Odkrywanie wzajemnych oddziaływań między komórkami NK a neuronami nocyceptorowymi

Podsumowanie

Neurony nocyceptorowe i komórki NK aktywnie oddziałują na siebie w kontekście zapalnym. Podejście oparte na współkulturze umożliwia badanie tej wzajemnej zależności.

Streszczenie

Neurony somatosensoryczne ewoluowały, aby wykrywać szkodliwe bodźce i aktywować odruchy obronne. Dzieląc się środkami komunikacji, neurony nocyceptorowe dostrajają również mechanizmy obronne gospodarza, kontrolując aktywność układu odpornościowego. Komunikacja między tymi systemami jest w większości adaptacyjna, pomagając chronić homeostazę, może również prowadzić do wystąpienia chorób przewlekłych lub je promować. Oba systemy ewoluowały równocześnie, aby umożliwić taką miejscową interakcję, jaką można znaleźć w pierwotnych i wtórnych tkankach limfatycznych i błonie śluzowej. Ostatnie badania wykazały, że nocyceptory bezpośrednio wykrywają i reagują na obce antygeny, cytokiny pochodzące z komórek odpornościowych i drobnoustroje.

Aktywacja nocyceptora nie tylko powoduje nadwrażliwość na ból i swędzenie, ale także obniża próg zapłonu nocyceptora, prowadząc do miejscowego uwalniania neuropeptydów. Peptydy, które są wytwarzane i uwalniane z obwodowych zakończeń nocyceptorów, mogą blokować chemotaksję i polaryzację limfocytów, kontrolując lokalizację, czas trwania i rodzaj zapalenia. Najnowsze dowody wskazują, że neurony czuciowe oddziałują z wrodzonymi komórkami odpornościowymi poprzez kontakt komórka-komórka, na przykład angażując receptory grupy 2D (NKG2D) na komórkach NK (natural killer).

Biorąc pod uwagę, że komórki NK wyrażają pokrewne receptory dla różnych mediatorów wytwarzanych przez nocyceptory, można sobie wyobrazić, że nocyceptory używają neuropeptydów do kontrolowania aktywności komórek NK. Tutaj opracowujemy metodę wspólnej hodowli do badania interakcji neuronów nocyceptorowych z komórkami NK w naczyniu. Stosując to podejście, odkryliśmy, że neurony nocyceptorowe lędźwiowe zmniejszają ekspresję cytokin w komórkach NK. Ogólnie rzecz biorąc, taka redukcjonistyczna metoda może być przydatna do zbadania, w jaki sposób neurony unerwiające nowotwór kontrolują funkcję przeciwnowotworową komórek NK i jak komórki NK kontrolują eliminację uszkodzonych neuronów.

Wprowadzenie

Ciała komórkowe neuronów czuciowych pochodzą ze zwojów korzenia grzbietowego (DRG). DRG znajdują się w obwodowym układzie nerwowym (PNS), między rogiem grzbietowym rdzenia kręgowego a zakończeniami nerwów obwodowych. Pseudo-unipolarna natura neuronów DRG pozwala na przekazywanie informacji z gałęzi obwodowej, która unerwia tkankę docelową, do gałęzi centralnej, która przenosi informacje somatosensoryczne do rdzenia kręgowego¹. Korzystając z wyspecjalizowanych receptorów kanałów jonowych, neurony pierwszego rzędu wykrywają zagrożenia stwarzane przez patogeny, alergeny i zanieczyszczenia², co prowadzi do napływu kationów (Na⁺, Ca²⁺) i generowania potencjału czynnościowego^3,4,⁵.

Te neurony również wysyłają potencjał działania antydromicznego w kierunku peryferii, gdzie nastąpiło początkowe wyczucie niebezpieczeństwa, co prowadzi do lokalnego uwolnienia neuropeptydów^1,4. Dlatego neurony nocyceptorowe służą jako mechanizm ochronny, ostrzegając gospodarza o zagrożeniu środowiskowym^4,5,6,7.

Aby komunikować się z neuronami drugiego rzędu, nocyceptory uwalniają różne neuroprzekaźniki (np. glutaminian) i neuropeptydy (np. peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP), substancja P (SP) i wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP))^6,7. Peptydy te działają na naczynia włosowate i sprzyjają wynaczynieniu osocza, obrzękowi oraz miejscowemu napływowi i modulacji komórek odpornościowych^2,4,7.

Systemy somatosensoryczne i immunologiczne wykorzystują wspólny system komunikacji złożony z cytokin i neuropeptydów oraz ich pokrewnych receptorów⁴. Chociaż ta dwukierunkowa komunikacja pomaga chronić przed niebezpieczeństwem i zachować homeostazę, może również przyczyniać się do patofizjologii choroby⁴.

Komórki NK są klasyfikowane jako wrodzone komórki limfoidalne i są wyspecjalizowane w eliminowaniu komórek zakażonych wirusem. Funkcja komórek NK jest regulowana przez równowagę receptorów stymulujących i hamujących, w tym receptora aktywującego NKG2D⁸. Endogenny ligand NKG2D, kwas retinowy wcześnie indukowalny1 (RAE1), ulega ekspresji przez komórki poddawane stresowi, takiemu jak nowotworzenie i infekcja^8,9.

Ostatnie badania wykazały, że uszkodzenie nerwów obwodowych pobudza neurony czuciowe do ekspresji nieprzystosowawczych cząsteczek, takich jak stathmin 2 (STMN2) i RAE1. W ten sposób, poprzez kontakt komórka-komórka, komórki NK wykazujące ekspresję NKG2D były aktywowane przez interakcję z neuronami wykazującymi ekspresję RAE1. Z kolei komórki NK były w stanie wyeliminować uszkodzone neurony nocyceptorowe i nadwrażliwość na ból, zwykle związaną z uszkodzeniem nerwów¹⁰. Oprócz osi NKG2D-RAE1, komórki NK wyrażają pokrewne receptory dla różnych mediatorów wytwarzanych przez nocyceptory. Możliwe jest zatem, że mediatory te modulują aktywność komórek NK. W pracy przedstawiono metodę kohodowli w celu zbadania biologii interakcji neuron nocyceptorowy z komórką NK. Podejście to pomoże lepiej zrozumieć, w jaki sposób neurony nocyceptorowe modulują wrodzoną odpowiedź komórek odpornościowych na uraz, infekcję lub nowotwór złośliwy.

Protokół

Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Montrealu (#22053, #22054) zatwierdziły wszystkie procedury dla zwierząt. Tabela 1 zawiera wykaz roztworów i ich skład, a Tabela materiałów zawiera wykaz materiałów, sprzętu i odczynników stosowanych w niniejszym protokole.

1. Izolacja, hodowla i stymulacja komórek NK

1. Wygeneruj nienaruszony neuron nocyceptora (kontrola rodzeństwa z miotu; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) i myszy poddane ablacji (TRPV1^cre::D TA^fl/wt) przez skrzyżowanie myszy z toksyną lox-stop-lox-błoniczą (DTA^fl/fl) z myszami^{TRPV1 cre/wt}.
2. Stosując inhalację CO₂ należy poddać eutanazji naiwną mysz kontrolną z miotu (TRPV1^wt::D TA^fl/wt).
3. Zebrać śledzionę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
4. Homogenizuj śledzionę za pomocą tłuczka.
5. Rozcieńczyć komórki 1 ml sterylnego PBS.
6. Przefiltrować mieszaninę przez sitko o pojemności 50 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
7. Uzupełnić objętość (10 ml) sterylnym PBS.
8. Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.
9. Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.
10. Zawiesić komórki w stężeniu 10⁸ komórek/ml w uzupełnionej pożywce RPMI 1640.
11. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby magnetycznie oczyścić komórki NK śledziony za pomocą zestawu do izolacji mysich komórek NK. Potwierdź czystość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej¹¹.
12. Zbierz 10 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru.
13. Odwirować komórki (500 × g, 5 min) i usunąć supernatant.
14. Ponownie zawiesić komórki NK w uzupełnionej pożywce hodowlanej RPMI 1640 (zawierającej IL-2 i IL-15).
15. Hodowla 2 × 10⁶ komórek NK/ml w 96-dołkowej płytce dolnej U przez 48 godzin.

2. Izolacja i hodowla neuronów DRG

1. Na 24 godziny przed zakończeniem stymulacji komórek NK (krok 1.15) pokryć 96-dołkową płytkę 100 μl/basenik lamininy (1 ng/ml) i inkubować przez 45 minut (37 °C).
2. Po inkubacji usunąć roztwór i pozostawić studzienki do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Stosując wdychanie CO₂ należy poddać eutanazji neuron nocyceptora w stanie nienaruszonym (kontrola rodzeństwa; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) lub myszy z ablacją (TRPV1^cre::D TA^fl/wt).
   UWAGA: Wdychanie CO₂ jest preferowane w przypadku zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ pozwala uniknąć zakłócenia nerwów rdzeniowych połączonych z DRG.
4. Przymocuj mysz do tablicy w pozycji leżącej, unieś skórę i nacinaj skórę wzdłuż kolumny grzbietowej. Zapoznaj się z Perner et al., aby uzyskać szczegółowe video¹².
5. Odetnij staw lędźwiowo-krzyżowy i oddziel kość krzyżową od odcinka lędźwiowego kręgosłupa nożyczkami.
6. Oddziel kręgosłup, przecinając mięśnie i żebra po obu stronach kręgosłupa w kierunku czaszki, aż do osiągnięcia podstawy czaszki.
7. Za pomocą nożyczek odetnij kręgosłup w stawie szczytowo-potylicznym.
8. Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z kręgosłupa.
9. Przypnij i otwórz kręgosłup, aby usunąć rdzeń kręgowy i uzyskać dostęp do DRG. Poszukaj DRG w otworze międzykręgowym połączonym z rdzeniem kręgowym przez korzeń grzbietowy, ale oddzielonym od opon mózgowych.
10. Zbierz DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml lodowato uzupełnionego DMEM.
11. Odwirować preparat (200 × g, 5 min, temperatura pokojowa) i usunąć sklarowany nad osadem.
12. Dodać 250 μl PBS zawierającego kolagenazę IV (1 mg/ml) i dypazę II (2,4 j./ml).
13. Inkubować DRG z roztworem kolagenazy IV/Dispazy II (C/D) (80 min, 37 °C, łagodne mieszanie). Podczas łączenia zwojów od kilku myszy utrzymuj stosunek 125 μl roztworu C/D na ganglion
.
14. Aby dezaktywować enzymy, dodaj 5 ml uzupełnionej pożywki DMEM.
15. Odwirować roztwór (200 × g, 5 min) i delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
16. Aby uniknąć niepożądanej utraty komórek, pozostaw ~100 μl supernatantu.
17. Dodać 1 ml uzupełnionej pożywki DMEM.
18. Za pomocą pistoletu do pipet i trzech szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się rozmiarach, delikatnie rozetrzyj DRG (~10 góra/dół na rozmiar pipety Pasteura) na preparat jednokomórkowy.
19. W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w sterylnym PBS do końcowego stężenia 15%. Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.
20. Stwórz gradient BSA w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, dodając 2 ml sterylnego PBS i powoli dozując 1 ml 15% roztworu BSA na dno probówki. Unikaj zakłócania gradientu, delikatnie wyjmując pipetę.
21. Za pomocą pipety P200 powoli pipetować zawiesinę zwojów nerwowych (która zawiera neurony) na bok rurki do gradientu.
22. Odwirować gradient BSA zawierający neurony (200 × g, 12 min, temperatura pokojowa). Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirówki na prędkość minimalną.
    UWAGA: Po odwirowaniu neurony znajdą się na dnie probówki, podczas gdy szczątki komórek zostaną uwięzione w gradiencie BSA.
23. Delikatnie usunąć cały supernatant za pomocą pipety.
24. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl Neurobasal.
25. Płytka 10⁴ neurony na dołek (200 μl neurobazal/studzienka) na pokrytej lamininą, płaskiej 96-dołkowej płytce.
    UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~8 studni na mysz.
26. Hodowla neuronów (37 °C, przez noc), aby umożliwić przyczepienie się.

3. Kokultura i cytometria przepływowa

1. Powoli usuń neuronalę z hodowli neuronów.
2. Po 48 godzinnej stymulacji IL-2 i IL-15 (patrz kroki 1.14-1.15), ponownie zawieś komórki NK i dodaj 10⁵ komórek NK / studzienkę do hodowli neuronów (96-dołkowa płaska płytka denna).
   UWAGA: Średnio badacz będzie w stanie napełnić ~6 studzienek na mysz.
3. Współhodowla komórek w uzupełnionym neurobazalnym MX (37 °C, 48 h).
4. Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
5. Wyrzucić sklarkatus i zabarwić komórki barwnikiem żywotności eFlour-780 (1:1 000, 15 min, 4 °C).
6. Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
7. Zablokować niespecyficzne miejsca na komórkach za pomocą CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
8. Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
9. Wybarwić (15 min, 4 °C) komórki anty-NK-1.1 BV421 (1:100), izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) anty-NKp46 (1:100) i fikoerytryną (PE) anty-GM-CSF (1:100).
10. Zebrać komórki, przemyć PBS (3x) i odwirować (500 × g, 5 min, 4 °C).
11. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (500 μL) i immunofenotypować komórki NK za pomocą cytometrii przepływowej¹¹. Zobacz Rysunek 1A dla strategii bramkowania.

Wyniki

Komórki NK zostały magnetycznie oczyszczone z kontrolnych kontrolnych splenocytów myszy z miotu (TRPV1^wt::D TA^fl/wt) i stymulowane (48 godzin) IL-2 i IL-15. Komórki NK były następnie hodowane samodzielnie lub współhodowane z neuronami DRG pobranymi z neuronów nocyceptorowych w stanie nienaruszonym (kontrola miotu; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) lub myszy z ablacją (TRPV1^cre::D TA^fl/wt). Komórki poddano następnie działaniu agonisty TRPV1 kapsaicyny (1 μM) lub jej nośn...

Dyskusja

Davies i ^wsp.11 odkryli, że uszkodzone neurony regulują w górę RAE1. Poprzez kontakt komórka-komórka, komórki NK wykazujące ekspresję NKG2D były następnie w stanie zidentyfikować i wyeliminować neurony RAE1 ⁺ , co z kolei ogranicza przewlekły ból¹¹. Biorąc pod uwagę, że komórki NK również wyrażają różne receptory neuropeptydowe i że te neuropeptydy są znane ze swoich zdolności immunomodulacyjnych, coraz ważniejsze wydaje się badanie interakcji między kom...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anty-mysie CD16/32	Jackson Laboratory	Nr kat.:017769
B-27	Jackson Laboratory	Nr kat.:009669
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) klasa hodowli	Precision Instruments	Nr kat.:504167
BV421 anty-mysi NK-1.1	Fisher Scientific	Nr kat.:12430112
Sitko do komórek (50 μ m)	Fisher Scientific	Nr kat.:A3160702
Kolagenaza IV	Fisher Scientific	Nr kat.:15140148
Toksyna dyfteryjnafl/fl	Fisher Scientific	Nr kat.:SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Nr kat.:13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Nr kat.:: 07-200-95
Zestaw do izolacji komórek NK myszy EasySep	Nr	kat.:CLS2595
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma	Nr kat.:C0130
FACSAria III	Sigma	Nr kat.:04942078001
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Sigma	Nr kat.:806552
FITC anty-mysz NKp46	Sigma	Nr kat.:L2020
Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem	Sigma	Nr kat.:03690
Szklana pipeta Pasteura	Sigma	Nr kat.:470236-274
Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF)	VWR	Nr kat.:02-0131
Laminin	Cedarlane	Nr kat.:03-50/31
L-Glutamina	Gibco	Nr kat.:A14867-01
Mysz rekombinowany IL-15	Gibco	Nr kat.:22400-089
Rekombinowany IL-2	dla myszy Gibco	Nr kat.:21103-049
Czynnik wzrostu nerwów (NGF)	Life Technologies	Nr kat.:13257-019
Pożywka nerwowa	PeproTech	Nr kat.:450-51-10
PE anty-mysie GM-CSF	PeproTech	Nr kat.:212-12
Penicylina i Streptomycyna	PeproTech	Nr kat.:210-15
Technologia komórek	macierzystych Tłem	nr: 19855
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Biolegend	Nr kat.:108732	Klon PK136
RPMI 1640 Media	Biolegend	Nr kat.:137606	Klon 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Nr kat.:505406	Klon MP1-22E9
Pęsety i narzędzia do preparowania.	Biolegend	Nr kat.:65-0865-14
96-dołkowa płytka w kształcie litery U	Biolegend	Nr kat.:101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson