Artykuł metodologiczny

Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego

DOI:

10.3791/63788

⸱

7 lipca 2023

 , 
1Norwegian Center for Stem Cell Research, Department of Immunology and Transfusion Medicine, Oslo University Hospital, 2Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Molecular Medicine, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uniknąć ograniczeń związanych z enzymatycznym lub mechanicznym pasażowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) hodowanych na komórkach żywicielskich, ustaliliśmy szybką, skuteczną, ekonomiczną, wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC lub hiPSC utrzymywanych na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (ludzkie embrionalne komórki macierzyste, hESC i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, hiPSC) były pierwotnie hodowane na różnych typach komórek żywiących w celu utrzymania w stanie niezróżnicowanym w długoterminowej hodowli. Podejście to zostało w dużym stopniu wyparte przez protokoły hodowli bez karmienia, ale obejmują one droższe odczynniki i mogą sprzyjać przejściu do stanu zaszczepionego, co ogranicza zdolność różnicowania komórek. Zarówno w warunkach żywienia, jak i bez karmienia, zbiór kolonii hESC lub hiPSC w celu pasażowania jest niezbędną procedurą do rozszerzania kultur.

Aby zapewnić łatwą i wydajną procedurę pasowania hESC/hiPSC hodowanych na komórkach zasilających, opracowaliśmy metodę zbierania za pomocą dysadhezji wywołanej przez chelator wapnia kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Oceniliśmy wydajność i jakość powstałych pasażowanych komórek, porównując to podejście z pierwotnym podejściem do zbioru mechanicznego, w którym kolonie są izolowane skalpelem pod mikroskopem (zbiór mechaniczny został wybrany jako komparator, aby uniknąć zmienności odczynników związanej z zbieraniem enzymatycznym).

W jednym zestawie eksperymentów, dwie różne linie hESC były utrzymywane na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka. Każda linia została poddana wielu pasażom przy użyciu zbioru opartego na EDTA lub mechanicznym zbieraniu i oceniona pod kątem wielkości i morfologii kolonii, gęstości komórek, ekspresji markerów macierzystości, różnicowania do trzech listków zarodkowych w ciałach zarodkowych i aberracji genomowych. W innym zestawie eksperymentów zastosowaliśmy zbieranie oparte na EDTA na dwóch różnych liniach hiPSC i uzyskaliśmy podobne wyniki. Dysadhezja wywołana EDTA zaoszczędziła czas i dała wyższy plon kolonii o korzystniejszej wielkości i bardziej jednolitej morfologii w porównaniu z zbiorem mechanicznym. Był również szybszy niż zbiór enzymatyczny i nie był podatny na zmienność partii enzymów. Metoda odadhezyjnej indukowanej EDTA ułatwia również przenoszenie linii hESC/hiPSC z hodowli opartej na komórkach zasilających do warunków wolnych od zasilania, jeśli jest to pożądane do dalszego wykorzystania i analizy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowe utrzymanie hESC i hiPSC in vitro jest podstawową i wygodną metodologią dla kilku kierunków badań nad komórkami ludzkimi i biologią rozwojową. Ze względu na nieodłączny napęd hESC i hiPSC do różnicowania, utrzymanie stanu niezróżnicowanego in vitro wymaga szczególnej troski i uwagi. W związku z tym opracowanie opłacalnych protokołów utrzymania i pasażowania hESC i hiPSC przy jak najmniejszej zmienności metodologicznej ma ogromne ogólne znaczenie.

Pierwotnie, hESC i hiPSC były hodowane na różnych typach komórek zasilających, aby pomóc w długoterminowej hodowli i utrzymaniu stanu niezróżnicowanego1,2,3. Ostatnio hodowla w warunkach wolnych od karmników stała się normą, ponieważ całkowicie unika się pracy z komórkami zasilającymi4. Jednak niektóre laboratoria i główne obiekty nadal hodują hESC lub hiPSC na komórkach zasilających. Posiew bez karmnika jest droższy, ponieważ wymaga użycia pożywek hodowlanych o specjalnym składzie i pewnej formy powlekania powierzchni hodowli w celu zapewnienia przylegania do kolonii (główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej [ECM] lub komercyjny związek ECM lub użycie dostępnych na rynku powlekanych płytek). Wydatek nie jest błahy i stanowi potencjalną przeszkodę finansową dla niektórych laboratoriów zainteresowanych prowadzeniem prac badawczo-rozwojowych w oparciu o hESC lub hiPSC. Co więcej, hodowla w warunkach wolnych od żywicieli ma tendencję do doprowadzania hESC i hiPSC do mniej naiwnego stanu niż ten, który utrzymuje się na komórkach karmicielskich5, co może zagrozić późniejszemu różnicowaniu i prowadzić do zmienności genetycznej6.

Historycznie, pasażowanie hESC i hiPSC hodowanych na komórkach karmiących wymagało mechanicznego zbierania - przy użyciu skalpela do wycinania kolonii pod mikroskopem7 - ale później zostało to w dużej mierze zastąpione przez trawienie enzymatyczne z lub bez delikatnego skrobania w celu wyizolowania kolonii lub zdysocjowanych komórek. Zbiór mechaniczny jest żmudny i wymaga precyzyjnej mikrochirurgii. Zbieranie enzymatyczne może różnić się wydajnością ze względu na różnice enzymatyczne między partiami i ma tendencję do faworyzowania całkowitej dysocjacji, co sprzyja śmierci komórki, chyba że przeciwdziałają im inhibitory ROCKS8,9 i zwiększa częstość występowania nieprawidłowych kariotypów9.

Aby skorzystać z niższych kosztów i większego potencjału różnicowania hodowli hESC i hiPSC na komórkach zasilających, unikając jednocześnie wad mechanicznego i enzymatycznego zbierania, opracowaliśmy szybką, skuteczną, efektywną kosztowo i wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC i hiPSC utrzymywanych na warstwie zasilającej ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA. Porównaliśmy plon, zmienność i jakość komórek macierzystych z tymi uzyskanymi przy zbiorze mechanicznym (nie porównaliśmy z trawieniem enzymatycznym ze względu na dodatkową zmienność, jaką pociąga za sobą to podejście). Zauważamy, że dysadhezja za pośrednictwem EDTA działa również dobrze przy przenoszeniu kolonii z hodowli opartej na karmicielu do warunków wolnych od karmnika, jeśli jest to pożądane do dalszego wykorzystania i analiz. Ta metoda zapewnia przejście ze spójną metodą pasażowania, ponieważ dysadhezja wywołana EDTA jest popularnym podejściem stosowanym w przypadku kultur bezżywiowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów używanych w tym protokole.

1. Hodowla ludzkich komórek fibroblastów i przygotowanie warstwy komórek zasilających

  1. Nasiona 0,5 × 106 ludzkich fibroblastów napletka (zwanych dalej "komórkami żywicielskimi") na każdą kolbę hodowlaną T-75 (liczba kolb w razie potrzeby) z 20 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco firmy Iscove (IMDM) z (w/) 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), zwaną dalej "pożywką dla komórek karmiących".
  2. Gdy komórki zasilające osiągną 90% konfluencji, usuń pożywkę i przemyj 3x 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco na kolbę, aby uniknąć zahamowania trypsyny przez czynniki w pożywce. Dodać 2 ml trypsyny-EDTA do każdej kolby i umieścić kolbę(-y) w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na 5 minut lub do momentu, gdy komórki zasilające odłączą się od kolby(-ów). Obserwuj oderwanie się komórek pod mikroskopem jako pływające agregaty komórek lub pojedyncze komórki.
  3. Dodać 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki z ogniwami zasilającymi do każdej kolby, aby dezaktywować trypsynę-EDTA, a następnie delikatnie zawiesić komórki zasilające przez pipetowanie.
  4. Przenieś komórki zasilające do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zakryj probówkę i osadzaj komórki podajnika przez odwirowanie w ilości 200 × g przez 5 minut.
  5. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu w komórce zasilającej. Następnie ostrożnie ponownie zawiesić osad w 4 ml świeżej pożywki z komórek podajnika. Upewnij się, że ogniwa zasilające są dokładnie zawieszone przed liczeniem za pomocą komory do liczenia komórek lub innego urządzenia do liczenia komórek.
  6. Dodać 0,5 × 106 komórek zasilających do wymaganej liczby nowych kolb hodowlanych T-75 do ekspansji i dodać 20 ml świeżej pożywki z komórek zasilających do każdej kolby. Inkubować kolbę(-i) hodowlaną(-e) w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 do momentu, gdy komórki zasilające osiągną 90% zbieżności.
    UWAGA: Ogniwa zasilające mogą być używane do co najmniej przejścia 25.
  7. Obliczyć liczbę komórek zasilających wymaganą do liczby szalek do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm, które zostaną użyte do hodowli hESC/hiPSC.
    UWAGA: Zwykle 3,0 × 105 komórek zasilających na naczynie do hodowli tkankowej wystarcza do wytworzenia zlewającej się warstwy komórek zasilających.
  8. Aby uniknąć proliferacji komórek zasilających, upewnij się, że są one mitotycznie zatrzymane na jeden z dwóch sposobów.
    UWAGA: W przypadku obu metod można wygenerować dużą partię mitotycznie zatrzymanych komórek zasilających i zamrozić je w podwielokrotnościach do późniejszego wykorzystania.
    1. Przeprowadzić zatrzymanie mitotyczne przez promieniowanie gamma, przenosząc wszystkie potrzebne komórki zasilające do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i uzupełniając pożywką z ogniw zasilających do całkowitej objętości 5 ml. Natychmiast przetransportować w temperaturze pokojowej do maszyny do napromieniowania gamma i naświetlić w celu mitotycznego zatrzymania ogniw zasilających (300 kV i 10 mA przez 20 min).
      UWAGA: Opóźnienie w transporcie może prowadzić do niepożądanego przymocowania komórek podajnika do ścianki probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli transport trwa dłużej niż kilka minut, upewnij się, że ogniwa podajnika pozostają zawieszone podczas transportu, ciągle mieszając rurkę.
    2. Przeprowadzić zatrzymanie mitotyczne przy użyciu mitomycyny C, przenosząc wszystkie komórki zasilające potrzebne w 5 ml pożywki z komórkami zasilającymi do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie dodać 15 ml pożywki z komórek zasilających zawierającej 20 μg/ml mitomycyny C i inkubować w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C/5% przez 3 godziny. Dodać 20 ml PBS o temperaturze 37 °C, Osadzać komórki przez odwirowanie w ilości 200 × g przez 5 minut, powtórzyć płukanie PBS jeszcze dwa razy i ponownie zawiesić w pożywce zasilającej.
  9. Po mitotycznym zatrzymaniu komórek karmiących należy powrócić do okapu do hodowli tkankowej i rozłożyć komórki karmiciela na płytce w temperaturze 3,0 × 105 komórek na 35 mm naczynie do hodowli tkankowej, w następujący sposób. Upewnij się, że komórki zasilające są całkowicie zawieszone, dodaj pożywkę z komórek zasilających, aby osiągnąć stężenie komórek zasilających 1,5 × 105 na ml i dodaj 2 ml tej zawiesiny komórek zasilających do każdego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
  10. Przenieść szalki hodowlane do inkubatora o temperaturze 37 °C/5% CO2 . Aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek podajnika, przesuwaj szalki hodowlane powoli, ale stanowczo na półce inkubatora do przodu i do tyłu 3x, po czym następuje pauza, a następnie wykonaj tę samą czynność od lewej do prawej 3x. Nie przesuwaj ponownie naczyń i delikatnie zamknij drzwi inkubatora.
  11. Po 24 godzinach zmień pożywkę z komórek zasilających na IMDM z 10% wymianą surowicy (SR). Pożywkę należy wymieniać co trzeci dzień. Ogniwa zasilające są gotowe do użycia po pierwszych 3 dniach.

2. Mechaniczne pobieranie kolonii hESC lub hiPSC

  1. Wstępnie rozgrzana pożywka hESC składająca się z 80% zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 20% SR, 1 mM substytutu glutaminy 100x, 1 mM aminokwasów endogennych (NEAA), 1 mM penicyliny/streptomycyny (P/S), 0,1 mM 2-merkaptoetanolu i 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Pożywkę hESC stosuje się do hodowli komórek hESC lub hiPSC na komórkach zasilających.
  2. Pobrać świeże szalki do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm zawierające mitotycznie zatrzymane komórki żywiciela i zastąpić pożywkę z komórek karmiących 1,2 ml pożywki hESC zawierającej bFGF co najmniej 30 minut przed przeniesieniem kolonii hESC/hiPSC.
  3. Umieścić naczynie hodowlane zawierające kolonie hESC/hiPSC na mitotycznie zatrzymanych komórkach zasilających pod mikroskopem o 10-krotnym powiększeniu umieszczonym w okapie z przepływem laminarnym. Użyj sterylnego skalpela, aby ostrożnie przeciąć obwód każdej kolonii, a następnie pokrój każdą kolonię na 5-6 mniej więcej równych kawałków. Ostrożnie podnieś kawałki kolonii końcówką ostrza skalpela, tak aby oderwały się od warstwy komórek zasilających i swobodnie unosiły się w podłożu.
    1. Staraj się unikać regionów kolonii, które zawierają różnicujące się komórki, które wyglądają jak wyspy mniejszych komórek z mniej wyraźnymi jądrami w porównaniu z hESC/hiPSC w kolonii.
  4. Przenieść swobodnie pływające kolonie za pomocą pipety o pojemności 1 ml do nowych szalek hodowlanych zawierających komórki zasilające. Staraj się trzymać kolonie oddzielnie, aby później nie wrastały na siebie. Ostrożnie przenieś szalki hodowlane do inkubatora komórkowego i unikaj naruszania naczyń do następnego dnia.
  5. Następnego dnia ostrożnie dodać 600 μl pożywki hESC zawierającej bFGF do końcowej objętości 1,8 ml. Pożywkę hESC + bFGF należy wymieniać codziennie aż do następnego pasażu (zwykle po 1 tygodniu).

3. Zbieranie kolonii hESC lub hiPSC za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA

  1. Weź świeże szalki hodowlane z mitotycznie zatrzymanymi komórkami zasilającymi i zmień IMDM z 10% SR na 1,2 ml wstępnie podgrzanej pożywki hESC + bFGF co najmniej 30 minut przed przeniesieniem kolonii.
  2. Dotykaj jednorazowo jednej szalki hodowlanej zawierającej kolonie hESC lub hiPSC. Usuń pożywkę hESC + bFGF i przemyj kolonie 1 ml DPBS o temperaturze pokojowej, aby wyeliminować wszelkie możliwe nieprzyłączone komórki i resztki komórek. Dodać 1 ml 0,5 mM EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C. Jeśli okap z przepływem laminarnym jest wyposażony w płytę grzewczą, wykonaj ten krok oraz czynności opisane w rozdziale 4 na płycie grzewczej, aby uzyskać lepszą przyczepność.
  3. Po 1 minutowej inkubacji usunąć roztwór EDTA i ostrożnie dodać 1 ml pożywki hESC + bFGF za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Delikatnie rozcieraj tą samą pipetą, aby uwolnić kolonie z warstwy komórek zasilających. Kontynuuj ostrożne rozcieranie, aż warstwa komórek zasilających poluzuje się i złoży w osobną kępę. Odciągnij warstwę komórek podajnika za pomocą końcówki pipety.
  4. Przenieść zawieszone kolonie hESC/hiPSC za pomocą nowej pipety o pojemności 1 ml do nowych szalek hodowlanych zawierających komórki zasilające i pożywkę hESC + bFGF, rozdzielając w stosunku 1:5. Kolonie mają tendencję do równomiernego rozmieszczania się w każdym nowym naczyniu hodowlanym, ale ułatwiają to, delikatnie przesuwając naczynie z boku na bok. Pożywkę hESC + bFGF należy wymieniać codziennie aż do następnego pasażu (zwykle po 1 tygodniu).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W testach i porównaniach udokumentowanych poniżej, użyliśmy dwóch linii hESC (H9 i HS429, odpowiednio z WiCell i Instytutu Karolinska) oraz dwóch linii hiPSC (NCS001 i NCS002, obie wygenerowane przez Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells). Dane przedstawione na rysunkach i tabelach pochodzą z linii hESC, ale zupełnie podobne wyniki uzyskano z linii hiPSC.

W naszych rękach mechaniczne zbieranie powodowało, że kolonie były dzielone na około pięć do sześciu kęp o średnicy ~200-250 μm, podczas gdy przy indukowanej przez EDTA dezadhezji, po której następowało rozcieranie, każda kolonia była dzielona na ~10-20 kęp o średnicy ~60 μm. Szacujemy, że liczba komórek w każdej grupie zebranej przez EDTA wynosi ~20. Ponieważ niepraktyczne jest dzielenie kolonii na kępy tej wielkości za pomocą skalpela, pod tym względem dysadhezja wywołana EDTA jest lepsza, ponieważ generuje grudki o rozmiarze bardziej korzystnym dla przeżycia komórki kolonii10,11.

Kolonie hESC/hiPSC zebrane za pomocą EDTA były również bardziej jednorodne pod względem wielkości i kształtu w porównaniu do kolonii zebranych mechanicznie (Rysunek 1A-F). Dzieje się tak, ponieważ cięcie wymagane do zbioru mechanicznego generuje nierówne krawędzie i różne rozmiary kępek. Aby ocenić to ilościowo, oceniliśmy okrągłość kolonii (jako miarę tego, jak zaokrąglone były krawędzie kolonii; wartość 1 oznacza idealne koło) 5 dni po przejściu przy użyciu protokołu ImageJ-win6412. Cyrkularność kolonii była istotnie niższa w koloniach zbieranych mechanicznie (zbiór mechaniczny: 0,61 ± 0,10; Zbiór na podstawie EDTA: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, test U-Manna-Whitneya, U = 10).

Gęstość komórek w zebranych i ponownie posianych koloniach, która jest miarą interakcji komórka-komórka po zbiorze podczas tworzenia kolonii, była podobna do zbioru opartego na EDTA i mechanicznego zbierania (Tabela 1 i Rysunek 1G,H). Kolonie zbierane mechanicznie miały większą tendencję do rozwoju nekrozy w swoich centralnych regionach (Ryc. 1J). Było to prawdopodobnie spowodowane zmiennością kształtu, a w szczególności wielkości mechanicznie izolowanych grudek komórek, ponieważ gdy te grudki są zbyt duże, mogą łatwo składać się na siebie po przeniesieniu do nowych szalek hodowlanych. Inaczej było w przypadku kolonii zebranych przy użyciu EDTA, które jednolicie wykazywały półprzezroczysty wygląd z wyraźnymi krawędziami (Rysunek 1I).

Korzystając z zbierania opartego na EDTA, byliśmy w stanie zebrać w zasadzie wszystkie kolonie, które zostały założone w studni w ciągu 2-3 minut. Korzystając z mechanicznego zbierania, zebranie wszystkich kolonii w studni byłoby żmudne i czasochłonne. Zazwyczaj udawało nam się zebrać tylko ~30%, czyli ~20-25 kolonii, przy użyciu mechanicznego zbioru, a to trwało ~20 min. Podobnie, stosując trawienie kolagenazą, a następnie delikatne skrobanie, zazwyczaj trudno było zebrać wszystkie kolonie, chociaż cała procedura trwała tylko kilka minut. W związku z tym zbiór oparty na EDTA jest równie szybki lub szybszy niż zbiór enzymatyczny i bardziej wydajny niż zbiór mechaniczny lub enzymatyczny.

Aby ocenić wpływ różnych metod zbioru na łodygę i pluripotencję, najpierw poddaliśmy kolonie uzyskane po 20 przejściach za pomocą EDTA lub mechanicznego zbioru analizie qPCR (Rysunek 2) i barwieniu immunocytochemicznemu (Rysunek 3 i Rysunek 4) dla znaczników pnia. Kolonie uzyskane przy użyciu obu metod wykazywały stabilną ekspresję markerów pnia zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Następnie oceniliśmy pluripotencję poprzez różnicowanie do trzech listków zarodkowych w ciałach embrionalnych ( Rysunek 5 i Rysunek 6). Ciała zarodkowe wygenerowane z hESC lub hiPSC uzyskanych po 20 pasażach przy użyciu dowolnej metody zawierały mieszaninę komórek wykazujących ekspresję powszechnie ocenianych markerów ektodermy, mezodermy i endodermy.

Na koniec, oceniliśmy częstość występowania aberracji genomowych u hESC i hiPSC pasażowanych każdą metodą za pomocą analizy genetycznej opartej na qPCR (patrz Tabela Materiałów). Kolonie uzyskane po 20 pasażach przy użyciu dowolnej metody zbioru wykazywały pewne przykłady niewielkiego odchylenia od referencyjnego diploidalnego wzorca chromosomowego (oceniane nieprawidłowości były powszechnie związane z przeprogramowaniem hiPSC, ale można je również uzyskać w hESC) (Ryc. 7). Wzorzec tych odchyleń był jednak zasadniczo taki sam w przypadku kolonii uzyskanych po obu metodach zbioru, co wskazuje, że nie były one związane z metodą zbioru.

figure-results-1
Rysunek 1: Morfologia kolonii i gęstość komórek po zbiorach opartych na EDTA lub mechanicznych. (A-F) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu kolonii hESC H9 założonych w hodowli bez karmienia przez 5 dni po 20 przejściach przy użyciu (A-C) EDTA lub (D-F) mechanicznego zbierania. (G,H) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne gęstości komórek w koloniach hESC H9 utworzonej po 20 pasażach przy użyciu (G) EDTA lub (H) mechanicznego zbierania. Jądra komórkowe są barwione DAPI. (I,J) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu kolonii hESC H9 powstałych po 20 pasażach przy użyciu (I) zbierania opartego na EDTA lub (J) mechanicznego. Zwróć uwagę na nekrotyczny obszar centralny w kolonii zbierany mechanicznie (strzałka w J). Wszystkie zdjęcia zostały wykonane 5 dni po 20. przejściu. Podziałka = 100 μm. Skróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ekspresja mRNA markera macierzystego w dwóch liniach hESC (H9 i HS429) wygenerowanych po mechanicznym zbiorze opartym na EDTA. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym wskazanych markerów w hESC H9 (górny panel) i HS429 (dolny panel) po pojedynczym przejściu przy użyciu mechanicznego zbierania, po 20 pasażach przy użyciu mechanicznego zbierania i po 20 pasażach przy użyciu zbierania opartego na EDTA (rozcieńczenie 1:5). Poziom ekspresji jest względny w stosunku do genu porządkowego ACTB (beta-aktyny). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Skróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ekspresja białek markerowych łodygi w linii H9 hESC po różnych warunkach zbioru. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne kolonii hESC H9 zebranych mechanicznie (A-E) przed dalszym pasażowaniem, (F-J) po 20 pasażach przy użyciu mechanicznego zbioru, oraz (K-O) po 20 przejściach z wykorzystaniem zbierania na bazie EDTA. Podziałka = 100 μm. Skróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ekspresja białek markerowych łodygi w linii HS429 hESC po różnych warunkach zbioru. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne kolonii HS429 hESC zebranych mechanicznie (A-E) przed dalszym pasażowaniem, (F-J) po 20 pasażach przy użyciu mechanicznego zbioru, oraz (K-O) po 20 przejściach z wykorzystaniem zbioru opartego na EDTA. Podziałka = 100 μm. Skróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ekspresja markerów dla trzech listków zarodkowych w ciałach zarodków wygenerowanych z linii hESC H9 po mechanicznym lub opartym na EDTA pobraniu. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne markerów dla (rzędy A i D) ektodermy (ECTO, TUJI), endodermy (rzędy B i E) (ENDO, AFP) oraz mezodermy (rzędy C i F) (MESO, SMA). EB generowane (A-C) po 20 przejściach zbioru mechanicznego lub (D-F) po 20 przejściach zbioru opartego na EDTA. Podziałka = 40 μm. Skróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; EBs = ciała embrionalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Ekspresja markerów dla trzech listków zarodkowych w ciałach zarodków wygenerowanych z linii HS429 hESC po mechanicznym lub opartym na EDTA pobraniu. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne markerów dla (rzędy A i D) ektodermy (ECTO, TUJI), (rzędy B i E) endodermy (ENDO, AFP) oraz (C i F rzędy) mezoderma (MESO, SMA). EB generowane (A-C) po 20 przejściach zbioru mechanicznego (A-C) lub (D-F) po 20 przejściach zbioru opartego na EDTA. Podziałka = 40 μm. Skróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; EBs = ciała embrionalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: analiza genetyczna oparta na qPCR powszechnych aberracji genomowych w liniach ESC HS9 i HS429 oraz linii iPSC NCS002 po 20 przejściach przy użyciu zbierania mechanicznego lub opartego na EDTA. Linia wyjściowa przy wartości 2 reprezentuje normalną diploidalność we wszystkich markerach chromosomowych. Wartość 1 lub 3 oznaczałaby odpowiednio utratę lub zysk wskazanego markera chromosomowego we wszystkich komórkach. Wartości pośrednie między 1 a 2 lub między 2 a 3 wskazują na obecność utraty lub przyrostu wskazanego markera we frakcji komórek. Należy zauważyć, że wzorzec aberracji jest podobny w obu warunkach zbioru. Skróty: ESC = embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; iPSC = indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. SZT. pkt. pkt. pkt. pkt.
Gęstość komórek (komórki/mm2)
Klasa H9znaczyćstandardowe odchylenie
Zbiór mechaniczny przed dalszym przejściemNumer katalogowy: 3918263,3
Zbiór mechaniczny 20 razy3868197,7
Zbierz EDTA 20 razyNumer katalogowy: 4080127,8
Zobacz materiał HS429znaczyćstandardowe odchylenie
Zbiór mechaniczny przed dalszym przejściemNumer katalogowy: 5249565,4
Zbiór mechaniczny 20 razyNumer katalogowy: 5247726,3 pkt.
Zbierz EDTA 20 razyNumer katalogowy: 4963448,8

Tabela 1: Porównanie gęstości komórek w koloniach z dwóch linii hESC (H9 i HS429) wygenerowanych po zbiorze opartym na EDTA lub mechanicznym. Gęstość komórek oceniano albo po pojedynczym pasażu przy użyciu mechanicznego zbierania, po 20 pasażach przy użyciu mechanicznego zbierania, albo po 20 pasażach przy użyciu zbierania opartego na EDTA (przy rozcieńczeniu 1:5). We wszystkich przypadkach n = 5 kolonii.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy szybką i opłacalną metodę zbierania hESC i hiPSC hodowanych na komórkach zasilających za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA i porównaliśmy ją przede wszystkim z konwencjonalną metodą mechanicznego zbierania przy użyciu skalpela. Porównaliśmy również zbiór oparty na EDTA z zbiorem enzymatycznym pod względem szybkości metody, ale nie aspektów uzyskanej jakości kolonii. Powodem tego jest fakt, że zbiór enzymatyczny jest z natury bardziej zmienny i wiąże się z częstszym występowaniem aberracji genomowych5, co może zaciemniać różnice między metodami.

Wykazaliśmy, że zbiór oparty na EDTA jest szybszy i bardziej wydajny niż którakolwiek z pozostałych metod i generuje mniejsze i morfologicznie bardziej jednorodne kolonie niż zbiór mechaniczny. Ta ostatnia cecha jest korzystna w odniesieniu do przeżywalności komórek, ponieważ większe grudki uzyskane w wyniku mechanicznego zbioru są podatne na nekrozę centralną, podczas gdy trawienie enzymatyczne ma tendencję do generowania izolowanych hESC i hiPSC, które są bardziej podatne na apoptozę i wymagają dodatkowego leczenia, na przykład inhibitorami ROCK, aby przeżyć. Zbiór oparty na EDTA może być stosowany dla co najmniej 20 pasaży. Metody zbierania oparte na EDTA i mechaniczne są porównywalne, jeśli chodzi o gęstość komórek kolonii, ekspresję mRNA i białek genów macierzystych, różnicowanie trzech listków zarodkowych w ciałach zarodkowych oraz nieprawidłowości genomowe. Jeśli celem jest wydajność, wyższa wydajność, mniejsza zmienność i łagodniejsze obchodzenie się z hESC i hiPSC, preferowane jest zbieranie oparte na EDTA.

Zauważamy również, że oparte na EDTA zbieranie hESC i hiPSC hodowanych na komórkach karmicielskich jest niedrogim sposobem na utrzymanie bardziej naiwnego stanu i zapewnia płynne przejście od hodowli opartej na karmicielu do hodowli bez karmienia, gdy jest to pożądane.

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Najbardziej krytycznymi etapami dysadhezji za pośrednictwem EDTA są sekcja 3 protokołu (inkubacja w roztworze EDTA) i sekcja 4 (rozcieranie). Jeśli ekspozycja na roztwór EDTA jest dłuższa niż 1 minuta, zwiększa się ryzyko całkowitej dysocjacji na pojedyncze komórki. Może się to również zdarzyć, jeśli roztarcie jest zbyt długotrwałe lub zbyt ostre. Na to ostatnie ma wpływ rozmiar końcówki pipety. Idealne jest użycie pipet do hodowli komórkowych o pojemności 1 ml, jak opisano tutaj. Używanie innego typu pipety o mniejszej średnicy końcówki jest ryzykowne.

Rozwiązywanie problemów
Jeśli komórki karmiące nadal się namnażają, zatrzymanie mitotyczne nie było skuteczne i należy pobrać nową partię i wznowić procedurę. Jeśli kolonie nie odkleją się od warstwy komórek zasilających, należy upewnić się, że w EDTA nie ma Ca2+ i że naczynie hodowlane zawierające kolonie jest dobrze przepłukane PBS w celu usunięcia pozostałej pożywki do hodowli komórkowych przed dodaniem EDTA. Zbyt duża dysocjacja, która generuje izolowane komórki lub zbyt małe grudki komórek, może powstać z powodu nadmiernego roztarcia i utrudnia tworzenie nowych kolonii. Stopień roztarcia należy określić empirycznie w próbnych seriach protokołu, aby potwierdzić, że powstałe grudki komórek mają średnicę ~60 μm. Jeśli warstwa zasilająca samoistnie odczepia się od naczynia hodowlanego, zwłaszcza zanim hESC/hiPSC będą gotowe do zbioru, może to być spowodowane tym, że komórki karmiące nie zostały wykorzystane w ciągu ~7 dni po przygotowaniu. W związku z tym ramy czasowe użytkowania ogniw zasilających powinny być uważnie monitorowane. Jeśli warstwa zasilająca dysocjuje podczas ekspozycji na EDTA (coś, czego nigdy nie zaobserwowaliśmy w przypadku użytych tutaj komórek zasilających), należy zmienić albo typ komórki zasilającej, albo metodę ich hodowli.

Ograniczenia techniki
Głównym ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona oględzin procesu odklejania się, aby osiągnąć pomyślny wynik. Oznacza to, że użytkownicy muszą nauczyć się rozpoznawać, kiedy kolonie uwalniają się z warstwy komórek zasilających, a warstwa komórek zasilających rozluźnia się od podłoża. Nie jest to jednak trudne, a z naszego doświadczenia wynika, że nowi użytkownicy tej techniki mogą ją opanować w ciągu kilku prób.

Istnieje również nieodłączna możliwość, że zebrane hESC lub hiPSC mogą być zanieczyszczone przez kilka komórek zasilających. Jeżeli zamiarem jest przeniesienie do warunków niebędących żywicielami lub wyizolowanie hESC lub hiPSC do testów, takie zanieczyszczenie zagroziłoby czystości. Zauważamy, że w przypadku zastosowanych tutaj komórek żywicielskich (fibroblasty ludzkiego napletka) niezwykle trudno jest zdysocjować warstwę komórek karmiących, nawet przy trawieniu enzymatycznym (nie pokazano). Ponieważ niezdysocjowana warstwa komórek zasilających jest usuwana in toto, zanieczyszczenie zebranych hESC lub hiPSC jest prawdopodobnie znikome. Ponieważ komórki zasilające są ponadto zatrzymywane mitotycznie wszelkie zanieczyszczenia ostatecznie zmniejszyłyby się do zera wraz z dalszym pasażowaniem hESC lub hiPSC.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Obecną normą dla hodowli hESC i hiPSC jest to, że odbywa się to w warunkach wolnych od karmienia, w przypadku których stosowanie EDTA do pasażowania jest powszechne. Hodowla bez karmnika zależy od użycia specjalnie opracowanych pożywek i substratów hodowlanych, które zapewniają przyleganie. Odczynniki te wiążą się z dodatkowym wydatkiem, który może przekroczyć budżety niektórych laboratoriów. Ponadto hodowla w warunkach wolnych od karmienia wiąże się z zaburzonym potencjałem różnicowania ze względu na brak specyficznych czynników w pożywkach hodowlanych bez karmienia i wynikające z tego przejście ze stanu naiwnego do stanu zagruntowanego. Wzrost na mitotycznie zatrzymanych komórkach żywicielskich pozwala uniknąć tego przejścia i może obniżyć ogólne koszty do możliwego do opanowania poziomu, ułatwiając w ten sposób szersze zastosowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych w badaniach laboratoryjnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Joel C. Glover jest dyrektorem, a Hege Brincker Fjerdingstad jest codziennym kierownikiem Norweskiego Ośrodka Badawczego dla Ludzkich Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych. Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Larsowi Moenowi za pomoc podczas wstępnych eksperymentów oraz Norweskiemu Ośrodkowi Badań nad Ludzkimi Pluripotencjalnymi Komórkami Macierzystymi w Norweskim Centrum Badań nad Komórkami Macierzystymi, Szpitalu Uniwersyteckim w Oslo, za korzystanie z urządzeń. Linię hESC H9 uzyskano z WiCell, a linię hESC HS429 uzyskano z Outi Hovatta w Instytucie Karolinska. Oba zostały wykorzystane zgodnie z Umowami o Transferze Materiałów. Linie hiPSC NCS001 i NCS002 zostały wygenerowane przez norweski ośrodek badań nad ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. To przeprogramowanie i wszystkie opisane tutaj prace zostały wykonane za zgodą Regionalnej Komisji Etycznej Norwegii Południowo-Wschodniej (zatwierdzenie REK 2017/110).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA pH 8,0Invitrogen15575020
15 ml probówki wirówkoweSarstedt62.554.502
2-merkaptoetanolGibco31350-010
50 ml probówki wirówkoweSarstedt62.547.254
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)PeproTechAF-100-18B-250UG
Marka Bü rker ChamberFisher Scientific10628431
Skalpele jednorazowe nr 15Susann-Morton505
DPBS (1x) bez Ca/MgGibco14190-094
Naczynie do hodowli tkankowych Easy Grip, 35 x 10 mmPipeta Falcon353001
Eppendorf 1 mlEppendorf
Pipeta Eppendorf 200 μ LEppendorf
FBS (Surowica bydlęca płodu)Gibco10270-106
Końcówka filtra 1,000 μ LSarstedt70.1186.210
Końcówka filtra 200 μ LSarstedt70.760.211
Gamma Cell 3000 Maszyna do napromieniania ELAN (alternatywnie użyj mitomycyny C do zatrzymania proliferacji)Najlepsza TheratronicsBT/MTS 8007 GC3000E
Glutamax 100xGibco35050-038
Matryca o obniżonym współczynniku wzrostuCorning734-0269
H9 linia hESCWiCellWAe009-A
Zestaw do analizy genetycznej hPSC Technologiekomórek macierzystych#07550
HS429 Linia hESC ECACCKIe024-A
Ludzkie fibroblasty napletka -CRL2429 liniaATTCCRL2429
IMDM (1x)Gibco21980-032
Linie iPSCNorweski główny zakład dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystychNCS001 i NCS002
Knockout DMEMGibco10829-018
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny lub odpowiednik (używamy LSM 700 firmy Zeiss)Mikroskop Zeiss
CETI
Mitomycyna CSigma AldrichM4287
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140.035
Pipety, plastik 10 mlSarstedt86.1254.001
Pipety plastikowe, 5 mlSarstedt86.1253.001
Wymiana surowicy (SR)Gibco10828-028
Filtry sterylne 0,22 umSarstedt83.1826.102
Kolba hodowlana T-75ThermoScientific156499
Barwienie niebieskim trypanem (0,4 %)Gibco15250-061
Trypsyna-EDTA, 500 mlGibco25300062

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Skottman, H., Hovet, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).
  2. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  3. Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9(2015).
  4. Villa-Diaz, L. G., et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).
  5. Watanabe, M., et al. TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids. Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).
  6. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).
  7. Inzunza, J., et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
  8. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  9. Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117(2020).
  10. Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).
  11. Meng, G., Rancourt, D. E. Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pasa owanie z u yciem EDTAodklejanie koloniizbieranie mechanicznemarkery pluripotencjicia a zarodkowewarstwa kom rek karmicielina wietlanie gamma

Powiązane artykuły