Artykuł metodologiczny

Analiza objętości terytorium astrocytów i kafelkowania w grubych, swobodnie pływających skrawkach tkanek

DOI:

10.3791/63804

⸱

20 kwietnia 2022

 , 
1Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina, Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metody cięcia, barwienia i obrazowania swobodnie unoszących się fragmentów tkanki mózgu myszy, a następnie szczegółowy opis analizy objętości terytorium astrocytów i nakładania się lub kafelkowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty posiadają zdumiewający stopień złożoności morfologicznej, który umożliwia im interakcję z prawie każdym typem komórek i struktur w mózgu. Dzięki tym interakcjom astrocyty aktywnie regulują wiele krytycznych funkcji mózgu, w tym tworzenie synaps, neurotransmisję i homeostazę jonów. W mózgu gryzoni astrocyty rosną pod względem wielkości i złożoności w ciągu pierwszych trzech tygodni po urodzeniu i tworzą wyraźne, nienakładające się na siebie terytoria, aby ułożyć mózg. Protokół ten zapewnia ustaloną metodę analizy objętości terytorium astrocytów i kafelkowania astrocytów przy użyciu swobodnie unoszących się skrawków tkanek z mózgu myszy. Po pierwsze, protokół ten opisuje etapy pobierania tkanek, kriosekcji i barwienia immunologicznego swobodnie pływających skrawków tkanek. Po drugie, protokół ten opisuje akwizycję i analizę obrazu objętości terytorium astrocytów i objętości nakładania się terytoriów, przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu. Wreszcie, w tym manuskrypcie omówiono zalety, ważne względy, typowe pułapki i ograniczenia tych metod. Protokół ten wymaga tkanki mózgowej z rzadkim lub mozaikowym znakowaniem fluorescencyjnym astrocytów i jest przeznaczony do użytku z powszechnym sprzętem laboratoryjnym, mikroskopią konfokalną i dostępnym na rynku oprogramowaniem do analizy obrazu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty to misternie rozgałęzione komórki, które pełnią wiele ważnych funkcji w mózgu1. W korze myszy promieniste komórki macierzyste gleju dają początek astrocytom w późnych stadiach embrionalnych i wczesnych stadiach postnatalnych2. W ciągu pierwszych trzech tygodni po urodzeniu astrocyty rosną pod względem wielkości i złożoności, rozwijając tysiące drobnych gałęzi, które bezpośrednio oddziałują z synapsami1. Jednocześnie astrocyty oddziałują z sąsiednimi astrocytami, aby ustanowić dyskretne, nienakładające się terytoria w celu kafelkowania mózgu3, utrzymując komunikację za pośrednictwem kanałów połączeń szczelinowych4. Morfologia i organizacja astrocytów jest zaburzona w wielu stanach chorobowych w wyniku zniewagi lub urazu5, co wskazuje na znaczenie tych procesów dla prawidłowego funkcjonowania mózgu. Analiza właściwości morfologicznych astrocytów podczas normalnego rozwoju, starzenia się i choroby może dostarczyć cennych informacji na temat biologii i fizjologii astrocytów. Co więcej, analiza morfologii astrocytów po manipulacji genetycznej jest cennym narzędziem do rozpoznawania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które rządzą ustalaniem i utrzymywaniem złożoności morfologicznej astrocytów.

Analiza morfologii astrocytów w mózgu myszy jest skomplikowana zarówno przez złożoność rozgałęzień astrocytów, jak i kafelkowanie astrocytów. Barwienie przeciwciał przy użyciu pośredniego włókna glejowego fibrylarnego białka kwaśnego (GFAP) jako markera specyficznego dla astrocytów wychwytuje tylko główne gałęzie i znacznie zaniża złożoność morfologiczną astrocytów1. Inne markery specyficzne dla komórek, takie jak transporter glutaminianu 1 (GLT-1; slc1a2), syntetaza glutaminy lub S100β lepiej radzą sobie z oznaczaniem gałęzi astrocytów6, ale wprowadzają nowy problem. Terytoria astrocytów w dużej mierze nie zachodzą na siebie, ale niewielki stopień nakładania się występuje na krawędziach obwodowych. Ze względu na złożoność rozgałęzień, gdy sąsiednie astrocyty są oznaczone tym samym kolorem, niemożliwe jest odróżnienie, gdzie kończy się jeden astrocyt, a zaczyna drugi. Rzadkie lub mozaikowe znakowanie astrocytów endogennymi białkami fluorescencyjnymi rozwiązuje oba problemy: marker fluorescencyjny wypełnia komórkę, aby uchwycić wszystkie gałęzie i pozwala na obrazowanie poszczególnych astrocytów, które można odróżnić od swoich sąsiadów. Zastosowano kilka różnych strategii w celu uzyskania rzadkiego znakowania fluorescencyjnego astrocytów, z manipulacją genetyczną lub bez, w tym wstrzyknięciem wirusa, elektroporacją plazmidu lub transgenicznymi liniami myszy. Szczegóły dotyczące realizacji tych strategii są opisane we wcześniej opublikowanych badaniach i protokołach1,7,8,9,10,11,12,13.

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru objętości terytorium astrocytów z mózgów myszy za pomocą fluorescencyjnego znakowania w niewielkiej populacji astrocytów (Rysunek 1). Ponieważ średnia średnica astrocytu w korze myszy wynosi około 60 μm, stosuje się odcinki o grubości 100 μm, aby poprawić skuteczność wychwytywania pojedynczych astrocytów w całości. Barwienie immunologiczne nie jest wymagane, ale jest zalecane w celu wzmocnienia endogennego sygnału fluorescencyjnego do obrazowania konfokalnego i analizy. Barwienie immunologiczne może również umożliwić lepsze wykrywanie drobnych gałęzi astrocytów i zmniejszyć fotobielenie endogennych białek podczas akwizycji obrazu. Aby poprawić przenikanie przeciwciał do grubych skrawków i zachować objętość tkanki przed przecięciem przez obrazowanie, stosuje się swobodnie unoszące się skrawki tkanki. Analiza objętości terytorium astrocytów wykonywana jest za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu. Dodatkowo protokół ten opisuje metodę analizy kafelkowania astrocytów w skrawkach tkanek z znakowaniem mozaikowym, gdzie sąsiednie astrocyty wyrażają różne znaczniki fluorescencyjne. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany w kilku ostatnich badaniach1,8,9 w celu scharakteryzowania wzrostu astrocytów podczas normalnego rozwoju mózgu, a także wpływu manipulacji genetycznych na rozwój astrocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy zostały użyte zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill oraz Division of Comparative Medicine (numer protokołu IACUC 21-116.0). Do tych eksperymentów wykorzystano myszy obu płci w 21. dniu po urodzeniu (P21). Myszy CD1 uzyskano komercyjnie (Tabela materiałów), a myszy MADM9 WT:WT i MADM9 WT:KO opisano wcześniej9.

UWAGA: Ten protokół wymaga mózgów z ekspresją białek fluorescencyjnych w rzadkiej populacji astrocytów. Ekspresja białek fluorescencyjnych może być wprowadzana genetycznie, wirusowo lub przez elektroporację. Szczegóły metod rzadkiego oznaczania astrocytów opisano we wcześniej opublikowanych badaniach i protokołach1,7,8,9,10,11,12,13.

1. Pobieranie i przygotowanie tkanek

UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest niebezpieczną substancją chemiczną. Wykonaj wszystkie kroki z PFA w dygestoriach chemicznych.

  1. Znieczulić myszy środkiem znieczulającym do wstrzykiwań (np. Avertin; 0,8 mg/kg) i zapewnić głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Użyj pompy perystaltycznej, aby wykonać perfuzję dosercową z lodowatą solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) + heparyną w tempie ~ 3 ml / min, aż wątroba będzie czysta (zwykle 3-5 min), a następnie lodowato zimne 4% PFA w TBS w tempie ~ 3 ml / min przez 5 min.
    UWAGA: Szybkość i czas przepływu są zoptymalizowane dla myszy po urodzeniu 21 dnia (P21). Dostosowanie szybkości przepływu i czasu perfuzji może być konieczne dla myszy w różnym wieku.
  2. Po perfuzji użyj nożyczek operacyjnych, aby odłączyć głowę i usunąć skórę, aby odsłonić czaszkę. Następnie użyj nożyczek do mikropreparowania, aby usunąć górną część czaszki, aby odsłonić mózg. Za pomocą kleszczy lub małej szpatułki wyjmij mózg i przenieś go do probówki zawierającej lodowate 4% PFA i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Pamiętaj, aby użyć probówki z płaskim dnem, takiej jak fiolka scyntylacyjna o pojemności 7 ml, aby mózg nie zaklinował się w dnie probówki, co mogłoby ścisnąć tkankę i zmienić objętość astrocytów.
  3. Następnego dnia wylej PFA z probówki. Dodaj 5 ml 1x TBS do probówki, aby przepłukać mózg i usunąć resztki PFA. Wylej TBS i powtórz ten proces jeszcze dwa razy, w sumie trzy płukania.
  4. Dodać 4-5 ml 30% sacharozy w TBS i inkubować mózg w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni lub do momentu, gdy mózg opadnie na dno probówki.
    UWAGA: Mózgi są gotowe do zamrożenia po zatopieniu, ale można je przechowywać w roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  5. Przygotować pożywkę do zamrażania w probówce o pojemności 50 ml, mieszając 15 ml związku o 100% optymalnej temperaturze cięcia (OCT) z 30 ml 30% sacharozy w TBS. Mieszać na nutatorze lub wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 1 godzinę, aby upewnić się, że roztwór jest w pełni wymieszany. Trzymaj rurkę w pozycji pionowej przez dodatkową godzinę, aby wszelkie pęcherzyki mogły wydostać się na powierzchnię.
    UWAGA: Podłoże do zamrażania można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
  6. Za pomocą pipety serologicznej dodaj pożywkę do zamrażania do kwadratowej formy do zatapiania (Tabela materiałów). Należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków do podłoża. W przypadku mózgu myszy P21 wystarczą 3 ml. Dostosuj głośność w zależności od potrzeb dla różnych grup wiekowych, aby mózg był całkowicie zanurzony.
  7. Dodaj mózg do podłoża i użyj pary kleszczy #5, aby usunąć wszelki pień mózgu, który może uniemożliwiać mózgowi siedzenie płasko w formie. Wyrównaj przód mózgu z jedną krawędzią formy.
  8. Przenieś formę na płaską powierzchnię schłodzoną suchym lodem. Dobrze sprawdza się w tym celu metalowa puszka na lunch wypełniona suchym lodem. Otocz formę granulkami suchego lodu, aby zapewnić powolne i równomierne zamrażanie.
  9. Gdy podłoże do zamrażania będzie całkowicie białe i stałe, przechowuj formę w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Mózg może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez kilka lat.

2. Cyrosekcja

UWAGA: Ta metoda podziału jest przeznaczona do pracy z wieloma różnymi dostępnymi na rynku kriostatami. W przypadku zastosowanego tutaj kriostatu (tabela materiałów) optymalna temperatura cięcia głowicy próbki wynosi -23 °C, a temperatura otoczenia w komorze wynosi od -23 °C do -25 °C.

UWAGA: Ostrze kriostatu jest niezwykle ostre. Zachowaj ostrożność podczas manipulowania ostrzem i obsługi kriostatu.

  1. Przygotować pożywkę sekcyjną, mieszając 25 ml 1x TBS i 25 ml glicerolu w probówce o pojemności 50 ml. Najłatwiej jest dodać glicerol, wlewając go bezpośrednio do probówki i używając markerów na probówce do pomiaru. Potrząśnij/wymieszaj probówkę, aby wymieszać. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
  2. Przygotuj się do pobrania skrawków tkanek, dodając 2 ml pożywki sekcyjnej na dołek do 12-dołkowej płytki. Oznacz górną i dolną część tabliczki przykładowymi informacjami. Umieść płytkę wraz z innymi materiałami (ostrze kriostatu, żyletka, uchwyty i pędzle) bezpośrednio w kriostacie i pozwól im zaaklimatyzować się do temperatury przez ~5 minut.
  3. Przenieś mózgi do komory kriostatu i pozwól im zaaklimatyzować się do temperatury wraz z zapasami.
  4. Usuń zamrożony blok tkanki z formy, przecinając dwa rogi formy żyletką i odrywając formę od tkanki. Ustaw blok tak, aby przód mózgu był skierowany do góry.
  5. Dodaj OCT do uchwytu tak, aby ~2/3 uchwytu było pokryte OCT i natychmiast umieść blok tkanki na uchwycie, zachowując orientację opisaną powyżej. Wciśnij blok w dół do OCT tak, aby leżał płasko na powierzchni uchwytu.
  6. Gdy OCT zostanie całkowicie zamrożony, a blok tkanki zostanie bezpiecznie umieszczony na swoim miejscu, clamp uchwyt do głowicy próbki. Włóż ostrze kriostatu i zbliż ostrze do próbki.
  7. Przycinaj mózg w odstępach 100 μm, aż do momentu tuż przed dotarciem do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Aby zmniejszyć ilość OCT, która rozpuszcza się w podłożu sekcyjnym, użyj żyletki, aby przyciąć nadmiar zamrażarki z boków bloku tkanki.
  8. Po osiągnięciu obszaru zainteresowania zacznij zbierać skrawki o grubości 100 μm. Zbieraj sekcje za pomocą płytki zabezpieczającej lub powoli przesuwając kriostat jedną ręką, używając pędzla w drugiej ręce, aby sprowadzić sekcję z bloku, gdy styka się z ostrzem. Jeśli model kriostatu jest wyposażony w pedał, użyj pedału, aby przesunąć kriostat tak, aby można było używać obu rąk do prowadzenia sekcji z bloku.
  9. Przenieś skrawki na płytkę 12-dołkową za pomocą pędzla lub kleszczy. Każda studnia może pomieścić co najmniej 10-12 sekcji. Podczas dodawania przekroju do podłoża zwykle wystarczy dotknąć dolną krawędzią przekroju do podłoża i pozwolić, aby przekrój wtopił się w podłoże bez zamoczenia pędzla lub kleszczy. Jeśli pędzel dotknie podłoża, należy go osuszyć ręcznikiem papierowym lub chusteczką, ponieważ zbyt mokra szczotka utrudni przenoszenie skrawków tkanki.
  10. Zabezpiecz płytkę, owijając ją folią lub folią parafinową. Upewnij się, że jest wyraźnie oznaczony, a następnie przechowuj go w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W przypadku większości protokołów barwienia skrawki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1-2 lata bez znacznej utraty sygnału.

3. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Wykonuj wszystkie mycia i inkubacje na wytrząsarce platformy orbitalnej ustawionej na około 100 obrotów na minutę. Wszystkie etapy przeprowadza się w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem inkubacji przeciwciał pierwotnych, która jest przeprowadzana w temperaturze 4 °C. Przygotować pożywkę montażową z wyprzedzeniem, łącząc składniki w probówce o pojemności 50 ml i mieszając na nutatorze przez noc. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy. Jeśli endogenny sygnał fluorescencyjny jest wystarczający do obrazowania i analizy bez konieczności barwienia immunologicznego, kroki 3.1-3.9 można pominąć. Jeśli pomijasz barwienie immunologiczne, wykonaj trzy 10-minutowe prania w TBS i przejdź do kroku 3.10.

  1. Przygotuj świeży roztwór TBST (0,2% Triton w TBS), dodając 1 ml 10% Triton-X do probówki o pojemności 50 ml i wypełniając probówkę do 50 ml 1x TBS. Przygotuj 2 ml roztworów blokujących i przeciwciał (10% koziej surowicy w TBST) dla każdego mózgu.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, przygotuj świeży TBST dla każdego nowego eksperymentu barwienia i użyj wysokiej jakości źródła 10% wodnego Triton-X (Tabela materiałów).
  2. Oznacz płytkę 24-dołkową zgodnie ze schematem (Rysunek 1). Umieść różne próbki w różnych rzędach, a różne roztwory w różnych kolumnach. Dodać 1 ml TBST do pierwszych trzech kolumn ("Wash 1", "Wash 2" i "Wash 3"). Dodać 1 ml roztworu blokującego do czwartej kolumny.
  3. Przygotuj szklany szpikut, topiąc koniec pipety Pasteura o średnicy 5,75 cala w małym haku za pomocą palnika Bunsena. Użyj tego kilofa, aby przenieść skrawki tkanki z płytki 12-dołkowej do kolumny Wash 1 płytki 24-dołkowej.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, przesiewaj sekcje przed rozpoczęciem barwienia. Aby przesiać skrawki, przenieś je pojedynczo na szalkę Petriego wypełnioną 1x TBS i zbadaj skrawki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 5x lub 10x, aby upewnić się, że obecna jest odpowiednia liczba komórek znakowanych fluorescencyjnie. Zaleca się barwienie od czterech do sześciu sekcji na studzienkę, chociaż w razie potrzeby można zabarwić do ośmiu na studzienkę.
  4. Myć sekcje przez 10 minut każda w przemyciu 1, 2 i 3 dołków, a następnie inkubować sekcje przez 1 godzinę w roztworze blokującym. Użyj szpikulca do szkła, aby przenieść sekcje z jednej studzienki do drugiej. Kilof może być używany do przenoszenia wielu sekcji mózgu jednocześnie.
  5. Przygotować 1 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych dla każdej próbki (np. Rabbit RFP 1:2000 lub Chicken GFP 1:2000). Dodać przeciwciało do roztworu przeciwciała, krótko zwirować, a następnie odwirować przez 5 minut w temperaturze ≥ 4 000 x g w temperaturze 4 °C. Inkubować skrawki w przeciwciałie pierwszorzędowym przez dwie do trzech nocy w temperaturze 4 °C, wstrząsając.
  6. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych odessać TBST dnia 1 ze studzienek płuczkowych, dodać 1 ml nowego TBST do każdego dołka do płukania i przenieść skrawki do pierwszego dołka płukania. Umyj sekcje 3x po 10 min każda.
    UWAGA: Do zasysania należy użyć 9-calowej pipety Pasteura połączonej rurką z kolbą próżniową. Jako źródło próżni można użyć domowych przewodów próżniowych lub elektrycznej pompy próżniowej.
  7. Podczas mycia skrawków należy przygotować drugorzędowe roztwory przeciwciał o stężeniu 1:200, dodając przeciwciała do roztworu przeciwciała (np. kozioł anty-królik 594 lub kozioł anty-kurczak 488). Krótko wirować, a następnie wirować przez 5 minut w temperaturze ≥ 4 000 x g w temperaturze 4 °C.
  8. Inkubować skrawki w przeciwciałie drugorzędowym przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Chroń skrawki przed światłem podczas tego etapu i wszystkich następnych kroków, aby złagodzić bielenie przeciwciał drugorzędowych.
  9. Po wtórnej inkubacji przeciwciał odessać TBST dnia 2 z dołków płuczkowych, dodać 1 ml nowego TBST do każdej studzienki płuczącej i przenieść sekcje do pierwszej studzienki do płukania. Umyj sekcje 3x w TBST przez 10 min każda.
  10. Podczas końcowego mycia wyjmij materiał montażowy z 4 °C i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej. Przygotuj mieszaninę 2:1 1x TBS:dH2O i dodaj ją do szalki Petriego. Przygotować szkiełko mikroskopowe, dodając do powierzchni 800 μl 2:1 TBS:dH2O.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie nieutwardzalnych nośników montażowych. Utwardzanie podłoża montażowego może zmienić objętość tkanki, co może zakłócić analizę objętości terytorium astrocytów. Przepis na prosty i niedrogi domowy nośnik montażowy znajduje się w tabeli materiałów.
  11. Za pomocą drobnego pędzla przenieś sekcje pojedynczo z dołka Wash 3 na szalkę Petriego. Ten krok usuwa tryton i pomaga spłaszczyć sekcje. Następnie przenieś skrawki z szalki Petriego do cieczy na szkiełku.
  12. Użyj pędzla, aby ułożyć sekcje tak, aby były płaskie na slajdzie. Ostrożnie usunąć nadmiar płynu z szkiełka za pomocą pipety P1000, a następnie zasysać próżniowo.
    UWAGA: Dodaj końcówkę pipety P200 do końca pipety Pasteura, aby uzyskać dokładniejszą kontrolę zasysania próżniowego.
  13. Po usunięciu całego nadmiaru płynu ze szkiełka należy użyć pipety transferowej, aby natychmiast dodać jedną kroplę podłoża montażowego do każdej sekcji i delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Pozwól nośnikowi montażowemu rozprowadzić się przez kilka minut, a następnie usuń nadmiar materiału montażowego, który wydostaje się spod szkiełka nakrywkowego przez zasysanie próżniowe.
    UWAGA: Nie pozwól, aby sekcje wyschły przed dodaniem nośnika montażowego. Jeśli skrawki zaczną wysychać przed dodaniem podłoża montażowego, może to wpłynąć na objętość tkanki i utrudnić dokładne zbieranie danych.
  14. Uszczelnij wszystkie cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je płasko w temperaturze 4 °C. Odczekaj co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem lub wykonaj zdjęcie następnego dnia.
    UWAGA: Skrawki wybarwione przeciwciałami przeciwko GFP i RFP mogą być przechowywane do 2 tygodni przed obrazowaniem, pod warunkiem, że są całkowicie uszczelnione lakierem do paznokci.

4. Obrazowanie konfokalne

UWAGA: Ten protokół podaje ogólne wytyczne dotyczące pozyskiwania obrazów, które mają szerokie zastosowanie do różnych mikroskopów konfokalnych, a nie szczegółowe informacje dla konkretnego interfejsu konfokalnego i programowego.

  1. Użyj celu 10x, aby zlokalizować poszczególne komórki do obrazowania, zwracając uwagę na określony region lub podregion mózgu (np. warstwę 5 kory wzrokowej), który jest istotny dla eksperymentu. Użyj pokrętła ostrości, aby spróbować określić, czy cały astrocyt jest zawarty w sekcji.
  2. Przełącz się na obiektyw olejowy o większym powiększeniu (np. 40x, 60x lub 63x) i ustaw ostrość na komórce. Patrząc przez okular, użyj pokrętła ostrości, aby przesunąć się od góry do dołu komórki.
    1. Sprawdź wzrokowo komórkę, aby upewnić się, że cała komórka znajduje się w sekcji. Jeśli komórka nagle traci ostrość i jest odcięta na krawędzi sekcji, wyklucz tę komórkę i znajdź inną.
  3. Korzystając z oprogramowania do akwizycji mikroskopu konfokalnego, dostosuj parametry akwizycji, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu i poziom szczegółowości (rozdzielczość 512 x 512 zapewni wystarczającą ilość szczegółów do analizy terytorium i skróci czas akwizycji obrazu). Użyj 2-krotnego zoomu, jeśli używasz obiektywu 40x, i bez zoomu, jeśli używasz obiektywu 60x lub 63x.
  4. Ustaw górną i dolną granicę stosu z. Aby upewnić się, że cały astrocyt jest przechwytywany, pierwszy i ostatni obraz stosu z nie powinny zawierać żadnego fluorescencyjnego znakowania komórki. Aby uzyskać odpowiednie pobieranie próbek, należy użyć kroku o wielkości 0,5 μm.

5. Analiza obrazu

UWAGA: Ten protokół opisuje kroki do przeprowadzenia analizy obrazu za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do analizy obrazu (np. Imaris; zobacz Tabelę Materiałów). Inne wersje tego oprogramowania mogą być używane z niewielkimi modyfikacjami przepływu pracy. Ten protokół wymaga również programu MATLAB do uruchomienia pliku Convex Hull XTension (pliku uzupełniającego).

  1. Przed rozpoczęciem analizy zainstaluj plik Convex Hull XTension XTSpotsConvexHull.m, wklejając plik w podfolderze rtmatlab folderu XT.
  2. Użyj konwertera plików Imaris, aby przekonwertować obrazy do formatu ".ims". Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu i wyświetl obraz w trybie wyświetlania 3D, wybierając przycisk Widok 3D.
  3. Przed analizą należy sprawdzić komórkę, aby upewnić się, że spełnia kryteria włączenia.
    1. Upewnij się, że cała komórka jest obecna na obrazie (tj. żadna część komórki nie powinna zostać wycięta z obrazu). Obróć obraz, aby sprawdzić przednią i tylną krawędź.
    2. Upewnij się, że komórka ma tylko jeden korpus komórki. Kliknij przycisk Pokrój, przeciągnij kursor po lewej stronie ekranu, aby poruszać się po stosie z i sprawdź, czy oznaczona komórka zawiera tylko jedną treść komórki.
    3. Upewnij się, że istnieje pojedynczy astrocyt, który można odróżnić od sąsiednich astrocytów oznaczonych tym samym kolorem.
  4. Tworzenie powierzchni
    1. Po ponownym wybraniu przycisku Widok 3D utwórz nową powierzchnię, klikając niebieską ikonę Dodaj nowe powierzchnie.
      1. Na karcie Utwórz, która pojawi się w lewym dolnym rogu okna oprogramowania, upewnij się, że tylko pola Segmentuj tylko region zainteresowania i Statystyka obiektu-obiektu są zaznaczone dla ustawień algorytmu, a pole Rozpocznij tworzenie z widokiem fragmentatora dla opcji Preferencje tworzenia nie jest zaznaczone. Kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować.
        UWAGA: Obszar zainteresowania może nie być potrzebny, jeśli na obrazie nie ma dodatkowego sygnału fluorescencyjnego poza komórką będącą przedmiotem zainteresowania. W takim przypadku pozostaw pole wyboru Segmentuj tylko obszar zainteresowania i przejdź do kroku 5.4.3.
    2. Utwórz obszar zainteresowania wokół komórki, wprowadzając wymiary w polach w obszarze Rozmiar narzędzia Tworzenie powierzchni lub przeciągając krawędzie żółtego pola (Rysunek 2A). Kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować.
    3. Wybierz właściwy kanał źródłowy z listy rozwijanej do analizy (np. Kanał 1 lub kanał zawierający wypełnienie komórkami fluorescencyjnymi). Wartość w polu Szczegóły powierzchni jest określana przez oprogramowanie i oparta na parametrach akwizycji obrazu. Upewnij się, że ta wartość pozostaje stała dla wszystkich próbek w eksperymencie. Kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować.
    4. Dostosuj próg (intensywność bezwzględną), przeciągając żółty pasek lub wprowadzając wartości w polu, tak aby szara powierzchnia wypełniała jak największą część sygnału komórki, nie wychodząc poza granicę komórki. Niewielka ilość sygnału fluorescencyjnego będzie widoczna na krawędziach powierzchni (Rysunek 2B). Kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować.
    5. Ostatni panel narzędzia Tworzenie powierzchni ustawia minimalną wartość jakości, która jest domyślną wartością Dolny próg oprogramowania. Upewnij się, że na liście rozwijanej wybrano opcję Liczba wokseli Img=1. Sprawdź, czy tylko lewy przycisk zasilania dolnego progu jest zielony (aktywny); Prawy przycisk zasilania powinien być czerwony (nieaktywny). Oprogramowanie domyślnie ustawia dolną wartość progową na 10. Pozostaw to bez zmian i kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć generowanie powierzchni.
    6. Dokładnie sprawdź nowo wygenerowaną powierzchnię. Usuń wszystkie elementy powierzchni, które nie są częścią komórki, zaznaczając je, klikając narzędzie Edycja ołówka i klikając opcję Usuń.
    7. Ujednolic pozostałe elementy powierzchni, klikając ikonę filtra lejka, aby zaznaczyć wszystko, klikając ikonę ołówka Edytuj i klikając opcję Ujednolicaj (Rysunek 2C).
      UWAGA: W przypadku dużego pliku obrazu oprogramowanie może czasami ulegać awariom podczas kolejnych kroków tego protokołu. W tym momencie warto zapisać plik.
  5. Generowanie punktów blisko powierzchni
    1. Kliknij pomarańczową ikonę Dodaj nowe miejsca. Po wybraniu nowych punktów (np. "Miejsca 1") na karcie Utwórz upewnij się, że tylko pole Statystyka obiektu-obiektu jest zaznaczone dla ustawień algorytmu, a pole Rozpocznij tworzenie z widokiem fragmentatora dla opcji Preferencje tworzenia nie jest zaznaczone. Kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować.
    2. Wybierz właściwy kanał źródłowy z listy rozwijanej (np. Kanał 1), a następnie wprowadź w polu wartość szacowanej średnicy XY wynoszącą 0,400 μm. Upewnij się, że zaznaczone jest tylko pole Odejmowanie tła. Kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować.
      UWAGA: 0,400 μm jest odpowiednie dla obrazów 1024 x 1024 lub 512 x 512 przy użyciu obiektywu 63x, 60x lub 40x. W przypadku innych warunków obrazowania średnica musi być określona na podstawie warunków obrazowania i pozostać stała przez cały czas trwania analizy. Odpowiednia wartość utworzy wystarczającą liczbę punktów, aby pokryć cały pozytywny sygnał, ale nie doda plam na sygnale tła.
    3. Ostatni panel narzędzia Tworzenie plam ustawia minimalną wartość jakości, która jest domyślną dolną wartością progową oprogramowania; upewnij się, że ta wartość pozostaje niezmieniona, chyba że istnieje zauważalna różnica w rozmieszczeniu/rozmieszczeniu plam (np. z powodu gorszej jakości barwienia). Kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć tworzenie spotów.
    4. Aby lepiej wyświetlić plamy, zmień przezroczystość powierzchni, wybierając opcję Powierzchnia i klikając narzędzie Kolor wielokolorowy. W obszarze Materiał wybierz materiał, który sprawia, że powierzchnia jest wystarczająco przezroczysta, aby można było wyświetlić punkty w całej komórce (od czwartego materiału na liście) (Rysunek 2D,E).
    5. Ponownie wybierz Punkty, kliknij ikonę Filtruj i wybierz z listy rozwijanej Najkrótsza odległość do powierzchni Powierzchnie=Powierzchnie X, gdzie 'Powierzchnie X' to analizowana powierzchnia (np. Powierzchnie 1). Upewnij się, że przyciski zasilania dolnego i górnego progu są zielone (aktywne).
      1. Wprowadź minimalną odległość -1,0 μm (odległość plamek od wnętrza powierzchni) w polu Dolny próg i maksymalną odległość 0,1 μm (odległość od zewnątrz) w polu Górny próg. Kliknij przycisk Powiel zaznaczenie do nowych miejsc, aby zakończyć generowanie punktów blisko powierzchni.
        UWAGA: Minimalne i maksymalne wartości odległości mogą się różnić w zależności od różnych parametrów akwizycji obrazu, takich jak obiektyw, powiększenie i rozdzielczość. Liczby te muszą być określone empirycznie. Przezroczysta powierzchnia pomaga ocenić, czy wartości obejmują wszystkie miejsca, które dokładnie reprezentują kształt powierzchni.
  6. Wygeneruj wypukły kadłub i zbierz pomiar terytorium
    1. Upewnij się, że nowo utworzone Spoty są wybrane w lewym górnym panelu okna oprogramowania (np. "Wybór Spotów 1 ['Najkrótsza odległość...]"). Kliknij ikonę narzędzi zębatych, a następnie wtyczkę Convex Hull. Kliknij wtyczkę tylko raz i poczekaj, aż pojawi się okno MATLAB, a następnie zniknie (może to potrwać kilka sekund). W widoku 3D pojawi się solidny kadłub
      2. .
    2. W lewym górnym panelu wybierz Wypukły kadłub Punktów X Wybór ['Najkrótsza odległość...], gdzie 'Wybór miejsc X' to nowo utworzone punkty (np. Wybór miejsc 1), a następnie kliknij na kadłub, aby go zaznaczyć (Rysunek 2F).
    3. Kliknij ikonę Statystyka wykresu, wybierz kartę Wybór, upewnij się, że z górnej listy rozwijanej wybrano opcję Określone wartości, a następnie wybierz opcję Wolumin z dolnej listy rozwijanej. Zapisz objętość kadłuba. Zapisz plik i przejdź do następnego obrazu.
  7. Pomiar objętości nakładania się terytoriów dla sąsiednich komórek o różnych znacznikach fluorescencyjnych
    UWAGA: Ta sekcja protokołu może być używana, jeśli próbki zawierają sąsiednie astrocyty, które wyrażają wyraźne znaczniki fluorescencyjne (np. Astrocyt 1 wyraża tylko GFP, a Astrocyt 2 wyraża tylko RFP). To znakowanie zostało osiągnięte przy użyciu strategii wirusowych lub genetycznych, jak opisano wcześniej9,10 (Rysunek 3A).
    1. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w krokach 5.4-5.6, utwórz powierzchnię, plamki blisko powierzchni i wypukłą powłokę dla każdego astrocytu (Rysunek 3B).
    2. Po wybraniu opcji Wypukły kadłub plam 1 Zaznaczenie... kliknij ikonę ołówka Edytuj i kliknij Zaznaczenie maski. W oknie Mask Channel upewnij się, że zaznaczony jest Kanał 1 (lub kanał reprezentujący astrocyt 1) i upewnij się, że pole obok opcji duplikowania kanału przed zastosowaniem maski jest zaznaczone. Kliknij OK, aby utworzyć kanał Masked CH1.
    3. Z wypukłym kadłubem Spots 2 Wybór... wybrane, kliknij ikonę ołówka Edytuj i kliknij Wybór maski. W oknie Kanał maski wybierz Kanał 2 (lub kanał reprezentujący astrocyt 2) z menu rozwijanego i upewnij się, że pole obok opcji zduplikowanego kanału przed zastosowaniem maski jest zaznaczone. Kliknij OK, aby utworzyć kanał Masked CH2 (Rysunek 3C).
    4. Kliknij na przycisk Coloc u góry ekranu i użyj narzędzia Coloc, aby utworzyć kanał kolokacji dwóch zamaskowanych kanałów. Ustaw kanał A na kanał 3 - zamaskowany CH1 i kanał B na kanał 4 - zamaskowany CH2 (Rysunek 3D).
    5. Przeciągnij żółty pasek histogramu w lewo dla obu kanałów. Użyj widoku plasterków poniżej, aby obserwować sygnał kolokalizacji, który będzie widoczny w kolorze szarym. Zauważ, że ponieważ sygnały fluorescencyjne dwóch komórek nie są w rzeczywistości kolokalizowane, próg będzie musiał zostać przesunięty w lewo, aby fałszywe kolokalizacje zaczęły pojawiać się w punktach styku komórka-komórka.
    6. Kliknij Zbuduj kanał Coloc po prawej stronie, aby zakończyć proces. Kliknij widok 3D, aby powrócić do standardowego widoku 3D. Kanał wyników kolokalizacji będzie teraz widoczny w kolorze szarym i pojawi się w polu regulacji wyświetlania.
    7. Utwórz powierzchnię, punkty znajdujące się blisko powierzchni oraz wypukłą powłokę kanału wyników kolokalizacji, wykonując czynności opisane w 5.4-5.7 (Rysunek 3E,F).
    8. Zapisz objętość wypukłej łuski. Jest to objętość nakładania się terytoriów. Podziel tę liczbę przez objętość terytorium jednego z astrocytów, aby obliczyć procent nakładania się terytoriów. Wybierz astrocyt kontrolny lub dziki, jeśli jeden z astrocytów jest genetycznie zmanipulowany w stosunku do drugiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia schematyczny zarys głównych kroków i przepływu pracy dla tego protokołu. Rysunek 2 pokazuje zrzuty ekranu przedstawiające kluczowe kroki przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu w celu wygenerowania powierzchni, wygenerowania punktów blisko powierzchni i wygenerowania wypukłej powłoki. Rysunek 3 pokazuje zastosowanie tej techniki do określania nakładania się terytoriów astrocytów/kafelkowania. W

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje ustaloną metodę analizy objętości terytorium astrocytów i kafelkowania astrocytów w korze myszy, szczegółowo opisując wszystkie główne etapy, począwszy od perfuzji, a skończywszy na analizie obrazu. Protokół ten wymaga mózgów myszy, które wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych w rzadkiej lub mozaikowej populacji astrocytów. Poza tym wymogiem, myszy w każdym wieku mogą być używane do tego protokołu, z niewielkimi zmianami ustawień perfuzji i objętości pożywki do zamrażania dodawanej do formy do z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia została przeprowadzona w UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060), częściowo wspierana przez fundusze z NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 oraz NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Grant U54 HD079124. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com. Obrazy i dane na rysunku 4 zostały przedrukowane z poprzedniej publikacji9 za zgodą wydawcy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#5 kleszczykówRobozRS-5045
1 mL TB StrzykawkaBecton Dickinson (BD)309623
10x TBS (sól fizjologiczna buforowana tris)30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl do pH 7,4, dH2O do 1 L; przechowywać w temperaturze pokojowej (RT)
Płytka 12-dołkowaGenesee Scientific25-106MP
1x TBS100 ml 10x TBS + 900 mL dH2O; przechowywać w RT
1x TBS + Heparyna28,2 mg Heparyna + 250 ml 1x TBS; przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Płytka 24-dołkowaGenesee Scientific25-107MP
30% sacharozy w TBS15 g sacharozy, 1x TBS do 50 ml; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
4% PFA (paraformaldehyd) w TBS40 g PFA, 4-6 granulek NaOH, 100 ml 10x TBS, dH2O do 1 L; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Avertin0,3125 g tribromoetanolu, 0,625 ml metylobutanolu, dH2O do 25 ml; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C; wyrzucić 2 tygodnie po wykonaniu
Bufor blokujący i przeciwciała10% surowicy koziej w TBST; przechowywać w temperaturze 4 & st.; C
Myszy CD1Charles River022
Fiolka do pobierania mózgówFisher Scientific03-337-20
Oprogramowanie do akwizycji konfokalnejOlympusFV31S-SW
Mikroskop konfokalnyOlympusFV3000RS
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12544E
CryostatThermo ScientificCryoStar NX50
Ostrze kriostatuThermo Scientific 3052835
DAPIInvitrogenD1306
Forma do zatapianiaPolysciences18646A-1
Zamrażarka2:1 30% sacharozy: OCT; przechowywać w RT
GFP przeciwciałoAves LabsGFP1010
GlicerolThermo Scientific158920010
Kozia anty-kurczak 488InvitrogenA-11039
Kozia anty-królik 594InvitrogenA11037
Kozia surowicaGibco16210064
HeparynaSigma-AldrichH3149
Kwas solnySigma-Aldrich258148
ImarisBitplaneN/AWersja 9.8.0
MATLABMathWorksN/A
Metalowa puszka na lunchAQUARIUSN/Aod Amazon, "DIY Large Fun Box"
MetylobutanolSigma-Aldrich152463
Mikro nożyczki preparacyjneRobozRS-5921
Mediummontażowe20 mM Tris pH 8,0, 90% glicerol, 0,5% galusan N-propylu; Przechowywać w temperaturze 4 & Deg; C; dobry do 2 miesięcy
Lakier do paznokciVWR100491-940
galusan N-propyluSigma-Aldrich02370-100G
O.C.T.Fisher Scientific23-730-571
OlejOlympusIMMOIL-F30CCSpecyficzny dla mikroskopu / obiektywu
Nożyczki operacyjne 6"RobozRS-6820
Wytrząsarka platformy orbitalnejFisher Scientific88861043Minimalna wymagana prędkość: 25 obr./min
PędzelBogrinuoN/Aod Amazon, "Pędzle do malowania detali - Miniaturowe szczotki"
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Pipet Pasteura (5.75")VWR14672-608
Pipet Pasteura (9")VWR14672-380
Chlorek potasuSigma-AldrichP9541-500G
ŻyletkaFisher Scientific12-640
RFP przeciwciałoRockland600-401-379
Pożywka1:1 glicerol: 1x TBS; przechowywać w RT
SlidesVWR48311-703
Chrloide soduFisher ScientificBP358-212
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881
SacharozaSigma-AldrichS0389
TBST (TBS + Triton X-100)0,2% Triton w 1x TBS; przechowywać w RT
Transfer PipetVWR414004-002
Tri-bromoetanolSigma-AldrichT48402
Tris(hydroksymetylo)aminometanThermo Scientific424570025
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Triton X-100 ( wysokiej jakości)Fisher Scientific50-489-120
XTSpotsConvexHullN/AN/Acustom XTension dostarczane jako materiał uzupełniający
sekcyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  2. Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
  3. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  4. Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
  5. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
  6. Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  7. Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).
  8. Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
  9. Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
  10. Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).
  11. Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).
  12. Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
  13. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).
  14. O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kafelkowanie astrocyt wnak adanie si terytori wprzekroje swobodnie p ywaj cemikroskopia konfokalnaprotok immunobarwieniaoprogramowanie do analizy obrazumorfologia astrocyt wmanipulacje genetyczneanaliza wypuk ej otoczki

Powiązane artykuły