Ocena efektywności fotosyntezy w mutantach fotooddechowych za pomocą analizy fluorescencji chlorofilu

Warunki stresu abiotycznego często spotykane na polach rolników mogą negatywnie wpływać na plony, zmniejszając wydajność fotosyntezy. Niekorzystne warunki środowiskowe, takie jak fale upałów, zmiany klimatyczne, susza i zasolenie gleby, mogą powodować stresy abiotyczne, które zmieniają dostępność CO₂ i zmniejszają reakcję rośliny na silny stres świetlny. Dwa największe strumienie węgla na Ziemi to fotosynteza i fotooddychanie, które są niezbędne dla wzrostu roślin i plonów. Wiele ważnych białek i enzymów biorących udział w tych procesach zostało scharakteryzowanych w warunkach laboratoryjnych i zidentyfikowanych na poziomie genetycznym¹. Chociaż poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu fotosyntezy i fotooddychania, wiele etapów, w tym transport między organellami roślinnymi, pozostaje niescharakteryzowanych^2,3.

Fotooddychanie, drugi co do wielkości strumień węgla w roślinach po fotosyntezie, rozpoczyna się, gdy enzym Rubisco wiąże tlen zamiast dwutlenku węgla do rybulozo-1,5 bisfosforanu (RuBP), tworząc związek hamujący 2-fosfoglikolan (2PG)¹. Aby zminimalizować hamujące działanie 2PG i poddać recyklingowi wcześniej związany węgiel, rośliny C3 wyewoluowały wieloorganelowy proces fotooddychania. Fotooddychanie przekształca dwie cząsteczki 2PG w jedną cząsteczkę 3-fosfoglicerynianu (3PGA), która może ponownie wejść w cykl wiązania węgla C3¹. W ten sposób fotooddychanie przekształca tylko 75% wcześniej ustalonego węgla z generacji 2PG i zużywa w tym procesie ATP. W rezultacie, proces fotooddychania jest znaczącym 10%-50% hamulcem procesu fotosyntezy, w zależności od dostępności wody i temperatur sezonu wegetacyjnego⁴.

Enzymy biorące udział w fotooddychaniu były przedmiotem badań od dziesięcioleci, ale tylko niewielka liczba białek transportowych została scharakteryzowana na poziomie genetycznym, mimo że co najmniej 25 etapów transportu jest zaangażowanych w ten proces5^,6,7. Dwa białka transportowe, które są bezpośrednio zaangażowane w ruch węgla powstającego w procesie fotooddychania, to transporter glikolu plastydowego/glicerynu PLGG1 i symporter sodu kwasów żółciowych BASS6, z których oba są zaangażowane w eksport glikolanu z chloroplast^5,6.

W otoczeniu [CO₂], Rubisco przywiązuje cząsteczkę tlenu do RuBP w około 20% przypadków¹. Kiedy rośliny są poddawane działaniu niskiego poziomu [CO_{2 ],} tempo fotooddychania wzrasta, co sprawia, że niski poziom [CO₂] jest idealnym środowiskiem do testowania mutantów, które mogą być ważne w warunkach podwyższonego stresu fotooddychania. Testowanie dodatkowych przypuszczalnych linii T-DNA białka transportującego chloroplasty pod niskim poziomem CO_{2 przez} 24 godziny i pomiar zmian we fluorescencji chlorofilu doprowadziło do identyfikacji linii roślinnych bass6-1, które wykazały fenotyp zmutowanego fotooddychania⁵. Dalsza charakterystyka wykazała, że BASS6 jest transporterem glikolu w wewnętrznej błonie chloroplastu.

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół podobny do tego, który początkowo był używany do identyfikacji BASS6 jako transportera fotooddychania, który pochodził z listy domniemanych białek transportowych znajdujących się w błonie chloroplastowej⁸ Ten protokół może być wykorzystany w wysokoprzepustowym eksperymencie charakteryzującym mutanty T-DNA Arabidopsis lub zmutowane rośliny generowane przez EMS jako sposób na identyfikację genów ważnych dla utrzymania wydajności fotosyntezy w zakresie stresy abiotyczne, takie jak upały, stres związany z silnym oświetleniem, susza i dostępność CO₂ . Badania przesiewowe mutantów roślinnych za pomocą fluorescencji chlorofilu były stosowane w przeszłości w celu szybkiej identyfikacji genów ważnych dla pierwotnego metabolizmu⁹. Biorąc pod uwagę, że aż 30% genomu rzodkiewnika zawiera geny kodujące białka o nieznanej lub słabo scharakteryzowanej funkcji, wywołana stresem analiza wydajności fotosyntezy może dostarczyć wglądu w funkcje molekularne, których nie obserwuje się w kontrolowanych warunkach u zmutowanych roślin¹⁰. Celem tej metody jest identyfikacja mutantów szlaku fotooddechowego za pomocą badań przesiewowych o niskim poziomie CO_{2 .} Przedstawiamy metodę identyfikacji mutantów, które zaburzają fotooddychanie po ekspozycji na niski poziom_CO2. Zaletą tej metody jest to, że jest to wysokoprzepustowe przesiewanie sadzonek, które można wykonać w stosunkowo krótkim czasie. Sekcje protokołu wideo zawierają szczegółowe informacje na temat przygotowania i sterylizacji nasion, wzrostu roślin i traktowania niskim poziomem CO_{2 ,} konfiguracji systemu obrazowania fluorescencyjnego, pomiaru wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu substancji, reprezentatywnych wyników i wniosków.

1. Przygotowanie i sterylizacja nasion

UWAGA: Przygotowanie nasion składa się z nasiąknięcia nasionami i ich sterylizacji. Należy pamiętać, że wszystkie te czynności należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki. Wszystkie niezbędne materiały, odczynniki i podłoża wzrostowe muszą być sterylizowane w autoklawie (patrz Tabela materiałów).

1. Wchłanianie i stratyfikacja nasion
   UWAGA: Używane linie nasion to plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) i typ dziki (WT, Col-0).
   1. Dozuj nasiona do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Nasiona należy zanurzyć w sterylnej wodzie w okapie z przepływem laminarnym i rozwarstwić w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2 dni.
2. Sterylizacja nasion
   1. W sterylnych warunkach przygotuj 10 ml 50% (v/v) roztworu wybielacza i dodaj około 20 μl Tween 20. W celu sterylizacji nasion usuń wodę z wchłoniętych nasion, dodaj 1 ml roztworu wybielacza do probówek mikrowirówek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Usuń roztwór wybielacza za pomocą pipety.
   3. Opłucz nasiona w 1 ml sterylnej wody, aby ponownie zawiesić. Usuń wodę, gdy nasiona osiądą na dnie. Powtórz krok 1.6 i krok 1.7 siedem razy.
   4. Ponownie zawiesić nasiona w sterylnym 0,1% roztworze agarozy.
3. Posiewanie nasion
   1. Przygotować 1 l roztworu Murashige & Skoog Basal Medium z witaminami i 1,0 g/l kwasu 2-(N-morfonio)etanosulfonowego (MS), dodając 5,43 g proszku do 500 ml wody destylowanej. Dostosuj pH w zakresie od 5,6 do 5,8 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Napełnij do 1 litra wodą destylowaną.
      1. Podzielić płynny roztwór na 500 ml i umieścić każdą połówkę w kolbie o pojemności 1 l zawierającej mieszadło magnetyczne. Dodać 5 g proszku agarowego, aby uzyskać 1% roztwór agaru w/v dla każdej kolby.
      2. Autoklaw w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 psi przez 30 minut, a następnie umieścić w temperaturze pokojowej, powoli mieszając. Po schłodzeniu wlej 25 ml agaru MS do kwadratowej szalki Petriego. Pozwól mu zastygnąć.
         UWAGA: Te płytki Murashige & Skoog Basal Medium zawierają 1% pożywki MS z witaminami i 1% agaru do hodowli mutantów testowych.
   2. Odetnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl żyletką. Umieść jedno ziarno na środku wyznaczonej kwadratowej siatki dla każdego badanego mutanta lub genotypu (1 cm² kwadrat) kwadratowej płytki MS (Rysunek 1) za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl.
      UWAGA: Kwadratowa siatka o wymiarach 1 cm x 1 cm pomaga zachować jednolitą odległość między siewkami i uniknąć nakładania się, co będzie ważne w późniejszym obrazowaniu i analizie fluorescencji.
   3. Po platerowaniu nasion owiń pokrywkę taśmą chirurgiczną, aby ją uszczelnić, i umieść ją w komorze wzrostu w warunkach opisanych poniżej.

2. Wzrost roślin i niskie stężenie CO₂

1. Uprawiaj rośliny przez 7-9 dni w temperaturze 20 °C w 8-godzinnym cyklu świetlnym 120 μmol·m⁻²s⁻¹ i 16 godzinach ciemności w temperaturze 18 °C. Sprawdź rośliny 6 dnia, aby określić, czy są wystarczająco duże, aby można je było obrazować. W 8 dniu po posadzeniu należy wystawić rośliny na działanie niskiego poziomu CO₂ .
2. Oczyszczanie o niskiej zawartości CO₂
   1. Po 7-9 dniach umieść cztery z ośmiu płytek z warunków otoczenia komory wzrostowej w warunkach fotooddechowych 20 °C, ciągłym poziomie światła 200 μmol·m⁻²s⁻¹ i niskim CO₂ przez 12 godzin.
   2. Skonstruować warunki niskiego poziomu CO₂ za pomocą hermetycznego przezroczystego pojemnika ze 100 g wapna sodowego umieszczonego na dnie pojemnika. Umieść pojemnik w tej samej komorze wzrostowej co kontrola. Utrzymywać instalacje kontrolne w temperaturze poniżej 120 μmol·^m−2s⁻¹ w otaczającym CO₂ przez 12 godzin.

3. Konfiguracja systemu obrazowania fluorescencyjnego

1. Umieść płytkę testową (przygotowaną zgodnie z sekcją 1 i sekcją 2) wyśrodkowaną pod kamerą w ustalonej odległości w systemie obrazowania fluorescencyjnego.
2. W oprogramowaniu przyrządu przejdź do okna na żywo i zaznacz pole Błyski, aby włączyć nieaktyniczne błyski pomiarowe.
3. Klikaj narzędzia Powiększanie i Ostrość, aż zobaczysz pełny i ostry obraz. W tym celu użyj stolika lub półki, aby wyregulować odległość między roślinami a kamerą. Utrzymuj stałe przybliżenie, ostrość i odległość od kamery przez cały eksperyment.
4. Ustaw wartość El. Shutter na 0 i dostosuj czułość, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny w zakresie 200-500 jednostek cyfrowych.
   UWAGA: Niższa wartość migawki (0-1) zapewni, że pomiarowe błyski nie będą aktyniczne, podczas gdy wyższa wartość (2) poprawi rozdzielczość obrazu.
5. Umieść światłomierz w tej samej pozycji, w której użyto go do regulacji ustawień aparatu.
6. W oknie na żywo zaznacz pole Super, aby uruchomić impuls nasycający trwający 800 ms. Pamiętaj, aby za każdym razem zaznaczyć pole dla nowego impulsu.
7. Użyj suwaka, aby dostosować procent mocy względnej dla Super impulsu, aż światłomierz wskaże 6,000-8,000 μmol·m⁻²s⁻¹.

4. Zaprojektuj program wydajności kwantowej

1. Importowanie standardowych narzędzi operacyjnych dla systemu obrazowania.
   Uwzględnij default.inc
   Dołącz light.inc
   UWAGA: Składnia programu używana jako odniesienie w tym eksperymencie dotyczy systemu obrazowania FluorCam.
2. Zdefiniuj następujące zmienne globalne zgodnie ze skonfigurowanymi ustawieniami światła:
   Migawka = 0
   Czułość = 40
   Super = 65
3. Uwzględnij krok czasowy rejestrowania danych:
   TS = 20ms
4. Pobrać pomiar Fo, pobierając próbki fluorescencji w stanie przystosowanym do ciemności.
   F0czas trwania = 2s;
   F0period = 200ms;
   UWAGA: F0duration określa zakres czasu, w którym rejestrowana jest fluorescencja przystosowana do ciemności. Okres F0 określa przedział czasu, w którym powtarzany jest pomiar fluorescencji dostosowany do ciemności.
5. Zapisz pomiary Fo w tabelach danych.
   <0,F0kropka.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->punkt kontrolny,"startFo"
   =>punkt kontrolny,"endFo";
   Gdzie < , > oznacza zbiór wartości fluorescencji indeksowanych czasem; => przechowuje pomiary w pliku systemowym; mfmsub reprezentuje cały zestaw danych dla eksperymentu; a checkpoint tworzy podzbiór danych o określonych pomiarach, takich jak startFo.
6. Zebrać i zapisać pomiar Fm, pobierając próbki fluorescencji po impulsie nasycenia.
   Czas trwania impulsu=960ms; ##
   a1=F0czas trwania + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(Czas trwania impulsu);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>punkt kontrolny,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>punkt kontrolny,"timeVisual";
   Gdzie a1 i a2 są zmiennymi koordynującymi czas pobierania próbek z impulsem nasycenia; a1 oznacza czas rozpoczęcia pomiaru Fm; a a2 reprezentuje czas środkowy impulsu.

5. Pomiar wydajności kwantowej próbek poddanych działaniu

1. Bezpośrednio po zabiegu przykryj płytki folią aluminiową na 15 minut w celu adaptacji do ciemności. Usuń folię, aby zmierzyć wydajność kwantową fotosystemu II za pomocą fluorometru o zmodyfikowanej amplitudzie impulsów. Następnie umieść płytkę siewną bezpośrednio pod kamerą i uruchom protokół wydajności kwantowej znajdujący się w repozytorium GitHub
.
2. Pobierz protokół quantum_yield z GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) lub użyj podobnie zaprojektowanego programu z sekcji 4. Użyj oprogramowania fluorometru, aby otworzyć plik programu, klikając ikonę folderu i przechodząc do lokalizacji pliku.
3. Uruchom program quantum yield, klikając ikonę czerwonej błyskawicy.
4. Po zakończeniu działania protokołu przejdź do okna analizy wstępnej. Podziel płytkę na pojedyncze sadzonki za pomocą narzędzi do zaznaczania, aby podświetlić wszystkie piksele dla każdej sadzonki na obrazie płytki. Kliknij opcję Wykluczenie tła, aby usunąć wszystkie podświetlone piksele tła, pozostawiając tylko obszar sadzonki.
5. Kliknij Analizuj, aby wygenerować dane fluorescencji dla każdej sadzonki na obrazie płytki. Ręcznie dostosuj zakres wartości fluorescencji, aby wyświetlić spójne wartości minimalne i maksymalne dla wszystkich płytek.
6. Kliknij na Średnia liczbowa w zakładce Eksperyment | Eksport | Liczbowy. Zaznacz opcję Wszystkie dane i według kolumny, a następnie kliknij przycisk OK, aby wygenerować plik tekstowy zawierający pomiary QY dla każdej sadzonki.

6. Otwieranie pliku danych

1. Otwórz plik tekstowy w arkuszu kalkulacyjnym do analizy. Spośród nagłówków pokazujących numer obszaru, rozmiar pikseli, Fm, Ft, Fq i QY, zidentyfikuj numer obszaru dla głównego genotypu (WT lub mutant testowy) i QYmax. Wykonaj test t parami w odniesieniu do typu dzikiego, aby określić istotność. Dane są interpretowane jako znacząco różne, gdy wartości p są niższe niż 0,05.

Wyniki pokazują obrazy płytek surowych i fluorescencyjnych z otoczenia i niskiego poziomu CO2 badań przesiewowych WT i mutantów testowych. Każda sadzonka jest oznaczona numerem obszaru, z odpowiednimi odczytami fluorescencji podawanymi jako QY. Dane są eksportowane jako plik tekstowy i można je otworzyć w arkuszu kalkulacyjnym w celu analizy (patrz tabela uzupełniająca S1). Wybrano zmutowane linie plgg1-1 i abcb26, aby wykazać pozytywną i negatywną identyfikację genów związanych ze stresem fotooddechowym. PLGG1 koduje pierwszy transporter w szlaku po natlenieniu RuBP6, podczas gdy uważa się, że ABCB26 koduje transporter antygenu, o którym nie wiadomo, że bierze udział w fotooddychaniu11. Dostosowane do ciemności wydajności Fv/Fm QY WT i mutantów są wizualizowane za pomocą wykresów pudełkowych i wąsów. Aby przetestować różnicę statystyczną między WT a testowanymi mutantami, zastosowano parami test t z wartością p < 0,05. W tym przypadku użyliśmy zmutowanych linii fotooddechowych o obniżonym QY Fv/Fm jako mutantów testowych, aby sprawdzić skuteczność metody przesiewowej. Wyniki pokazują, że testowane mutanty mają znacznie niższą wydajność QY niż WT. Rysunek 3B pokazuje znaczne zmniejszenie stosunku zmiennej do maksymalnej fluorescencji (Fv/Fm) dla plgg1-1, ale nie abcb26 przy niskim CO2. Wynik ten jest zgodny z rolą PLGG1 jako transportera zaangażowanego w fotooddychanie, podczas gdy abcb26 nie wykazuje fenotypu innego niż kontrola WT w warunkach niskiego CO2 . W związku z tym ta metoda przesiewowa może zidentyfikować mutanty fotooddechowe za pomocą badań przesiewowych o niskiej zawartości CO2 .

Rysunek 1: Przykładowy schemat układu płytki nasiennej. Pokazano dwie powtórzenia techniczne z sześcioma nasionami umieszczonymi w rzędzie. Nasiona kontrolne WT umieszczone nad nasionami zmutowanych. Skrót: WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Dostosowane do ciemności obrazy 9-dniowych siewek Fv/Fm. Kontrolę typu dzikiego porównuje się z liniami mutantów T-DNA w otoczeniu i przy niskim poziomie CO2 . Skala kolorów reprezentuje średnią Fv/Fm każdej sadzonki. Podziałka liniowa = 1 cm. Skróty: Fv/Fm = stosunek fluorescencji zmiennej do maksymalnej; WT = typ dziki; PLGG1-1 = Plastydowy translokator glikolu/glicerianu 1; abcb26 = Kaseta wiążąca ATP B26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obserwacje fluorescencji. Pomiary maksymalnej wydajności kwantowej (Fv/Fm) wykonane na siewkach w warunkach (A) otoczenia i (B) niskiej zawartości CO2 . Pola reprezentują zakres między wewnętrznymi kwartylami, linie w ramkach reprezentują mediany, a wąsy reprezentują maksymalne i minimalne obserwacje. * Wskazuje istotną różnicę w oparciu o test t parami w stosunku do WT (n > 44, p < 0,05; Tabela uzupełniająca S2). Skróty: Fv/Fm = stosunek fluorescencji zmiennej do maksymalnej; WT = typ dziki; PLGG1-1 = Plastydowy translokator glikolu/glicerianu 1; abcb26 = Kaseta wiążąca ATP B26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca S1: Skompilowane dane fluorescencyjne ze wszystkich płytek siewek użytych w eksperymencie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Statystyki są raportowane z testu t między dzikimi typami i obydwoma zmutowanymi genotypami. Uważa się, że mutanty znacznie różnią się od typu dzikiego, gdy wartość p jest niższa niż 0,05. Tabela A przedstawia testy t przeprowadzone na roślinach uprawianych w otoczeniu CO2 , natomiast tabela B przedstawia testy t przeprowadzone na roślinach uprawianych przy niskiej emisji CO2 . Test t: dwie próby przy założeniu równych wariancji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów.