Neurony nocyceptorowe i komórki NK aktywnie oddziałują na siebie w kontekście zapalnym. Podejście oparte na współkulturze umożliwia badanie tej wzajemnej zależności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami NK a neuronami nocyceptorowymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony somatosensoryczne ewoluowały, aby wykrywać szkodliwe bodźce i aktywować odruchy obronne. Dzieląc się środkami komunikacji, neurony nocyceptorowe dostrajają również mechanizmy obronne gospodarza, kontrolując aktywność układu odpornościowego. Komunikacja między tymi systemami jest w większości adaptacyjna, pomagając chronić homeostazę, może również prowadzić do wystąpienia chorób przewlekłych lub je promować. Oba systemy ewoluowały równocześnie, aby umożliwić taką miejscową interakcję, jaką można znaleźć w pierwotnych i wtórnych tkankach limfatycznych i błonie śluzowej. Ostatnie badania wykazały, że nocyceptory bezpośrednio wykrywają i reagują na obce antygeny, cytokiny pochodzące z komórek odpornościowych i drobnoustroje.
Aktywacja nocyceptora nie tylko powoduje nadwrażliwość na ból i swędzenie, ale także obniża próg zapłonu nocyceptora, prowadząc do miejscowego uwalniania neuropeptydów. Peptydy, które są wytwarzane i uwalniane z obwodowych zakończeń nocyceptorów, mogą blokować chemotaksję i polaryzację limfocytów, kontrolując lokalizację, czas trwania i rodzaj zapalenia. Najnowsze dowody wskazują, że neurony czuciowe oddziałują z wrodzonymi komórkami odpornościowymi poprzez kontakt komórka-komórka, na przykład angażując receptory grupy 2D (NKG2D) na komórkach NK (natural killer).
Biorąc pod uwagę, że komórki NK wyrażają pokrewne receptory dla różnych mediatorów wytwarzanych przez nocyceptory, można sobie wyobrazić, że nocyceptory używają neuropeptydów do kontrolowania aktywności komórek NK. Tutaj opracowujemy metodę wspólnej hodowli do badania interakcji neuronów nocyceptorowych z komórkami NK w naczyniu. Stosując to podejście, odkryliśmy, że neurony nocyceptorowe lędźwiowe zmniejszają ekspresję cytokin w komórkach NK. Ogólnie rzecz biorąc, taka redukcjonistyczna metoda może być przydatna do zbadania, w jaki sposób neurony unerwiające nowotwór kontrolują funkcję przeciwnowotworową komórek NK i jak komórki NK kontrolują eliminację uszkodzonych neuronów.
Wprowadzenie
Ciała komórkowe neuronów czuciowych pochodzą ze zwojów korzenia grzbietowego (DRG). DRG znajdują się w obwodowym układzie nerwowym (PNS), między rogiem grzbietowym rdzenia kręgowego a zakończeniami nerwów obwodowych. Pseudo-unipolarna natura neuronów DRG pozwala na przekazywanie informacji z gałęzi obwodowej, która unerwia tkankę docelową, do gałęzi centralnej, która przenosi informacje somatosensoryczne do rdzenia kręgowego1. Korzystając z wyspecjalizowanych receptorów kanałów jonowych, neurony pierwszego rzędu wykrywają zagrożenia stwarzane przez patogeny, alergeny i zanieczyszczenia2, co prowadzi do napływu kationów (....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Montrealu (#22053, #22054) zatwierdziły wszystkie procedury dla zwierząt. Tabela 1 zawiera wykaz roztworów i ich skład, a Tabela materiałów zawiera wykaz materiałów, sprzętu i odczynników stosowanych w niniejszym protokole.
1. Izolacja, hodowla i stymulacja komórek NK
- Wygeneruj nienaruszony neuron nocyceptora (kontrola rodzeństwa z miotu; TRPV1wt::D TAfl/wt) i myszy poddane ablacji (TRPV1cre::D TAfl/wt) przez skrzyżowanie myszy z toksyną lox-stop-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórki NK zostały oczyszczone magnetycznie ze splenocytów myszy kontrolnych z tego samego miotu (TRPV1wt::DTAfl/wt) i stymulowane (przez 48 h) za pomocą IL-2 oraz IL-15. Następnie komórki NK hodowano osobno lub w ko-kulturze z neuronami z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) pobranymi od myszy z nienaruszonymi neuronami nocyceptywnymi (kontrola z tego samego miotu; TRPV1wt::DTAfl/wt) lub z nimi abladowanymi (TRPV1cre::DTAfl/wt). Następnie komórki poddano dzi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Davies i wsp.11 odkryli, że uszkodzone neurony regulują w górę RAE1. Poprzez kontakt komórka-komórka, komórki NK wykazujące ekspresję NKG2D były następnie w stanie zidentyfikować i wyeliminować neurony RAE1 + , co z kolei ogranicza przewlekły ból11. Biorąc pod uwagę, że komórki NK również wyrażają różne receptory neuropeptydowe i że te neuropeptydy są znane ze swoich zdolności immunomodulacyjnych, coraz ważniejsze wydaje się badanie interakcji między kom.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair program (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824), oraz Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anty-mysie CD16/32 | Jackson Laboratory | Nr kat.:017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Nr kat.:009669 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) klasa hodowli | Precision Instruments | Nr kat.:504167 | |
| BV421 anty-mysi NK-1.1 | Fisher Scientific | Nr kat.:12430112 | |
| Sitko do komórek (50 μ m) | Fisher Scientific | Nr kat.:A3160702 | |
| Kolagenaza IV | Fisher Scientific | Nr kat.:15140148 | |
| Toksyna dyfteryjnafl/fl | Fisher Scientific | Nr kat.:SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Nr kat.:13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Nr kat.:: 07-200-95 | |
| Zestaw do izolacji komórek NK myszy EasySep | Nr | kat.:CLS2595 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Sigma | Nr kat.:C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Nr kat.:04942078001 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Sigma | Nr kat.:806552 | |
| FITC anty-mysz NKp46 | Sigma | Nr kat.:L2020 | |
| Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem | Sigma | Nr kat.:03690 | |
| Szklana pipeta Pasteura | Sigma | Nr kat.:470236-274 | |
| Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF) | VWR | Nr kat.:02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Nr kat.:03-50/31 | |
| L-Glutamina | Gibco | Nr kat.:A14867-01 | |
| Mysz rekombinowany IL-15 | Gibco | Nr kat.:22400-089 | |
| Rekombinowany IL-2 | dla myszy Gibco | Nr kat.:21103-049 | |
| Czynnik wzrostu nerwów (NGF) | Life Technologies | Nr kat.:13257-019 | |
| Pożywka nerwowa | PeproTech | Nr kat.:450-51-10 | |
| PE anty-mysie GM-CSF | PeproTech | Nr kat.:212-12 | |
| Penicylina i Streptomycyna | PeproTech | Nr kat.:210-15 | |
| Technologia komórek | macierzystych Tłem | nr: 19855 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Biolegend | Nr kat.:108732 | Klon PK136 |
| RPMI 1640 Media | Biolegend | Nr kat.:137606 | Klon 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Nr kat.:505406 | Klon MP1-22E9 |
| Pęsety i narzędzia do preparowania. | Biolegend | Nr kat.:65-0865-14 | |
| 96-dołkowa płytka w kształcie litery U | Biolegend | Nr kat.:101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
Bibliografia
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
