Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń i ich pochodnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Podsumowanie

Ten artykuł omawia metodę izolacji i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń (pBM-MSC) i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z nich, dostarczając metodologicznej podstawy do przedklinicznej oceny skuteczności transplantacji BM-MSC i ich pochodnych EV.

Streszczenie

Wraz z rozwojem terapii komórkami macierzystymi w badaniach translacyjnych i medycynie regeneracyjnej, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BM-MSC), jako rodzaj pluripotencjalnych komórek macierzystych, są preferowane ze względu na ich natychmiastową dostępność i udowodnione bezpieczeństwo. Doniesiono, że przeszczepienie BM-MSC jest bardzo korzystne w naprawie uszkodzonych tkanek w różnych chorobach, co może być związane z modulacją odpowiedzi immunologicznej i zapalnej za pomocą mechanizmów parakrynnych. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), charakteryzujące się dwuwarstwową strukturą błony lipidowej, są uważane za główne mediatory parakrynnego działania komórek macierzystych. Znane ze swojej kluczowej roli w komunikacji komórkowej i regulacji epigenetycznej, EV były już stosowane in vivo w immunoterapii. Jednak, podobnie jak w przypadku komórek matczynych, większość badań nad skutecznością przeszczepiania EV nadal pozostaje na poziomie małych zwierząt, co nie wystarczy, aby dostarczyć niezbędnych dowodów dla klinicznego przełożenia. W tym przypadku stosujemy wirowanie w gradiencie gęstości, aby najpierw wyizolować komórki szpiku kostnego (BMC) ze szpiku kostnego świni, a następnie uzyskać BM-MSC świń (pBM-MSC) przez hodowlę komórkową, zidentyfikowane na podstawie wyników obserwacji pod mikroskopem, testu różnicowania indukowanego i cytometrii przepływowej. Ponadto izolujemy EV pochodzące z pBM-MSC w supernatancie komórki za pomocą ultrawirowania, co zostało udowodnione technikami transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i western blotting. Ogólnie rzecz biorąc, pBM-MSCs i ich pochodne EV można wyizolować i skutecznie zidentyfikować za pomocą następujących protokołów, które mogą być szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych nad skutecznością przeszczepiania BM-MSCs i ich pochodnych EV.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 10 lat, terapia komórkami macierzystymi obiecywała ogromne korzyści pacjentom cierpiącym na różne choroby i urazy, takie jak urazy, choroby układu oddechowego i sercowo-naczyniowego. Wraz z postępem w tej dziedzinie, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BM-MSC) są stopniowo faworyzowane przez ludzi ze względu na ich dostępność i niewiele sporów etycznych¹, które zostały uznane za złoty standard w badaniach klinicznych pomimo innych typów komórek². Terapie oparte na BM-MSCs są również atrakcyjne dla coraz większej liczby badaczy ze względu na ich unikalną zdolność do modulowania odpowiedzi immunologicznych i zapalnych oraz naprawy uszkodzonych tkanek poprzez różnicowanie lub mechanizmy parakrynne³.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs), jak popiera Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV)⁴, odnoszą się do całkowitej liczby cząsteczek o strukturze dwuwarstwowej lipidów, które są naturalnie uwalniane z komórek. Dzięki niedawnym odkryciom różnych zawartości, takich jak białka, lipidy i materiały genetyczne (np. miRNA, mRNA, cząsteczki DNA, a także długie niekodujące RNA) w EV z różnych typów komórek⁵, ich kluczowe role w komunikacji komórkowej i regulacji epigenetycznej zostały rozpoznane⁶. Jako nowy substytut komórek matczynych, EV zostały zastosowane w immunoterapii i medycynie regeneracyjnej z badaniami in vivo, które służą jako podstawa dla trwających badań przedklinicznych i uzupełniających badań klinicznych⁷.

Jednak obecnie, większość badań nad skutecznością transplantacji BM-MSCs i ich pochodnych EV nadal pozostaje na poziomie małych zwierząt, co nie wystarcza do dostarczenia niezbędnych dowodów do klinicznego tłumaczenia. W związku z tym niezwykle pilne jest przeprowadzenie badań przedklinicznych nad przeszczepianiem BM-MSC i pochodnych EV na poziomie dużych zwierząt, takich jak trzoda chlewna.

Doniesiono, że MSCs są obecne w szpiku kostnym w bardzo małych ilościach, stanowiąc tylko 0,01% do 0,001% wszystkich komórek⁸. Jednak przedkliniczne podawanie BM-MSC wymaga dużej liczby komórek (≥10⁷ na zwierzę)⁹; wymagana ilość EV jest jeszcze większa, której mediana dawki wynosi 0,25 mg białka na kilogram masy ciała u świń¹⁰. Aby osiągnąć tak dużą liczbę, istnieje pilna potrzeba opracowania bezpiecznej i skutecznej metody izolowania i hodowli MSCs ze szpiku kostnego świń w celu osiągnięcia ich ogromnej ekspansji in vitro, a następnie pozyskania ich EV o wysokim stężeniu białka.

Do tej pory istnieją różne metody izolowania BM-MSC i ich pochodnych EV. Obecne metody izolacji BM-MSC obejmują bezpośrednie sadzenie komórek szpiku kostnego (BMC)¹¹, wirowanie w gradiencie gęstości, sortowanie etykiet molekularnych na powierzchni komórek oraz badania przesiewowe cytometrii przepływowej. Doniesiono, że sortowanie etykiet molekularnych na powierzchni komórki i badanie przesiewowe cytometrii przepływowej powodują zmniejszenie wskaźnika adhezji komórek, wzrost śmiertelności w ciągu 24 godzin i zahamowanie proliferacji¹², podczas gdy bezpośrednia hodowla BMC może skutkować dużą liczbą mieszanych komórek krwiotwórczych. Dlatego wirowanie w gradiencie gęstości jest obecnie powszechnie stosowane do otrzymywania BM-MSC. Obecne metody izolowania EV od supernatantów komórkowych obejmują ultrawirowanie, ultrafiltrację, wytrącanie polimerów i wykluczanie rozmiaru¹³. W porównaniu z innymi metodami, ultrawirowanie ma tę zaletę, że jest niskokosztowa, łatwa w użyciu i kompatybilna z przygotowaniem dużych objętości bez skomplikowanej obróbki wstępnej, co było "złotym standardem" separacji EV¹⁴. Jednak podczas tego procesu istnieje duża niejednorodność w odczynnikach i technikach w różnych laboratoriach^3,15, co może być mylące dla czytelników. W artykule szczegółowo wyjaśniono szereg sekwencyjnych etapów izolacji pBM-MSC i pochodzących z nich EV, a późniejsze wyniki identyfikacji dowodzą, że metoda ta jest wykonalna w celu uzyskania pBM-MSC i ich EV do dalszej analizy w badaniach przedklinicznych. Mamy nadzieję, że ta systematyczna praca może stanowić podstawę metodologiczną dla badaczy zajmujących się przedkliniczną oceną transplantacji pBM-MSC i ich pochodnych EV, tak aby można było jak najszybciej przeprowadzić badania kliniczne.

Protokół

Zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych wydanym przez National Institutes of Health, USA, wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), Szpital Fuwai, Chińska Akademia Nauk Medycznych.

1. Przygotowanie przedoperacyjne dla zwierząt

1. Dorosłe samce chińskich świnek miniaturowych (30 ± 5 kg) w wieku około 12 miesięcy należy pozyskać z Instytutu Zoologii Chińskiej Akademii Nauk i umieścić je w obiektach Centrum Doświadczalnego dla Zwierząt Szpitala Fuwai z co najmniej 2-tygodniowym wyprzedzeniem. Przeprowadzaj kontrole przedoperacyjne, takie jak rutynowe badania krwi, aby upewnić się, że zwierzęta są zdrowe.
2. Oczyść i ogol skórę w okolicy ud świnki miniaturowej dzień przed operacją. Aby uniknąć aspiracji, należy pościć świnkę miniaturową przez 12 godzin przed ekstrakcją szpiku kostnego.

2. Przygotowanie do izolacji i hodowli komórek

1. Użyj Percollu (1.130 g/ml) do wyizolowania mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego. Wymieszać roztwór podstawowy z 10x stężonym PBS w stosunku 9:1, aby uzyskać podłoże izotoniczne. Następnie wymieszać pożywkę izotoniczną z PBS w stosunku 3:2, aby uzyskać 60% roztwór perkolu (1,077 g/ml), który można użyć jako końcowy roztwór separujący do wyizolowania pBM-MSC.
2. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1,0% penicyliną-streptomycyną, aby uzyskać kompletną pożywkę. Podgrzewać całe podłoże i PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu późniejszej hodowli komórek.

3. Znieczulenie zwierząt

1. Znieczulenie ogólne z ketaminą (10 mg/kg) i ksylazyną (2 mg/kg) należy podać domięśniowo. Szybko przeprowadź intubację dotchawiczą, gdy świnka miniaturowa ma powolny oddech i mniejszą aktywność kończyn, i zachowaj spontaniczne oddychanie, aby zapobiec nieudanej intubacji.
2. Przeprowadzić podtrzymanie znieczulenia poprzez wdychanie 2% izofluranu, z tlenem (1,5 l/min) jako gazem nośnym. Podczas znieczulenia monitoruj tętno, oddychanie i nasycenie krwi tlenem miniświnki w czasie rzeczywistym.

4. Pobieranie szpiku kostnego od świni miniaturowej

1. Umieść minipig w pozycji bocznej. Aby zapewnić wystarczającą ilość szpiku kostnego do późniejszej hodowli komórek, zlokalizuj punkt nakłucia szpiku kostnego w bliższej części kości udowej świni miniaturowej (Rysunek 1). Zdezynfekuj i ułóż skórę w miejscu nakłucia przed zastosowaniem operacji.
2. Zaciśnij skórę wokół miejsca nakłucia ręką niedominującą i przebij igłę do biopsji szpiku kostnego pionowo w punkcie, w którym znajduje się ręka dominująca. Gdy wyczujesz, że igła styka się z kością korową, delikatnie obracaj uchwyt w lewo i w prawo, aby wywiercić igłę. Kiedy igła wchodzi do jamy szpiku kostnego, często pojawia się uczucie utraty oporu.
3. Po wkłuciu należy wyjąć igłę rdzeniową. Następnie przymocuj jednorazową sterylną strzykawkę o pojemności 50 ml do końca zewnętrznej igły i wcześniej przepłucz wewnętrzną ściankę strzykawki heparyną.
4. Powoli wyekstrahuj 20 ml szpiku kostnego i ostrożnie przenieś je do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Po zakończeniu procedury wyciągnij igłę i zdejmij serwetkę. Zdezynfekuj miejsce nakłucia i dociskaj je przez 20 minut w celu hemostazy.
6. Ekstubować miniświnkę po przywróceniu spontanicznego oddychania. Kiedy jest w pełni obudzony ze swobodnym ruchem kończyn, włóż miniświnkę z powrotem do klatki, aby kontynuować karmienie.

5. Izolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego

1. Dodaj równą objętość podgrzanego PBS do szpiku kostnego i dokładnie je wymieszaj. Następnie za pomocą sterylnej pipety ostrożnie przenieść 20 ml rozcieńczonego szpiku kostnego powyżej 60% poziomu gradientu gęstości roztworu w stosunku objętościowym 1:1 do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
2. Odwirować probówkę przy 600 x g (przyspieszenie (ACC) = 5, opóźnienie (DEC) = 5) przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: Po odwirowaniu w probówce powstają cztery fazy, w tym faza surowicy, faza komórki jednojądrzastej, faza pożywki gradientu gęstości i faza wytrącania od góry do dołu. Faza komórkowa jednojądrzasta jest cienką warstwą kłaczkowatą między surowicą a podłożem o gradiencie gęstości. W tej fazie znajdują się mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego.
3. Pobrać jednojądrzastą fazę komórkową do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i przemyć dwukrotnie PBS w stężeniu 800 x g przez 5 minut.
4. Ponownie zawiesić umyte komórki w 2 ml kompletnej pożywki i umieścić zawieszone komórki w kolbie hodowlanej o średnicy 175 cm2 komórek o gęstości 3-5 x 10⁵/ml.
   UWAGA: Wszystkie powyższe procedury izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych można zobaczyć w Rysunek 2.

6. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro

1. Inkubować kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C w nasyconej, wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO_{2 .} Delikatnie wstrząsać kolbą hodowlaną co 24 godziny, aby zapobiec przylegającemu wzrostowi wytrąconych krwiotwórczych komórek macierzystych i obserwować wzrost, morfologię i zanieczyszczenie komórek pod mikroskopem.
2. Pożywkę hodowlaną należy wymienić po raz pierwszy po 3 dniach, a następnie zmieniać pożywkę co 2-3 dni. Gdy kolonie komórkowe osiągną 80%-90% konfluencji, subkulturuj komórki w stosunku 1: 2.

7. Adidogenne, osteogenne i chondrogenne różnicowanie pBM-MSCs

1. Test różnicowania adipogennego
   1. Przygotować pożywkę do różnicowania adipogennego A (Medium A) i B (Medium B) dla BM-MSC zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Szczegółowe informacje na temat zestawu można znaleźć w Tabeli Materiałów.
   2. Dodaj 1 ml 0,1% żelatyny do płytki sześciodołkowej i delikatnie wstrząśnij, aby równomiernie pokryła dno każdej studzienki. Następnie umieścić sześciodołkową płytkę w czystej ławce lub inkubatorze CO₂ na co najmniej 30 minut.
   3. Po 30 minutach odessać żelatynę i dodać 2 ml ogólnej kompletnej pożywki do każdej studzienki. Następnie umieść pBM-MSC na płytce sześciodołkowej o gęstości komórek 2 x 10⁴ komórek/cm². Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotności nasyconej 5% CO_{2 .}
   4. Gdy komórki osiągną 100% zbieżności, ostrożnie usuń całe podłoże i dodaj 2 ml pożywki A do każdego dołka płytki. Po 3 dniach usuń pożywkę A z płytki i dodaj 2 ml pożywki B do każdej studzienki.
   5. Po utrzymaniu przez 1 dzień usuń pożywkę B i zastąp ją pożywką A do indukcji. Zgodnie ze sposobem "Medium A przez 3 dni, Medium B przez 1 dzień", użyj kolejno Medium A i B do indukcji.
   6. Obserwuj stan komórki każdego dnia w tym okresie. Jeśli komórki kurczą się lub umierają podczas procesu indukcji pożywki A, zastąp ją pożywką B na czas, aż stan komórki się poprawi.
   7. Powtórzyć proces indukcji i konserwacji i przygotować się do barwienia, gdy pod mikroskopem zaobserwuje się wystarczającą ilość kropelek lipidów o odpowiedniej wielkości.
   8. Usuń pożywkę do różnicowania adipogennego z płytki sześciodołkowej i delikatnie przemyj 1x PBS. Dodaj 2 ml 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i utrwalaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Usuń utrwalacz paraformaldehydu i przemyj 1x PBS dwa lub trzy razy, aby upewnić się, że utrwalacz został dokładnie usunięty. Dodaj 2 ml barwnika Oil Red O do każdej studzienki i bejcuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   10. Usuń barwnik Oil Red O i umyj 1x PBS dwa lub trzy razy. Dodaj 2 ml 1x PBS do każdej studzienki, a następnie obserwuj efekt różnicowania adipogennego pod mikroskopem.
2. Test różnicowania osteogennego
   1. Przygotuj kompletną pożywkę do różnicowania osteogennego zgodnie z instrukcją zestawu.
   2. Wykonaj kroki 7.1.2-7.1.3, aby zainstalować i wyhodować pBM-MSC.
   3. Gdy komórki osiągną 70% zbieżności, ostrożnie usuń ogólne kompletne podłoże i dodaj 2 ml pożywki do różnicowania osteogennego do każdego dołka płytki.
   4. Zmieniaj pożywkę na nową pożywkę do różnicowania osteogennego co 3 dni. Kontynuuj indukcję przez 2-4 tygodnie i przygotuj się do barwienia czerwonym barwnikiem Alizarin, gdy podczas osteogenezy pojawią się oczywiste guzki wapnia.
   5. Usuń pożywkę do różnicowania osteogennego z płytki sześciodołkowej i delikatnie przemyj 1x PBS. Dodaj 2 ml 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i utrwalaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Usuń utrwalacz paraformaldehydu i przemyj 1x PBS dwa lub trzy razy, aby upewnić się, że utrwalacz został dokładnie wyczyszczony. Dodaj 2 ml czerwonego barwnika Alizarin do każdej studzienki i barwij przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Usuń barwnik Alizarin Red i umyj 1x PBS dwa lub trzy razy. Dodaj 2 ml 1x PBS do każdej studzienki, a następnie obserwuj efekt różnicowania osteogennego pod mikroskopem.
3. Test różnicowania chondrogennego
   1. Przygotuj premiks do różnicowania chondrogennego zgodnie z instrukcją zestawu.
   2. Przenieś 3-4 x 10⁵ pBM-MSC do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 4 minuty w temperaturze 20 °C.
   3. Usunąć supernatant i dodać 0,5 ml premiksu w celu ponownego zawieszenia osadu otrzymanego przez odwirowanie w poprzednim etapie, a następnie odwirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Powtórzyć ten krok, aby ponownie umyć komórki.
   4. Przygotować kompletną pożywkę do różnicowania chondrogennego.
   5. Zawiesić komórkę otrzymaną w poprzednim etapie za pomocą 0,5 ml kompletnej pożywki i odwirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
   6. Odkręć nakrętkę rurki wirówki, aby ułatwić wymianę gazową. Umieść go pionowo w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności nasyconej.
   7. Gdy komórki wydają się agregować (zwykle po 24-48 godzinach, w zależności od rzeczywistej sytuacji), przesuń dolną część probówki wirówkowej, aby kulki chrząstki oderwały się od dna i zawiesiły w pożywce.
   8. Zmieniaj pożywkę na świeżą, kompletną do różnicowania chondrogennego co 2-3 dni. Kontynuuj indukcję, aż w rurce uformują się kulki chrząstki o średnicy 1,5-2 mm, a następnie przygotuj skrawki do barwienia.
   9. Przygotuj skrawki parafinowe kulek chrząstki zgodnie z rutynowymi etapami eksperymentów patologicznych. Dodać niebieski barwnik Alicia do odwoskowanych fragmentów i bejcować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   10. Opłucz szkiełko bieżącą wodą przez 5 minut, a następnie po wyschnięciu obserwuj efekt barwienia Alicia blue pod mikroskopem.

8. Identyfikacja fenotypu komórki za pomocą cytometrii przepływowej

1. Gdy kolonie komórkowe osiągną 80%-90% konfluencji w pasażach 3-5, usuń pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyj komórki podgrzanym PBS. Następnie trawić komórki za pomocą 3-4 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować je w temperaturze 37 °C w nasyconej wilgotnej atmosferze 5% CO₂ przez 2-3 minuty, aż zostaną odłączone od dna kolby pod mikroskopem.
2. Zebrać komórki za pomocą 10 ml kompletnej pożywki i przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przemyć komórki PBS o temperaturze 4 °C.
3. Zawiesić komórki na 10 ml przy 4 °C PBS. Zawiesina komórek jest podzielona na dziewięć grup o objętości 1 ml w każdej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, nazwanych kontrolą ujemną, kontrolą izotypu FITC, kontrolą izotypu PE, kontrolą izotypu APC, odpowiednio grupą CD105, CD29, CD90, CD14 i CD45. Upewnij się, że liczba komórek w każdej mikroprobówce wynosi od 1 x 10⁵ do 1 x 10⁶.
4. Odwirować zawiesinę o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w każdej mikroprobówce za pomocą 100 μl PBS o temperaturze 4 °C. Z wyjątkiem ujemnej grupy kontrolnej, dodać 5 μl odpowiedniej kontroli izotypu (FITC, PE i kontrola izotypu myszy IgG1 kappa) i przeciwciał (przeciwciało monoklonalne CD105, CD29, CD90, CD14 i CD45) do cytometrii przepływowej do każdej mikroprobówki zgodnie z kolejnością w kroku 8.3. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C w ciemności.
5. Dodać 1 ml PBS o temperaturze 4 °C do każdej mikroprobówki i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i dodać 200 μl PBS o temperaturze 4 °C w celu ponownego zawieszenia komórek.
6. Przetestuj co najmniej 10 000 komórek na cytometrii przepływowej po przefiltrowaniu zawiesiny komórkowej¹⁶ i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej.

9. Izolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń

1. Gdy konfluencja pBM-MSCs osiągnie 80%-90%, wyrzuć supernatant i przemyj komórki PBS 2x. Następnie dodać 25 ml IMDM bez surowicy do każdej kolby hodowlanej i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO_{2 przez} 48 godzin.
2. Zebrać supernatant komórek (kondycjonowane podłoże, CM) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
3. Ponownie zebrać supernatant do innej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przeprowadzić izolację EV tak szybko, jak to możliwe po pobraniu supernatantu. W przypadku długotrwałego przechowywania supernatant należy przechowywać w lodówce w temperaturze -80 °C, aby zapobiec utracie EV.
4. Odwirować supernatant zgodnie z krokiem 9.3 przy 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
5. Przenieść supernatant do sterylnej probówki używanej do wirówki szybkoobrotowej i odwirować przy 16 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
6. Przenieść sklarowany osad ponownie do probówki ultrawirówki i wirować przy stężeniu 120 000 x g przez co najmniej 70 minut w temperaturze 4 °C, z wirnikiem o stałym kącie nachylenia.
7. Całkowicie odrzucić supernatant. Dodać 1 ml PBS o temperaturze 4 °C do każdej probówki ultrawirówki i ponownie zawiesić osad za pomocą mikropipety. Wymieszać roztwór z tej samej grupy w probówce ultrawirówkowej, a następnie dodać 4 °C PBS, aby objętość była większa niż 3/4 probówki.
8. Wirować przy 120 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant w jak największym stopniu.
9. Ponownie zawiesić środek strącający sterylnym PBS i przechowywać EV w lodówce o temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Ilość PBS do ponownego wymieszania można określić jako 100 μl dla wytrącania z każdych dwóch kolb hodowlanych^{o długości 175 cm2}. Wszystkie powyższe kroki izolowania EV są systematycznie pokazane w Rysunek 3.

10. Identyfikacja EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i western blotting

1. Umieść próbkę EVs na lodzie po rozmrożeniu w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C, a następnie rozcieńcz do połowy poprzedniego stężenia za pomocą PBS w celu wykrycia NTA¹⁷.
2. Odpipetować 10 μl próbki na siatce miedzianej, pozostawić na 1 minutę i wchłonąć pływającą ciecz za pomocą bibuły filtracyjnej. Następnie dodaj 10 μl kwasu fosfatungstycznego do siatki miedzianej, odstaw na 1 minutę i wchłoń nadmiar płynu.
3. Po wysuszeniu przez kilka minut w RT wykonaj obrazowanie mikroskopią elektronową w warunkach napięcia przyspieszającego 100 KV¹⁸.
4. Zawiesić próbkę EVs z kroku 9.9 w buforze do lizy RIPA (25 mM Tris·HCl (pH 7,6), 150 mM chlorek sodu [NaCl], 1% nonyl-fenoksyetoksyetanol (NP-40), 1% deoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS), 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF), 1x inhibitor proteazy) i wykryć ekspresję specyficznych markerów dla EV, takich jak Alix, TSG101, CD81 i CD63 przez western blotting¹⁹.

Wyniki

Ustanowienie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świni
Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego świni zostały z powodzeniem wyizolowane i wyhodowane in vitro, a morfologię pBM-MSC w różnych dniach można zobaczyć w Ryc. 4. W pierwotnej hodowli pBM-MSCs obserwacja mikroskopowa wykazała, że przyleganie komórek nastąpiło dzień po posadzeniu, a przylegające komórki miały zwykle okrągły kształt. Pierwotne pBM-MSCs na ogół pozostawały w fazie spoczynku przez 3 dni po posadzeniu, a proliferacja komórek rozpoczęła się^{4 dnia.} Po proliferacji morfologia komórki zmieniła się z okrągłej na wrzecionowatą, wieloboczną lub gwiaździstą, a jądra są centralne, z podwójnymi jąderkami w niektórych komórkach. Kolonie komórkowe powstawały 7-9 dni po rozpoczęciu proliferacji komórek, a 80%-90% konfluencji komórek można było osiągnąć po 12-14 dniach. Obserwacja mikroskopowa wykazała, że przylegające komórki rosły jako rozproszone kolonie i były ułożone w wirujący wzór.

Proliferacja komórek została znacznie przyspieszona po pasażowaniu, a 80%-90% konfluencji można było osiągnąć w ciągu tygodnia. Morfologia komórek była jednorodna wrzecionowata od drugiego przejścia, przypominająca fibroblasty, ze stosunkiem długości do szerokości około 2-3:1. Gdyby komórki były zróżnicowane, mogłyby wydawać się wielokątne lub w kształcie gwiazdy. Po pasażowaniu komórki nie rosły już jako rozproszone kolonie, ale równomiernie i promieniście w układzie równoległym.

Identyfikacja potencjału różnicowania komórek przez barwienie
W teście różnicowania adipogennego barwienie czerwienią olejową O wykazało, że wokół jądra pojawiły się okrągłe pomarańczowo-czerwone kropelki lipidów o różnych rozmiarach (Rysunek 5A); W teście różnicowania osteogennego barwienie czerwienią alizaryny wykazało czerwone guzki na powierzchni komórki (Figura 5B), co było spowodowane reakcją barwną z solami wapnia zdeponowanymi przez osteoblasty zróżnicowane z pBM-MSCs. W teście różnicowania chondrogennego barwienie niebieskim Alicia wykazało, że cały wycinek tkanki był niebieski (Rysunek 5C), co było spowodowane barwieniem endo-kwaśnego mukopolisacharydu w kulkach chrzęstnych.

Identyfikacja fenotypu komórki za pomocą cytometrii przepływowej
Przeprowadzono testy markerów powierzchniowych komórek w celu stworzenia fenotypu pBM-MSC. Z wyników cytometrii przepływowej (Rysunek 6) trzy dodatnie markery, takie jak CD105, CD29 i CD90, uległy znaczącej ekspresji na powierzchni pBM-MSC, stanowiąc odpowiednio 96,5%, 99,8% i 92% (Figura 6A-C). Jednak ekspresja CD14 i CD45 była ujemna ( Rysunek 6D, E). Tymczasem wyniki odpowiednich kontroli izotypów były negatywne, co zostało już nałożone na rysunek, wykluczając możliwość nieswoistego wiązania przeciwciał.

Identyfikacja EV pochodzących z pBM-MSC przez NTA, TEM i western blotting
Wynik NTA wykazał, że mediana wielkości cząstek wynosiła 126,9 nm, co mieściło się w zakresie EVs; poza tym pierwotne stężenie próbki EVs wynosiło 1,5 x^{10 10} cząstek/ml, a dokładną wartość przypisaną do rozmiaru można znaleźć w Rysunek 7A. Wykres trajektorii cząstek jest pokazany w Rysunek 7B, co ilustruje, że cząstki poruszały się w nieregularnym ruchu Browna. Co więcej, pęcherzyk dyskoidalny, jako klasyczna struktura EV, można było wyraźnie zobaczyć pod mikroskopem elektronowym przy powiększeniach 50 000x (Rysunek 7C). Ponadto ekspresję specyficznych markerów dla EV, takich jak Alix, TSG101, CD81 i CD63, wykryto w próbce za pomocą western blotting (Rysunek 7D).

Rysunek 1: Punkt nakłucia szpiku kostnego miniświnki. Czerwony obszar pokazuje punkt nakłucia ekstrakcji szpiku kostnego, znajdujący się w bliższej części kości udowej świnki miniaturowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Izolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego świni. Proces izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego świni przedstawiono na schemacie blokowym, a cztery fazy ciekłe są wyraźnie zilustrowane po odwirowaniu w gradieniu gęstości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Izolowanie EV pochodzących z pBM-MSC. Schemat ideowy przedstawia konkretne kroki w celu odizolowania pojazdów elektrycznych od kondycjonowanego podłoża za pomocą ultrawirowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Cechy morfologiczne pBM-MSC w różnych dniach. Podobne cechy morfologiczne pBM-MSC można zaobserwować w 3., 5., 7. i 9^{. dniu po} posadzeniu w 100-krotnym polu mikroskopowym, a kolonie komórkowe powstały w 9^{. dniu.} Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Identyfikacja potencjału różnicowania pBM-MSCs poprzez barwienie. (A) odpowiednio adipogenny, (B) osteogenny i (C) chondrogeninowy test różnicowania pBM-MSC. Potencjał różnicowania pBM-MSCs można określić na podstawie tych wyników barwienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wyniki identyfikacji pBM-MSC za pomocą cytometrii przepływowej. CD105, CD29 i CD90 ulegają znaczącej ekspresji na powierzchni pBM-MSC, stanowiąc odpowiednio 96,5%, 99,8% i 92,0%, podczas gdy ekspresja CD14 i CD45 jest ujemna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Wyniki identyfikacji EV pochodzących z pBM-MSC według morfologii i biologii molekularnej. (A) wynik NTA EV pochodzących z pBM-MSCs, odpowiednio z wykresem rozkładu wielkości cząstek i (B) wykresem trajektorii cząstek; (C) Zdjęcie TEM wykonane w powiększeniach 50 000x, a biała strzałka pokazuje klasyczną strukturę pęcherzyków dyskoidalnych. (D) Ekspresja specyficznych markerów dla EV przez western blot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Tradycyjny punkt nakłucia szpiku kostnego u świnek miniaturowych umieszczono w grzebieniu biodrowym²⁰. Chociaż łatwo jest go zlokalizować, ilość ekstrakcji szpiku kostnego jest ograniczona²¹ (ogólnie tylko około 5 ml), więc trudno jest spełnić wymóg dużej liczby ekspansji in vitro do przeszczepu in vivo. W tej metodzie przenieśliśmy punkt nakłucia szpiku kostnego na proksymalną część kości udowej i z tego miejsca można pobrać co najmniej 20 ml szpiku kostnego, gwarantując wystarczającą ilość pBM-MSCs do późniejszej hodowli komórek.

Dwa główne roztwory separacyjne stosowane do izolowania BM-MSC za pomocą wirowania w gradiacji gęstości to Percoll i Ficoll. Percoll składa się z silikonowanego poliwinylopirolidonu (PVP), który jest nowatorskim nietoksycznym i niedrażniącym środkiem odśrodkowym oddzielającym o gradiencie gęstości. Niska stała dyfuzji Percollu skutkuje stosunkowo stabilnym gradientem gęstości; W związku z tym zadowalającą separację komórek można zwykle osiągnąć w ciągu kilkudziesięciu minut przy niskich siłach odśrodkowych (200-1000 x g). Metoda izolacji pBM-MSCs za pomocą Ficoll została opisana wcześniej²¹. W porównaniu z Ficollem, Percoll był stopniowo stosowany ze względu na jego zalety łatwej izooperatowności, niskiej lepkości, nietoksyczności i niepowodowania agregacji komórek, co może uzupełniać istniejące metody izolacji pBM-MSC.

Podczas izolowania i hodowli pBM-MSC nie można pominąć niektórych krytycznych etapów. Po pierwsze, skuteczna stratyfikacja różnych faz ciekłych po odwirowaniu w gradifikacji gęstości jest kluczem do wyizolowania oczyszczonych pBM-MSC. BM-MSC, jako rodzaj komórek jednojądrzastych szpiku kostnego (BM-MNC), mają ciężar właściwy podobny do limfocytów i monocytów, około 1,075 g/ml. Pierwotna gęstość Percollu wynosi 1.130 g/ml, a aby pomyślnie uzyskać warstwę komórkową zawierającą BM-MSC po odwirowaniu w gradimencie gęstości, należy wcześniej skonfigurować 60% roztwór do separacji gradientu gęstości izotonicznej (1.077 g / ml) zgodnie z zależnością gęstości Percolla^{- stężenie 22}. Co więcej, odpowiednie warunki wirowania również przyczyniają się do pomyślnej stratyfikacji. Biorąc pod uwagę niską stałą dyfuzji Percollu, odwirowaliśmy wyekstrahowany szpik kostny przy 600 x g przez 20 minut przy stosunkowo niskich poziomach przyspieszenia/opóźnienia (ACC = 5, DEC = 5), co pozwoliło uzyskać dobry efekt stratyfikacji. Po drugie, odpowiednia gęstość sadzenia jest również niezbędna dla hodowli komórkowych. W celu pozyskania wystarczającej liczby MSCs (zwykle więcej niż 10⁷ na zwierzę⁹) do późniejszego przeszczepienia, używamy kolb hodowlanych o powierzchni 175^cm2 do hodowli komórkowych. W poprzednim badaniu²⁰ uzyskane BM-MNC były zwykle sadzone w kolbach hodowlanych do uprawy o gęstości 5 x 10⁵/^cm2. Doniesiono, że po odwirowaniu w gradiencie gęstości można uzyskać 2-3 x 10⁷ BM-MNC na każde 5 ml szpiku kostnego^{świni 23}. Dlatego w tym protokole zalecamy umieszczenie całkowitych BM-MNC wyizolowanych z każdego 20 ml szpiku kostnego świni w kolbie hodowlanej o długości 175^cm2 w celu uzyskania odpowiedniej gęstości. Po trzecie, należy unikać zanieczyszczeń podczas izolacji i hodowli pBM-MSC. Podczas pobierania jednojądrzastej fazy komórkowej pipeta nie powinna być wkładana do fazy Percoll, aby nie zmieszać się z cieczą oddzielającą. Ponadto po 24 godzinach od posadzenia komórek kolbę hodowlaną należy delikatnie wstrząsnąć, aby zmniejszyć przyleganie czerwonych krwinek.

Podczas procesu ultrawirowania wysoki poziom zanieczyszczenia agregatami białkowymi i lipoproteinami za pomocą tej metody nieuchronnie zagraża kwantyfikacji i analizie funkcjonalnej EV¹⁴. W celu maksymalnego zmniejszenia zanieczyszczenia w procesie, głębokość cieczy na dnie powinna być zachowana za każdym razem na głębokości 5 mm podczas przenoszenia supernatantu przed etapem ultrawirowania. Tymczasem, po pierwszym ultrawirowaniu, ponowne zawieszenie granulatu w sterylnym PBS, a następnie ponowne wykonanie ultrawirowania może skutecznie zmniejszyć zanieczyszczenie lipoproteinami.

Chociaż wirowanie w gradiencie gęstości i ultrawirowanie są szeroko stosowane odpowiednio w izolowaniu BM-MSC i ich pochodnych EV, te dwie techniki mają również swoje ograniczenia. Z jednej strony, technika Percoll jest długotrwała i kłopotliwa, a uzyskanie próbki koncentratu BM za pomocą przyłóżkowego urządzenia do zatężania komórek zostało zgłoszone jako alternatywna metoda izolacji^{MSCs 24}. Z drugiej strony metoda ultrawirowania wymaga nie tylko wysoko wykwalifikowanych techników, ale także drogiego sprzętu; w związku z tym łączne zastosowanie dwóch lub więcej technik może stanowić rozsądną strategię dla skuteczniejszej izolacji pojazdów elektrycznych²⁵. Poza tym poprawy wymaga również identyfikacja pBM-MSC i pochodnych pojazdów elektrycznych. Na przykład, zgodnie z międzynarodowymi kryteriami definiowania MSCs²⁶, ekspresja niektórych pozytywnych lub ujemnych markerów, takich jak CD73, CD34 i HLA-DR, nadal nie jest obecna w wynikach identyfikacji fenotypów BM-MSC za pomocą cytometrii przepływowej w tym badaniu. Ponadto, mimo że podjęto środki w celu uniknięcia zanieczyszczenia podczas procesu izolacji pojazdów elektrycznych, ze względu na ograniczenia naszego laboratorium, nie jesteśmy w stanie ocenić czystości próbki pojazdów elektrycznych, aby usprawnić dalsze prace.

W badaniu tym połączono metody sekwencyjnej izolacji pBM-MSCs i ich pochodnych EV, co zostało systematycznie udowodnione późniejszymi wynikami identyfikacji. W szczególności podkreśliliśmy kluczowe operacje w tej serii kroków, wyjaśniając pewne specyficzne warunki eksperymentalne, które mogą do pewnego stopnia rozwiązać problem heterogeniczności występującej w różnych laboratoriach podczas tego procesu. Ta metodyczna praca może być szeroko stosowana w badaniach przedklinicznych nad skutecznością przeszczepiania BM-MSC i ich pochodnych EV, co może stanowić podstawę eksperymentalną o wystarczającym poziomie dla badań klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
175 cm2 kolba do hodowli komórkowych	Thermo Fisher	159910	używana do hodowli komórkowych
0,25% Trypsyna/EDTA	Thermo Fisher	25200056	stosowany do trawienia komórek
Zestaw do różnicowania adipogennego dla szpiku kostnego Mezenchymalne komórki macierzyste	OriCell	GUXMX-90031	stosowany do oznaczania różnicowania adipogennego
Alix Przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher	MA1-83977	używane do identyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Ev) za pomocą western blotting
APC Mouse IgG1 kappa Isotype Control	Thermo Fisher	17-4714-42	stosowany do eliminowania skutków niespecyficznego barwienia w cytometrii przepływowej
CD105 (Endoglin) Przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher	17-1057-42	służy do identyfikacji pBM-MSC metodą cytometrii przepływowej
CD14 Przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher	MA1-82074	służy do identyfikacji pBM-MSC metodą cytometrii przepływowej
CD29/IGTB1 Przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher	MA1-19458	służy do identyfikacji pBM-MSC za pomocą cytometrii przepływowej
CD45 Przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher	MA5-28383	służy do identyfikacji pBM-MSC za pomocą cytometrii przepływowej
Przeciwciało monoklonalne CD63	Thermo Fisher	10628D	używane do identyfikacji EV metodą western blott
Przeciwciało monoklonalne CD81	Thermo Fisher	MA5-13548	używane do identyfikacji EV metodą western blott
CD90 Przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher	A15794	używane do identyfikacji pBM-MSC metodą cytometrii przepływowej
Zestaw do różnicowania chondrogennego dla szpiku kostnego Mezenchymalne komórki macierzyste	OriCell	GUXMX-90041	używany do oznaczania różnicowania chondrogennego
Surowica bydlęca	płodu Gibco	10099141C	służy do przygotowania kompletnego podłoża
FITC Mysz IgG1 kappa Isotype Control	Thermo Fisher	11-4714-42	stosowany do eliminacji skutków niespecyficznego barwienia w cytometrii przepływowej
Cytometria przepływowa	BD	Accuri C6	stosowana do identyfikacji fenotypu komórki
Oprogramowanie FlowJo	BD	V10	używane do analizy danych z cytometrii przepływowej
Probówka wirówkowa o dużej prędkości (50 ml)	Beckman	357003	używany do szybkiego wirowania
Zmodyfikowany Ilbecco's Medium	Gibco	firmy Iscove C12440500BT	używany do hodowli komórkowych
Niskotemperaturowa szybkoobrotowa wirówka podłogowa	Avanti	J-26XPI	stosowany do szybkiego wirowania w celu uzyskania czystego, kondycjonowanego podłoża
Nonyl fenoksyetoksyetanol (NP-40)	Sigma-Aldrich	NP40S	stosowany do składu buforu do lizy RIPA
Zestaw do różnicowania osteogennego do szpiku kostnego Mezenchymalne komórki macierzyste	OriCell	GUXMX-90021	używany do testu różnicowania osteogennego
PE Mysz IgG1 kappa Kontrola izotypu	Thermo Fisher	12-4714-42	stosowany w celu wyeliminowania skutków niespecyficznego barwienia w cytometrii przepływowej
Percoll	Cytiva	17089102	stosowany do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego świń (pBM-MSCs)
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)	Thermo Scientific	36978	stosowany do składu buforu do lizy RIPA
buforowana fosforanem (10x)	Beyotime	ST476	używany do przygotowania izotonicznego Percollu roztwór
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)	Cytiva	AF29561133	stosowany do rozcieńczania Percollu i przemywania komórek
Inhibitor proteazy (1x)	Thermo Scientific	A32955	stosowany do składu buforu do lizy RIPA
chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9888	stosowany do składu buforu do lizy RIPA
deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750	stosowany do składu buforu do lizy RIPA
dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	używany do składu buforu do lizy RIPA
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	Hitachi	HT7700	używany do obrazowania mikroskopii elektronowej
Tris· HCl	Sigma-Aldrich	93363	używany do składu buforu do lizy RIPA
TSG101 Przeciwciało monoklonalne	Thermo Fisher	MA1-23296	używany do identyfikacji EV za pomocą western blotting
Ultrawirówka (typ 50.2 Ti Rotor)	Beckman	optima L-100XP	używana do ultrawirowania w celu wyizolowania egzosomów
Probówka do ultrawirówki (26,3 ml)	Beckman	355654	używana do ultrawirowanie
ZetaVIEW	Particle Metrix	S/N 17-310	używane do analizy śledzenia nanocząstek