Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

DOI:

10.3791/63787

⸱

5 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Guangzhou First People’s Hospital, School of Medicine, South China University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trwające badanie kliniczne, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), jest pierwszym badaniem przesiewowym w populacji ogólnej w kierunku cukrzycy typu 1 (T1D) i celiakii w Stanach Zjednoczonych. W związku z pandemią choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) pilnie potrzebna jest epidemiologia COVID-19 w populacji ogólnej oraz wiedza na temat związku między zakażeniem COVID-19 a rozwojem cukrzycy typu 1. Obecnie standardowa metoda przesiewowa testu wiązania promieniotwórczego (RBA) sprostała dwóm wielkim wyzwaniom: niskiej skuteczności przy pojedynczym formacie testu i niskiej swoistości choroby przy dużym odsetku przeciwciał o niskim powinowactwie generowanych podczas badań przesiewowych. Dzięki opracowanej wcześniej platformie multipleksowego testu elektrochemiluminescencji (ECL), opracowano nowatorski test ECL 6-Plex, który łączy w jednym dołku wszystkie cztery autoprzeciwciała wysp trzustkowych (IAb) przeciwko insulinie, dekarboksylazie kwasu glutaminowego (GAD65), antygenowi insulinoma 2 (IA-2) i transporterowi 8 (ZnT8) dla T1D, autoprzeciwciałom przeciwko transglutaminazie (TGA) w przypadku celiakii i przeciwciałom przeciwko koronawirusowi zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) wiążącemu receptor (RBD) dla COVID-19. Test został zwalidowany w ślepej próbie przy użyciu 880 próbek z badania ASK, w tym 325 próbek dodatnich i 555 próbek wszystkich ujemnych pod względem przeciwciał, i porównany ze standardowymi RBA i pojedynczym testem ECL. Dzięki zaletom wysokiej skuteczności, niskiego kosztu i małej objętości surowicy, test ten został zaakceptowany jako podstawowe narzędzie przesiewowe w badaniu ASK.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duże badania epidemiologiczne na całym świecie pokazują, że częstość występowania cukrzycy typu 1 (T1D) gwałtownie wzrasta o 3%-5% rocznie, a częstość występowania cukrzycy typu 1 podwoiła się w ciągu ostatnich 20 lat, szczególnie u małych dzieci1,2. Autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym (IAb) zwykle pojawiają się wiele lat przed objawami klinicznymi i są obecnie najbardziej wiarygodnymi biomarkerami predykcyjnymi i diagnostycznymi dla T1D3. Badania przesiewowe w kierunku autoprzeciwciał przeciwko cukrzycy typu 1 mogą zidentyfikować osoby zagrożone progresją do klinicznej cukrzycy typu 1, edukować społeczeństwo, znacznie zmniejszyć zagrażające życiu powikłania kwasicy ketonowej i przynieść korzyści w badaniach klinicznych dotyczących terapii profilaktycznych. Na całym świecie prowadzone są działania prewencyjne w kierunku cukrzycy typu 1 i przeprowadza się wiele badań interwencyjnych wśród osób z dodatnim wynikiem IAbs w celu opóźnienia progresji do klinicznej cukrzycy typu 1, a Barbara Davis Center for Diabetes rozpoczęło pierwsze amerykańskie badanie kliniczne badań przesiewowych w populacji ogólnej w 2016 r. w kierunku cukrzycy typu 1 i celiakii, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4. Celiakia (CD) jest przewlekłą chorobą zapalną jelit związaną z czynnikami immunologicznymi i genetycznymi. Częstość występowania CD u dzieci z cukrzycą typu 1 może sięgać nawet 24,5%5. Ponad połowa osób z CD może nie mieć typowych objawów w momencie prezentacji6, więc serologiczne badania przesiewowe w kierunku celiakii są jak najbardziej konieczne.

Od początku pandemii choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) na całym świecie zgłoszono ponad 200 milionów przypadków, a dzieci stanowią do 16% potwierdzonych laboratoryjnie przypadków7. Wiele badań wykazało wpływ istniejącej cukrzycy typu 1 na ciężkość i śmiertelność zakażenia COVID-19 8, podczas gdy wpływ zakażenia COVID-19 na rozwój cukrzycy typu 1 nie jest jasny. Badanie całkowitego wskaźnika zakażeń COVID-19 w populacji ogólnej poprzez oznaczenie przeciwciał przeciwko koronawirusowi zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-COV-2) oraz badanie związku między zakażeniem COVID-19 a wywołaniem autoimmunizacji T1D lub przyspieszeniem progresji T1D jest pilnie potrzebne i bardzo ważne, a trwające badanie ASK stanowi do tego doskonałą platformę. Ze względu na pojedynczy format testu i generowanie dużej ilości dodatnich przeciwciał o niskim powinowactwie, standardowy test wiązania promieniotwórczego (RBA) napotkał wąskie gardło w postaci niskiej skuteczności i niskiej swoistości choroby9. W niniejszej pracy przedstawiamy nowatorski test elektrochemiluminescencji 6-pleksowej (ECL) zbudowany na naszej poprzedniej platformie testowej multipleksowej ECL przy użyciu płytki Multiple-Plex, łączącej sześć testów autoprzeciwciał w jednym dołku, w tym wszystkie cztery główne IAb na insulinę (IAA), dekarboksylazę kwasu glutaminowego-65 (), antygen insulinoma-2 (IA-2A) i transport-8 (ZnT8A), autoprzeciwciała przeciwko transglutaminazie (TGA) w celiakii, oraz przeciwciała przeciwko domenie wiążącej receptor SARS-CoV-2 (RBD) (COVID-19A). Jest to pierwszy test multipleksowy, w którym zrekrutowano pełny panel czterech głównych IAb, a następnie połączono go z TGA i COVID-19A. Został on zatwierdzony i formalnie zaakceptowany jako podstawowe narzędzie przesiewowe zastępujące standardowe RBA w badaniu ASK.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badawczy został zatwierdzony przez Colorado Multiple Institutional Review Board.

1. Przygotowanie bufora

  1. Przygotować bufor do etykietowania (2x PBS, pH 7,9): Dodać 100 ml 10x PBS do 400 ml wody destylowanej i dostosować pH za pomocą NaOH do 7,9.
  2. Zrobić 3 mM biotyny i Ru Sulfo-NHS: Rozpuść 1 mg biotyny w 588 μl buforu znakującego i rozpuść 150 nmol Ru Sulfo-NHS w 50 μl buforu znakującego.
  3. Przygotować bufor antygenu (1% BSA): Rozpuścić 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 500 ml 1x PBS.
  4. Przygotować bufor powlekający (3% Bloker A): Rozpuścić 15 g Blokera A w 500 ml 1x PBS.
  5. Przygotuj pierwszy bufor do płukania (0,05 % Tween 20, PBST): Wymieszaj 2,5 ml Tween 20 w 5 000 ml 1x PBS.
  6. Przygotować drugi bufor do przemywania (0,4 M NaCl): Wymieszać 50 ml 5 M NaCl w 575 ml wody destylowanej, aby uzyskać 0,4 M roztwór NaCl.
    UWAGA: Aby zapewnić skuteczne etykietowanie, zawsze używaj świeżo przygotowanych roztworów biotyny i Ru Sulfo-NHS, a nie wcześniej wyprodukowanych.

2. Znakowanie białka antygenowego osobno biotyną i Ru Sulfo-NHS

UWAGA: Wyższe stężenie białka antygenowego ≥0,5 mg/ml jest zalecane dla wyższej efektywności znakowania.

  1. Przygotuj sześć ukierunkowanych roztworów białek antygenowych, w tym proinsulinę,-65, IA-2, ZnT8, TG i domenę wiążącą receptor (RBD) białka kolca SARS-CoV-2. Obliczyć mole każdego białka antygenowego zgodnie z jego masą cząsteczkową i uzyskać odpowiednie proporcje molowe biotyny lub Ru Sulfo-NHS. Stosunek antygenu do sumy biotyny lub Ru Sulfo-NHS będzie wynosił 1:5 dla antygenów drobnocząsteczkowych (masa cząsteczkowa ≤10 kd), takich jak białko proinsuliny. W przypadku antygenów średniocząsteczkowych (masa cząsteczkowa 10-50 kd), takich jak ZnT8, stosunek dostosuje się do 1:10. W przypadku antygenów o dużej masie cząsteczkowej (masa cząsteczkowa >50 kd), takich jak, stosunek molowy będzie wynosił 1:20.
  2. Podzielić białko antygenu na dwie równe części i oddzielnie wymieszać je z biotyną i Ru Sulfo-NHS, stosując obliczony stosunek molowy w kroku 2.1. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1,5 godziny, unikając światła.
    UWAGA: Wszystkie redukujące substancje chemiczne, takie jak Tris lub glicyna w buforze białka antygenowego, muszą zostać usunięte przez kolumnę wirową zaklejającą zagruntowaną buforem 2x PBS (pH 7,9).
  3. Zalać kolumny wirowe 2x PBS (wielkość kolumny wirowej, 2 ml lub 5 ml, zależy od objętości znakującego białka antygenowego): Dodaj 1 ml buforu 2x PBS do kolumny wirowej, odwiruj ją przy 1,000 x g przez 2 minuty i powtórz krok jeszcze 2x.
  4. Pozwól, aby mieszanina białka antygenowego i biotyny lub -Ru Sulfo-NHS przeszła przez zagruntowaną kolumnę wirową 1x (odwirować kolumnę przy 1,000 x g przez 2 minuty) w celu oczyszczenia i zatrzymania reakcji znakowania.
  5. Zmierzyć końcową objętość znakowanego białka antygenowego eluowanego z kolumn wirowych, obliczając stężenia białka antygenowego znakowanego biotyną lub Ru Sulfo-NHS. Wykonać mniejsze porcje znakowanego białka antygenowego (50 μl/probówkę) i przechowywać je w temperaturze -80 °C do długotrwałego stosowania.
    UWAGA: Pokrycie białka po każdej kolumnie wirowania będzie wynosić około 90%-95% wskaźnika retencji.

3. Zdefiniuj najlepsze stężenie i proporcje dla antygenów znakowanych biotyną i Ru Sulfo-NHS dla testu ECL 6-Plex (test szachownicy)

UWAGA: Test szachownicy dla każdego antygenu jest konieczny przed integracją z testem multipleksowanym.

  1. Zastosuj test szachownicy dla każdego antygenu osobno.
    UWAGA: Kroki 3.2.-3.7. użyje TGA jako krótkiego przykładu. Proces testu szachownicy TGA polega na symulacji procesu testu, ale tylko z jednym rodzajem antygenu.
  2. Dokonać seryjnego rozcieńczenia biotynylowanego tTG i tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS. Zalecane stężenia robocze pierwszego roztworu mieszaniny zaczynają się od 240 ng/ml zarówno dla tTG biotynylowanego, jak i znakowanego Ru Sulfo-NHS. Załóżmy, że stężenia zarówno oryginalnego tTG biotynylowanego, jak i znakowanego Ru Sulfo-NHS wynoszą 1,0 μg/μL. Wykonaj 10-krotne rozcieńczenie oryginalnego tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS i 5-krotne rozcieńczenie oryginalnego biotynylowanego tTG z 5% BSA.
  3. Zmieszać 4 μl biotynylowanego białka tTG ze 156 μl 5% BSA (buforu antygenowego) i 240 μl łącznika sprzężonego ze streptawidyną w jednej probówce i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 min. Następnie dodać 160 μl roztworu zatrzymującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 minut. Pobrać 400 μl mieszaniny i wymieszać z 2 ml roztworu zatrzymującego. Stężenie biotynylowanego tTG w mieszaninie wynosi 240 ng/ml.
  4. Aby wykonać seryjne rozcieńczenie antygenu ZnT8 znakowanego biotyną, należy przygotować kolejne pięć nowych probówek, pobrać 1 ml podwielokrotności z mieszaniny w kroku 3.3 i wymieszać z 1 ml roztworu zatrzymującego w nowej probówce i otrzymać mieszaninę o stężeniu 120 ng/ml. Powtórz ten krok, wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:1 i uzyskaj tTG znakowany biotyną o stężeniach 60 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml i 7,5 ng/ml.
  5. Dodać 4 μl tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS z 1,6 ml roztworu zatrzymującego i otrzymać mieszaninę tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS o stężeniu 240 ng / ml. Wykonując te same kroki 3.4., wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:1 i uzyskaj antygen ZnT8 znakowany Ru Sulfo-NHS przy 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml i 3,75 ng / ml. Ostatnie stężenie wynosi 0 ng / ml, tylko roztwór zatrzymujący i bez antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS.
  6. Przygotować próbki surowicy kontroli dodatniej i kontroli ujemnej tTG (wstępnie zakwalifikowane i standaryzowane za pomocą pojedynczego testu ECL tTG) oraz 96-dołkową płytkę PCR. Porcjować próbki dodatniej i ujemnej surowicy kontrolnej odpowiednio do lewej i prawej połowy płytki, po 7 μl w każdym dołku. Dodaj 1x PBS do płytki, po 33 μl na dołek.
  7. Na lewą połowę płytki PCR dodać 24 μl seryjnie rozcieńczonego roztworu łącznika tTG znakowanego biotyną do każdej studzienki, jednej kolumny z jednym stężeniem w kolejności od najwyższego do najniższego. W ten sam sposób dodać 16 μl seryjnie rozcieńczonego antygenu tTG znakowanego Ru Sulfo-NHS do każdej studzienki, jeden rząd o jednym stężeniu, a następnie dokładnie wymieszać. Powtórz krok na prawej połowie płytki PCR.
  8. Kontynuować pozostałe etapy oznaczania opisane w krokach 5.3-9.1, aż do uzyskania surowych danych dotyczących liczenia.
  9. Obliczyć stosunek sygnałów kontroli dodatniej do odpowiadających im sygnałów kontroli ujemnej. Określić najlepsze stężenie antygenu znakowanego biotyną i antygenu znakowanego Ru Sulfo-NHS o wyższych wartościach współczynnika i niższym tle dla ujemnej próbki kontrolnej. Optymalne stężenia robocze biotyny i białka antygenowego znakowanego Ru Sulfo-NHS przedstawiono poniżej: 16,0 ng/ml i 8,0 ng/ml dla GAD65, 18,8 ng/ml i 9,4 ng/ml dla SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng/ml i 42,0 ng/ml dla IA-2, 60,0 ng/ml i 60,0 ng/ml dla tTG, 4,2 ng/ml i 4,2 ng/ml dla ZnT8, oraz 31,3 ng/ml i 31,3 ng/ml dla proinsuliny.

4. Utwórz rozwiązanie antygenowe sprzężone z łącznikiem

  1. Rozcieńczyć antygeny znakowane biotyną i Ru Sulfo-NHS 5% BSA do optymalnych stężeń roboczych zgodnie z krokiem 3.9.
  2. Zwiąż wstępnie wybrane łączniki z każdym biotynylowanym białkiem antygenowym. W przypadku jednego testu na 96-dołkowej płytce dodać 4 μl biotynylowanych GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i białka antygenu proinsuliny do oddzielnej probówki zawierającej 156 μl 1% BSA i wymieszać z 240 μl odpowiednich łączników sprzężonych ze streptawidyną 1, 2, 3, 8, 9 i 10 (Rysunek 1). Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Podamy 160 μl roztworu zatrzymującego do każdej probówki i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Z każdej probówki wyjąć 400 μl roztworu mieszaniny i połączyć je ze sobą.
  4. Dodaj 4 μl Ru Sulfo-NHS znakowanego GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 i antygenu proinsuliny do powyższej mieszaniny, a następnie dodaj 1,6 ml roztworu zatrzymującego i 3,2 ml 1x PBS i wymieszaj. Teraz roztwór antygenu jest gotowy do użycia w teście.

5. Inkubuj próbki surowicy z oznaczonym antygenem

  1. Podwielokrotność 7 μl surowicy na dołek na 96-dołkową płytkę PCR i przykryć folią uszczelniającą. Podgrzej surowicę w temperaturze 56 °C przez 30 minut na maszynie do PCR. Krótko odwirować płytkę o masie 100 x g przez 1 min.
  2. Dodać 63 μl roztworu antygenu (przygotowanego w kroku 4.4) do dołka i wymieszać z surowicami. Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.
  3. Wytrząsać płytkę na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min w czasie suchej temperatury przez 2 godziny, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 18-24 godziny.

6. Przygotuj płytę 6-Plex

  1. Wyjmij płytkę 6-Plex z lodówki o temperaturze 4 °C, pozwalając, aby płyta znalazła się w RT. Dodaj 150 μl 3% Blockera A do każdego dołka płytki 6-Plex.
  2. Włóż płytkę z powrotem do lodówki o temperaturze 4 °C, przykryj płytkę folią, unikając światła, i inkubuj przez noc.
    UWAGA: Etapy oznaczania w dniu 1 obejmują sekcje 4.-6.

7. Surowica/antygen przenosi się do płytki 6-Plex

  1. Następnego dnia wyjmij inkubującą płytkę 6-Plex z lodówki i wylej cały bufor z płytki. Poklep talerz o ręczniki papierowe do wyschnięcia.
  2. Za każdym razem umyj płytkę 6-Plex 150 μl buforu myjącego na studzienkę. Wysuszyć płytkę na ręcznikach papierowych, a podwielokrotna surowica/antygen inkubuje się z każdej studzienki płytki do inkubacji PCR przez noc do dwóch dołków płytki 6-Plex (30 μl na studzienkę w przypadku duplikatów).
  3. Przykryj płytkę folią, następnie umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością 450 obr./min przy RT przez 1 godzinę.

8. Umyj płytkę 6-Plex i dodaj bufor do odczytu.

  1. Wlać roztwór do płytki 6-Plex i za każdym razem przemyć płytkę 3 razy 150 μl 0,4 M buforu płuczącego NaCl na studzienkę.
  2. Po zakończeniu trzeciego prania osusz płytkę o ręcznik papierowy i dodaj 150 μl buforu do odczytu do każdej studzienki.
    UWAGA: Pęcherzyki powietrza w studni wpływają na dokładność czytnika płytek i należy ich za wszelką cenę unikać.

9. Przeczytaj tabliczkę i przeanalizuj dane

  1. Policz płytkę w analizatorze elektrochemiluminescencji. Wyniki odczytu zostaną przedstawione wraz z wartościami w zliczeniach na sekundę (CPS). Obliczyć względny wskaźnik przeciwciał w każdej próbce, używając surowego CPS uzyskanego z maszyny odczytującej w stosunku do CPS wewnętrznej wzorca dodatnich i ujemnych kontroli każdego specyficznego przeciwciała (wartość indeksu = [CPS (próbka) - CPS (norma ujemna)] / [CPS (norma dodatnia) - CPS (norma ujemna)]).
  2. Określ ujemne lub dodatnie wyniki przeciwciał, korzystając z wartości odcięcia, które zostały ustalone na 99,5do 99,8 percentyla 555 ujemnych próbek kontrolnych z badania ASK (wszystkie ujemne próbki przeciwciał bez historii lub historii rodzinnej cukrzycy lub innego rodzaju choroby autoimmunologicznej).
    UWAGA: Etapy testu w dniu 2 obejmują sekcje 7-9.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3 ilustrują reprezentatywne wyniki. Surowe CPS uzyskane z maszyny odczytującej przedstawiono w tabeli 1. W Tabeli 2 surowe CPS zostały ułożone i posortowane według sześciu łączników i odpowiadających im przeciwciał. Tabela 3 przedstawia obliczone wartości indeksu dla CPS zgodnie z opisem w protokole testu. Wszystkie surowe wartości zliczania powinny być sprawdzane, aby uniknąć błędnych wyników indeksu końcowego spowodowanych nieprawidłowymi duplikatami. W tabeli 1 podano przykłady nieprawidłowych duplikatów, które skutkowały błędem w końcowym obliczeniu indeksu w tabeli 3.

Ten test został zweryfikowany w ślepy sposób przy użyciu 880 wybranych próbek z badania ASK, z 325 próbkami dodatnimi IAbs i 555 próbkami wszystkimi negatywnymi Abs. Poziomy autoprzeciwciał z testu ECL 6-Plex dla 880 próbek porównano punkt po punkcie z poziomami odpowiednich pojedynczych testów ECL (Rysunek 2) oraz z odpowiadającym im pojedynczym standardowym RBA (Rysunek 3). Punkt odcięcia, czułość i swoistość dla każdego przeciwciała wymieniono w tabeli 4. Czułość i swoistość tego testu ECL-COVID-19A określono odpowiednio na 100% i 99,9%10.

figure-results-1
Rysunek 1: Ilustracja testu ECL 6-Plex. Autoprzeciwciała surowicy łączą antygen znakowany Ru Sulfo-NHS z antygenem biotynylowanym, który jest sprzężony ze specyficznym łącznikiem i tworzy kompleks antygen-przeciwciało-antygen-łącznik. Kompleksy są przechwytywane przez każdy konkretny łącznik do określonych miejsc na płycie 6-Plex. Dla każdego antygenu przypisano określone numery łączników:-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 i Proinslulin-linker-10. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą He et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Porównanie sześciu poziomów przeciwciał w 880 próbkach z badania ASK między pojedynczym testem ECL a testem 6-Plex ECL. Na panelach przedstawiono porównania poziomów przeciwciał odpowiednio dla, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA i COVID-19A (wskaźnik COVID-19A przedstawiono jako (100 x obliczona wartość indeksu)). Linie przerywane reprezentują punkty odcięcia testu dla każdego testu przeciwciał. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą He et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie pięciu poziomów przeciwciał w 880 próbkach z badania ASK między RBA a testem ECL 6-Plex. Panele wyświetlają porównania poziomów przeciwciał odpowiednio dla, IAA, IA-2A, ZnT8A i TGA. Linie przerywane reprezentują punkty odcięcia testu dla każdego testu przeciwciał. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą He et al.11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Surowe liczby CPS (lewa połowa talerza). Surowe zliczenia CPS uzyskane z lewej połowy płytki testowej. Każda próbka jest wykonywana dwukrotnie. Każda liczba CPS w tej samej kolumnie (A1, A2, A3 itd.) reprezentuje dane odczytu z 10 miejsc w tej samej studni (odpowiednie numery konsolidatorów są oznaczone). Przykłady nieprawidłowych duplikatów są wyróżnione kolorem szarym, jak pokazano w wierszu D-linker 3 kolumna 5 i kolumna 6. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Układ danych z Tabeli 1, posortowanych sześcioma linkerami. Wartości CPS z tabeli 1 zostały przearanżowane, obliczając średnie wartości dla zduplikowanych odczytów CPS i usuwając nieużywane wartości dla konsolidatorów 4-7. Wartości wzorca wewnętrznego kontroli wysoko-dodatniej, nisko dodatniej i ujemnej każdego testu autoprzeciwciał są zaznaczone cienką pogrubioną czcionką. PC, kontrola pozytywna. NC, kontrola negatywna. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Wyniki wartości indeksu. Wartości indeksów dla każdej próbki dla wszystkich sześciu przeciwciał obliczono w odniesieniu do odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych. Wartość indeksu większa niż wartość odcięcia została zdefiniowana jako dodatnia, oznaczona ciemną pogrubioną czcionką. Błędne zduplikowane wartości CPS w tabeli 1, wiersz D-linker 3-kolumny 5 i 6, doprowadziły do dodatniej wartości indeksu IA-2A próbki 11 (zaznaczonej na szaro), co prawdopodobnie było wynikiem fałszywie dodatnim. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Granica, czułość i swoistość testu dla, IA-2A, ZnT8A, IAA i TGA wśród 880 próbek ASK, w tym 325 próbek dodatnich IAbs i 555 próbek wszystkich przeciwciał ujemnych. Optymalna wartość indeksu odcięcia testu, IA-2A, ZnT8A, IAA i TGA została ustalona na co najmniej 99. percentyl z 555 normalnych próbek kontrolnych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interwencja w leczeniu cukrzycy typu 1 weszła w erę poprzedzającą cukrzycę typu 1, w której trwają krajowe i międzynarodowe programy badań przesiewowych na dużą skalę w kierunku cukrzycy typu 1 oraz dynamicznie rozwijające się badania kliniczne stosowane w stadium 1 cukrzycy typu 1 w celu zniesienia lub spowolnienia progresji do klinicznej cukrzycy typu 112,13. Pomiary czterech IAb przy użyciu obecnego standardu RBA z pojedynczym formatem testu IAb są pracochłonne i nieefektywne w przypadku programu masowych badań przesiewowych. Wraz z pilnym zapotrzebowaniem na wysokoprzepustowy multipleksowany test IAbs, multipleksowany test ECL, 3-ekranowy test ICA ELISA oraz wykrywanie przeciwciał metodą aglutynacji-PCR (ADAP) stały się obecnie konkurencyjnymi technologiami. W badaniu Fr1da dotyczącym badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1 w populacji małych dzieci w Niemczech, jako główny test zastosowano 3-przesiewowy test ICA ELISA łączący 3 IAb (, IA-2A i ZnT8A)14. Głównym ograniczeniem 3-ekranowego testu ICA ELISA jest brak IAA, który jest w większości pierwszym IAb, który pojawia się z dużą częstością występowania u małych dzieci z cukrzycą typu 1. Ponadto test nie jest w stanie odróżnić, który z trzech IAb jest dodatni od pozytywnego sygnału, a każda dodatnia próbka musi zostać powtórzona z trzema pojedynczymi testami w celu potwierdzenia. ADAP15 łączy, IA-2A i IAA i zilustrował wysoką czułość i swoistość testu podczas warsztatów IASP, ale brakuje danych dotyczących jego predykcyjności w populacyjnych badaniach przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, których warsztaty IASP nie są w stanie określić. Multipleksowy test ECL w niniejszym badaniu jest zbudowany na platformie pojedynczego testu ECL, który został zwalidowany pod kątem obecnego standardu RBA w wielu badaniach klinicznych, takich jak TrailNet 9,16, DAISY 17,18,19 i ASK 4,20,21 studiować. Niniejszy test został zwalidowany zarówno w stosunku do RBA, jak i pojedynczego testu ECL przy użyciu 880 próbek surowicy od uczestników badania ASK. Jak pokazano na rycinie 2 i rycinie 3, poziomy przeciwciał między 6-Plex a pojedynczym ECL lub między 6-Plex a RBA były w większości zgodne ze sobą pod względem dodatniej skuteczności przeciwciał. Współczynniki koincydencji IAb testowanych przez RBA i 6-Plex wynosiły 91,7%-97,8%, a współczynniki koincydencji IAb testowanych przez pojedyncze ECL i 6-Plex wynosiły 95,3%-99,2%. Rozbieżność między testem ECL a RBA dotyczyła głównie osób z pojedynczym IAb. Poziomy IAb testowane przez 6-Plex i pojedynczy ECL (r = 0,6431-0,9434, wszystkie p < 0,0001) oraz 6-Plex i RBA (r = 0,5775-0,8576, wszystkie p < 0,0001) były również dobrze skorelowane. TGA testowane testem 6-Plex były silnie skorelowane z wynikami zarówno testu RBA (99,4%), jak i pojedynczego testu ECL (99,4%). Dodatkowo, COVID-19A testowany przez 6-Plex osiągnął 99,8% zgodność z wynikami pojedynczego testu ECL.

W rezultacie, test ECL 6-Plex został formalnie zaakceptowany jako podstawowa metoda przesiewowa dla trwającego badania ASK i zastąpił standardową RBA22. Test ten wykazał doskonałą czułość i swoistość przy wyższej przepustowości, niższych kosztach i mniejszej objętości surowicy w porównaniu ze standardowym RBA.

Udokumentowano, że w badaniu przesiewowym T1D pojedynczy IAb wykryty przez RBA, który stanowił dużą część dodatnich wyników IAb, miał niskie powinowactwo, niskie ryzyko choroby i skutkował ogólnie niską wartością predykcyjną 19,21,23,24,25,26 . Tak niskie przewidywanie ryzyka spowodowało ogromne dodatkowe koszty wizyt kontrolnych i spowodowało trudności w badaniach profilaktycznych nad cukrzycą typu 1. W wielu badaniach klinicznych wykazano, że uznana platforma testowa ECL pozwala na odróżnienie IAb o wysokim powinowactwie od IAb o niskim powinowactwie generowanych przez RBA i znaczne zwiększenie wartości predykcyjnych dla wszystkich czterech IAb, zwłaszcza w przypadku pojedynczego dodatniego IAb 16,17,18,21. Technologia multipleksowego testu ECL została zbudowana na platformie pojedynczego testu ECL, z tą wyraźną zaletą, jaką jest wykrywanie Abs o wysokim powinowactwie. W niniejszym badaniu test ECL 6-Plex zilustrował jego podobieństwo do odpowiadających mu testów z pojedynczym ECL pod względem czułości i swoistości.

Niektóre ograniczenia i problemy techniczne związane z testem ECL multiplex przy użyciu wielu płytek Plex zostały już omówione w poprzednich publikacjach27,28. Przy sześciu znakowanych antygenach w jednym dołku mogą występować pewne wpływy między różnymi antygenami, a tło testu może wzrosnąć po dodaniu każdego testu przeciwciał do multipleksowania w tym samym dołku. Potrzebna jest duża ilość prac optymalizacyjnych w celu dostosowania warunków testu, w szczególności w celu dostosowania końcowych stężeń każdego znakowanego białka antygenowego w oparciu o test szachownicy dla każdego antygenu, w celu utrzymania czułości i swoistości dla każdego testu przeciwciał. Jak wspomniano w poprzednich badaniach27,28, niewielka liczba próbek (<1%) skutkuje fałszywie dodatnim wynikiem na płytce wielokrotnej Plex bez wyraźnej przyczyny. Wszystkie dodatnie wyniki należy powtórzyć i potwierdzić pojedynczym testem ECL w ramach rutynowego laboratoryjnego zapewnienia jakości; Zazwyczaj fałszywe alarmy są usuwane. W niniejszym badaniu nie zaobserwowano wyników fałszywie ujemnych spowodowanych "efektem prozonu" zaobserwowanym w poprzednim teście ECL 7-Plex27,28. W opisanym tutaj teście usunęliśmy etap obróbki kwasem próbek surowicy z poprzedniego protokołu; zamiast tego podgrzaliśmy próbki surowicy w temperaturze 56 °C przez 30 minut (krok 5.1.). W drugim dniu mycia talerzy użyliśmy bufora myjącego zawierającego 0,4 M NaCl (krok 8.1.) zamiast zwykłego buforu myjącego, aby bardziej rygorystycznie umyć płytkę. Modyfikacje te sprawiły, że multipleksowy test ECL stał się prostszy i obniżył tło bez utraty czułości testu.

Podsumowując, test ten ma wyjątkową wydajność w wykrywaniu jednocześnie czterech IAb, TGA i COVID-19A. Funkcja multipleksowania, a także wysoka przepustowość, niski koszt i małe zapotrzebowanie na objętość surowicy sprawiają, że badania przesiewowe na dużą skalę w kierunku cukrzycy typu 1 i chorób współistniejących są znacznie bardziej wykonalne w populacji ogólnej. Pacjenci z cukrzycą typu 1 lub jakąkolwiek chorobą autoimmunologiczną mają znacznie większe ryzyko wystąpienia innych chorób autoimmunologicznych. Multipleksowy test ECL stanowi doskonałą platformę do jednoczesnych badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie było wspierane przez grant JDRF 2--2019-695-S-B, 2--2020-965-S-B, 1--2017-564-M_N, grant NIH DK32083 oraz grant Centrum Badań nad Cukrzycą (DRC) P30 DK116073.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5 mMNaCl ThermoFisher1070832
96-dołkowa wytrząsarkapłytkowa VWR12620-926
96-dołkowa okrągła płyta dolnaFisher8408220
BiotinThermoFisherPI21329
Blocker AMSDR93AA
Butelka 500 ml FiltrFisher0974064A
Surowica bydlęca AlbuminaSigmaA-7906
Białko GAD65Diamyd Medical10-65702-01
Białko IA-2 (AA 605-979)Creative BioMart283309
MESO QuickPlex SQ120MSDR31QQ-3Analizator elektrochemiluminescencji
PBS 10xThermoFisher70011044
PBS 1xThermoFisher10010023
Białko proinsulinoweAmideBio20160118B3
Bufor odczytu BMSDY0800019
białko RBD SARS-CoV-2Creative BiomartSpike-190V
Stop SolutionMSDY0090019
Sulfo-TAG
tTGDiarect AG15201
Tween 20SigmaP-1379
U-Plex 6-testowa płytka SECTORMSDZ00U0142E6-plex
Linker U-PLEX 1MSDL0010022
U-PLEX Linker 10MSDL0100020
U-PLEX Linker 2MSDL0020015
U-PLEX Linker 3MSD
U-PLEX Linker 8MSDL0080018
U-PLEX Linker 9MSDL0090014
Kolumna ZeBaThermoFisher89892Kolumny wirujące
Laboratorium BadawczeBiałka ZnT8n/a
MSD R91AO-1 L0030018

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Group, T. S. The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study. Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  4. Stahl, M. G., et al. Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study. The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).
  5. Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study. BMC Gastroenterology. 12, 180(2012).
  6. Agardh, D., et al. Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort. Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).
  7. Jaime, G., Deville, E. S., Ouellette, C. P. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print (2021).
  8. Barron, E., et al. Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).
  9. Miao, D., et al. Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  10. Jia, X., et al. Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).
  11. He, L., et al. High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease. Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).
  12. McQueen, R. B., et al. Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado. Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).
  13. Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. General population screening for type 1 diabetes: has its time come. Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).
  14. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  15. Cortez, F. J., et al. Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR. PLoS One. 15 (11), 0242049(2020).
  16. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  17. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  18. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  19. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  20. Zhao, Z., et al. Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 2904563(2016).
  21. Jia, X., et al. High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).
  22. He, L., et al. A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay. Diabetes. 70, Supplement 1 158(2021).
  23. Achenbach, P., et al. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).
  24. Schlosser, M., et al. In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk. Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).
  25. Mayr, A., et al. GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes. Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).
  26. Siljander, H., et al. Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).
  27. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  28. Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases. Journal of Visualized Experiments. (159), e61160(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiplexowy test ECLprzesiewowe badanie cukrzycy typu 1przesiewowe badanie celiakiiprzesiewowe badanie przeciwcia przeciw COVID 19wykrywanie autoprzeciwciawysokoprzepustowe badanie przesiewoweautoprzeciwcia a przeciw wyspom trzustkowymprzeciwcia a przeciw SARS CoV 2radioligandowy test wi zaniawielkoskalowe badanie przesiewowe

Powiązane artykuły