Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) jest używana przez badaczy od kiedy została po raz pierwszy wprowadzona jako wygodne podejście do uzyskania obrazowania w super rozdzielczości za pomocą konwencjonalnych mikroskopów, takich jak mikroskopy epifluorescencyjne i konfokalne^1,2,3,4,5^,6,7. Korzystając z ExM, możliwe jest osiągnięcie rozdzielczości bocznej ~70 nm nawet przy użyciu zwykłych mikroskopów konfokalnych. Gdy ExM jest połączony z obrazowaniem w superrozdzielczości, rozdzielczość jest jeszcze lepsza. Na przykład można osiągnąć rozdzielczość około 30 nm za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM) i rozdzielczość około 4 nm za pomocą stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM)^1,5.

Jednak niska skuteczność etykietowania jest krytycznym problemem w przypadku standardowych metod ExM. Utrata fluorescencji może się różnić w zależności od rodzaju grup fluorescencyjnych i czasu trawienia. Średnio jednak doniesiono, że ponad 50% fluoroforów jest traconych po etapach polimeryzacji i trawienia białek ExM, co jest szkodliwe dla jakości obrazowania^3,4.

W ten sposób opracowano mikroskopię rozszerzającą zapamiętywanie etykiet (LR-ExM), która może skutecznie zatrzymywać etykiety i zmniejszać straty sygnału¹. Kluczową innowacją LR-ExM jest zastosowanie zestawu trójfunkcyjnych kotwic, a nie tylko barwników fluorescencyjnych - jak w standardowej procedurze ExM - do barwienia interesujących białek. Te trójfunkcyjne łączniki składają się z trzech części: (1) łącznika (np. N-hydroksysukcynimidu (NHS)) do połączenia z przeciwciałem, (2) kotwicy (np. metakryloamidu (MA)) do zakotwiczenia białek w polimerze oraz (3) łącznika reporterowego (np. biotyny lub digoksygeniny (DIG)) do koniugacji z barwnikiem organicznym. Trójfunkcyjne kotwice przetrwają etapy polimeryzacji i trawienia białek, a tym samym zapobiegają utracie fluoroforu.

Ponadto, ta metoda ma ogromny potencjał, ponieważ jest kompatybilna z samoetykietującymi znacznikami enzymatycznymi, takimi jak SNAP czy CLIP. Metody znaczników enzymatycznych mają pewne zalety w porównaniu z podejściem immunologicznym pod względem wysokiej swoistości i skuteczności znakowania^8,9,10.

W tym manuskrypcie szczegółowo opisano procedurę LR-ExM. LR-ExM to wysoce skuteczna i elastyczna metoda pozwalająca osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną przy zwiększonej wydajności etykietowania.

1. Hodowla komórkowa

1. Użyj komórek U2OS hodowanych w pożywce McCoy's 5A uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Hodować komórki na 16-dołkowym wyjmowanym komorowym szkle nakrywkowym (powierzchnia hodowli 0,4^cm2) dla łatwości obsługi.

2. Utrwalenie i przepuszczalność

UWAGA: Warunki fiksacji i przenikania zależą od zoptymalizowanych protokołów barwienia immunologicznego. Poniżej znajduje się protokół utrwalania i przepuszczalności mikrotubul do barwienia immunologicznego i dołów pokrytych klatryną (CCP).

1. Gdy liczba komórek osiągnie ~ 0,04 x 10⁶, utrwal komórki za pomocą 100 μl 3,2% paraformaldehydu (PFA) w buforze PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA i 1 mM MgCl₂, pH 6,9) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (Tabela 1).
   UWAGA: Mocowanie za pomocą PFA odbywa się w certyfikowanym kapturze ochronnym.
2. Przemyć komórki trzy razy przez 5 minut każdy, 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
3. Przepuszczalność komórek za pomocą 100 μl buforu permeabilizacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut (Tabela 1).
   UWAGA: Kontynuuj znakowanie tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć degradacji docelowego białka, RNA lub DNA i uzyskać optymalny wynik. Jeśli jednak zajdzie taka potrzeba, utrwalone próbki mogą być przechowywane przez wydłużony czas (do miesiąca) w buforze PBS w temperaturze 4 °C. Odparowany PBS należy wymienić i chronić próbkę przed fotobieleniem.

3. Endogenne blokowanie streptawidyny i biotyny

1. Inkubować komórki z roztworem streptawidyny rozcieńczonym w buforze blokującym komórki (100 μl) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (Tabela 1).
2. Przepłukać krótko 200 μl buforu blokującego komórki.
3. Inkubować komórki ze 100 μl roztworu biotyny rozcieńczonego w buforze blokującym komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: W przypadku korzystania z metody samodzielnego etykietowania, takiej jak używanie znaczników SNAP lub CLIP-, pomiń krok 4 i przejdź do kroku 5.1: podejście do samodzielnego etykietowania.

4. Barwienie przeciwciał pierwotnych

1. Inkubować komórki z szczurzym przeciwciałem anty-α-tubulinowym (rozcieńczenie 1:500) i króliczym przeciwciałem przeciwko klatrynie łańcucha ciężkiego (rozcieńczenie 1:100) w 100 μl buforu blokującego komórki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dwukrotnie wydłużyć czas inkubacji próbek tkanek.
2. Próbki należy przemywać czterokrotnie 200 μl PBS przez 5 minut każda.

5. Barwienie przeciwciał wtórnych specyficznych dla LR-ExM

1. Sprzężone przeciwciała IgG z trójfunkcyjnymi łącznikami, takimi jak N-hydroksysukcynimid (NHS) - metakryloamid (MA) - biotyna lub NHS-MA-digoksygenina (Dig) (Figura 1B). Synteza trójfunkcyjnych kotwic i koniugacja przeciwciał drugorzędowych zostały wcześniej wprowadzone w Shi et al.¹. Podejście do samoznakowania: Sprzężone przeciwciała IgG z trójfunkcyjnymi łącznikami, takimi jak MA- benzylguanina (BG)-Biotyna lub MA- benzylocytozyna (BC)-Dig (Figura 1B). Synteza trójfunkcyjnych kotwic i koniugacja drugorzędowych przeciwciał zostały wcześniej wprowadzone w Shi et al.¹.
2. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi anty-królika-Dig-MA (rozcieńczenie 1:100) i osła anty-szczur-biotyna-MA (rozcieńczenie 1:100) w 100 μl buforu blokującego komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Należy podwoić ten czas inkubacji dla próbek tkanek.
3. Próbki należy przemywać czterokrotnie w 200 μl PBS przez 5 minut każda.

6. Dodatkowe zakotwiczenie

1. Inkubować komórki z 0,25% aldehydem glutarowym (GA) w PBS (100 μl) przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zakotwiczenia białek na hydrożelu. Alternatywnie do zakotwiczenia należy użyć 25 mM estru N-hydroksysukcynimidu kwasu metakrylowego (MA-NHS). Zaleca się jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.
2. Próbki należy myć trzykrotnie w PBS przez 5 minut każda.

7. Żelowanie

UWAGA: Szybkość rozprężania jest określana przez czas dyfuzji soli i wody na zewnątrz lub do żelu; tak więc odlewanie cienkich żeli przyspiesza czas rozprężania.

1. Usuń górną strukturę 16-dołkowej płytki żelowej. Dodać 40 μl roztworu monomeru do każdej studzienki, aby kondycjonować komórki na lodzie. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
   1. Aby przygotować roztwór monomeru, patrz Tabela 2.
2. Przygotować roztwór żelujący na lodzie. Dodać podwójnie destylowaną wodę i 10% akcelerator N,N,N′,N′ tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu monomeru (10% TEMED: roztwór monomeru = 1:47); nie dodawaj jeszcze inicjatora (Tabela 3).
3. W komorze do hodowli komórkowej o powierzchni 0,4^cm2 należy użyć roztworu żelującego o objętości około 40 μl. Przygotować 45 μl roztworu żelującego na każdą studzienkę.
4. Dodać 10% nadsiarczanu amonu (APS) do roztworu żelującego, inkubować na lodzie i natychmiast odpipetować 40 μl roztworu żelującego do każdej silikonowej uszczelki dobrze na lodzie. Inkubować na lodzie przez 3 minuty (10% APS: 10% TEMED: roztwór monomeru = 1:1:47).
5. Chronić próbkę przed światłem i przenieść szkło nakrywkowe z szalki Petriego o średnicy 10 cm do inkubatora o temperaturze 37 °C na 1,5 godziny w celu żelowania. Aby utrzymać wilgotność żelu podczas inkubacji w temperaturze 37 °C, przykryć szalkę Petriego pokrywką i wlać kilka kropli wody do płytki Petriego.

8. Trawienie

1. Po żelowaniu wyjmij szklankę, aby oddzielić żel i przenieś żel na płytkę 6-dołkową. Trawić osadzone komórki za pomocą 2 ml buforu wytrawiającego (tabela 1) przez noc w temperaturze pokojowej lub 4 godziny w temperaturze 37 °C. Użyć co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do wytrawiania.
2. Żele należy myć z co najmniej 10-krotnym nadmiarem wody niż końcowa objętość żelu. Powtórz etap prania cztery razy przez 20 do 30 minut za każdym razem. Żel rozszerza się około dwukrotnie w każdym wymiarze.
   UWAGA: Próbki żelu można przechowywać do 1 miesiąca w buforze PBS w temperaturze 4 °C. Wymień odparowaną wodę, aby uniknąć wysuszenia i chroń próbkę przed światłem podczas przechowywania. Aby uniknąć degradacji kotew trójfunkcyjnych, próbki należy zabarwić jak najszybciej po roztrawieniu i umyciu.

9. Barwienie fluorescencyjne po trawieniu

1. Inkubować żele w objętości 2 ml buforu barwiącego streptawidynę (STV)/digoksygeninę (DIG) z 2 do 5 μM barwnikiem STV i/lub barwnikiem anty-DIG przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Próbki należy przechowywać w ciemności.

10. Rozbudowa

1. Umyj i rozpręż żel czterokrotnie nadmiarem wody (2-3 ml) przez 30 minut do 1 godziny za każdym razem.
2. Dla łatwiejszej wizualizacji komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, wybarwić komórki DAPI podczas trzeciego z pięciu myć. Rozcieńczyć stężenie podstawowe DAPI (5 mg/ml, przechowywane w temperaturze 4 °C) w rozcieńczeniach 1:5 000 w wodzie do mycia. Żel inkubować z roztworem wodnym DAPI (2 ml) przez 30 minut do 1 godziny.
3. Przemyć jeszcze dwa razy 3 ml wody.
4. Rozpręż żele w dowolnym płaskim naczyniu, które jest wystarczająco duże, aby pomieścić próbki. Żele ekspandowane, które są przygotowywane na szkle nakrywkowym o powierzchni^{0,4 cm i 2} cm, dobrze mieszczą się w 6-dołkowej płytce ze szklanym dnem.
   UWAGA: Próbki barwione po ekspandowaniu mogą być przechowywane do 4 miesięcy w buforze PBS w temperaturze 4°C. Dodaj tyle wody, aby uniknąć wysuszenia i chronić próbkę przed fotowybielaniem. Powtórz etap ekspansji i barwienia DAPI przed obrazowaniem. Aby uniknąć ryzyka degradacji fluoroforu, próbki należy jak najszybciej zobrazować.

11. Obrazowanie

1. Pokryj 6-dołkową komorę obrazowania ze szklanym dnem 0,01% poli-L-lizyny (po 3 ml każda) w celu unieruchomienia próbek żelu.
2. Przenieść próbki żelu do powlekanej komory obrazowania.
3. Zobrazuj próbki za pomocą dowolnych lunet fluorescencyjnych.

Doły pokryte klatryną (CCP) są barwione immunologicznie za pomocą trójfunkcyjnych kotwic (Rysunek 1B), a LR-ExM jest wykonywany zgodnie z opisem w Rysunek 1A. LR-ExM (Rysunek 2C,E) wykazuje znacznie wyższą intensywność fluorescencji w porównaniu z mikroskopią ekspansji retencji białek (proExM, Rysunek 2A) lub biotyna-ExM (Rysunek 2B); sygnał dla LR-ExM był około sześć razy wyższy niż proExM (Rysunek 2D). LR-ExM może skutecznie wychwytywać małe struktury, takie jak CCP, które są nawet mniejsze niż limit dyfrakcji (Rysunek 2F,G).

Niektóre reprezentatywne wyniki LR-ExM są prezentowane przy użyciu metody barwienia immunologicznego. Mikrotubule i CCP są współimmunologicznie barwione przy użyciu trójfunkcyjnych kotwic, w tym NHS-MA-DIG i NHS-MA-biotyny (Rysunek 3A,B). LR-ExM jest dostępny w podejściu enzymatycznym opartym na znacznikach. Wynik przedstawiono przy użyciu kotew trójfunkcyjnych BG-MA-biotyna (dla SNAP-tag) i BC-MA-DIG (dla CLIP-tag) w Rysunek 3C-F. Co więcej, w LR-ExM można połączyć zarówno barwienie immunologiczne, jak i podejście znacznika białkowego, jak pokazano na Rysunek 3G-J. Na podstawie tych wyników potwierdzono, że LR-ExM jest korzystny dla uzyskania wysokiej jakości obrazów o zwiększonej wydajności i rozdzielczości etykietowania.

LR-ExM wykazuje również doskonałą wydajność w próbkach tkanek. LR-ExM przeprowadza się na tkance mózgowej myszy poprzez koimmunologiczne barwienie markera presynaptycznego fagotu i markera postsynaptycznego Homera1. Obie etykiety są wyraźne i dobrze oddzielone, co zapewnia wysoką rozdzielczość i wydajność etykietowania (Rysunek 4A-E).

Rysunek 1: Przebieg pracy mikroskopii ekspansji retencji etykiet (LR-ExM). (a) Przebieg pracy LR-ExM. (B) Schematy kotew trójfunkcyjnych. Ten rysunek został zmodyfikowany z Shi et al.1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kwantyfikacja zatrzymywania sygnału (A-C) Mikroskopia ekspansywna (ExM) obrazy konfokalne wgłębień pokrytych klatryną (CCP) w komórkach U2OS pośrednio wybarwionych immunologicznie dla łańcucha ciężkiego klatryny (POI). (A) Retencja białka ExM (ProExM) przy użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z AF488. (B) ExM z znakowaniem po ekspandacji przy użyciu przeciwciał sprzężonych z biotyną. (C) LR-ExM przy użyciu przeciwciał sprzężonych z trójfunkcyjnymi kotwicami NHS-MA-biotyna. Próbki w B i C są barwione po ekspandacji streptawidyną-AF488. (D) Kwantyfikacja intensywności A-C. Słupki błędów reprezentują SD. n = 3 dla każdego przypadku. Współczynniki rozszerzania długości obrazów w formatach A, B, C i E-G wynoszą odpowiednio 4,3, 4,5, 4,6 i 4,3. Współczynnik rozszerzalności długości dla próbek użytych na powierzchni D wynosi 4,5 ± 0,2. Podziałki skali, 500 nm (A-C i E) i 100 nm (F i G). Wszystkie podziałki liniowe znajdują się w jednostkach przed rozprężaniem. Arb. u., jednostki dowolne; STV, streptawidyna. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem (Nikon CSU-W1) z obiektywem 60x zanurzonym w wodzie (NA1.27). Ten rysunek został zmodyfikowany z Shi et al.1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki LR-ExM przy użyciu mikroskopów konfokalnych. (A,B) Obrazy konfokalne LR-ExM mikrotubul znakowanych przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z biotyną NHS-MA-biotyna (magenta) i CCP znakowanych przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z NHS-MA-DIG (zielone) w komórce U2OS. (B) Widok w powiększeniu. (C-F) Obrazy konfokalne LR-ExM CCP i / lub mitochondriów w komórkach HeLa znakowane przy użyciu podejścia znacznika białkowego (C), klatryny znakowanej znacznikiem SNAP, (D) znakowanej znacznikiem CLIP TOMM20 i (E) obrazowania dwukolorowego. (F) Widok w powiększeniu. (G) Dwukolorowe konfokalne obrazy LR-ExM wykorzystujące kombinację podejścia immunologicznego (NPC, red hot) i podejścia opartego na znaczniku białkowym (lamina A/C znakowana SNAP (cyjan)). (H) Widok w powiększeniu. (I,J) Widoki poszczególnych kanałów H. Należy zauważyć, że tło cytoplazmatyczne w G jest spowodowane przez przeciwciało anty-NUP153. Współczynniki rozszerzenia długości dla obrazów w formatach A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 i G-J wynoszą 4,5. Podziałka liniowa: 1 μm dla A, 200 nm dla B i F, 500 nm dla C-E, 2 μm dla G i 500 nm dla H, I i J. Wszystkie podziałki liniowe znajdują się w jednostkach przed rozprężaniem. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem (Nikon CSU-W1) z obiektywem 60x zanurzonym w wodzie (NA1.27). Ten rysunek został zmodyfikowany z Shi et al.1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki LR-ExM na próbkach tkanek. (A) Konfokalny obraz LR-ExM wycinka mózgu myszy pośrednio wybarwionego immunologicznie dla markera presynaptycznego fagotu (magenta) i markera postsynaptycznego Homer1 (zielony). (B,C) Powiększone obrazy synaps. (D,E) Profile intensywności poprzecznej wzdłuż długich osi żółtego pola. Fagot jest znakowany przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z NHS-MA-DIG, a Homer1 jest znakowany przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z biotyną NHS-MA. Wszystkie próbki są barwione po ekspandacji streptawindyną-AF488 i/lub anty-digoksyną-AF594. Współczynniki rozszerzania długości dla obrazów w A-C wynoszą 4,2. Podziałki liniowe, 1 μm (A) i 200 nm (B,C). Wszystkie podziałki liniowe znajdują się w jednostkach przed rozprężaniem. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem (Nikon CSU-W1) z obiektywem 60x zanurzonym w wodzie (NA1.27). Ten rysunek został zmodyfikowany z Shi et al.1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Chemikalia i Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Roztwór monomeru Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Roztwór do żelowania Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.