Neurony nocyceptorowe i komórki NK aktywnie oddziałują na siebie w kontekście zapalnym. Podejście oparte na współkulturze umożliwia badanie tej wzajemnej zależności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami NK a neuronami nocyceptorowymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony somatosensoryczne ewoluowały, aby wykrywać szkodliwe bodźce i aktywować odruchy obronne. Dzieląc się środkami komunikacji, neurony nocyceptorowe dostrajają również mechanizmy obronne gospodarza, kontrolując aktywność układu odpornościowego. Komunikacja między tymi systemami jest w większości adaptacyjna, pomagając chronić homeostazę, może również prowadzić do wystąpienia chorób przewlekłych lub je promować. Oba systemy ewoluowały równocześnie, aby umożliwić taką miejscową interakcję, jaką można znaleźć w pierwotnych i wtórnych tkankach limfatycznych i błonie śluzowej. Ostatnie badania wykazały, że nocyceptory bezpośrednio wykrywają i reagują na obce antygeny, cytokiny pochodzące z komórek odpornościowych i drobnoustroje.
Aktywacja nocyceptora nie tylko powoduje nadwrażliwość na ból i swędzenie, ale także obniża próg zapłonu nocyceptora, prowadząc do miejscowego uwalniania neuropeptydów. Peptydy, które są wytwarzane i uwalniane z obwodowych zakończeń nocyceptorów, mogą blokować chemotaksję i polaryzację limfocytów, kontrolując lokalizację, czas trwania i rodzaj zapalenia. Najnowsze dowody wskazują, że neurony czuciowe oddziałują z wrodzonymi komórkami odpornościowymi poprzez kontakt komórka-komórka, na przykład angażując receptory grupy 2D (NKG2D) na komórkach NK (natural killer).
Biorąc pod uwagę, że komórki NK wyrażają pokrewne receptory dla różnych mediatorów wytwarzanych przez nocyceptory, można sobie wyobrazić, że nocyceptory używają neuropeptydów do kontrolowania aktywności komórek NK. Tutaj opracowujemy metodę wspólnej hodowli do badania interakcji neuronów nocyceptorowych z komórkami NK w naczyniu. Stosując to podejście, odkryliśmy, że neurony nocyceptorowe lędźwiowe zmniejszają ekspresję cytokin w komórkach NK. Ogólnie rzecz biorąc, taka redukcjonistyczna metoda może być przydatna do zbadania, w jaki sposób neurony unerwiające nowotwór kontrolują funkcję przeciwnowotworową komórek NK i jak komórki NK kontrolują eliminację uszkodzonych neuronów.
Wprowadzenie
Ciała komórkowe neuronów czuciowych pochodzą ze zwojów korzenia grzbietowego (DRG). DRG znajdują się w obwodowym układzie nerwowym (PNS), między rogiem grzbietowym rdzenia kręgowego a zakończeniami nerwów obwodowych. Pseudo-unipolarna natura neuronów DRG pozwala na przekazywanie informacji z gałęzi obwodowej, która unerwia tkankę docelową, do gałęzi centralnej, która przenosi informacje somatosensoryczne do rdzenia kręgowego1. Korzystając z wyspecjalizowanych receptorów kanałów jonowych, neurony pierwszego rzędu wykrywają zagrożenia stwarzane przez patogeny, alergeny i zanieczyszczenia2, co prowadzi do napływu kationów (Na+, Ca2+) i generowania potencjału czynnościowego3,4,5.
Te neurony również wysyłają potencjał działania antydromicznego w kierunku peryferii, gdzie nastąpiło początkowe wyczucie niebezpieczeństwa, co prowadzi do lokalnego uwolnienia neuropeptydów1,4. Dlatego neurony nocyceptorowe służą jako mechanizm ochronny, ostrzegając gospodarza o zagrożeniu środowiskowym4,5,6,7.
Aby komunikować się z neuronami drugiego rzędu, nocyceptory uwalniają różne neuroprzekaźniki (np. glutaminian) i neuropeptydy (np. peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP), substancja P (SP) i wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP))6,7. Peptydy te działają na naczynia włosowate i sprzyjają wynaczynieniu osocza, obrzękowi oraz miejscowemu napływowi i modulacji komórek odpornościowych2,4,7.
Systemy somatosensoryczne i immunologiczne wykorzystują wspólny system komunikacji złożony z cytokin i neuropeptydów oraz ich pokrewnych receptorów4. Chociaż ta dwukierunkowa komunikacja pomaga chronić przed niebezpieczeństwem i zachować homeostazę, może również przyczyniać się do patofizjologii choroby4.
Komórki NK są klasyfikowane jako wrodzone komórki limfoidalne i są wyspecjalizowane w eliminowaniu komórek zakażonych wirusem. Funkcja komórek NK jest regulowana przez równowagę receptorów stymulujących i hamujących, w tym receptora aktywującego NKG2D8. Endogenny ligand NKG2D, kwas retinowy wcześnie indukowalny1 (RAE1), ulega ekspresji przez komórki poddawane stresowi, takiemu jak nowotworzenie i infekcja8,9.
Ostatnie badania wykazały, że uszkodzenie nerwów obwodowych pobudza neurony czuciowe do ekspresji nieprzystosowawczych cząsteczek, takich jak stathmin 2 (STMN2) i RAE1. W ten sposób, poprzez kontakt komórka-komórka, komórki NK wykazujące ekspresję NKG2D były aktywowane przez interakcję z neuronami wykazującymi ekspresję RAE1. Z kolei komórki NK były w stanie wyeliminować uszkodzone neurony nocyceptorowe i nadwrażliwość na ból, zwykle związaną z uszkodzeniem nerwów10. Oprócz osi NKG2D-RAE1, komórki NK wyrażają pokrewne receptory dla różnych mediatorów wytwarzanych przez nocyceptory. Możliwe jest zatem, że mediatory te modulują aktywność komórek NK. W pracy przedstawiono metodę kohodowli w celu zbadania biologii interakcji neuron nocyceptorowy z komórką NK. Podejście to pomoże lepiej zrozumieć, w jaki sposób neurony nocyceptorowe modulują wrodzoną odpowiedź komórek odpornościowych na uraz, infekcję lub nowotwór złośliwy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Montrealu (#22053, #22054) zatwierdziły wszystkie procedury dla zwierząt. Tabela 1 zawiera wykaz roztworów i ich skład, a Tabela materiałów zawiera wykaz materiałów, sprzętu i odczynników stosowanych w niniejszym protokole.
1. Izolacja, hodowla i stymulacja komórek NK
- Wygeneruj nienaruszony neuron nocyceptora (kontrola rodzeństwa z miotu; TRPV1wt::D TAfl/wt) i myszy poddane ablacji (TRPV1cre::D TAfl/wt) przez skrzyżowanie myszy z toksyną lox-stop-lox-błoniczą (DTAfl/fl) z myszamiTRPV1 cre/wt.
- Stosując inhalację CO2 należy poddać eutanazji naiwną mysz kontrolną z miotu (TRPV1wt::D TAfl/wt).
- Zebrać śledzionę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Homogenizuj śledzionę za pomocą tłuczka.
- Rozcieńczyć komórki 1 ml sterylnego PBS.
- Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 50 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Uzupełnić objętość (10 ml) sterylnym PBS.
- Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.
- Zawiesić komórki w stężeniu 108 komórek/ml w uzupełnionej pożywce RPMI 1640.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby magnetycznie oczyścić komórki NK śledziony za pomocą zestawu do izolacji mysich komórek NK. Potwierdź czystość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej11.
- Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki NK w uzupełnionej pożywce hodowlanej RPMI 1640 (zawierającej IL-2 i IL-15).
- Hodowla 2 × 106 komórek NK/ml w 96-dołkowej płytce dolnej U przez 48 godzin.
2. Izolacja i hodowla neuronów DRG
- Na 24 godziny przed zakończeniem stymulacji komórek NK (krok 1.15) pokryć 96-dołkową płytkę 100 μl/basenik lamininy (1 ng/ml) i inkubować przez 45 minut (37 °C).
- Po inkubacji usunąć roztwór i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Stosując wdychanie CO2 należy poddać eutanazji neuron nocyceptora w stanie nienaruszonym (kontrola rodzeństwa; TRPV1wt::D TAfl/wt) lub myszy z ablacją (TRPV1cre::D TAfl/wt).
UWAGA: Wdychanie CO2 jest preferowane w przypadku zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ pozwala uniknąć zakłócenia nerwów rdzeniowych połączonych z DRG. - Przymocuj mysz do tablicy w pozycji leżącej, unieś skórę i nacinaj skórę wzdłuż kolumny grzbietowej. Zapoznaj się z Perner et al., aby uzyskać szczegółowe video12.
- Odetnij staw lędźwiowo-krzyżowy i oddziel kość krzyżową od odcinka lędźwiowego kręgosłupa nożyczkami.
- Oddziel kręgosłup, przecinając mięśnie i żebra po obu stronach kręgosłupa w kierunku czaszki, aż do osiągnięcia podstawy czaszki.
- Za pomocą nożyczek odetnij kręgosłup w stawie szczytowo-potylicznym.
- Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z kręgosłupa.
- Przypnij i otwórz kręgosłup, aby usunąć rdzeń kręgowy i uzyskać dostęp do DRG. Poszukaj DRG w otworze międzykręgowym połączonym z rdzeniem kręgowym przez korzeń grzbietowy, ale oddzielonym od opon mózgowych.
- Zbierz DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml lodowato uzupełnionego DMEM.
- Odwirować preparat (200 × g, 5 min, temperatura pokojowa) i usunąć sklarowany nad osadem.
- Dodać 250 μl PBS zawierającego kolagenazę IV (1 mg/ml) i dypazę II (2,4 j./ml).
- Inkubować DRG z roztworem kolagenazy IV/Dispazy II (C/D) (80 min, 37 °C, łagodne mieszanie). Podczas łączenia zwojów od kilku myszy utrzymuj stosunek 125 μl roztworu C/D na ganglion .
- Aby dezaktywować enzymy, dodaj 5 ml uzupełnionej pożywki DMEM.
- Odwirować roztwór (200 × g, 5 min) i delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
- Aby uniknąć niepożądanej utraty komórek, pozostaw ~100 μl supernatantu.
- Dodać 1 ml uzupełnionej pożywki DMEM.
- Za pomocą pistoletu do pipet i trzech szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się rozmiarach, delikatnie rozetrzyj DRG (~10 góra/dół na rozmiar pipety Pasteura) na preparat jednokomórkowy.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w sterylnym PBS do końcowego stężenia 15%. Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.
- Stwórz gradient BSA w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, dodając 2 ml sterylnego PBS i powoli dozując 1 ml 15% roztworu BSA na dno probówki. Unikaj zakłócania gradientu, delikatnie wyjmując pipetę.
- Za pomocą pipety P200 powoli pipetować zawiesinę zwojów nerwowych (która zawiera neurony) na bok rurki do gradientu.
- Odwirować gradient BSA zawierający neurony (200 × g, 12 min, temperatura pokojowa). Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirówki na prędkość minimalną.
UWAGA: Po odwirowaniu neurony znajdą się na dnie probówki, podczas gdy szczątki komórek zostaną uwięzione w gradiencie BSA. - Delikatnie usunąć cały supernatant za pomocą pipety.
- Ponownie zawiesić komórki w 500 μl Neurobasal.
- Płytka 104 neurony na dołek (200 μl neurobazal/studzienka) na pokrytej lamininą, płaskiej 96-dołkowej płytce.
UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~8 studni na mysz. - Hodowla neuronów (37 °C, przez noc), aby umożliwić przyczepienie się.
3. Kokultura i cytometria przepływowa
- Powoli usuń neuronalę z hodowli neuronów.
- Po 48 godzinnej stymulacji IL-2 i IL-15 (patrz kroki 1.14-1.15), ponownie zawieś komórki NK i dodaj 105 komórek NK / studzienkę do hodowli neuronów (96-dołkowa płaska płytka denna).
UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~6 studzienek na mysz. - Współhodowla komórek w uzupełnionym neurobazalnym MX (37 °C, 48 h).
- Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Wyrzucić sklarkatus i zabarwić komórki barwnikiem żywotności eFlour-780 (1:1 000, 15 min, 4 °C).
- Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Zablokować niespecyficzne miejsca na komórkach za pomocą CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
- Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Wybarwić (15 min, 4 °C) komórki anty-NK-1.1 BV421 (1:100), izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) anty-NKp46 (1:100) i fikoerytryną (PE) anty-GM-CSF (1:100).
- Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (500 μL) i immunofenotypować komórki NK za pomocą cytometrii przepływowej11. Zobacz Rysunek 1A dla strategii bramkowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórki NK zostały oczyszczone magnetycznie ze splenocytów myszy kontrolnych z tego samego miotu (TRPV1wt::DTAfl/wt) i stymulowane (przez 48 h) za pomocą IL-2 oraz IL-15. Następnie komórki NK hodowano osobno lub w ko-kulturze z neuronami z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) pobranymi od myszy z nienaruszonymi neuronami nocyceptywnymi (kontrola z tego samego miotu; TRPV1wt::DTAfl/wt) lub z nimi abladowanymi (TRPV1cre::DTAfl/wt). Następnie komórki poddano dzi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Davies i wsp.11 odkryli, że uszkodzone neurony regulują w górę RAE1. Poprzez kontakt komórka-komórka, komórki NK wykazujące ekspresję NKG2D były następnie w stanie zidentyfikować i wyeliminować neurony RAE1 + , co z kolei ogranicza przewlekły ból11. Biorąc pod uwagę, że komórki NK również wyrażają różne receptory neuropeptydowe i że te neuropeptydy są znane ze swoich zdolności immunomodulacyjnych, coraz ważniejsze wydaje się badanie interakcji między kom...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), Canadian Foundation for Innovation (37439), Canada Research Chair program (950-231859), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824), oraz Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anty-mysie CD16/32 | Jackson Laboratory | Nr kat.:017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Nr kat.:009669 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) klasa hodowli | Precision Instruments | Nr kat.:504167 | |
| BV421 anty-mysi NK-1.1 | Fisher Scientific | Nr kat.:12430112 | |
| Sitko do komórek (50 μ m) | Fisher Scientific | Nr kat.:A3160702 | |
| Kolagenaza IV | Fisher Scientific | Nr kat.:15140148 | |
| Toksyna dyfteryjnafl/fl | Fisher Scientific | Nr kat.:SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Nr kat.:13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Nr kat.:: 07-200-95 | |
| Zestaw do izolacji komórek NK myszy EasySep | Nr | kat.:CLS2595 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Sigma | Nr kat.:C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Nr kat.:04942078001 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Sigma | Nr kat.:806552 | |
| FITC anty-mysz NKp46 | Sigma | Nr kat.:L2020 | |
| Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem | Sigma | Nr kat.:03690 | |
| Szklana pipeta Pasteura | Sigma | Nr kat.:470236-274 | |
| Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF) | VWR | Nr kat.:02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Nr kat.:03-50/31 | |
| L-Glutamina | Gibco | Nr kat.:A14867-01 | |
| Mysz rekombinowany IL-15 | Gibco | Nr kat.:22400-089 | |
| Rekombinowany IL-2 | dla myszy Gibco | Nr kat.:21103-049 | |
| Czynnik wzrostu nerwów (NGF) | Life Technologies | Nr kat.:13257-019 | |
| Pożywka nerwowa | PeproTech | Nr kat.:450-51-10 | |
| PE anty-mysie GM-CSF | PeproTech | Nr kat.:212-12 | |
| Penicylina i Streptomycyna | PeproTech | Nr kat.:210-15 | |
| Technologia komórek | macierzystych Tłem | nr: 19855 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Biolegend | Nr kat.:108732 | Klon PK136 |
| RPMI 1640 Media | Biolegend | Nr kat.:137606 | Klon 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Nr kat.:505406 | Klon MP1-22E9 |
| Pęsety i narzędzia do preparowania. | Biolegend | Nr kat.:65-0865-14 | |
| 96-dołkowa płytka w kształcie litery U | Biolegend | Nr kat.:101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
Bibliografia
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
- Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
- Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
- Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
- Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
- Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
- Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
- Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333(2021).
- Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
- Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
- Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
