), charakteryzujące się dwuwarstwową strukturą błony lipidowej, są uważane za główne mediatory parakrynnego działania komórek macierzystych. Znane ze swojej kluczowej roli w komunikacji komórkowej i regulacji epigenetycznej, EV były już stosowane in vivo w immunoterapii. Jednak, podobnie jak w przypadku komórek matczynych, większość badań nad skutecznością przeszczepiania EV nadal pozostaje na poziomie małych zwierząt, co nie wystarczy, aby dostarczyć niezbędnych dowodów dla klinicznego przełożenia. W tym przypadku stosujemy wirowanie w gradiencie gęstości, aby najpierw wyizolować komórki szpiku kostnego (BMC) ze szpiku kostnego świni, a następnie uzyskać BM-MSC świń (pBM-MSC) przez hodowlę komórkową, zidentyfikowane na podstawie wyników obserwacji pod mikroskopem, testu różnicowania indukowanego i cytometrii przepływowej. Ponadto izolujemy EV pochodzące z pBM-MSC w supernatancie komórki za pomocą ultrawirowania, co zostało udowodnione technikami transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i western blotting. Ogólnie rzecz biorąc, pBM-MSCs i ich pochodne EV można wyizolować i skutecznie zidentyfikować za pomocą następujących protokołów, które mogą być szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych nad skutecznością przeszczepiania BM-MSCs i ich pochodnych EV.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 10 lat, terapia komórkami macierzystymi obiecywała ogromne korzyści pacjentom cierpiącym na różne choroby i urazy, takie jak urazy, choroby układu oddechowego i sercowo-naczyniowego. Wraz z postępem w tej dziedzinie, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BM-MSC) są stopniowo faworyzowane przez ludzi ze względu na ich dostępność i niewiele sporów etycznych1, które zostały uznane za złoty standard w badaniach klinicznych pomimo innych typów komórek2. Terapie oparte na BM-MSCs są również atrakcyjne dla coraz większej liczby badaczy ze względu na ich unikalną zdolność do modulowania odpowiedzi immunologicznych i zapalnych oraz naprawy uszkodzonych tkanek poprzez różnicowanie lub mechanizmy parakrynne3.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs), jak popiera Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV)4, odnoszą się do całkowitej liczby cząsteczek o strukturze dwuwarstwowej lipidów, które są naturalnie uwalniane z komórek. Dzięki niedawnym odkryciom różnych zawartości, takich jak białka, lipidy i materiały genetyczne (np. miRNA, mRNA, cząsteczki DNA, a także długie niekodujące RNA) w EV z różnych typów komórek5, ich kluczowe role w komunikacji komórkowej i regulacji epigenetycznej zostały rozpoznane6. Jako nowy substytut komórek matczynych, EV zostały zastosowane w immunoterapii i medycynie regeneracyjnej z badaniami in vivo, które służą jako podstawa dla trwających badań przedklinicznych i uzupełniających badań klinicznych7.

Jednak obecnie, większość badań nad skutecznością transplantacji BM-MSCs i ich pochodnych EV nadal pozostaje na poziomie małych zwierząt, co nie wystarcza do dostarczenia niezbędnych dowodów do klinicznego tłumaczenia. W związku z tym niezwykle pilne jest przeprowadzenie badań przedklinicznych nad przeszczepianiem BM-MSC i pochodnych EV na poziomie dużych zwierząt, takich jak trzoda chlewna.

Doniesiono, że MSCs są obecne w szpiku kostnym w bardzo małych ilościach, stanowiąc tylko 0,01% do 0,001% wszystkich komórek8. Jednak przedkliniczne podawanie BM-MSC wymaga dużej liczby komórek (≥107 na zwierzę)9; wymagana ilość EV jest jeszcze większa, której mediana dawki wynosi 0,25 mg białka na kilogram masy ciała u świń10. Aby osiągnąć tak dużą liczbę, istnieje pilna potrzeba opracowania bezpiecznej i skutecznej metody izolowania i hodowli MSCs ze szpiku kostnego świń w celu osiągnięcia ich ogromnej ekspansji in vitro, a następnie pozyskania ich EV o wysokim stężeniu białka.

Do tej pory istnieją różne metody izolowania BM-MSC i ich pochodnych EV. Obecne metody izolacji BM-MSC obejmują bezpośrednie sadzenie komórek szpiku kostnego (BMC)11, wirowanie w gradiencie gęstości, sortowanie etykiet molekularnych na powierzchni komórek oraz badania przesiewowe cytometrii przepływowej. Doniesiono, że sortowanie etykiet molekularnych na powierzchni komórki i badanie przesiewowe cytometrii przepływowej powodują zmniejszenie wskaźnika adhezji komórek, wzrost śmiertelności w ciągu 24 godzin i zahamowanie proliferacji12, podczas gdy bezpośrednia hodowla BMC może skutkować dużą liczbą mieszanych komórek krwiotwórczych. Dlatego wirowanie w gradiencie gęstości jest obecnie powszechnie stosowane do otrzymywania BM-MSC. Obecne metody izolowania EV od supernatantów komórkowych obejmują ultrawirowanie, ultrafiltrację, wytrącanie polimerów i wykluczanie rozmiaru13. W porównaniu z innymi metodami, ultrawirowanie ma tę zaletę, że jest niskokosztowa, łatwa w użyciu i kompatybilna z przygotowaniem dużych objętości bez skomplikowanej obróbki wstępnej, co było "złotym standardem" separacji EV14. Jednak podczas tego procesu istnieje duża niejednorodność w odczynnikach i technikach w różnych laboratoriach3,15, co może być mylące dla czytelników. W artykule szczegółowo wyjaśniono szereg sekwencyjnych etapów izolacji pBM-MSC i pochodzących z nich EV, a późniejsze wyniki identyfikacji dowodzą, że metoda ta jest wykonalna w celu uzyskania pBM-MSC i ich EV do dalszej analizy w badaniach przedklinicznych. Mamy nadzieję, że ta systematyczna praca może stanowić podstawę metodologiczną dla badaczy zajmujących się przedkliniczną oceną transplantacji pBM-MSC i ich pochodnych EV, tak aby można było jak najszybciej przeprowadzić badania kliniczne.

Protokół

Zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych wydanym przez National Institutes of Health, USA, wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), Szpital Fuwai, Chińska Akademia Nauk Medycznych.

1. Przygotowanie przedoperacyjne dla zwierząt

  1. Dorosłe samce chińskich świnek miniaturowych (30 ± 5 kg) w wieku około 12 miesięcy należy pozyskać z Instytutu Zoologii Chińskiej Akademii Nauk i umieścić je w obiektach Centrum Doświadczalnego dla Zwierząt Szpitala Fuwai z co najmniej 2-tygodniowym wyprzedzeniem. Przeprowadzaj kontrole przedoperacyjne, takie jak rutynowe badania krwi, aby upewnić się, że zwierzęta są zdrowe.
  2. Oczyść i ogol skórę w okolicy ud świnki miniaturowej dzień przed operacją. Aby uniknąć aspiracji, należy pościć świnkę miniaturową przez 12 godzin przed ekstrakcją szpiku kostnego.

2. Przygotowanie do izolacji i hodowli komórek

  1. Użyj Percollu (1.130 g/ml) do wyizolowania mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego. Wymieszać roztwór podstawowy z 10x stężonym PBS w stosunku 9:1, aby uzyskać podłoże izotoniczne. Następnie wymieszać pożywkę izotoniczną z PBS w stosunku 3:2, aby uzyskać 60% roztwór perkolu (1,077 g/ml), który można użyć jako końcowy roztwór separujący do wyizolowania pBM-MSC.
  2. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1,0% penicyliną-streptomycyną, aby uzyskać kompletną pożywkę. Podgrzewać całe podłoże i PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu późniejszej hodowli komórek.

3. Znieczulenie zwierząt

  1. Znieczulenie ogólne z ketaminą (10 mg/kg) i ksylazyną (2 mg/kg) należy podać domięśniowo. Szybko przeprowadź intubację dotchawiczą, gdy świnka miniaturowa ma powolny oddech i mniejszą aktywność kończyn, i zachowaj spontaniczne oddychanie, aby zapobiec nieudanej intubacji.
  2. Przeprowadzić podtrzymanie znieczulenia poprzez wdychanie 2% izofluranu, z tlenem (1,5 l/min) jako gazem nośnym. Podczas znieczulenia monitoruj tętno, oddychanie i nasycenie krwi tlenem miniświnki w czasie rzeczywistym.

4. Pobieranie szpiku kostnego od świni miniaturowej

  1. Umieść minipig w pozycji bocznej. Aby zapewnić wystarczającą ilość szpiku kostnego do późniejszej hodowli komórek, zlokalizuj punkt nakłucia szpiku kostnego w bliższej części kości udowej świni miniaturowej (Rysunek 1). Zdezynfekuj i ułóż skórę w miejscu nakłucia przed zastosowaniem operacji.
  2. Zaciśnij skórę wokół miejsca nakłucia ręką niedominującą i przebij igłę do biopsji szpiku kostnego pionowo w punkcie, w którym znajduje się ręka dominująca. Gdy wyczujesz, że igła styka się z kością korową, delikatnie obracaj uchwyt w lewo i w prawo, aby wywiercić igłę. Kiedy igła wchodzi do jamy szpiku kostnego, często pojawia się uczucie utraty oporu.
  3. Po wkłuciu należy wyjąć igłę rdzeniową. Następnie przymocuj jednorazową sterylną strzykawkę o pojemności 50 ml do końca zewnętrznej igły i wcześniej przepłucz wewnętrzną ściankę strzykawki heparyną.
  4. Powoli wyekstrahuj 20 ml szpiku kostnego i ostrożnie przenieś je do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  5. Po zakończeniu procedury wyciągnij igłę i zdejmij serwetkę. Zdezynfekuj miejsce nakłucia i dociskaj je przez 20 minut w celu hemostazy.
  6. Ekstubować miniświnkę po przywróceniu spontanicznego oddychania. Kiedy jest w pełni obudzony ze swobodnym ruchem kończyn, włóż miniświnkę z powrotem do klatki, aby kontynuować karmienie.

5. Izolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego

  1. Dodaj równą objętość podgrzanego PBS do szpiku kostnego i dokładnie je wymieszaj. Następnie za pomocą sterylnej pipety ostrożnie przenieść 20 ml rozcieńczonego szpiku kostnego powyżej 60% poziomu gradientu gęstości roztworu w stosunku objętościowym 1:1 do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  2. Odwirować probówkę przy 600 x g (przyspieszenie (ACC) = 5, opóźnienie (DEC) = 5) przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Po odwirowaniu w probówce powstają cztery fazy, w tym faza surowicy, faza komórki jednojądrzastej, faza pożywki gradientu gęstości i faza wytrącania od góry do dołu. Faza komórkowa jednojądrzasta jest cienką warstwą kłaczkowatą między surowicą a podłożem o gradiencie gęstości. W tej fazie znajdują się mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego.
  3. Pobrać jednojądrzastą fazę komórkową do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i przemyć dwukrotnie PBS w stężeniu 800 x g przez 5 minut.
  4. Ponownie zawiesić umyte komórki w 2 ml kompletnej pożywki i umieścić zawieszone komórki w kolbie hodowlanej o średnicy 175 cm2 komórek o gęstości 3-5 x 105/ml.
    UWAGA: Wszystkie powyższe procedury izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych można zobaczyć w Rysunek 2.

6. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro

  1. Inkubować kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C w nasyconej, wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Delikatnie wstrząsać kolbą hodowlaną co 24 godziny, aby zapobiec przylegającemu wzrostowi wytrąconych krwiotwórczych komórek macierzystych i obserwować wzrost, morfologię i zanieczyszczenie komórek pod mikroskopem.
  2. Pożywkę hodowlaną należy wymienić po raz pierwszy po 3 dniach, a następnie zmieniać pożywkę co 2-3 dni. Gdy kolonie komórkowe osiągną 80%-90% konfluencji, subkulturuj komórki w stosunku 1: 2.

7. Adidogenne, osteogenne i chondrogenne różnicowanie pBM-MSCs

  1. Test różnicowania adipogennego
    1. Przygotować pożywkę do różnicowania adipogennego A (Medium A) i B (Medium B) dla BM-MSC zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Szczegółowe informacje na temat zestawu można znaleźć w Tabeli Materiałów.
    2. Dodaj 1 ml 0,1% żelatyny do płytki sześciodołkowej i delikatnie wstrząśnij, aby równomiernie pokryła dno każdej studzienki. Następnie umieścić sześciodołkową płytkę w czystej ławce lub inkubatorze CO2 na co najmniej 30 minut.
    3. Po 30 minutach odessać żelatynę i dodać 2 ml ogólnej kompletnej pożywki do każdej studzienki. Następnie umieść pBM-MSC na płytce sześciodołkowej o gęstości komórek 2 x 104 komórek/cm2. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotności nasyconej 5% CO2 .
    4. Gdy komórki osiągną 100% zbieżności, ostrożnie usuń całe podłoże i dodaj 2 ml pożywki A do każdego dołka płytki. Po 3 dniach usuń pożywkę A z płytki i dodaj 2 ml pożywki B do każdej studzienki.
    5. Po utrzymaniu przez 1 dzień usuń pożywkę B i zastąp ją pożywką A do indukcji. Zgodnie ze sposobem "Medium A przez 3 dni, Medium B przez 1 dzień", użyj kolejno Medium A i B do indukcji.
    6. Obserwuj stan komórki każdego dnia w tym okresie. Jeśli komórki kurczą się lub umierają podczas procesu indukcji pożywki A, zastąp ją pożywką B na czas, aż stan komórki się poprawi.
    7. Powtórzyć proces indukcji i konserwacji i przygotować się do barwienia, gdy pod mikroskopem zaobserwuje się wystarczającą ilość kropelek lipidów o odpowiedniej wielkości.
    8. Usuń pożywkę do różnicowania adipogennego z płytki sześciodołkowej i delikatnie przemyj 1x PBS. Dodaj 2 ml 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i utrwalaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Usuń utrwalacz paraformaldehydu i przemyj 1x PBS dwa lub trzy razy, aby upewnić się, że utrwalacz został dokładnie usunięty. Dodaj 2 ml barwnika Oil Red O do każdej studzienki i bejcuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Usuń barwnik Oil Red O i umyj 1x PBS dwa lub trzy razy. Dodaj 2 ml 1x PBS do każdej studzienki, a następnie obserwuj efekt różnicowania adipogennego pod mikroskopem.
  2. Test różnicowania osteogennego
    1. Przygotuj kompletną pożywkę do różnicowania osteogennego zgodnie z instrukcją zestawu.
    2. Wykonaj kroki 7.1.2-7.1.3, aby zainstalować i wyhodować pBM-MSC.
    3. Gdy komórki osiągną 70% zbieżności, ostrożnie usuń ogólne kompletne podłoże i dodaj 2 ml pożywki do różnicowania osteogennego do każdego dołka płytki.
    4. Zmieniaj pożywkę na nową pożywkę do różnicowania osteogennego co 3 dni. Kontynuuj indukcję przez 2-4 tygodnie i przygotuj się do barwienia czerwonym barwnikiem Alizarin, gdy podczas osteogenezy pojawią się oczywiste guzki wapnia.
    5. Usuń pożywkę do różnicowania osteogennego z płytki sześciodołkowej i delikatnie przemyj 1x PBS. Dodaj 2 ml 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i utrwalaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Usuń utrwalacz paraformaldehydu i przemyj 1x PBS dwa lub trzy razy, aby upewnić się, że utrwalacz został dokładnie wyczyszczony. Dodaj 2 ml czerwonego barwnika Alizarin do każdej studzienki i barwij przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Usuń barwnik Alizarin Red i umyj 1x PBS dwa lub trzy razy. Dodaj 2 ml 1x PBS do każdej studzienki, a następnie obserwuj efekt różnicowania osteogennego pod mikroskopem.
  3. Test różnicowania chondrogennego
    1. Przygotuj premiks do różnicowania chondrogennego zgodnie z instrukcją zestawu.
    2. Przenieś 3-4 x 105 pBM-MSC do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 4 minuty w temperaturze 20 °C.
    3. Usunąć supernatant i dodać 0,5 ml premiksu w celu ponownego zawieszenia osadu otrzymanego przez odwirowanie w poprzednim etapie, a następnie odwirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Powtórzyć ten krok, aby ponownie umyć komórki.
    4. Przygotować kompletną pożywkę do różnicowania chondrogennego.
    5. Zawiesić komórkę otrzymaną w poprzednim etapie za pomocą 0,5 ml kompletnej pożywki i odwirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
    6. Odkręć nakrętkę rurki wirówki, aby ułatwić wymianę gazową. Umieść go pionowo w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności nasyconej.
    7. Gdy komórki wydają się agregować (zwykle po 24-48 godzinach, w zależności od rzeczywistej sytuacji), przesuń dolną część probówki wirówkowej, aby kulki chrząstki oderwały się od dna i zawiesiły w pożywce.
    8. Zmieniaj pożywkę na świeżą, kompletną do różnicowania chondrogennego co 2-3 dni. Kontynuuj indukcję, aż w rurce uformują się kulki chrząstki o średnicy 1,5-2 mm, a następnie przygotuj skrawki do barwienia.
    9. Przygotuj skrawki parafinowe kulek chrząstki zgodnie z rutynowymi etapami eksperymentów patologicznych. Dodać niebieski barwnik Alicia do odwoskowanych fragmentów i bejcować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    10. Opłucz szkiełko bieżącą wodą przez 5 minut, a następnie po wyschnięciu obserwuj efekt barwienia Alicia blue pod mikroskopem.

8. Identyfikacja fenotypu komórki za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Gdy kolonie komórkowe osiągną 80%-90% konfluencji w pasażach 3-5, usuń pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyj komórki podgrzanym PBS. Następnie trawić komórki za pomocą 3-4 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować je w temperaturze 37 °C w nasyconej wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 2-3 minuty, aż zostaną odłączone od dna kolby pod mikroskopem.
  2. Zebrać komórki za pomocą 10 ml kompletnej pożywki i przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przemyć komórki PBS o temperaturze 4 °C.
  3. Zawiesić komórki na 10 ml przy 4 °C PBS. Zawiesina komórek jest podzielona na dziewięć grup o objętości 1 ml w każdej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, nazwanych kontrolą ujemną, kontrolą izotypu FITC, kontrolą izotypu PE, kontrolą izotypu APC, odpowiednio grupą CD105, CD29, CD90, CD14 i CD45. Upewnij się, że liczba komórek w każdej mikroprobówce wynosi od 1 x 105 do 1 x 106.
  4. Odwirować zawiesinę o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w każdej mikroprobówce za pomocą 100 μl PBS o temperaturze 4 °C. Z wyjątkiem ujemnej grupy kontrolnej, dodać 5 μl odpowiedniej kontroli izotypu (FITC, PE i kontrola izotypu myszy IgG1 kappa) i przeciwciał (przeciwciało monoklonalne CD105, CD29, CD90, CD14 i CD45) do cytometrii przepływowej do każdej mikroprobówki zgodnie z kolejnością w kroku 8.3. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C w ciemności.
  5. Dodać 1 ml PBS o temperaturze 4 °C do każdej mikroprobówki i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i dodać 200 μl PBS o temperaturze 4 °C w celu ponownego zawieszenia komórek.
  6. Przetestuj co najmniej 10 000 komórek na cytometrii przepływowej po przefiltrowaniu zawiesiny komórkowej16 i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej.

9. Izolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń

  1. Gdy konfluencja pBM-MSCs osiągnie 80%-90%, wyrzuć supernatant i przemyj komórki PBS 2x. Następnie dodać 25 ml IMDM bez surowicy do każdej kolby hodowlanej i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin.
  2. Zebrać supernatant komórek (kondycjonowane podłoże, CM) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
  3. Ponownie zebrać supernatant do innej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przeprowadzić izolację EV tak szybko, jak to możliwe po pobraniu supernatantu. W przypadku długotrwałego przechowywania supernatant należy przechowywać w lodówce w temperaturze -80 °C, aby zapobiec utracie EV.
  4. Odwirować supernatant zgodnie z krokiem 9.3 przy 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść supernatant do sterylnej probówki używanej do wirówki szybkoobrotowej i odwirować przy 16 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieść sklarowany osad ponownie do probówki ultrawirówki i wirować przy stężeniu 120 000 x g przez co najmniej 70 minut w temperaturze 4 °C, z wirnikiem o stałym kącie nachylenia.
  7. Całkowicie odrzucić supernatant. Dodać 1 ml PBS o temperaturze 4 °C do każdej probówki ultrawirówki i ponownie zawiesić osad za pomocą mikropipety. Wymieszać roztwór z tej samej grupy w probówce ultrawirówkowej, a następnie dodać 4 °C PBS, aby objętość była większa niż 3/4 probówki.
  8. Wirować przy 120 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant w jak największym stopniu.
  9. Ponownie zawiesić środek strącający sterylnym PBS i przechowywać EV w lodówce o temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Ilość PBS do ponownego wymieszania można określić jako 100 μl dla wytrącania z każdych dwóch kolb hodowlanycho długości 175 cm2. Wszystkie powyższe kroki izolowania EV są systematycznie pokazane w Rysunek 3.

10. Identyfikacja EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i western blotting

  1. Umieść próbkę EVs na lodzie po rozmrożeniu w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C, a następnie rozcieńcz do połowy poprzedniego stężenia za pomocą PBS w celu wykrycia NTA17.
  2. Odpipetować 10 μl próbki na siatce miedzianej, pozostawić na 1 minutę i wchłonąć pływającą ciecz za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie dodaj 10 μl kwasu fosfatungstycznego do siatki miedzianej, odstaw na 1 minutę i wchłoń nadmiar płynu.
  3. Po wysuszeniu przez kilka minut w RT wykonaj obrazowanie mikroskopią elektronową w warunkach napięcia przyspieszającego 100 KV18.
  4. Zawiesić próbkę EVs z kroku 9.9 w buforze do lizy RIPA (25 mM Tris·HCl (pH 7,6), 150 mM chlorek sodu [NaCl], 1% nonyl-fenoksyetoksyetanol (NP-40), 1% deoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS), 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF), 1x inhibitor proteazy) i wykryć ekspresję specyficznych markerów dla EV, takich jak Alix, TSG101, CD81 i CD63 przez western blotting19.

Wyniki

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świni
Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z szpiku kostnego świni zostały pomyślnie wyizolowane i wyhodowane in vitro, a morfologię pBM-MSC w poszczególnych dniach można zobaczyć na Rycina 4W pierwotnej hodowli pBM-MSC obserwacje mikroskopowe wykazały, że adhezja komórek nastąpiła jeden dzień po wysianiu, a komórki adherentne miały zazwyczaj kształt okrągły. Pierwotne pBM-MSC zazwyczaj pozostawały w fazie spoczynku przez 3 dni po wysianiu, a proliferacja komórek rozpoczęła się w 4.th Dnia. Po proliferacji morfologia komórek zmieniła się z okrągłej na wrzecionowatą, wieloboczną lub gwiaździstą, a jądra są centralnie położone, przy czym w niektórych komórkach widoczne są podwójne jąderka. Kolonie komórek utworzyły się 7–9 dni po rozpoczęciu proliferacji, a konfluencję komórek na poziomie 80%–90% osiągnięto w 12–14 dniach. Obserwacja mikroskopowa wykazała, że komórki adherentne rosły w postaci rozproszonych kolonii i układały się w wirujące wzory.

Proliferacja komórek uległa znacznemu przyspieszeniu po pasażowaniu, a konfluencja na poziomie 80%-90% mogła zostać osiągnięta w ciągu tygodnia. Morfologia komórek od drugiego pasażu była jednorodna, wrzecionowata, przypominająca fibroblasty, z proporcją długości do szerokości wynoszącą około 2-3:1. W przypadku zróżnicowania komórek mogły one przybrać kształt wielokątny lub gwiaździsty. Po pasażowaniu komórki nie rosły już w formie rozproszonych kolonii, lecz równomiernie i promieniście w układzie równoległym.

Identyfikacja potencjału różnicowania komórek za pomocą barwienia
W teście różnicowania adypogennego barwienie Oil Red O wykazało obecność okrągłych, pomarańczowo-czerwonych kropli lipidów o różnych rozmiarach wokół jądra komórkowego (Rycina 5A); w teście różnicowania osteogennego barwienie Alizaryną Czerwoną ujawniło czerwone grudki na powierzchni komórek (Rycina 5B), co było wynikiem reakcji barwnej z solami wapnia odłożonymi przez osteoblasty zróżnicowane z pBM-MSCs. W teście różnicowania chondrogennego barwienie błękitem Alcian wykazało, że cały przekrój tkanki był niebieski (Rycina 5C), co wynikało z barwienia kwaśnych mukopolisacharydów w obrębie kulek chrzęstnych.

Identyfikacja fenotypu komórek metodą cytometrii przepływowej
W celu określenia fenotypu pBM-MSCs przeprowadzono analizy markerów powierzchniowych komórek. Z wyników cytometrii przepływowej (Rysunek 6) wynika, że trzy markery pozytywne, takie jak CD105, CD29 i CD90, były znacząco wyrażane na powierzchni pBM-MSCs, stanowiąc odpowiednio 96,5%, 99,8% i 92% (Rysunek 6A-C). Natomiast ekspresja CD14 i CD45 była negatywna (Rysunek 6D,E). Jednocześnie wyniki odpowiadających im kontroli izotypowych były we wszystkich przypadkach negatywne (naniesione na wykresy), co wyklucza możliwość nieswoistego wiązania przeciwciał.

Identyfikacja EV pochodzących z pBM-MSCs za pomocą NTA, TEM i western blossomingu
Wynik NTA wykazał, że średnica cząstek wynosiła 126,9 nm, co mieści się w zakresie EV; ponadto pierwotne stężenie próbki EV wynosiło 1,5 x 1010 cząstek/mL, a dokładną wartość przypisaną do rozmiaru można znaleźć na Rysunku 7A. Diagram trajektorii cząstek przedstawiono na Rysunku 7B, co ilustruje, że cząstki znajdowały się w nieregularnym ruchu Browna. Ponadto dyskoidalne pęcherzyki, będące klasyczną strukturą EV, były wyraźnie widoczne pod mikroskopem elektronowym przy powiększeniu 50 000x (Rysunek 7C). Wykryto również w próbce ekspresję specyficznych markerów EV, takich jak Alix, TSG101, CD81 i CD63, za pomocą western blossomingu (Rysunek 7D).

Schemat anatomii szkieletu świni pokazujący miejsce nakłucia do badań biologicznych.
Rycina 1: Miejsce punkcji szpiku kostnego u miniswini. Czerwony obszar wskazuje miejsce nakłucia w celu pobrania szpiku kostnego, znajdujące się w bliższym odcinku kości udowej miniswini. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Proces izolacji szpiku kostnego; schemat metody wirowania; przygotowanie hodowli komórkowych do badań.
Rysunek 2: Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego świni. Proces izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego świni przedstawiono na schemacie blokowym, a cztery fazy ciekłe są wyraźnie zilustrowane po wirowaniu w gradiencie gęstości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Proces izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV); metoda wirowania, schemat szczegółowo przedstawiający kroki i wyniki.
Rysunek 3: Izolacja EV pochodzących z pBM-MSCs. Schemat przedstawia poszczególne etapy izolacji EV z pożywki kondycjonowanej za pomocą ultrawirowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost komórek w czasie; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej z 3., 5., 7. i 9. dnia; analiza komórkowa.
Rycina 4Charakterystyka morfologiczna pBM-MSC w różnych dniach. Podobne cechy morfologiczne pBM-MSCs można zaobserwować na 3B+R, 5th, 7th, oraz 9th dzień po posadzeniu w polu widzenia mikroskopu 100x, a kolonie komórek uformowały się na 9th dzień Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe różnicowania komórek; barwione próbki A, B, C; wizualizacja procesu, narzędzie badawcze.
Rycina 5. Identyfikacja potencjału różnicowania pBM-MSCs za pomocą barwienia. ( A) test różnicowania adipogennego, (B) osteogennego oraz (C) chondrogennego pBM-MSCs. Potencjał różnicowania pBM-MSCs można zidentyfikować na podstawie tych wyników barwienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histogramy cytometrii przepływowej przedstawiające analizę markerów CD (CD105, CD29, CD90, CD14, CD45).
Rycina 6: Wyniki identyfikacji pBM-MSCs za pomocą cytometrii przepływowej. CD105, CD29 i CD90 są znacząco eksprymowane na powierzchni pBM-MSCs, stanowiąc odpowiednio 96,5%, 99,8% i 92,0%, podczas gdy ekspresja CD14 i CD45 jest negatywna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza nanocząsteczek: wykres rozkładu wielkości, obraz fluorescencyjny, mikroskopia elektronowa, analiza białek.
Rysunek 7: Wyniki identyfikacji EV pochodzących z pBM-MSCs na podstawie morfologii i biologii molekularnej. (A) Wynik NTA dla EV pochodzących z pBM-MSCs, z wykresem rozkładu wielkości cząstek i (B) schematem trajektorii cząstek; (C>) obraz TEM wykonany przy powiększeniu 50 000x, gdzie biała strzałka wskazuje klasyczną strukturę pęcherzyków dyskoidalnych. (D) Ekspresja specyficznych markerów dla EV metodą western blotting. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Tradycyjny punkt nakłucia szpiku kostnego u świnek miniaturowych umieszczono w grzebieniu biodrowym20. Chociaż łatwo jest go zlokalizować, ilość ekstrakcji szpiku kostnego jest ograniczona21 (ogólnie tylko około 5 ml), więc trudno jest spełnić wymóg dużej liczby ekspansji in vitro do przeszczepu in vivo. W tej metodzie przenieśliśmy punkt nakłucia szpiku kostnego na proksymalną część kości udowej i z tego miejsca można pobrać co najmniej 20 ml szpiku kostnego, gwarantując wystarczającą ilość pBM-MSCs do późniejszej hodowli komórek.

Dwa główne roztwory separacyjne stosowane do izolowania BM-MSC za pomocą wirowania w gradiacji gęstości to Percoll i Ficoll. Percoll składa się z silikonowanego poliwinylopirolidonu (PVP), który jest nowatorskim nietoksycznym i niedrażniącym środkiem odśrodkowym oddzielającym o gradiencie gęstości. Niska stała dyfuzji Percollu skutkuje stosunkowo stabilnym gradientem gęstości; W związku z tym zadowalającą separację komórek można zwykle osiągnąć w ciągu kilkudziesięciu minut przy niskich siłach odśrodkowych (200-1000 x g). Metoda izolacji pBM-MSCs za pomocą Ficoll została opisana wcześniej21. W porównaniu z Ficollem, Percoll był stopniowo stosowany ze względu na jego zalety łatwej izooperatowności, niskiej lepkości, nietoksyczności i niepowodowania agregacji komórek, co może uzupełniać istniejące metody izolacji pBM-MSC.

Podczas izolowania i hodowli pBM-MSC nie można pominąć niektórych krytycznych etapów. Po pierwsze, skuteczna stratyfikacja różnych faz ciekłych po odwirowaniu w gradifikacji gęstości jest kluczem do wyizolowania oczyszczonych pBM-MSC. BM-MSC, jako rodzaj komórek jednojądrzastych szpiku kostnego (BM-MNC), mają ciężar właściwy podobny do limfocytów i monocytów, około 1,075 g/ml. Pierwotna gęstość Percollu wynosi 1.130 g/ml, a aby pomyślnie uzyskać warstwę komórkową zawierającą BM-MSC po odwirowaniu w gradimencie gęstości, należy wcześniej skonfigurować 60% roztwór do separacji gradientu gęstości izotonicznej (1.077 g / ml) zgodnie z zależnością gęstości Percolla- stężenie 22. Co więcej, odpowiednie warunki wirowania również przyczyniają się do pomyślnej stratyfikacji. Biorąc pod uwagę niską stałą dyfuzji Percollu, odwirowaliśmy wyekstrahowany szpik kostny przy 600 x g przez 20 minut przy stosunkowo niskich poziomach przyspieszenia/opóźnienia (ACC = 5, DEC = 5), co pozwoliło uzyskać dobry efekt stratyfikacji. Po drugie, odpowiednia gęstość sadzenia jest również niezbędna dla hodowli komórkowych. W celu pozyskania wystarczającej liczby MSCs (zwykle więcej niż 107 na zwierzę9) do późniejszego przeszczepienia, używamy kolb hodowlanych o powierzchni 175cm2 do hodowli komórkowych. W poprzednim badaniu20 uzyskane BM-MNC były zwykle sadzone w kolbach hodowlanych do uprawy o gęstości 5 x 105/cm2. Doniesiono, że po odwirowaniu w gradiencie gęstości można uzyskać 2-3 x 107 BM-MNC na każde 5 ml szpiku kostnegoświni 23. Dlatego w tym protokole zalecamy umieszczenie całkowitych BM-MNC wyizolowanych z każdego 20 ml szpiku kostnego świni w kolbie hodowlanej o długości 175cm2 w celu uzyskania odpowiedniej gęstości. Po trzecie, należy unikać zanieczyszczeń podczas izolacji i hodowli pBM-MSC. Podczas pobierania jednojądrzastej fazy komórkowej pipeta nie powinna być wkładana do fazy Percoll, aby nie zmieszać się z cieczą oddzielającą. Ponadto po 24 godzinach od posadzenia komórek kolbę hodowlaną należy delikatnie wstrząsnąć, aby zmniejszyć przyleganie czerwonych krwinek.

Podczas procesu ultrawirowania wysoki poziom zanieczyszczenia agregatami białkowymi i lipoproteinami za pomocą tej metody nieuchronnie zagraża kwantyfikacji i analizie funkcjonalnej EV14. W celu maksymalnego zmniejszenia zanieczyszczenia w procesie, głębokość cieczy na dnie powinna być zachowana za każdym razem na głębokości 5 mm podczas przenoszenia supernatantu przed etapem ultrawirowania. Tymczasem, po pierwszym ultrawirowaniu, ponowne zawieszenie granulatu w sterylnym PBS, a następnie ponowne wykonanie ultrawirowania może skutecznie zmniejszyć zanieczyszczenie lipoproteinami.

Chociaż wirowanie w gradiencie gęstości i ultrawirowanie są szeroko stosowane odpowiednio w izolowaniu BM-MSC i ich pochodnych EV, te dwie techniki mają również swoje ograniczenia. Z jednej strony, technika Percoll jest długotrwała i kłopotliwa, a uzyskanie próbki koncentratu BM za pomocą przyłóżkowego urządzenia do zatężania komórek zostało zgłoszone jako alternatywna metoda izolacjiMSCs 24. Z drugiej strony metoda ultrawirowania wymaga nie tylko wysoko wykwalifikowanych techników, ale także drogiego sprzętu; w związku z tym łączne zastosowanie dwóch lub więcej technik może stanowić rozsądną strategię dla skuteczniejszej izolacji pojazdów elektrycznych25. Poza tym poprawy wymaga również identyfikacja pBM-MSC i pochodnych pojazdów elektrycznych. Na przykład, zgodnie z międzynarodowymi kryteriami definiowania MSCs26, ekspresja niektórych pozytywnych lub ujemnych markerów, takich jak CD73, CD34 i HLA-DR, nadal nie jest obecna w wynikach identyfikacji fenotypów BM-MSC za pomocą cytometrii przepływowej w tym badaniu. Ponadto, mimo że podjęto środki w celu uniknięcia zanieczyszczenia podczas procesu izolacji pojazdów elektrycznych, ze względu na ograniczenia naszego laboratorium, nie jesteśmy w stanie ocenić czystości próbki pojazdów elektrycznych, aby usprawnić dalsze prace.

W badaniu tym połączono metody sekwencyjnej izolacji pBM-MSCs i ich pochodnych EV, co zostało systematycznie udowodnione późniejszymi wynikami identyfikacji. W szczególności podkreśliliśmy kluczowe operacje w tej serii kroków, wyjaśniając pewne specyficzne warunki eksperymentalne, które mogą do pewnego stopnia rozwiązać problem heterogeniczności występującej w różnych laboratoriach podczas tego procesu. Ta metodyczna praca może być szeroko stosowana w badaniach przedklinicznych nad skutecznością przeszczepiania BM-MSC i ich pochodnych EV, co może stanowić podstawę eksperymentalną o wystarczającym poziomie dla badań klinicznych.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Yang Jianzhongowi i Wang Xueminowi za ich wkład w operację ekstrakcji szpiku kostnego. Praca ta została wsparta grantami z CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [numer grantu 2016-I2M-1-009], National Natural Science Foundation of China (nr: 82070307; nr: 81874461).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
175 cm2 kolba do hodowli komórkowychThermo Fisher159910używana do hodowli komórkowych
0,25% Trypsyna/EDTAThermo Fisher25200056stosowany do trawienia komórek
Zestaw do różnicowania adipogennego dla szpiku kostnego Mezenchymalne komórki macierzysteOriCell  GUXMX-90031stosowany do oznaczania różnicowania adipogennego
Alix Przeciwciało monoklonalneThermo FisherMA1-83977używane do identyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Ev) za pomocą western blotting
APC Mouse IgG1 kappa Isotype ControlThermo Fisher17-4714-42stosowany do eliminowania skutków niespecyficznego barwienia w cytometrii przepływowej
CD105 (Endoglin) Przeciwciało monoklonalneThermo Fisher17-1057-42służy do identyfikacji pBM-MSC metodą cytometrii przepływowej
CD14 Przeciwciało monoklonalneThermo FisherMA1-82074służy do identyfikacji pBM-MSC metodą cytometrii przepływowej
CD29/IGTB1 Przeciwciało monoklonalneThermo FisherMA1-19458służy do identyfikacji pBM-MSC za pomocą cytometrii przepływowej
CD45 Przeciwciało monoklonalneThermo FisherMA5-28383służy do identyfikacji pBM-MSC za pomocą cytometrii przepływowej
Przeciwciało monoklonalne CD63Thermo Fisher10628Dużywane do identyfikacji EV metodą western blott
Przeciwciało monoklonalne CD81Thermo FisherMA5-13548używane do identyfikacji EV metodą western blott
CD90 Przeciwciało monoklonalneThermo FisherA15794używane do identyfikacji pBM-MSC metodą cytometrii przepływowej
Zestaw do różnicowania chondrogennego dla szpiku kostnego Mezenchymalne komórki macierzysteOriCellGUXMX-90041używany do oznaczania różnicowania chondrogennego
Surowica bydlęcapłodu Gibco10099141Csłuży do przygotowania kompletnego podłoża
FITC Mysz IgG1 kappa Isotype ControlThermo Fisher11-4714-42stosowany do eliminacji skutków niespecyficznego barwienia w cytometrii przepływowej
Cytometria przepływowaBDAccuri C6stosowana do identyfikacji fenotypu komórki
Oprogramowanie FlowJoBDV10używane do analizy danych z cytometrii przepływowej
Probówka wirówkowa o dużej prędkości (50 ml)Beckman357003używany do szybkiego wirowania
Zmodyfikowany Ilbecco's MediumGibcofirmy Iscove C12440500BTużywany do hodowli komórkowych
Niskotemperaturowa szybkoobrotowa wirówka podłogowaAvantiJ-26XPIstosowany do szybkiego wirowania w celu uzyskania czystego, kondycjonowanego podłoża
Nonyl fenoksyetoksyetanol (NP-40)Sigma-AldrichNP40Sstosowany do składu buforu do lizy RIPA
Zestaw do różnicowania osteogennego do szpiku kostnego Mezenchymalne komórki macierzysteOriCellGUXMX-90021używany do testu różnicowania osteogennego
PE Mysz IgG1 kappa Kontrola izotypuThermo Fisher12-4714-42stosowany w celu wyeliminowania skutków niespecyficznego barwienia w cytometrii przepływowej
PercollCytiva17089102stosowany do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń (pBM-MSCs)
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)Thermo Scientific36978stosowany do składu buforu do lizy RIPA
buforowana fosforanem (10x)BeyotimeST476używany do przygotowania izotonicznego Percollu roztwór
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)CytivaAF29561133stosowany do rozcieńczania Percollu i przemywania komórek
Inhibitor proteazy (1x)Thermo ScientificA32955stosowany do składu buforu do lizy RIPA
chlorek soduSigma-AldrichS9888stosowany do składu buforu do lizy RIPA
deoksycholan soduSigma-AldrichD6750stosowany do składu buforu do lizy RIPA
dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-AldrichL3771używany do składu buforu do lizy RIPA
Transmisyjna mikroskopia elektronowaHitachiHT7700używany do obrazowania mikroskopii elektronowej
Tris· HClSigma-Aldrich93363używany do składu buforu do lizy RIPA
TSG101 Przeciwciało monoklonalneThermo FisherMA1-23296używany do identyfikacji EV za pomocą western blotting
Ultrawirówka (typ 50.2 Ti Rotor)Beckmanoptima L-100XPużywana do ultrawirowania w celu wyizolowania egzosomów
Probówka do ultrawirówki (26,3 ml)Beckman355654używana do ultrawirowanie
ZetaVIEWParticle MetrixS/N 17-310używane do analizy śledzenia nanocząstek
Sól fizjologiczna

Bibliografia

  1. Heslop, J. A., et al. Concise review: workshop review: understanding and assessing the risks of stem cell-based therapies. Stem Cells Translational Medicine. 4 (4), 389-400 (2015).
  2. Berebichez-Fridman, R., Montero-Olvera, P. R. Sources and clinical applications of mesenchymal stem cells: State-of-the-art review. Sultan Qaboos University Medical Journal. 18 (3), 264-277 (2018).
  3. Antebi, B., Mohammadipoor, A., Batchinsky, A. I., Cancio, L. C. The promise of mesenchymal stem cell therapy for acute respiratory distress syndrome. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 84 (1), 183-191 (2018).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  6. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnology Advances. 36 (1), 328-334 (2018).
  7. Lener, T., et al. Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials - an ISEV position paper. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 30087(2015).
  8. Castro-Malaspina, H., et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood. 56 (2), 289-301 (1980).
  9. vander Spoel, T. I. G., et al. Human relevance of pre-clinical studies in stem cell therapy: systematic review and meta-analysis of large animal models of ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 649-658 (2011).
  10. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Advanced Drug Delivery Reviews. 178, 113961(2021).
  11. Mareschi, K., et al. Multipotent mesenchymal stromal stem cell expansion by plating whole bone marrow at a low cellular density: a more advantageous method for clinical use. Stem Cells International. , 920581(2012).
  12. Van Vlasselaer, P., Falla, N., Snoeck, H., Mathieu, E. Characterization and purification of osteogenic cells from murine bone marrow by two-color cell sorting using anti-Sca-1 monoclonal antibody and wheat germ agglutinin. Blood. 84 (3), 753-763 (1994).
  13. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers In Immunology. 9, 738(2018).
  16. Huang, P., et al. Combinatorial treatment of acute myocardial infarction using stem cells and their derived exosomes resulted in improved heart performance. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 300(2019).
  17. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e61979(2021).
  18. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56482(2018).
  19. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55057(2017).
  20. Yang, Y. J., et al. Atorvastatin treatment improves survival and effects of implanted mesenchymal stem cells in post-infarct swine hearts. European Heart Journal. 29 (12), 1578-1590 (2008).
  21. Lee, W. -J., et al. Isolation and cellular phenotyping of mesenchymal stem cells derived from synovial fluid and bone marrow of minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e54077(2016).
  22. Lindqvist, R. Food Microorganisms: Buoyant Density Centrifugation. Encyclopedia of Separation Science. Wilson, I. D. , Academic Press. 2843-2849 (2000).
  23. Yao, Y. L., Zhang, H., Gong, D. J., Song, Z. G., Xu, Z. Y. Transfecting hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 2 gene into porcine bone marrow mesenchymal stem cells. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. 13 (49), 9673-9676 (2009).
  24. Hegde, V., et al. A prospective comparison of 3 approved systems for autologous bone marrow concentration demonstrated nonequivalency in progenitor cell number and concentration. Journal of Orthopaedic Trauma. 28 (10), 591-598 (2014).
  25. Gallet, R., et al. Exosomes secreted by cardiosphere-derived cells reduce scarring, attenuate adverse remodelling, and improve function in acute and chronic porcine myocardial infarction. European Heart Journal. 38 (3), 201-211 (2017).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Świńskie BM-MSCwirowanie w gradiencie gęstościhodowla komórkowacytometria przepływowaultrawirowanietransmisyjna mikroskopia elektronowaanaliza śledzenia nanocząstekWestern blotting

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.