Artykuł metodologiczny

Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63793

⸱

11 października 2022

 ,  , 
1Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California Irvine, 3Department of Chemistry, University of California Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół mikroskopii rozszerzania retencji etykiet (LR-ExM) jest zademonstrowany. LR-ExM wykorzystuje nowatorski zestaw kotew trójfunkcyjnych, który zapewnia lepszą wydajność etykietowania w porównaniu z wcześniej wprowadzonymi mikroskopami ekspandacyjnymi.

Streszczenie

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) to technika przygotowania próbki, którą można połączyć z większością metod mikroskopii świetlnej w celu zwiększenia rozdzielczości. Po zanurzeniu komórek lub tkanek w pęczniejącym hydrożelu, próbki mogą być fizycznie rozszerzane od trzech do szesnastu razy (wymiar liniowy) w porównaniu z pierwotnym rozmiarem. W związku z tym efektywna rozdzielczość każdego mikroskopu jest zwiększana przez współczynnik rozszerzalności. Głównym ograniczeniem wcześniej wprowadzonego ExM jest zmniejszona fluorescencja po polimeryzacji i procedurze trawienia. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano mikroskopię rozszerzającą retencję etykiet (LR-ExM), która zapobiega utracie sygnału i znacznie zwiększa wydajność etykietowania przy użyciu zestawu nowatorskich kotwic trójfunkcyjnych. Technika ta pozwala na osiągnięcie wyższej rozdzielczości podczas badania struktur komórkowych lub subkomórkowych w skali nanometrycznej przy minimalnych stratach sygnału fluorescencyjnego. LR-ExM może być stosowany nie tylko do znakowania immunofluorescencyjnego, ale także do samoznakowania znaczników białkowych, takich jak znaczniki SNAP i CLIP, osiągając w ten sposób wyższą wydajność znakowania. W niniejszej pracy przedstawiono procedurę i rozwiązywanie problemów związanych z tym podejściem opartym na barwieniu immunologicznym, a także omówienie podejść do samoznakowania LR-ExM jako alternatywy.

Wprowadzenie

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) jest używana przez badaczy od kiedy została po raz pierwszy wprowadzona jako wygodne podejście do uzyskania obrazowania w super rozdzielczości za pomocą konwencjonalnych mikroskopów, takich jak mikroskopy epifluorescencyjne i konfokalne1,2,3,4,5,6,7. Korzystając z ExM, możliwe jest osiągnięcie rozdzielczości bocznej ~70 nm nawet przy użyciu zwykłych mikroskopów konfokalnych. Gdy ExM jest połączony z obrazowaniem w superrozdzielczości, rozdzielczość jest jeszcze lepsza. Na przykład można osiągnąć rozdzielczość około 30 nm za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM) i rozdzielczość około 4 nm za pomocą stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM)1,5.

Jednak niska skuteczność etykietowania jest krytycznym problemem w przypadku standardowych metod ExM. Utrata fluorescencji może się różnić w zależności od rodzaju grup fluorescencyjnych i czasu trawienia. Średnio jednak doniesiono, że ponad 50% fluoroforów jest traconych po etapach polimeryzacji i trawienia białek ExM, co jest szkodliwe dla jakości obrazowania3,4.

W ten sposób opracowano mikroskopię rozszerzającą zapamiętywanie etykiet (LR-ExM), która może skutecznie zatrzymywać etykiety i zmniejszać straty sygnału1. Kluczową innowacją LR-ExM jest zastosowanie zestawu trójfunkcyjnych kotwic, a nie tylko barwników fluorescencyjnych - jak w standardowej procedurze ExM - do barwienia interesujących białek. Te trójfunkcyjne łączniki składają się z trzech części: (1) łącznika (np. N-hydroksysukcynimidu (NHS)) do połączenia z przeciwciałem, (2) kotwicy (np. metakryloamidu (MA)) do zakotwiczenia białek w polimerze oraz (3) łącznika reporterowego (np. biotyny lub digoksygeniny (DIG)) do koniugacji z barwnikiem organicznym. Trójfunkcyjne kotwice przetrwają etapy polimeryzacji i trawienia białek, a tym samym zapobiegają utracie fluoroforu.

Ponadto, ta metoda ma ogromny potencjał, ponieważ jest kompatybilna z samoetykietującymi znacznikami enzymatycznymi, takimi jak SNAP czy CLIP. Metody znaczników enzymatycznych mają pewne zalety w porównaniu z podejściem immunologicznym pod względem wysokiej swoistości i skuteczności znakowania8,9,10.

W tym manuskrypcie szczegółowo opisano procedurę LR-ExM. LR-ExM to wysoce skuteczna i elastyczna metoda pozwalająca osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną przy zwiększonej wydajności etykietowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

  1. Użyj komórek U2OS hodowanych w pożywce McCoy's 5A uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  2. Hodować komórki na 16-dołkowym wyjmowanym komorowym szkle nakrywkowym (powierzchnia hodowli 0,4cm2) dla łatwości obsługi.

2. Utrwalenie i przepuszczalność

UWAGA: Warunki fiksacji i przenikania zależą od zoptymalizowanych protokołów barwienia immunologicznego. Poniżej znajduje się protokół utrwalania i przepuszczalności mikrotubul do barwienia immunologicznego i dołów pokrytych klatryną (CCP).

  1. Gdy liczba komórek osiągnie ~ 0,04 x 106, utrwal komórki za pomocą 100 μl 3,2% paraformaldehydu (PFA) w buforze PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA i 1 mM MgCl2, pH 6,9) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (Tabela 1).
    UWAGA: Mocowanie za pomocą PFA odbywa się w certyfikowanym kapturze ochronnym.
  2. Przemyć komórki trzy razy przez 5 minut każdy, 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Przepuszczalność komórek za pomocą 100 μl buforu permeabilizacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut (Tabela 1).
    UWAGA: Kontynuuj znakowanie tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć degradacji docelowego białka, RNA lub DNA i uzyskać optymalny wynik. Jeśli jednak zajdzie taka potrzeba, utrwalone próbki mogą być przechowywane przez wydłużony czas (do miesiąca) w buforze PBS w temperaturze 4 °C. Odparowany PBS należy wymienić i chronić próbkę przed fotobieleniem.

3. Endogenne blokowanie streptawidyny i biotyny

  1. Inkubować komórki z roztworem streptawidyny rozcieńczonym w buforze blokującym komórki (100 μl) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (Tabela 1).
  2. Przepłukać krótko 200 μl buforu blokującego komórki.
  3. Inkubować komórki ze 100 μl roztworu biotyny rozcieńczonego w buforze blokującym komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W przypadku korzystania z metody samodzielnego etykietowania, takiej jak używanie znaczników SNAP lub CLIP-, pomiń krok 4 i przejdź do kroku 5.1: podejście do samodzielnego etykietowania.

4. Barwienie przeciwciał pierwotnych

  1. Inkubować komórki z szczurzym przeciwciałem anty-α-tubulinowym (rozcieńczenie 1:500) i króliczym przeciwciałem przeciwko klatrynie łańcucha ciężkiego (rozcieńczenie 1:100) w 100 μl buforu blokującego komórki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dwukrotnie wydłużyć czas inkubacji próbek tkanek.
  2. Próbki należy przemywać czterokrotnie 200 μl PBS przez 5 minut każda.

5. Barwienie przeciwciał wtórnych specyficznych dla LR-ExM

  1. Sprzężone przeciwciała IgG z trójfunkcyjnymi łącznikami, takimi jak N-hydroksysukcynimid (NHS) - metakryloamid (MA) - biotyna lub NHS-MA-digoksygenina (Dig) (Figura 1B). Synteza trójfunkcyjnych kotwic i koniugacja przeciwciał drugorzędowych zostały wcześniej wprowadzone w Shi et al.1. Podejście do samoznakowania: Sprzężone przeciwciała IgG z trójfunkcyjnymi łącznikami, takimi jak MA- benzylguanina (BG)-Biotyna lub MA- benzylocytozyna (BC)-Dig (Figura 1B). Synteza trójfunkcyjnych kotwic i koniugacja drugorzędowych przeciwciał zostały wcześniej wprowadzone w Shi et al.1.
  2. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi anty-królika-Dig-MA (rozcieńczenie 1:100) i osła anty-szczur-biotyna-MA (rozcieńczenie 1:100) w 100 μl buforu blokującego komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Należy podwoić ten czas inkubacji dla próbek tkanek.
  3. Próbki należy przemywać czterokrotnie w 200 μl PBS przez 5 minut każda.

6. Dodatkowe zakotwiczenie

  1. Inkubować komórki z 0,25% aldehydem glutarowym (GA) w PBS (100 μl) przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zakotwiczenia białek na hydrożelu. Alternatywnie do zakotwiczenia należy użyć 25 mM estru N-hydroksysukcynimidu kwasu metakrylowego (MA-NHS). Zaleca się jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.
  2. Próbki należy myć trzykrotnie w PBS przez 5 minut każda.

7. Żelowanie

UWAGA: Szybkość rozprężania jest określana przez czas dyfuzji soli i wody na zewnątrz lub do żelu; tak więc odlewanie cienkich żeli przyspiesza czas rozprężania.

  1. Usuń górną strukturę 16-dołkowej płytki żelowej. Dodać 40 μl roztworu monomeru do każdej studzienki, aby kondycjonować komórki na lodzie. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
    1. Aby przygotować roztwór monomeru, patrz Tabela 2.
  2. Przygotować roztwór żelujący na lodzie. Dodać podwójnie destylowaną wodę i 10% akcelerator N,N,N′,N′ tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu monomeru (10% TEMED: roztwór monomeru = 1:47); nie dodawaj jeszcze inicjatora (Tabela 3).
  3. W komorze do hodowli komórkowej o powierzchni 0,4cm2 należy użyć roztworu żelującego o objętości około 40 μl. Przygotować 45 μl roztworu żelującego na każdą studzienkę.
  4. Dodać 10% nadsiarczanu amonu (APS) do roztworu żelującego, inkubować na lodzie i natychmiast odpipetować 40 μl roztworu żelującego do każdej silikonowej uszczelki dobrze na lodzie. Inkubować na lodzie przez 3 minuty (10% APS: 10% TEMED: roztwór monomeru = 1:1:47).
  5. Chronić próbkę przed światłem i przenieść szkło nakrywkowe z szalki Petriego o średnicy 10 cm do inkubatora o temperaturze 37 °C na 1,5 godziny w celu żelowania. Aby utrzymać wilgotność żelu podczas inkubacji w temperaturze 37 °C, przykryć szalkę Petriego pokrywką i wlać kilka kropli wody do płytki Petriego.

8. Trawienie

  1. Po żelowaniu wyjmij szklankę, aby oddzielić żel i przenieś żel na płytkę 6-dołkową. Trawić osadzone komórki za pomocą 2 ml buforu wytrawiającego (tabela 1) przez noc w temperaturze pokojowej lub 4 godziny w temperaturze 37 °C. Użyć co najmniej 10-krotnego nadmiaru buforu do wytrawiania.
  2. Żele należy myć z co najmniej 10-krotnym nadmiarem wody niż końcowa objętość żelu. Powtórz etap prania cztery razy przez 20 do 30 minut za każdym razem. Żel rozszerza się około dwukrotnie w każdym wymiarze.
    UWAGA: Próbki żelu można przechowywać do 1 miesiąca w buforze PBS w temperaturze 4 °C. Wymień odparowaną wodę, aby uniknąć wysuszenia i chroń próbkę przed światłem podczas przechowywania. Aby uniknąć degradacji kotew trójfunkcyjnych, próbki należy zabarwić jak najszybciej po roztrawieniu i umyciu.

9. Barwienie fluorescencyjne po trawieniu

  1. Inkubować żele w objętości 2 ml buforu barwiącego streptawidynę (STV)/digoksygeninę (DIG) z 2 do 5 μM barwnikiem STV i/lub barwnikiem anty-DIG przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Próbki należy przechowywać w ciemności.

10. Rozbudowa

  1. Umyj i rozpręż żel czterokrotnie nadmiarem wody (2-3 ml) przez 30 minut do 1 godziny za każdym razem.
  2. Dla łatwiejszej wizualizacji komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, wybarwić komórki DAPI podczas trzeciego z pięciu myć. Rozcieńczyć stężenie podstawowe DAPI (5 mg/ml, przechowywane w temperaturze 4 °C) w rozcieńczeniach 1:5 000 w wodzie do mycia. Żel inkubować z roztworem wodnym DAPI (2 ml) przez 30 minut do 1 godziny.
  3. Przemyć jeszcze dwa razy 3 ml wody.
  4. Rozpręż żele w dowolnym płaskim naczyniu, które jest wystarczająco duże, aby pomieścić próbki. Żele ekspandowane, które są przygotowywane na szkle nakrywkowym o powierzchni0,4 cm i 2 cm, dobrze mieszczą się w 6-dołkowej płytce ze szklanym dnem.
    UWAGA: Próbki barwione po ekspandowaniu mogą być przechowywane do 4 miesięcy w buforze PBS w temperaturze 4°C. Dodaj tyle wody, aby uniknąć wysuszenia i chronić próbkę przed fotowybielaniem. Powtórz etap ekspansji i barwienia DAPI przed obrazowaniem. Aby uniknąć ryzyka degradacji fluoroforu, próbki należy jak najszybciej zobrazować.

11. Obrazowanie

  1. Pokryj 6-dołkową komorę obrazowania ze szklanym dnem 0,01% poli-L-lizyny (po 3 ml każda) w celu unieruchomienia próbek żelu.
  2. Przenieść próbki żelu do powlekanej komory obrazowania.
  3. Zobrazuj próbki za pomocą dowolnych lunet fluorescencyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Doły pokryte klatryną (CCP) są barwione immunologicznie za pomocą trójfunkcyjnych kotwic (Rysunek 1B), a LR-ExM jest wykonywany zgodnie z opisem w Rysunek 1A. LR-ExM (Rysunek 2C,E) wykazuje znacznie wyższą intensywność fluorescencji w porównaniu z mikroskopią ekspansji retencji białek (proExM, Rysunek 2A) lub biotyna-ExM (Rysunek 2B); sygnał dla LR-ExM był około sześć razy wyższy niż proExM (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczową innowacją LR-ExM jest wykorzystanie trójfunkcyjnych kotwic do skutecznego znakowania docelowych białek i poprawy jakości obrazu. Metoda ta jest ograniczona przez kotwice trójfunkcyjne, które nie są tak łatwo dostępne dla badaczy. Jednak trójfunkcyjne kotwice mogą być udostępniane innym badaczom na żądanie, a podobne produkty, takie jak sondy ExM firmy Chrometa, są teraz również dostępne na rynku.

W tym protokole przeprowadzono 1-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej dla etapów b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 do X.S.), U.S. National Science Foundation (DMS1763272 do S.P.) oraz Simons Foundation (594598 do S.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akrylamid Sigma A9099 Żel ExM
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearchH+L, 711– 005-152Przeciwciało
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearchH+L, 712– 005-153Przeciwciało
Alexa Fluor 488-StreptavidinJackson ImmunoResearch016-540-084Sondy fluorescencyjne 
Alexa Fluor 594 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-580-084Sondy fluorescencyjne 
Alexa Fluor 647 StreptavidinJackson ImmunoResearch016-600-084Sondy fluorescencyjne 
Nadsiarczan amonu Sigma A3678 Żel ExM
anty-H3K4me3Abcamab8580Przeciwciało
anty-H3K9me3Abcamab176916Przeciwciało
DAPI dioctanThermofisher ScientificD3571Sondy fluorescencyjne 
DyLight 488 Anty-digoxigenina/digoksyna (DIG)Vector LaboratoriesDI-7488Sondy fluorescencyjne 
DyLight 594 Znakowane anty-digoxigenin/digoksyna (DIG)Vector LaboratoriesDI-7594Sondy fluorescencyjne 
EGTAEMD Millipore Corp.324626-25GMBufor utrwalający
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sigma Bufor trawiennyEDTA
Aldehyd glutarowy 10% EM GradeMikroskopia elektronowa Nauki50-262-13Zakotwiczenie
Grace Bio-Labs CultureDobrze wyjmowana komorowa szklana osłonaGrace Bio-Labs GBL112358-8EAKomora do hodowli komórkowych
Grace Bio-Labs Narzędzie do usuwania CultureWellGrace Bio-Labs GBL103259Narzędzie do usuwania
guanidyny HCl Sigma G3272 Bufor mineralizacyjny
Chlorek magnezuSigmaM8266-1KGBufor utrwalający
McCoy's 5aATCC30– 2007Pożywka hodowlana
Ester N-hydroksysukcynimidu kwasu metakrylowego, 98%  (MA-NHS)Sigma 730300-1GZakotwiczenie
monoklonalne mysie przeciwciało anty-Nup153Abcamab24700Przeciwciało
N,N′ Metylenobisakrylamid Sigma M7279 Żel ExM
N,N,N′,N′ Tetrametyloetylenodiamina  (TEMED)Sigma T7024 Żel ExM
16% Paraformaldehydowe roztwory wodneMikroskopia elektronowa Nauki50-980-487Bufor utrwalający
RURYSigmaP6757-25GBufor utrwalający
Poli-L-LizynaSigmaP8920-100MLPowłoka komory
Proteinaza K Sigma-AldrichP4850-5MLBufor trawienny
Królik przeciwciało przeciw klatrynie o łańcuchach ciężkichAbcamab21679Przeciwciało
anty– &alfa;-tubulina, tyrozynowa, klon YL1/2Millipore SigmaMAB1864-IPrzeciwciało
Akrylan Sodu Sigma408220ExM Gel zestaw
blokujący streptawidynę / biotynęVector LaboratoriesSP-2002Bufor blokujący
Tris-HCl Technologie życiowe AM9855 Bufor mineralizacyjny
U2OSATCCHTB-96Linia komórkowa
6-dołkowe szklane płytki dolneCellvisP06-1.5H-NPłytka obrazowa

Bibliografia

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775(2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

znakowanie fluorescencyjnekotwice tr jfunkcyjneznakowanie immunofluorescencyjnetagowanie bia ekosadzanie w hydro eludo ki op aszczone klatrynwysoka wydajno znakowania

Powiązane artykuły