Aby uniknąć ograniczeń związanych z enzymatycznym lub mechanicznym pasażowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) hodowanych na komórkach żywicielskich, ustaliliśmy szybką, skuteczną, ekonomiczną, wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC lub hiPSC utrzymywanych na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA.
Artykuł metodologiczny
Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (ludzkie embrionalne komórki macierzyste, hESC i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, hiPSC) były pierwotnie hodowane na różnych typach komórek żywiących w celu utrzymania w stanie niezróżnicowanym w długoterminowej hodowli. Podejście to zostało w dużym stopniu wyparte przez protokoły hodowli bez karmienia, ale obejmują one droższe odczynniki i mogą sprzyjać przejściu do stanu zaszczepionego, co ogranicza zdolność różnicowania komórek. Zarówno w warunkach żywienia, jak i bez karmienia, zbiór kolonii hESC lub hiPSC w celu pasażowania jest niezbędną procedurą do rozszerzania kultur.
Aby zapewnić łatwą i wydajną procedurę pasowania hESC/hiPSC hodowanych na komórkach zasilających, opracowaliśmy metodę zbierania za pomocą dysadhezji wywołanej przez chelator wapnia kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Oceniliśmy wydajność i jakość powstałych pasażowanych komórek, porównując to podejście z pierwotnym podejściem do zbioru mechanicznego, w którym kolonie są izolowane skalpelem pod mikroskopem (zbiór mechaniczny został wybrany jako komparator, aby uniknąć zmienności odczynników związanej z zbieraniem enzymatycznym).
W jednym zestawie eksperymentów, dwie różne linie hESC były utrzymywane na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka. Każda linia została poddana wielu pasażom przy użyciu zbioru opartego na EDTA lub mechanicznym zbieraniu i oceniona pod kątem wielkości i morfologii kolonii, gęstości komórek, ekspresji markerów macierzystości, różnicowania do trzech listków zarodkowych w ciałach zarodkowych i aberracji genomowych. W innym zestawie eksperymentów zastosowaliśmy zbieranie oparte na EDTA na dwóch różnych liniach hiPSC i uzyskaliśmy podobne wyniki. Dysadhezja wywołana EDTA zaoszczędziła czas i dała wyższy plon kolonii o korzystniejszej wielkości i bardziej jednolitej morfologii w porównaniu z zbiorem mechanicznym. Był również szybszy niż zbiór enzymatyczny i nie był podatny na zmienność partii enzymów. Metoda odadhezyjnej indukowanej EDTA ułatwia również przenoszenie linii hESC/hiPSC z hodowli opartej na komórkach zasilających do warunków wolnych od zasilania, jeśli jest to pożądane do dalszego wykorzystania i analizy.
Wprowadzenie
Prawidłowe utrzymanie hESC i hiPSC in vitro jest podstawową i wygodną metodologią dla kilku kierunków badań nad komórkami ludzkimi i biologią rozwojową. Ze względu na nieodłączny napęd hESC i hiPSC do różnicowania, utrzymanie stanu niezróżnicowanego in vitro wymaga szczególnej troski i uwagi. W związku z tym opracowanie opłacalnych protokołów utrzymania i pasażowania hESC i hiPSC przy jak najmniejszej zmienności metodologicznej ma ogromne ogólne znaczenie.
Pierwotnie, hESC i hiPSC były hodowane na różnych typach komórek zasilających, aby pomóc w długoterminowej hodowli i utrzymaniu stanu niezróżnicowanego1,2,3. Ostatnio hodowla w warunkach wolnych od karmników stała się normą, ponieważ całkowicie unika się pracy z komórkami zasilającymi4. Jednak niektóre laboratoria i główne obiekty nadal hodują hESC lub hiPSC na komórkach zasilających. Posiew bez karmnika jest droższy, ponieważ wymaga użycia pożywek hodowlanych o specjalnym składzie i pewnej formy powlekania powierzchni hodowli w celu zapewnienia przylegania do kolonii (główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej [ECM] lub komercyjny związek ECM lub użycie dostępnych na rynku powlekanych płytek). Wydatek nie jest błahy i stanowi potencjalną przeszkodę finansową dla niektórych laboratoriów zainteresowanych prowadzeniem prac badawczo-rozwojowych w oparciu o hESC lub hiPSC. Co więcej, hodowla w warunkach wolnych od żywicieli ma tendencję do doprowadzania hESC i hiPSC do mniej naiwnego stanu niż ten, który utrzymuje się na komórkach karmicielskich5, co może zagrozić późniejszemu różnicowaniu i prowadzić do zmienności genetycznej6.
Historycznie, pasażowanie hESC i hiPSC hodowanych na komórkach karmiących wymagało mechanicznego zbierania - przy użyciu skalpela do wycinania kolonii pod mikroskopem7 - ale później zostało to w dużej mierze zastąpione przez trawienie enzymatyczne z lub bez delikatnego skrobania w celu wyizolowania kolonii lub zdysocjowanych komórek. Zbiór mechaniczny jest żmudny i wymaga precyzyjnej mikrochirurgii. Zbieranie enzymatyczne może różnić się wydajnością ze względu na różnice enzymatyczne między partiami i ma tendencję do faworyzowania całkowitej dysocjacji, co sprzyja śmierci komórki, chyba że przeciwdziałają im inhibitory ROCKS8,9 i zwiększa częstość występowania nieprawidłowych kariotypów9.
Aby skorzystać z niższych kosztów i większego potencjału różnicowania hodowli hESC i hiPSC na komórkach zasilających, unikając jednocześnie wad mechanicznego i enzymatycznego zbierania, opracowaliśmy szybką, skuteczną, efektywną kosztowo i wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC i hiPSC utrzymywanych na warstwie zasilającej ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA. Porównaliśmy plon, zmienność i jakość komórek macierzystych z tymi uzyskanymi przy zbiorze mechanicznym (nie porównaliśmy z trawieniem enzymatycznym ze względu na dodatkową zmienność, jaką pociąga za sobą to podejście). Zauważamy, że dysadhezja za pośrednictwem EDTA działa również dobrze przy przenoszeniu kolonii z hodowli opartej na karmicielu do warunków wolnych od karmnika, jeśli jest to pożądane do dalszego wykorzystania i analiz. Ta metoda zapewnia przejście ze spójną metodą pasażowania, ponieważ dysadhezja wywołana EDTA jest popularnym podejściem stosowanym w przypadku kultur bezżywiowych.
Protokół
Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów używanych w tym protokole.
1. Hodowla ludzkich komórek fibroblastów i przygotowanie warstwy komórek zasilających
- Nasiona 0,5 × 106 ludzkich fibroblastów napletka (zwanych dalej "komórkami żywicielskimi") na każdą kolbę hodowlaną T-75 (liczba kolb w razie potrzeby) z 20 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco firmy Iscove (IMDM) z (w/) 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), zwaną dalej "pożywką dla komórek karmiących".
- Gdy komórki zasilające osiągną 90% konfluencji, usuń pożywkę i przemyj 3x 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco na kolbę, aby uniknąć zahamowania trypsyny przez czynniki w pożywce. Dodać 2 ml trypsyny-EDTA do każdej kolby i umieścić kolbę(-y) w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na 5 minut lub do momentu, gdy komórki zasilające odłączą się od kolby(-ów). Obserwuj oderwanie się komórek pod mikroskopem jako pływające agregaty komórek lub pojedyncze komórki.
- Dodać 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki z ogniwami zasilającymi do każdej kolby, aby dezaktywować trypsynę-EDTA, a następnie delikatnie zawiesić komórki zasilające przez pipetowanie.
- Przenieś komórki zasilające do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zakryj probówkę i osadzaj komórki podajnika przez odwirowanie w ilości 200 × g przez 5 minut.
- Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu w komórce zasilającej. Następnie ostrożnie ponownie zawiesić osad w 4 ml świeżej pożywki z komórek podajnika. Upewnij się, że ogniwa zasilające są dokładnie zawieszone przed liczeniem za pomocą komory do liczenia komórek lub innego urządzenia do liczenia komórek.
- Dodać 0,5 × 106 komórek zasilających do wymaganej liczby nowych kolb hodowlanych T-75 do ekspansji i dodać 20 ml świeżej pożywki z komórek zasilających do każdej kolby. Inkubować kolbę(-i) hodowlaną(-e) w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 do momentu, gdy komórki zasilające osiągną 90% zbieżności.
UWAGA: Ogniwa zasilające mogą być używane do co najmniej przejścia 25. - Obliczyć liczbę komórek zasilających wymaganą do liczby szalek do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm, które zostaną użyte do hodowli hESC/hiPSC.
UWAGA: Zwykle 3,0 × 105 komórek zasilających na naczynie do hodowli tkankowej wystarcza do wytworzenia zlewającej się warstwy komórek zasilających. - Aby uniknąć proliferacji komórek zasilających, upewnij się, że są one mitotycznie zatrzymane na jeden z dwóch sposobów.
UWAGA: W przypadku obu metod można wygenerować dużą partię mitotycznie zatrzymanych komórek zasilających i zamrozić je w podwielokrotnościach do późniejszego wykorzystania.- Przeprowadzić zatrzymanie mitotyczne przez promieniowanie gamma, przenosząc wszystkie potrzebne komórki zasilające do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i uzupełniając pożywką z ogniw zasilających do całkowitej objętości 5 ml. Natychmiast przetransportować w temperaturze pokojowej do maszyny do napromieniowania gamma i naświetlić w celu mitotycznego zatrzymania ogniw zasilających (300 kV i 10 mA przez 20 min).
UWAGA: Opóźnienie w transporcie może prowadzić do niepożądanego przymocowania komórek podajnika do ścianki probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli transport trwa dłużej niż kilka minut, upewnij się, że ogniwa podajnika pozostają zawieszone podczas transportu, ciągle mieszając rurkę. - Przeprowadzić zatrzymanie mitotyczne przy użyciu mitomycyny C, przenosząc wszystkie komórki zasilające potrzebne w 5 ml pożywki z komórkami zasilającymi do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie dodać 15 ml pożywki z komórek zasilających zawierającej 20 μg/ml mitomycyny C i inkubować w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C/5% przez 3 godziny. Dodać 20 ml PBS o temperaturze 37 °C, Osadzać komórki przez odwirowanie w ilości 200 × g przez 5 minut, powtórzyć płukanie PBS jeszcze dwa razy i ponownie zawiesić w pożywce zasilającej.
- Przeprowadzić zatrzymanie mitotyczne przez promieniowanie gamma, przenosząc wszystkie potrzebne komórki zasilające do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i uzupełniając pożywką z ogniw zasilających do całkowitej objętości 5 ml. Natychmiast przetransportować w temperaturze pokojowej do maszyny do napromieniowania gamma i naświetlić w celu mitotycznego zatrzymania ogniw zasilających (300 kV i 10 mA przez 20 min).
- Po mitotycznym zatrzymaniu komórek karmiących należy powrócić do okapu do hodowli tkankowej i rozłożyć komórki karmiciela na płytce w temperaturze 3,0 × 105 komórek na 35 mm naczynie do hodowli tkankowej, w następujący sposób. Upewnij się, że komórki zasilające są całkowicie zawieszone, dodaj pożywkę z komórek zasilających, aby osiągnąć stężenie komórek zasilających 1,5 × 105 na ml i dodaj 2 ml tej zawiesiny komórek zasilających do każdego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
- Przenieść szalki hodowlane do inkubatora o temperaturze 37 °C/5% CO2 . Aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek podajnika, przesuwaj szalki hodowlane powoli, ale stanowczo na półce inkubatora do przodu i do tyłu 3x, po czym następuje pauza, a następnie wykonaj tę samą czynność od lewej do prawej 3x. Nie przesuwaj ponownie naczyń i delikatnie zamknij drzwi inkubatora.
- Po 24 godzinach zmień pożywkę z komórek zasilających na IMDM z 10% wymianą surowicy (SR). Pożywkę należy wymieniać co trzeci dzień. Ogniwa zasilające są gotowe do użycia po pierwszych 3 dniach.
2. Mechaniczne pobieranie kolonii hESC lub hiPSC
- Wstępnie rozgrzana pożywka hESC składająca się z 80% zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 20% SR, 1 mM substytutu glutaminy 100x, 1 mM aminokwasów endogennych (NEAA), 1 mM penicyliny/streptomycyny (P/S), 0,1 mM 2-merkaptoetanolu i 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Pożywkę hESC stosuje się do hodowli komórek hESC lub hiPSC na komórkach zasilających.
- Pobrać świeże szalki do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm zawierające mitotycznie zatrzymane komórki żywiciela i zastąpić pożywkę z komórek karmiących 1,2 ml pożywki hESC zawierającej bFGF co najmniej 30 minut przed przeniesieniem kolonii hESC/hiPSC.
- Umieścić naczynie hodowlane zawierające kolonie hESC/hiPSC na mitotycznie zatrzymanych komórkach zasilających pod mikroskopem o 10-krotnym powiększeniu umieszczonym w okapie z przepływem laminarnym. Użyj sterylnego skalpela, aby ostrożnie przeciąć obwód każdej kolonii, a następnie pokrój każdą kolonię na 5-6 mniej więcej równych kawałków. Ostrożnie podnieś kawałki kolonii końcówką ostrza skalpela, tak aby oderwały się od warstwy komórek zasilających i swobodnie unosiły się w podłożu.
- Staraj się unikać regionów kolonii, które zawierają różnicujące się komórki, które wyglądają jak wyspy mniejszych komórek z mniej wyraźnymi jądrami w porównaniu z hESC/hiPSC w kolonii.
- Przenieść swobodnie pływające kolonie za pomocą pipety o pojemności 1 ml do nowych szalek hodowlanych zawierających komórki zasilające. Staraj się trzymać kolonie oddzielnie, aby później nie wrastały na siebie. Ostrożnie przenieś szalki hodowlane do inkubatora komórkowego i unikaj naruszania naczyń do następnego dnia.
- Następnego dnia ostrożnie dodać 600 μl pożywki hESC zawierającej bFGF do końcowej objętości 1,8 ml. Pożywkę hESC + bFGF należy wymieniać codziennie aż do następnego pasażu (zwykle po 1 tygodniu).
3. Zbieranie kolonii hESC lub hiPSC za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA
- Weź świeże szalki hodowlane z mitotycznie zatrzymanymi komórkami zasilającymi i zmień IMDM z 10% SR na 1,2 ml wstępnie podgrzanej pożywki hESC + bFGF co najmniej 30 minut przed przeniesieniem kolonii.
- Dotykaj jednorazowo jednej szalki hodowlanej zawierającej kolonie hESC lub hiPSC. Usuń pożywkę hESC + bFGF i przemyj kolonie 1 ml DPBS o temperaturze pokojowej, aby wyeliminować wszelkie możliwe nieprzyłączone komórki i resztki komórek. Dodać 1 ml 0,5 mM EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C. Jeśli okap z przepływem laminarnym jest wyposażony w płytę grzewczą, wykonaj ten krok oraz czynności opisane w rozdziale 4 na płycie grzewczej, aby uzyskać lepszą przyczepność.
- Po 1 minutowej inkubacji usunąć roztwór EDTA i ostrożnie dodać 1 ml pożywki hESC + bFGF za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Delikatnie rozcieraj tą samą pipetą, aby uwolnić kolonie z warstwy komórek zasilających. Kontynuuj ostrożne rozcieranie, aż warstwa komórek zasilających poluzuje się i złoży w osobną kępę. Odciągnij warstwę komórek podajnika za pomocą końcówki pipety.
- Przenieść zawieszone kolonie hESC/hiPSC za pomocą nowej pipety o pojemności 1 ml do nowych szalek hodowlanych zawierających komórki zasilające i pożywkę hESC + bFGF, rozdzielając w stosunku 1:5. Kolonie mają tendencję do równomiernego rozmieszczania się w każdym nowym naczyniu hodowlanym, ale ułatwiają to, delikatnie przesuwając naczynie z boku na bok. Pożywkę hESC + bFGF należy wymieniać codziennie aż do następnego pasażu (zwykle po 1 tygodniu).
Wyniki
W poniżej udokumentowanych analizach i porównaniach wykorzystano dwie linie hESC (H9 oraz HS429, pochodzące odpowiednio z WiCell i Instytutu Karolinska) oraz dwie linie hiPSC (NCS01 i NCS02, obie wygenerowane przez Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells). Dane przedstawione na rysunkach i w tabelach pochodzą z linii hESC, jednak w przypadku linii hiPSC uzyskano całkowicie analogiczne wyniki.
W naszych badaniach mechaniczne zbieranie spowodowało podział kolonii na około pięć do sześciu skupisk o średnicy ~20-250 µm, natomiast w przypadku odklejania indukowanego EDTA z następującą po nim tryturacją, każda kolonia została podzielona na ~10-20 skupisk o średnicy ~60 µm. Szacujemy, że liczba komórek w każdym skupisku zebranym przy użyciu EDTA wynosi ~20. Ponieważ podział kolonii na skupiska tej wielkości za pomocą skalpela jest niepraktyczny, pod tym względem odklejanie indukowane EDTA jest lepszą metodą, gdyż generuje skupiska o rozmiarze bardziej sprzyjającym przeżywalności komórek kolonii10,1.
Kolonie hESC/hiPSC pozyskane przy użyciu EDTA były również bardziej jednorodne pod względem rozmiaru i kształtu w porównaniu do kolonii pozyskanych mechanicznie (Rysunek 1A-F). Wynika to z faktu, że cięcie niezbędne przy pobieraniu mechanicznym powoduje powstawanie nierównych krawędzi i skupisk o różnej wielkości. Aby ocenić to ilościowo, zbadaliśmy kolistość kolonii (jako miarę zaokrąglenia krawędzi kolonii; wartość 1 oznacza idealne koło) 5 dni po pasażowaniu, stosując protokół ImageJ-win6412. Kolistość kolonii była znacząco niższa w przypadku kolonii pozyskanych mechanicznie (pozyskiwanie mechaniczne: 0,61 ± 0,10; pozyskiwanie w oparciu o EDTA: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, test U Manna-Whitneya, U = 10).
Gęstość komórek w zebranych i ponownie wysianych koloniach, będąca miarą interakcji komórka-komórka po zbiorze podczas tworzenia się kolonii, była podobna w przypadku zbioru z użyciem EDTA oraz zbioru mechanicznego (Tabela 1 oraz Rycina 1G,H). Kolonie zebrane mechanicznie wykazywały większą tendencję do rozwoju nekrozy w regionach centralnych (Rycina 1J). Było to prawdopodobnie spowodowane zmiennością kształtu i, w szczególności, wielkości mechanicznie izolowanych skupisk komórek, ponieważ gdy skupiska te są zbyt duże, mogą łatwo zwijać się podczas przenoszenia na nowe naczynia hodowlane. Niey miało to miejsca w przypadku kolonii zebranych z użyciem EDTA, które jednolicie wykazywały półprzezroczysty wygląd z wyraźnymi krawędziami (Rycina 1I).
Stosując metodę zbioru opartą na EDTA, byliśmy w stanie zebrać praktycznie wszystkie kolonie powstałe w dołku w ciągu 2-3 min. W przypadku zbioru mechanicznego zebranie wszystkich kolonii z dołka byłoby żmudne i czasochłonne. Zazwyczaj udawało nam się zebrać tylko ~30%, czyli ~20-25 kolonii, stosując zbiór mechaniczny, a zajmowało to ~20 min. Podobnie, przy zastosowaniu trawienia kolagenazą z następującym po nim delikatnym skrobaniem, zazwyczaj trudno było zebrać wszystkie kolonie, choć cała procedura trwała zaledwie kilka minut. Zatem zbiór oparty na EDTA jest tak samo szybki lub szybszy niż zbiór enzymatyczny i bardziej efektywny niż zbiór mechaniczny lub enzymatyczny.
Aby ocenić wpływ różnych metod zbioru na stan macierzyście i pluripotencję, poddano najpierw kolonie uzyskane po 20 pasażach przy użyciu zbioru opartego na EDTA lub zbioru mechanicznego analizie qPCR (Rysunek 2) oraz barwieniu immunocytochemicznemu (Rysunek 3 i Rysunek 4) w kierunku markerów macierzyistości. Kolonie uzyskane obiema metodami wykazały stabilną ekspresję markerów macierzyistości zarówno na poziomie mRNA, jak i białek. Następnie oceniono pluripotencję poprzez różnicowanie do trzech listków zarodkowych w ciałach embrionalnych (Rysunek 5 i Rysunek 6). Ciała embrionalne wytworzone z hESC lub hiPSC uzyskanych po 20 pasażach przy użyciu dowolnej z metod zawierały mieszaninę komórek wykazujących ekspresję powszechnie stosowanych markerów ektodermy, mezodermy i endodermy.
W końcu oceniliśmy częstość występowania aberracji genomowych w hESC i hiPSC pasażowanych każdą z metod, wykorzystując analizę genetyczną opartą na qPCR (patrz Tabela materiałów). Kolonie uzyskane po 20 pasażach przy zastosowaniu obu metod zbioru wykazywały niektóre przykłady niewielkich odchyleń od referencyjnego diploidowego wzorca chromosomowego (ocenione nieprawidłowości były tymi, które powszechnie wiążą się z reprogramowaniem hiPSC, ale mogą one również wystąpić w hESC) (Rycina 7). Jednakże wzorzec tych odchyleń był w zasadzie taki sam w koloniach uzyskanych po zastosowaniu obu metod zbioru, co wskazuje, że nie były one powiązane z metodą zbioru.
Rysunek 1Morfologia kolonii i gęstość komórek po zbiorach z wykorzystaniem EDTA lub metod mechanicznych. (A-F) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu kolonii hESC H9 hodowanych w warunkach bezkarmiących przez 5 dni po 20 pasażach przy użyciu (A-C) oparty na EDTA lub (D-F) zbiór mechaniczny. (G,H) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne gęstości komórek w koloniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) linii H9, ustanowionych po 20 pasażach przy użyciu (G) oparty na EDTA lub (H) zbiór mechaniczny. Jądra komórkowe są barwione DAPI. (I,J) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu kolonii hESC H9 ustanowionych po 20 pasażach z użyciem (I) oparty na EDTA lub (J) zbiór mechaniczny. Zwróć uwagę na nekrotyczny obszar centralny w kolonii zebranej mechanicznie (strzałka w J). Wszystkie obrazy pozyskano 5 dni po 20. pasażu. Paski skali = 100 µmSkróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2Ekspresja mRNA markerów macierzystości w dwóch liniach hESC (H9 i HS429) uzyskanych po zbiorze z wykorzystaniem EDTA lub metodą mechaniczną. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym dla wskazanych markerów w hESC H9 (górny panel) i HS429 (dolny panel) po pojedynczym pasażowaniu z użyciem zbioru mechanicznego, po 20 pasażowaniach z użyciem zbioru mechanicznego oraz po 20 pasażowaniach z użyciem zbioru w oparciu o EDTA (rozcieńczenie 1:5). Poziom ekspresji jest względny w stosunku do genu referencyjnego. ACTB (beta-aktyna). Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Skróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3Ekspresja białek markerów pluripotencji w linii hESC H9 po zastosowaniu różnych warunków zbioru. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne kolonii hESC H9 pobranych mechanicznie (A-E) przed dalszym pasażowaniem, (F-J) po 20 pasażach z wykorzystaniem zbioru mechanicznego, i (K-O) po 20 pasażach z wykorzystaniem zbioru opartego na EDTA. Paski skali = 100 µmSkróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4Ekspresja białek markerów pluripotencji w linii hESC HS429 po zastosowaniu różnych warunków zbioru. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne kolonii hESC HS429 pobranych mechanicznie (A-E) przed dalszym pasażowaniem, (F-J) po 20 pasażach z wykorzystaniem zbioru mechanicznego, i (K-O) po 20 pasażach z wykorzystaniem zbioru opartego na EDTA. Paski skali = 100 µmSkróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5Ekspresja markerów trzech listków zarodkowych w ciałach embrionalnych generowanych z linii hESC H9 po zbiorze mechanicznym lub z zastosowaniem EDTA. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne markerów dla (A i D rzędy) ektoderma (ECTO, TUJI), (B i E rzędy) endodermy (ENDO, AFP), i (C i F rzędy) mezodermy (MESO, SMA). Wygenerowane ciałka embrionalne (EBs) (A-C) po 20 pasażach mechanicznego pozyskiwania lub (D-F) po 20 pasażach zbiórki z użyciem EDTA. Paski skali = 40 µmSkróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; EBs = ciała embrionoidalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6Ekspresja markerów trzech listew zarodkowych w ciałach zarodkowych generowanych z linii hESC HS429 po mechanicznym lub EDTA-opartym zbieraniu. Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne markerów dla (A i D rzędy) ektodermy (ECTO, TUJI), (B i E wiersze) endodermy (ENDO, AFP), oraz (C i F rzędy) mezodermy (MESO, SMA). Wygenerowane ciała embrionalne (EB) (A-C) po 20 pasażach zbioru mechanicznego (A-C) lub (D-F) po 20 pasażach zbiórki z wykorzystaniem EDTA. Paski skali = 40 µmSkróty: hESC = ludzka embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; EBs = ciała embrionalne. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 7Analiza genetyczna oparta na qPCR powszechnych aberracji genomowych w liniach ESC HS9 i HS429 oraz linii iPSC NCS02 po 20 pasażach z wykorzystaniem zbioru mechanicznego lub opartego na EDTA. Linia bazowa na wartości 2 reprezentuje prawidłową diploidalność we wszystkich markerach chromosomalnych. Wartość 1 lub 3 reprezentowałaby odpowiednio utratę lub przyrost wskazanego markera chromosomalnego we wszystkich komórkach. Wartości pośrednie między 1 a 2 lub między 2 a 3 wskazują na obecność utraty lub przyrostu wskazanego markera w części komórek. Należy zauważyć, że wzorzec aberracji jest podobny w obu warunkach zbioru. Skróty: ESC = embrionalna komórka macierzysta; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; iPSC = indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
| Gęstość komórek (cells/mm2) | ||
| H9 | średnia | odchylenie std. |
| Zbiór mechaniczny przed dalszym pasażowaniem | 3918 | 263.3 |
| Zbiór mechaniczny (20 razy) | 3868 | 197.7 |
| Zbiór z EDTA (20 razy) | 4080 | 127.8 |
| HS429 | średnia | odchylenie std. |
| Zbiór mechaniczny przed dalszym pasażowaniem | 5249 | 565.4 |
| Zbiór mechaniczny (20 razy) | 5247 | 726.3 |
| Zbiór z EDTA (20 razy) | 4963 | 48.8 |
Tabela 1: Porównanie gęstości komórek w koloniach z dwóch linii hESC (H9 i HS429) uzyskanych po zbiorze z użyciem EDTA lub metodą mechaniczną. Gęstość komórek oceniano po pojedynczym pasażu z zastosowaniem zbioru mechanicznego, po 20 pasażach z zastosowaniem zbioru mechanicznego lub po 20 pasażach z zastosowaniem zbioru z użyciem EDTA (przy rozcieńczeniu 1:5). We wszystkich przypadkach n = 5 kolonii.
Dyskusja
Opisaliśmy szybką i opłacalną metodę zbierania hESC i hiPSC hodowanych na komórkach zasilających za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA i porównaliśmy ją przede wszystkim z konwencjonalną metodą mechanicznego zbierania przy użyciu skalpela. Porównaliśmy również zbiór oparty na EDTA z zbiorem enzymatycznym pod względem szybkości metody, ale nie aspektów uzyskanej jakości kolonii. Powodem tego jest fakt, że zbiór enzymatyczny jest z natury bardziej zmienny i wiąże się z częstszym występowaniem aberracji genomowych5, co może zaciemniać różnice między metodami.
Wykazaliśmy, że zbiór oparty na EDTA jest szybszy i bardziej wydajny niż którakolwiek z pozostałych metod i generuje mniejsze i morfologicznie bardziej jednorodne kolonie niż zbiór mechaniczny. Ta ostatnia cecha jest korzystna w odniesieniu do przeżywalności komórek, ponieważ większe grudki uzyskane w wyniku mechanicznego zbioru są podatne na nekrozę centralną, podczas gdy trawienie enzymatyczne ma tendencję do generowania izolowanych hESC i hiPSC, które są bardziej podatne na apoptozę i wymagają dodatkowego leczenia, na przykład inhibitorami ROCK, aby przeżyć. Zbiór oparty na EDTA może być stosowany dla co najmniej 20 pasaży. Metody zbierania oparte na EDTA i mechaniczne są porównywalne, jeśli chodzi o gęstość komórek kolonii, ekspresję mRNA i białek genów macierzystych, różnicowanie trzech listków zarodkowych w ciałach zarodkowych oraz nieprawidłowości genomowe. Jeśli celem jest wydajność, wyższa wydajność, mniejsza zmienność i łagodniejsze obchodzenie się z hESC i hiPSC, preferowane jest zbieranie oparte na EDTA.
Zauważamy również, że oparte na EDTA zbieranie hESC i hiPSC hodowanych na komórkach karmicielskich jest niedrogim sposobem na utrzymanie bardziej naiwnego stanu i zapewnia płynne przejście od hodowli opartej na karmicielu do hodowli bez karmienia, gdy jest to pożądane.
Krytyczne kroki w ramach protokołu
Najbardziej krytycznymi etapami dysadhezji za pośrednictwem EDTA są sekcja 3 protokołu (inkubacja w roztworze EDTA) i sekcja 4 (rozcieranie). Jeśli ekspozycja na roztwór EDTA jest dłuższa niż 1 minuta, zwiększa się ryzyko całkowitej dysocjacji na pojedyncze komórki. Może się to również zdarzyć, jeśli roztarcie jest zbyt długotrwałe lub zbyt ostre. Na to ostatnie ma wpływ rozmiar końcówki pipety. Idealne jest użycie pipet do hodowli komórkowych o pojemności 1 ml, jak opisano tutaj. Używanie innego typu pipety o mniejszej średnicy końcówki jest ryzykowne.
Rozwiązywanie problemów
Jeśli komórki karmiące nadal się namnażają, zatrzymanie mitotyczne nie było skuteczne i należy pobrać nową partię i wznowić procedurę. Jeśli kolonie nie odkleją się od warstwy komórek zasilających, należy upewnić się, że w EDTA nie ma Ca2+ i że naczynie hodowlane zawierające kolonie jest dobrze przepłukane PBS w celu usunięcia pozostałej pożywki do hodowli komórkowych przed dodaniem EDTA. Zbyt duża dysocjacja, która generuje izolowane komórki lub zbyt małe grudki komórek, może powstać z powodu nadmiernego roztarcia i utrudnia tworzenie nowych kolonii. Stopień roztarcia należy określić empirycznie w próbnych seriach protokołu, aby potwierdzić, że powstałe grudki komórek mają średnicę ~60 μm. Jeśli warstwa zasilająca samoistnie odczepia się od naczynia hodowlanego, zwłaszcza zanim hESC/hiPSC będą gotowe do zbioru, może to być spowodowane tym, że komórki karmiące nie zostały wykorzystane w ciągu ~7 dni po przygotowaniu. W związku z tym ramy czasowe użytkowania ogniw zasilających powinny być uważnie monitorowane. Jeśli warstwa zasilająca dysocjuje podczas ekspozycji na EDTA (coś, czego nigdy nie zaobserwowaliśmy w przypadku użytych tutaj komórek zasilających), należy zmienić albo typ komórki zasilającej, albo metodę ich hodowli.
Ograniczenia techniki
Głównym ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona oględzin procesu odklejania się, aby osiągnąć pomyślny wynik. Oznacza to, że użytkownicy muszą nauczyć się rozpoznawać, kiedy kolonie uwalniają się z warstwy komórek zasilających, a warstwa komórek zasilających rozluźnia się od podłoża. Nie jest to jednak trudne, a z naszego doświadczenia wynika, że nowi użytkownicy tej techniki mogą ją opanować w ciągu kilku prób.
Istnieje również nieodłączna możliwość, że zebrane hESC lub hiPSC mogą być zanieczyszczone przez kilka komórek zasilających. Jeżeli zamiarem jest przeniesienie do warunków niebędących żywicielami lub wyizolowanie hESC lub hiPSC do testów, takie zanieczyszczenie zagroziłoby czystości. Zauważamy, że w przypadku zastosowanych tutaj komórek żywicielskich (fibroblasty ludzkiego napletka) niezwykle trudno jest zdysocjować warstwę komórek karmiących, nawet przy trawieniu enzymatycznym (nie pokazano). Ponieważ niezdysocjowana warstwa komórek zasilających jest usuwana in toto, zanieczyszczenie zebranych hESC lub hiPSC jest prawdopodobnie znikome. Ponieważ komórki zasilające są ponadto zatrzymywane mitotycznie wszelkie zanieczyszczenia ostatecznie zmniejszyłyby się do zera wraz z dalszym pasażowaniem hESC lub hiPSC.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Obecną normą dla hodowli hESC i hiPSC jest to, że odbywa się to w warunkach wolnych od karmienia, w przypadku których stosowanie EDTA do pasażowania jest powszechne. Hodowla bez karmnika zależy od użycia specjalnie opracowanych pożywek i substratów hodowlanych, które zapewniają przyleganie. Odczynniki te wiążą się z dodatkowym wydatkiem, który może przekroczyć budżety niektórych laboratoriów. Ponadto hodowla w warunkach wolnych od karmienia wiąże się z zaburzonym potencjałem różnicowania ze względu na brak specyficznych czynników w pożywkach hodowlanych bez karmienia i wynikające z tego przejście ze stanu naiwnego do stanu zagruntowanego. Wzrost na mitotycznie zatrzymanych komórkach żywicielskich pozwala uniknąć tego przejścia i może obniżyć ogólne koszty do możliwego do opanowania poziomu, ułatwiając w ten sposób szersze zastosowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych w badaniach laboratoryjnych.
Oświadczenia
Joel C. Glover jest dyrektorem, a Hege Brincker Fjerdingstad jest codziennym kierownikiem Norweskiego Ośrodka Badawczego dla Ludzkich Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych. Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Dziękujemy Larsowi Moenowi za pomoc podczas wstępnych eksperymentów oraz Norweskiemu Ośrodkowi Badań nad Ludzkimi Pluripotencjalnymi Komórkami Macierzystymi w Norweskim Centrum Badań nad Komórkami Macierzystymi, Szpitalu Uniwersyteckim w Oslo, za korzystanie z urządzeń. Linię hESC H9 uzyskano z WiCell, a linię hESC HS429 uzyskano z Outi Hovatta w Instytucie Karolinska. Oba zostały wykorzystane zgodnie z Umowami o Transferze Materiałów. Linie hiPSC NCS001 i NCS002 zostały wygenerowane przez norweski ośrodek badań nad ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. To przeprogramowanie i wszystkie opisane tutaj prace zostały wykonane za zgodą Regionalnej Komisji Etycznej Norwegii Południowo-Wschodniej (zatwierdzenie REK 2017/110).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 ml probówki wirówkowe | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 ml probówki wirówkowe | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Marka Bü rker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Skalpele jednorazowe nr 15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) bez Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Naczynie do hodowli tkankowych Easy Grip, 35 x 10 mm | Pipeta Falcon | 353001 | |
| Eppendorf 1 ml | Eppendorf | ||
| Pipeta Eppendorf 200 μ L | Eppendorf | ||
| FBS (Surowica bydlęca płodu) | Gibco | 10270-106 | |
| Końcówka filtra 1,000 μ L | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Końcówka filtra 200 μ L | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 Maszyna do napromieniania ELAN (alternatywnie użyj mitomycyny C do zatrzymania proliferacji) | Najlepsza Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Matryca o obniżonym współczynniku wzrostu | Corning | 734-0269 | |
| H9 linia hESC | WiCell | WAe009-A | |
| Zestaw do analizy genetycznej hPSC Technologie | komórek macierzystych | #07550 | |
| HS429 Linia hESC | ECACC | KIe024-A | |
| Ludzkie fibroblasty napletka -CRL2429 linia | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| Linie iPSC | Norweski główny zakład dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych | NCS001 i NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny lub odpowiednik (używamy LSM 700 firmy Zeiss) | Mikroskop Zeiss | ||
| CETI | |||
| Mitomycyna C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Aminokwasy endogenne (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipety, plastik 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipety plastikowe, 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Wymiana surowicy (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Filtry sterylne 0,22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| Kolba hodowlana T-75 | ThermoScientific | 156499 | |
| Barwienie niebieskim trypanem (0,4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsyna-EDTA, 500 ml | Gibco | 25300062 |
Bibliografia
- Skottman, H., Hovet, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9(2015).
- Villa-Diaz, L. G., et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).
- Watanabe, M., et al. TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids. Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).
- Inzunza, J., et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117(2020).
- Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).
- Meng, G., Rancourt, D. E. Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Przedruki i uprawnienia
