Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63799

⸱

27 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Streszczenie

Podczas rozwoju kręgowców, komórki grzebienia nerwowego (NCC) intensywnie migrują i różnicują się w różne typy komórek, które przyczyniają się do powstania struktur takich jak szkielet twarzoczaszki i obwodowy układ nerwowy. Chociaż zrozumienie migracji NCC w kontekście zarodka 3D ma kluczowe znaczenie, wyizolowanie komórek migrujących w hodowli 2D ułatwia wizualizację i charakterystykę funkcjonalną, uzupełniając badania embrionalne. Niniejszy protokół demonstruje metodę izolowania fałdów nerwowych czaszki piskląt w celu wygenerowania pierwotnych kultur NCC. Migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych pokrytych na podłożu pokrytym fibronektyną. Powoduje to powstawanie rozproszonych, przylegających populacji NCC, które można ocenić za pomocą barwienia i ilościowych analiz morfologicznych. To uproszczone podejście do hodowli jest wysoce elastyczne i można je łączyć z innymi technikami. Na przykład emigracja i zachowania migracyjne NCC mogą być oceniane za pomocą obrazowania poklatkowego lub badane funkcjonalnie poprzez włączenie inhibitorów lub eksperymentalnych manipulacji ekspresją genów (np. DNA, morfolino lub elektroporacja CRISPR). Ze względu na swoją wszechstronność, metoda ta zapewnia potężny system do badania rozwoju NCC czaszki.

Wprowadzenie

Komórki grzebienia neuronalnego (NCCs) stanowią przejściową populację komórek w embrionach kręgowców. NCCs są specyfikowane na granicach płytki neuralnej i przechodzą przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), aby migrować z grzbietowej części cewy nerwowej1. Po EMT komórki NCCs rozprzestrzeniają się szeroko w całym embrionie, ostatecznie różnicując się i przyczyniając do powstania różnych struktur, w tym szkieletu czaszkowo-twarzowego, odcinka wypływowego serca oraz większości obwodowego układu nerwowego2. Zmiany w polaryzacji komórek, cytoszkielecie i właściwościach adhezyjnych leżą u podstaw tego przejścia z populacji komórek przedmigracyjnych w populację migrującą3. Badanie EMT i migracji NCCs pozwala zrozumieć fundamentalne mechanizmy ruchliwości komórek i dostarcza wiedzy niezbędnej w dążeniach do zapobiegania oraz leczenia wad wrodzonych i przerzutów nowotworowych.

Podczas gdy analizy in vivo są niezbędne do zrozumienia procesów rozwojowych NCC w kontekście embrionalnym, metody in vitro oferują dostęp wizualny i fizyczny, który ułatwia dodatkowe kierunki badawcze. W uproszczonym środowisku 2D można ocenić morfologię NCC, struktury cytoszkieletu oraz przebyty dystans migracji. Ponadto można analizować wpływ zaburzeń genetycznych lub czynników rozpuszczalnych na zachowania migracyjne ruchliwych NCC4,5,6,7,8,9,10. Dodatkowo izolowane premigracyjne lub migrujące NCC można zbierać, łączyć i wykorzystywać w metodologiach wysokoprzepustowych do badania regulacji rozwojowej NCC poprzez profilowanie proteomiczne, transkryptomiczne i epigenomiczne7,11. Chociaż dostępne są metody przygotowania czaszkowych NCC z różnych modelowych organizmów rozwojowych12,13,14, niniejszy artykuł przedstawia mechanikę podejścia dla osób, które po raz pierwszy uczą się hodować czaszkowe NCC z embrionów kurzych.

Niniejszy protokół opisuje wszechstronną technikę przygotowywania kultur komórek grzebienia neuronalnego (NCC) z czaszki kurczaka (Rysunek 1). Ponieważ NCC łatwo migrują z wyeksplantowanych fałdów neuronalnych na podłoże hodowlane, NCC kurczaka naturalnie oddzielają się od tkanki embrionalnej, co umożliwia łatwe generowanie kultur pierwotnych. Ze względu na to, że NCC śródmózgowia migrują en masse z czaszkowych fałdów neuronalnych (w przeciwieństwie do przedłużonej delaminacji komórka po komórce w pniu15), kultury te składają się głównie z migrujących komórek czaszkowego grzebienia neuronalnego, a wstępne wycięcie fałdu neuronalnego stanowi metodę pozyskiwania przedmigracyjnych NCC. Szczegółowo opisano podstawową metodę preparowania i hodowli czaszkowych fałdów neuronalnych kurczaka oraz przedstawiono sugestie dotyczące różnych zastosowań i modyfikacji tej metody.

Proces różnicowania neuronów, schemat ilustrujący ekstrakcję komórek i hodowlę w szalce Petriego.
Rycina 1: Schematyczny przegląd protokołu hodowli fałdów neuralnych głowy kurczaka. (A,B) Fałdy neuralne głowy (obrysowane na niebiesko) są wycinane z zarodka kurczaka z pięcioma somytami (widok grzbietowy na A). Szare pasma to półksiężyc sercowy. (C) Po wysianiu na fibronektynę, migrujące komórki grzebienia neuralnego wyłaniają się z fałdów neuralnych i rozprzestrzeniają się po podłożu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Można używać dowolnej odmiany ras Gallus gallus, w tym White Leghorn, Golden Sex Link lub Rhode Island Red. Jaja kurze użyte w niniejszym badaniu pochodziły z różnych ras i pochodziły z wielu źródeł, w tym z lokalnych gospodarstw i wylęgarni.

1. Przygotowanie roztworów i materiałów

  1. Przygotować roztwór Ringera, mieszając 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2HPO4 i 0,147 mM KH2PO4 (patrz tabela materiałów). Dostosuj pH do 7,4 i przefiltruj sterylizację do butelek o pojemności 100 ml. Przechowywać w czystym, suchym miejscu. Nie myj butelek mydłem (traktuj jako szkło do kultur tkankowych).
  2. Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego fibronektyny (FN) (patrz tabela materiałów) przez rozpuszczenie FN w sterylnym roztworze Ringera i przechowywać w 100 μl podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C (stabilnie przez co najmniej 4 lata).
  3. Przygotuj kompletne pożywki hodowlane, uzupełniając pożywkę L15 0,8% L-glutaminy, 0,08% penicyliny/streptomycyny, 10% FBS i 10% ekstraktu z zarodków piskląt12. Utworzyć 3 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
    UWAGA: Jeśli kultury są inkubowane w inkubatorze CO2, DMEM/F12 należy zastąpić L15, który jest buforowany powietrzem.
  4. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu w 1x PBS. Dostosuj pH do 7,4. Utworzyć 10 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Z paraformaldehydem należy obchodzić się w dygestorium.
  5. Przygotuj ramki nośne z bibuły filtracyjnej (prostokąty papieru o wymiarach około 1 cm x 1,5 cm z dwoma lub trzema dziurkowanymi otworami zachodzącymi na siebie na długiej osi).
    1. Za pomocą standardowego dziurkacza z trzema otworami wybij otwory wzdłuż krawędzi dużego kawałka bibuły filtracyjnej, wytnij/przytnij wybitą krawędź w pasek, a następnie pokrój pasek między otworami na prostokąty o długości ~ 1,5 cm. Bibuły filtracyjne do autoklawu przed użyciem (opcjonalnie).
  6. Zbierz narzędzia do preparowania, w tym cienkie kleszcze , kleszcze, nożyczki do preparacji, nożyczki sprężynowe i zaostrzone igły wolframowe16.

2. Inkubacja zarodków

  1. Pozyskaj zapłodnione jaja z któregokolwiek z wyżej wymienionych źródeł.
  2. Umieść zapłodnione jaja w pozycji pionowej (długa oś jaja pionowo ze spiczastym końcem w dół/stroną do góry) w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C (100 °F).
  3. Inkubuj, aż uformuje się od czterech do siedmiu somitów (etapy 8+-9)17, co zajmuje około 35 godzin
    UWAGA: Czas inkubacji może się znacznie różnić w zależności od szczepu, wieku kur, pory roku itp. i musi być określony doświadczalnie. Programowalne timery wylotowe są przydatne do inicjowania inkubacji w nocy w celu uzyskania pożądanego czasu.
  4. Po wyjęciu z inkubatora dokładnie spryskaj jaja 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia, aby zdezynfekować skorupki.
    UWAGA: Zarodki można pobrać natychmiast, ale pozostawienie jaj do ostygnięcia do temperatury pokojowej zmniejsza kruchość żółtek i utratę zarodków podczas pobierania.

3. Przygotowanie potraw kulturowych

  1. Wybierz szalki hodowlane fałdów nerwowych (patrz tabela materiałów) odpowiednie dla dalszego zastosowania.
    1. W przypadku kultur, które będą utrwalane i barwione, należy użyć szklanych szkiełek nakrywkowych umieszczonych w wielodołkowych szalkach do hodowli tkankowych.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe, które pasują do wielkości studzienki, będą się mniej poruszać przy mieszaniu płynów, dzięki czemu eksplantaty będą mniej podatne na przesuwanie się i bardziej prawdopodobne jest, że przylgną do szkiełka nakrywkowego, a nie do dna naczynia.
    2. Wybierz naczynia jednokomorowe ze szklanym dnem lub dzielone (patrz tabela materiałów) do obrazowania na żywo za pomocą mikroskopu odwróconego.
    3. Do obrazowania na żywo w mikroskopie pionowym lub stereoskopowym należy użyć 6-, 12- lub 24-dołkowych optycznie odpowiednich płytek do hodowli tkankowych.
    4. Wybierz plastikowe szalki do hodowli tkankowych do masowego zbierania migrujących komórek grzebienia nerwowego do wysokoprzepustowych analiz.
  2. Dodaj 10 j./ml penicyliny i 10 μg/ml streptomycyny do 100 ml butelki sterylnego roztworu Ringera (na przykład 100 μl 10 000 j./ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny, aby uzyskać P/S Ringera). Użyj P/S Ringera w ciągu 1 tygodnia.
  3. Rozmrozić podwielokrotność 1 mg/ml FN na lodzie. Rozcieńczyć wskaźnikiem P/S Ringera do stężenia 10-100 μg/ml FN.
  4. Odpipetować tyle roztworu FN, aby pokryć dno studzienki lub naczynia. Na przykład 100 μl na studzienkę w płytce 24-dołkowej, 500 μl na szalkę 35 mm.
  5. Załóż pokrywkę i inkubuj naczynia lub talerze z roztworem FN w nawilżanym inkubatorze (lub przykrytej tacy z destylowanymi ręcznikami papierowymi nasączonymi wodą) w temperaturze 38 °C (100 °F) przez co najmniej 1 godzinę podczas preparowania fałdów nerwowych.

4. Izolacja zarodków piskląt

  1. Uważaj, aby zachować orientację jaja (zarodek unosi się na wierzchu żółtka podczas inkubacji). Użyj nożyczek lub kleszczy, aby zrobić mały otwór w skorupce, około 1/4-1/3 długości jajka.
    1. Ostrożnie włóż końcówkę nożyczek lub kleszczyków do małego otworu, uważając, aby nie naruszyć żółtka, i przetnij skorupkę jajka wokół jajka, usuwając górną część skorupki jajka (Rysunek 2A).
  2. Umieść zarodek do izolacji.
    UWAGA: Jeśli zarodek nie jest idealnie umieszczony w miseczce muszli, użyj kleszczy, aby ostrożnie obrócić żółtko, tak aby zarodek znalazł się na wierzchu. Alternatywnie, wlej żółtko do rękawiczki z miseczką, uważając, aby nie złamać żółtka i pozwalając albuminie spłynąć (Ryc. 2B). Następnie zarodek można ustawić, przesuwając żółtko z ręki do ręki
    3. .
  3. Przygotuj zarodek, delikatnie używając płaskiej krawędzi zamkniętych, kleszczyków, aby zetrzeć nadmiar albuminy, która pozostała na powierzchni żółtka pokrywającego zarodek (Ryc. 2C). Nadmiar albuminy można również usunąć za pomocą delikatnego nacisku za pomocą delikatnej wycieraczki roboczej.
    UWAGA: Po usunięciu albuminy powierzchnia żółtka powinna wyglądać na teksturowaną, a nie gładką. Nieusunięcie wystarczającej ilości albuminy spowoduje zahamowanie przylegania nośnika bibuły filtracyjnej w sekcji 4, kroku 4.
  4. Za pomocą kleszczy umieść ramkę nośną z bibuły filtracyjnej nad zarodkiem, tak aby zarodek znajdował się w okienku ramki. Delikatnie dociśnij bibułę filtracyjną, aby przykleić ją do żółtka.
  5. Wytnij na zewnątrz ramę bibuły filtracyjnej za pomocą nożyczek do preparowania (Rysunek 2D). Użyj kleszczyków lub końcówek nożyczek, aby chwycić krawędź ramki i delikatnie oderwij zarodek od żółtka (Rysunek 2E). Uniesienie pod kątem pomoże czysto usunąć zarodek z żółtka.
  6. Umieść zarodek papierową ramką do dołu (zarodek brzuszną stroną do góry) na szalce Petriego o średnicy 60 mm lub 100 mm wypełnionej P/S Ringera (Ryc. 2F). Trzymaj naczynie z zarodkami na lodzie, jeśli zbierasz je do dalszej aplikacji wrażliwej na RNA lub białko.
    UWAGA: Nieumieszczenie zarodków brzuszną stroną do góry grozi oderwaniem ich od papierowych ramek. Wiele zarodków można pobrać i przechowywać w Ringer's P/S przez maksymalnie 1 godzinę przed przejściem do etapów rozwarstwiania fałdów nerwowych.

5. Analizowanie fałdów nerwowych

  1. Przenieś zarodek do czystego naczynia zawierającego roztwór P/S Ringera i opłucz zarodek, trzymając ramkę bibuły filtracyjnej kleszkami i delikatnie przesuwając w przód iw tył, aby usunąć żółtko, które zasłania widok zarodka. Wymień P/S Ringera lub przenieś do świeżego naczynia, jeśli stanie się mętne.
  2. Umieść zarodek stroną grzbietową/ramową do góry pod mikroskopem preparacyjnym. Pozostawiając zarodek na papierowej ramce, aby był napięty i utrzymywany na miejscu, usuń błonę witelinową za pomocą kleszczy, aby odsłonić fałdy nerwowe.
    UWAGA: Jeśli zarodek spadnie z papierowej ramy, można go rozłożyć płasko w naczyniu lub przypiąć do naczynia pokrytego sylgardem18 w celu sekcji.
  3. Za pomocą nożyczek sprężynowych lub zaostrzonej igły wolframowej ostrożnie wyciąć fałdy nerwowe śródmózgowia. Uwzględnij tkankę ogonową do rozszerzających się pęcherzyków wzrokowych i rostralną do tyłomózgowia, gdzie zwężenia rombomerów dopiero zaczynają się pojawiać (półksiężyc serca jest również użytecznym wskaźnikiem, Rysunek 3B, C). Uważaj, aby wyciąć najbardziej grzbietowy aspekt fałdu nerwowego z minimalnym zanieczyszczeniem cewy nerwowej i ektodermą nieneuronalną (Rysunek 3C).
  4. Przenieś fałdy nerwowe do czystego naczynia zawierającego P/S Ringera za pomocą pipetora P20 lub sterylnej, szklanej pipety Pasteura przepłukanej żółtkiem P/S Ringera (blokuje to plastik lub szkło, aby zapobiec przywieraniu tkanki). Przechowuj zebrane fałdy na lodzie podczas preparowania dodatkowych fałd.

6. Poszycie fałdów nerwowych

  1. Rozmrozić podwielokrotność kompletnych pożywek hodowlanych (sekcja 1, krok 3). Dodać 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny i wysterylizować filtrem. Przygotowane podłoża należy przechowywać w temperaturze 37-38 °C podczas wykonywania innych czynności.
  2. Wyjąć szalki hodowlane z inkubatora (sekcja 3, krok 5). Za pomocą pipety lub pipety Pasteura usuń roztwór FN z szkiełek nakrywkowych, szalek lub studzienek. Po przepłukaniu podłoża pokrytego FN za pomocą P/S Ringera, dodać odpowiednią objętość kompletnej pożywki hodowlanej do szalek lub studzienek (500 μl dla studzienek na płytce 24-dołkowej, 2 ml dla szalki 35 mm lub płytki sześciodołkowej).
    UWAGA: Mniejsze objętości mogą zachować drogie odczynniki (np. tak niskie, jak 200 μl dla płytki 24-dołkowej), ale upewnij się, że naczynie jest wystarczająco nawilżone, aby uniknąć parowania.
  3. Używając pipetora p20 lub p200, najpierw przepłucz końcówkę pipety żółtkiem Ringera's P/S, aby zablokować plastik i zapobiec przywieraniu chusteczki. Następnie przenieś izolowane fałdy nerwowe na szkiełka nakrywkowe pokryte FN, uważając, aby przenieść jak najmniej Ringera P / S. Umieść zagięcie (fałdy) w kierunku środka szkiełka nakrywkowego pokrytego FN.
    UWAGA: Jeden lub kilka fałdów nerwowych można pokryć na szkiełku nakrywkowym o średnicy 12 mm w studzience 19 mm, do 50 na płytce o średnicy 35 mm.
  4. Po pozostawieniu eksplantatów na 10-15 minut, umieść je w wilgotnej komorze o temperaturze 38 °C (100 °F), powoli i ostrożnie przenosząc szalki hodowlane z platerowanymi fałdami nerwowymi. Zminimalizuje to przesuwanie się fałdów nerwowych w studzienkach, zapewniając, że pozostaną one rozproszone i przylegają do wszelkich szkiełek nakrywkowych.
    UWAGA: W przypadku stosowania L15 (nie DMEM), naczynia z kultur eksplantatów można również inkubować w inkubatorze do jaj za pomocą przykrytej tacy z zwilżonymi ręcznikami papierowymi.
  5. Inkubuj kultury fałdów nerwowych w nawilżanym inkubatorze przez czas aktywnej migracji (łącznie około 16-20 godzin, Rysunek 4).

7. Utrwalanie i barwienie kulturowych wędrownych NCC do analizy morfologicznej

  1. Usuń pożywkę hodowlaną za pomocą pipety Pasteura i przepłucz studzienki wysterylizowanym filtrem 1x PBS.
  2. Dodać 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Może być konieczne eksperymentalne określenie czasu utrwalania. Możliwe jest również dodanie paraformaldehydu bezpośrednio do podłoża przez 10 minut (50:50), usunięcie i zastąpienie nierozcieńczonym 4% paraformaldehydem na 10 minut, aby zachować delikatniejsze struktury komórkowe.
  3. Usuń paraformaldehyd i spłucz trzy razy 1x PBS.
  4. NCC utrwalone należy zabarwić odpowiednim barwnikiem do oceny morfologicznej. Na przykład barwienie sprzężoną falloidyną Oregon Green jest szczegółowo opisane tutaj.
    UWAGA: Wizualizacja cytoszkieletu aktynowego za pomocą phalloidyny19 ujawnia strukturalną złożoność migrującego NCC o stosunkowo jednolitej intensywności barwienia; Jednak falloidyna może nie uwydatniać wszystkich obszarów komórek. Można również stosować barwniki, które znakują błonę plazmatyczną (np. aglutyninę z kiełków pszenicy lub DiI) lub cytoplazmę, ale komplikują obrazowanie drobnych wypukłości w stosunku do jaskrawo barwiącego się ciała komórki. Ponadto immunofluorescencję można przeprowadzić równolegle w celu znakowania komórek grzebienia nerwowego za pomocą HNK-1 lub w celu określenia subkomórkowej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania7,20.
    1. Usunąć końcowe płukanie PBS i dodać PBS + 0,5% Triton X-100 (PBST) + 5% surowicy (FBS lub od innego zwierzęcia odpowiedniego do barwienia przeciwciałem) w celu przykrycia szkiełek nakrywkowych i inkubować przez 10 minut na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej.
    2. Odpipetować 200 nM sprzężonej falloidyny Oregon Green (rozcieńczonej w PBST + 5% surowicy) na gładką powierzchnię (taką jak elastyczna folia uszczelniająca parafinę) dla każdego szkiełka nakrywkowego. W przypadku szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm należy odpipetować kubat o objętości 30 μl.
    3. Za pomocą kleszczy usuń szkiełko nakrywkowe z surowicy PBST + 5%, upewniając się, że komórki są skierowane do góry. Krótko dotknij krawędzi szkiełka nakrywkowego delikatną wycieraczką roboczą, aby odsączyć nadmiar płynu.
    4. Delikatnie umieść każdą komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na kropli rozcieńczonej falloidyny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w ciemności podczas barwienia (przykryć naczyniem pokrytym folią aluminiową lub umieścić w szufladzie).
    5. Podczas inkubacji dodać PBST do dołków szalki hodowlanej (750 μl PBST na każde zagłębienie na 24-dołkowej płytce).
    6. Po okresie inkubacji zdejmij szkiełka nakrywkowe z roztworu barwiącego i umieść je z powrotem w naczyniu hodowlanym, odwracając szkiełko nakrywkowe tak, aby strona z komórkami była skierowana do góry. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest pokryte PBST i umieść na wytrząsarce platformy na 10 minut, trzymając szkiełka nakrywkowe przykryte i w ciemności. Usuń PBST i powtórz ten krok dwa razy, w sumie trzy 10-minutowe prania.
    7. Umieścić jedną kroplę (na szkiełko nakrywkowe) podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) na szkiełku mikroskopowym. Objętość 25 μl dobrze sprawdza się w przypadku szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm.
    8. Po ostatnim umyciu PBST dotknij krawędzi szkiełka nakrywkowego delikatną wycieraczką zadaniową, aby usunąć nadmiar płynu, śledząc stronę komórkową szkiełka nakrywkowego.
    9. Zamontuj szkiełko nakrywkowe stroną do dołu, powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe pod kątem na nośnik montażowy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Poczekaj, aż nośnik się ustawi przed obrazowaniem.

8. Ocena morfologiczna kulturowych wędrownych NCC

  1. Obrazy poplamionych komórek i eksport jako pliki .tiff.
    UWAGA: Obiektyw 40x dobrze sprawdza się w przypadku obrazowania kultur, ale obiektywy od 10x (aby uchwycić całe pole migrujących NCC) do 100x (pojedyncze NCC) mogą być używane do zbierania obrazów do oceny morfologicznej. Obrazy w niniejszym badaniu zostały wykonane przy użyciu odwróconej platformy obrazowania multimodalnego (patrz tabela materiałów).
  2. Prześlij obrazy do oprogramowania do analizy obrazów (ImageJ21, patrz Spis materiałów). Kliknij Obraz > Duplikuj, aby utworzyć drugą kopię każdego obrazu do analizy, pozostawiając w ten sposób oryginał nieedytowany, ponieważ większości przetwarzania obrazu nie można cofnąć.
  3. Kliknij Obraz > Dostosuj jasność/kontrast > i użyj przesuwanych pasków, aby dostosować jasność lub kontrast obrazów.
  4. Przekonwertuj obrazy na skalę szarości, wykonując poniższe czynności.
    1. Jeśli obrazy są eksportowane w RGB, zostaną przesłane w RGB jako scalony kanał. Aby oddzielić obrazy, kliknij Obraz > Kolor > Podziel kanały, aby uzyskać jednokanałowe obrazy w skali szarości.
    2. Jeśli obrazy są już rozdzielone, przejdź do opcji Obraz > Wpisz > 8-bitowy, aby przekonwertować plik na skalę szarości.
  5. Kliknij Obraz > Dostosuj próg, aby przekonwertować > obraz binarny, w którym piksele są identyfikowane jako komórki (pierwszy plan;) lub tło (biały). Użyj suwaka i/lub kliknij Auto, aby wybrać ustawienie Próg, które wyraźnie definiuje komórki z tła.
    1. Jeśli komórki nakładają się na siebie lub barwienie nie jest ciągłe, może być konieczne dalsze przetwarzanie za pomocą funkcji Watershed lub Fill Holes22. Spowoduje to oddzielenie komórek od siebie lub wypełnienie luk w komórkach do analizy. Kliknij Process > Binary > Create Binary aby najpierw przekonwertować obraz na 8-bitowy format binarny. Następnie kliknij Process > Binary > Watershed lub Fill Holes.
      UWAGA: Oprogramowanie najlepiej sprawdzi się tam, gdzie sygnały muszą być oddzielone lub wypełnione, które w razie potrzeby można dalej regulować za pomocą wtyczek.
  6. Wybierz pomiary, które mają zostać przechwycone. Kliknij Analizuj > ustaw pomiary i zaznacz pola Deskryptory kształtu, aby przeprowadzić analizę cyrkularności (Circ.), Aspect Ratio (AR), Roundness (Round) i Solidity.
    UWAGA: Inne pomiary, takie jak Obszar i Obwód, mogą być również uwzględnione, w zależności od rodzaju potrzebnej analizy.
  7. Kliknij Analizuj > Analizuj cząstki i ustaw parametry z menu "Analizuj cząstki".
    1. W sekcji "Rozmiar" oszacuj z grubsza, jak duże są komórki lub cząstki będące przedmiotem zainteresowania w pikselach, ponieważ sygnał tła lub mniejsze szczątki komórek również zostaną uwzględnione, jeśli parametr Rozmiar pozostanie ustawiony na 0-nieskończoność (na przykład ustawiony na 500-Nieskończoność w Rysunek 5).
      UWAGA: Dostosowanie rozmiaru do węższego zakresu może wykluczyć mniejsze lub większe cząstki niż te, które są potrzebne do analizy.
    2. W sekcji "Okrągłość" pozostaw wartość 0-1.0, aby zmierzyć wszystkie kształty komórek na obrazie.
    3. W sekcji "Pokaż" wybierz Gołe kontury z menu rozwijanego, aby sprawdzić kontury komórek wybrane za pomocą funkcji "Analizuj cząstki". Zeskanuj kontury, aby upewnić się, że nakładające się na siebie komórki są rozróżniane, ale komórki nie są niepotrzebnie dzielone. Zaznacz także pola menu "Wyświetl wyniki", "Podsumuj" i "Dodaj do menedżera".
  8. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij Ok.
    UWAGA: Pojawią się cztery oddzielne okna, pokazujące (1) gołe kontury komórek zidentyfikowanych na obrazie, (2) komórki zliczone na obrazie, (3) wyniki pomiarów każdej komórki oraz (4) podsumowanie całkowitej liczby zliczonych komórek i ich uśrednionych pomiarów.
    1. Jeśli szczątki zostały policzone, nakładające się na siebie komórki były liczone jako jedna, pojedyncze komórki były liczone jako wielokrotności lub wiele komórek zostało pominiętych w liczeniu, wróć do oryginalnego, nieedytowanego obrazu, utwórz kolejny duplikat i dostosuj "Próg" lub inne parametry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przegląd obecnego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Inkubowane jaja otwarto, a żółtko wraz z zarodkiem na powierzchni wyizolowano, delikatnie wlewając zawartość na dłoń w rękawiczce (Rysunek 2A,B). Po usunięciu albuminy (Rysunek 2C), do błony żółtka otaczającej zarodek przyłożono ramki z papieru filtracyjnego, aby ułatwić wycięcie i uniesienie zarodka z żółtka, które zaczyna wypływać po przecięciu błon żółtka (<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj technika zapewnia adaptowalną metodę izolowania fałdów nerwowych piskląt i posiewania ich w celu stworzenia kultur migrujących czaszkowych NCC. Kultury te zapewniają uproszczone warunki 2D do łatwej analizy migracji i morfologii NCC piskląt, które mogą uzupełniać bardziej wymagające technicznie metody obrazowania ovo 24,25,26. Chociaż ta metoda in vitro jest stosunkowo prosta, spójne wyniki zależą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Corinne A. Fairchild i Katie L. Vermillion, które uczestniczyły w rozwoju naszej wersji protokołu hodowli fałdów nerwowych czaszki piskląt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AxioObserver wyposażony w konfokalną głowicę skanującą LSM710 sterowaną za pomocą oprogramowania ZEN 3.0 SR ZeissUżywany alfa Plan-Apochromat 100x/1.46 Olej DIC M27 obiektyw
CaCl2Sigma-AldrichC3306
Naczynia komorowe (szklane dno, pojedyncze lub dzielone)MatTek; Cell VisP35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		Pojedyncza komora 35 mm lub 4-komorowa 35 mm
Szkło osłonoweCarolina Biological Supply Company633029, 633031, 633033, 633035, 633037okręgi, 0,13– Grubość 0,17 mm, dostępna w średnicach 12-25 mm 
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033Alternatywa dla podłoża L15
Inkubator jajSportsman1502
FBS Life Technologies10437-028
FibronectinFisher ScientificCB-40008A Bibuła
filtracyjnaKleszcze chromatograficzneWhatman
()Fisher Scientific; Thomas Scientific08-890 (Fisher); 1141W97 (Thomas)
Kleszcze (drobne)Narzędzia do nauki precyzyjnej11252-20Dumont #5
Obraz Jhttps://fiji.sc/Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu
KClSigma-AldrichP3911
KH2PO4Sigma-AldrichP0662
L15 mediaInvitrogen11415064
L-glutaminaInvitrogen25030
Podłoża montażowe (Vectashield lub ProLong Gold)Vector Laboratories; Thermofisher ScientificH-1700 (Vectashield); P36930 (ProPrzedłuż Złoto)
Na2HPO4Sigma-AldrichS9638
NaClSigma-AldrichS9888
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Penicylina/streptomycynaLife Technologies15140-14810 000 jednostek/ml penicyliny; 10 000 mg/ml Streptomycyna
Szalki PetriegoVWR (lub podobne)60 mm, 100 mm
PhalloidinSigma-AldrichP1951dostępne wiele fluroforów
Uchwyt na szpilkiFine Science Tools26016-12Do igły wolframowej (alternatywa dla nożyczek sprężynowych)
Nożyczki (rozwarstwienie)Fine Science Tools14061-10
Nożyczki sprężynoweNarzędziado nauki15000-08Krawędź tnąca 2,5 mm (alternatywa dla igły wolframowej)
SylgardKraydenSylgard 184
Sigma-AldrichSLGVM33RSMillex-GV Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, PVDF, 33 mm, sterylizowane promieniami gamma
Naczynia do hodowli tkankowychSarstedt83-3900Szalki hodowlane 35 mm do masowych kultur fałdów nerwowych
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Drut wolframowyRóżnorodność źródełŚrednica 0,01" dla igły wolframowej (alternatywa dla nożyczek sprężynowych)
grade 3MMFiltry strzykawkowe

Bibliografia

  1. Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
  2. Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
  3. Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
  4. McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231(2020).
  5. Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
  6. Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
  7. Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
  8. Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  9. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
  10. Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
  11. Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
  12. Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
  13. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118(2014).
  14. Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051(2019).
  15. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
  16. Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
  19. Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
  20. Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
  23. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  24. Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  25. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
  26. McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
  27. Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
  28. Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424(2021).
  29. Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
  30. Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
  31. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki grzebienia neuronalnegohodowla zarodka kurczakaeksplant fa du neuronalnegomigracja kom rekbarwienie falloidynobrazowanie time lapsemanipulacje genetyczneanaliza w programie ImageJ
Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.