Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63805

⸱

29 kwietnia 2022

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 2Norris Cotton Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Streszczenie

Większość procesów komórkowych jest regulowana przez dynamiczną fosforylację białek. Ponad trzy czwarte białek jest fosforylowanych, a fosfatazy fosfoproteinowe (PPP) koordynują ponad 90% całej komórkowej defosforylacji seryny/treoniny. Deregulacja fosforylacji białek jest związana z patofizjologią różnych chorób, w tym raka i neurodegeneracji. Pomimo ich powszechnej aktywności, mechanizmy molekularne kontrolujące środki ochrony roślin i mechanizmy kontrolowane przez środki ochrony roślin są słabo scharakteryzowane. W tym miejscu opisano podejście proteomiczne zwane kulkami inhibitora fosfatazy i spektrometrią mas (PIB-MS) w celu identyfikacji i ilościowego określenia PPP, ich modyfikacji potranslacyjnych i ich interaktorów w ciągu zaledwie 12 godzin przy użyciu dowolnej linii komórkowej lub tkanki. PIB-MS wykorzystuje nieselektywny inhibitor PPP, mikrocystynę-LR (MCLR), unieruchomiony na kulkach sefarozy w celu wychwytywania i wzbogacania endogennych PPP i powiązanych z nimi białek (określanych jako PPPome). Metoda ta nie wymaga egzogennej ekspresji znakowanych wersji PPP ani stosowania specyficznych przeciwciał. PIB-MS oferuje innowacyjny sposób badania ewolucyjnie konserwatywnych PPP i poszerzania naszej obecnej wiedzy na temat sygnalizacji defosforylacji.

Wprowadzenie

Fosforylacja białek kontroluje większość procesów komórkowych, w tym między innymi odpowiedź na uszkodzenia DNA, sygnalizację czynników wzrostu oraz przejście przez mitozę1,2,3. W komórkach ssaków większość białek jest w pewnym momencie fosforylowana na jednym lub kilku resztach seryny, treoniny lub tyrozyny, przy czym fosfoseryny i fosfotreoniny stanowią około 98% wszystkich miejsc fosforylacji2,3. Podczas gdy kinazy były szeroko badane w kontekście sygnalizacji komórkowej, rola białek fosfataz białkowych (PPP) w regulacji dynamicznych procesów komórkowych jest wciąż odkrywana.

Dynamika fosforylacji jest kontrolowana przez dynamiczne oddziaływanie między kinazami a fosfatazami. W komórkach ssaków występuje ponad 400 kinaz białkowych katalizujących fosforylację seryny/treoniny. Ponad 90% tych miejsc jest defosforylowanych przez fosfatazy białkofosforanowe (PPPs), niewielką rodzinę enzymów składającą się z PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT i PPZ2,3. PP1 i PP2A odpowiadają za większość defosforylacji fosfoseryny i fosfotreoniny w komórce2,3,4. Znaczna różnica w liczbie kinaz i fosfataz oraz brak specyficzności podjednostek katalitycznych PPP in vitro prowadziły do przekonania, że kinazy są głównym determinantem fosforylacji2,3. Jednak liczne badania wykazały, że fosfatazy ustalają specyficzność substratową poprzez tworzenie multimerycznych holoenzymów5,6,7,8,9. Na przykład PP1 jest heterodimerem składającym się z podjednostki katalitycznej oraz, w danej chwili, jednej z ponad 150 podjednostek regulacyjnych6,7,8. Z kolei PP2A jest heterotrimerem utworzonym z podjednostki rusztowaniowej (A), regulacyjnej (B) i katalitycznej (C)2,3,9. Istnieją cztery odrębne rodziny podjednostek regulacyjnych PP2A (B55, B56, PR72 i striatyna), z których każda posiada wiele genów, wariantów splicingowych i wzorców lokalizacji2,3,9. Multimeryczna natura PPP niweluje różnicę w liczbie kinaz i podjednostek katalitycznych PPP. Tworzy ona jednak wyzwania analityczne w badaniu sygnalizacji PPP. Aby kompleksowo analizować sygnalizację PPP, kluczowe jest zbadanie różnych holoenzymów w komórce lub tkance. Znaczny postęp w badaniu ludzkiego kinomu osiągnięto dzięki zastosowaniu kulek z inhibitorami kinaz, zwanych kuleczkami inhibitorów multipleksowych lub kinobeads; jest to strategia proteomiki chemicznej, w której inhibitory kinaz są unieruchomione na kuleczkach, a spektrometria mas jest wykorzystywana do identyfikacji wzbogaconych kinaz oraz ich interaktorów10,11,12,13.

Opracowaliśmy podobne podejście do badania biologii PPP. Technika ta polega na wychwytywaniu powinowactwa katalitycznych podjednostek PPP przy użyciu kulek z unieruchomionym, nieselektywnym inhibitorem PPP zwanym mikrocystyną-LR (MCLR), określanych jako kulki z inhibitorem fosfataz (PIB)14,15. W przeciwieństwie do innych metod wymagających znakowania endogennego lub ekspresji egzogennych podjednostek PPP, co mogłoby zmienić aktywność lub lokalizację białek, metoda PIB-MS pozwala na wzbogacanie endogennych katalitycznych podjednostek PPP, ich powiązanych podjednostek regulacyjnych i rusztowaniowych oraz białek oddziałujących (tzw. PPPome) z komórek i tkanek w danym punkcie czasowym lub w określonych warunkach traktowania. MCLR hamuje PP1, PP2A, PP4-6, PPT oraz PPZ w stężeniach nanomolarnych, co sprawia, że PIBs są wysoce skuteczne w wzbogacaniu PPPome16. Metodę tę można skalować do zastosowania w dowolnym materiale wyjściowym, od komórek po próbki kliniczne. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy zastosowanie PIBs i spektrometrii mas (PIB-MS) w celu efektywnego wychwytywania, identyfikacji i kwantyfikacji endogennego PPPome oraz jego stanów modyfikacji.

Schemat przepływu pracy proteomicznej: przygotowanie próbek, spektrometria mas, znakowanie TMT, analiza danych.
Rysunek 1: Podsumowanie wizualne protokołu PIB-MS. W eksperymencie PIB-MS próbki mogą być pozyskiwane w różnych formach, od pojedynczych komórek po guzy. Próbka jest pobierana, lizowana i homogenizowana przed wzbogaceniem PPP. W celu wzbogacenia PPP, lizat inkubuje się z PIB w obecności luby braku inhibitora PPP, takiego jak MCLR. Następnie PIBy są płukane, a PPP są eluowane w warunkach denaturujących. Próbki są przygotowywane do analizy spektrometrycznej poprzez usunięcie detergentów za pomocą wzbogacania białek SP3, trawienia trypsyną i odsalania. Próbki mogą być następnie opcjonalnie znakowane metodą TMT przed analizą spektrometrią mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Metoda PIB-MS obejmuje lizę i klarowanie komórek lub tkanek, inkubację lizatu z PIB, elucję oraz analizę eluatu za pomocą western blotingu lub metod opartych na spektrometrii mas (Rycina 1). Dodanie wolnego MCLR może służyć jako kontrola w celu odróżnienia specyficznych binderów PIB od interaktorów niespecyficznych. W większości zastosowań można wykorzystać podejście bez znakowania w celu bezpośredniej identyfikacji białek w eluatach. W przypadkach, gdy wymagana jest większa precyzja ilościowa lub identyfikacja gatunków o niskiej zawartości, można zastosować dalszą obróbkę z wykorzystaniem znakowania tandemowymi znacznikami masowymi (TMT), aby zwiększyć zakres pokrycia i zmniejszyć ilość materiału wejściowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Generowanie PIBów odbywa się zgodnie z opisem Moorheada i wsp., gdzie 1 mg mikrocystyny i około 6 ml sefarozy są sprzężone w celu wytworzenia PIB o zdolności wiązania do 5 mg/mL17.

1. Przygotowanie próbki

UWAGA: Typowa ilość początkowa dla PIB-MS to 1 mg białka ogółem na warunek. W tym eksperymencie użyto około 2,5 x 106 komórek HeLa do ekstrakcji 1 mg białka. Obliczenia te należy wykonać dla każdej linii komórkowej lub tkanki używanej w eksperymencie18. Jeżeli próbka jest ograniczona i nie można uzyskać 1 mg, ilość danych wejściowych może zostać zmniejszona przy niewielkiej utracie wykrywalności podjednostki PPP. Alternatywnie można zastosować etykietowanie TMT, aby umożliwić zmieszanie wszystkich warunków w jednej próbce, zwiększając czułość wykrywania, jak pokazano w kroku 9.

  1. Pobrać próbki tkanek lub granulki komórek. W przypadku granulek komórkowych zebrać komórki przez odwirowanie przy 277 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT), usunąć pożywkę i przemyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
  2. Przygotować bufor do lizy (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100 (obj./obj.), 5 mM pięciowodna sól disodowa kwasu beta-glicerofosforowego, koktajl inhibitorów proteazy III w stosunku 1:500 (obj.) i przechowywać na lodzie. Przygotować tyle, aby zlizować i umyć wszystkie próbki. Jeśli zaczynasz od 1 mg białka na warunek, przygotuj około 3 ml buforu na próbkę do lizy i płukania.
    UWAGA: Bufor do lizy wymieniony na tym etapie jest łagodnym roztworem detergentu, który może nie wystarczyć do rozpuszczenia nierozpuszczalnych białek błonowych lub związanych z cytoszkieletem. Można zbadać inne detergenty, aby poprawić rozpuszczalność. Przetestowano zakres stężeń NaCl i Triton-X-100 i stwierdzono, że powyższe stężenia są optymalne dla niskiego tła i wysokiego wiązania podjednostek fosfatazy.
  3. Dodać schłodzony bufor do lizy do próbek. Do lizy 1 mg białka użyj 1 ml buforu. Jeśli próbka jest zamrożona, dodać bufor do lizy i pozostawić próbkę do rozmrożenia na lodzie w buforze.
    1. W przypadku komórek homogenizuj próbki za pomocą sonifikacji, utrzymując komórki na lodzie między impulsami. Sonizuj próbki o amplitudzie 15% za pomocą trzech impulsów 15 s. Może się to różnić w zależności od użytego sonikatora (patrz Tabela Materiałów).
    2. W przypadku tkanek należy najpierw homogenizować próbki za pomocą młynka do tkanek Dounce, aby zmielić tkankę do momentu upłynnienia, a następnie wykonać sonikację, jak opisano w kroku 1.3.1.
  4. Sklarować homogenizowaną próbkę nierozpuszczalnych zanieczyszczeń przez odwirowanie w temperaturze 21,130 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie, nie naruszając utworzonych granulek lub lipidów, które zebrały się z boku probówek, przenieś lizaty do nowych probówek. W razie potrzeby usunąć 100 μl próbki ze wstępnego wzbogacania oczyszczonego lizatu i przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy pamiętać, aby lizaty były przechowywane na lodzie.
  5. Oznaczyć całkowitą zawartość białka w każdej próbce, wykonując test kwantyfikacyjny białka, taki jak test kwasu bicinchoninowego (BCA), na małej porcji każdej próbki, zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że lizaty są trzymane na lodzie podczas testu BCA.
  6. Po wykonaniu testu BCA przenieś równoważną ilość białka do nowych probówek i rozcieńcz buforem do lizy, aby upewnić się, że każda probówka ma takie samo stężenie białka (np. 1 mg/ml). Jeśli doświadczenie wymaga kontroli inhibitora PPP, należy przygotować dwie porcje każdej próbki o tej samej zawartości białka i przejść do kroku 1.7. Jeśli kontrola inhibitora PPP nie jest potrzebna, przejdź do kroku 2. Upewnij się, że próbki są przechowywane na lodzie.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby w analizie PIB-MS stosować równe stężenia białek dla każdego stanu. Kontrole inhibitorów PPP stosuje się w celu odróżnienia specyficznych spoiw do PIB od tła niespecyficznego.
  7. W celu kontroli inhibitora PPP należy traktować jedną próbkę wolnym MCLR (1 μM), a drugą równą objętość DMSO jako kontrolę. Próbki należy delikatnie zawirować i inkubować je na lodzie przez 15 min.
    UWAGA: Traktowanie lizatów MCLR blokuje wiązanie podjednostek katalitycznych PPP, ale nie białek, które wiążą się niespecyficznie z PIB w próbkach. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z MCLR, ponieważ jest toksyczny. Zapoznaj się ze środkami ostrożności dotyczącymi obchodzenia się z materiałami w Tabeli materiałów.

2. Przygotowanie PIB-ów

  1. Określ liczbę PIB potrzebnych do eksperymentu. Na 1 mg białka można uzyskać 1-3 μg środków ochrony roślin i białek oddziałujących; użyć co najmniej 10 μl stałej żywicy PIBs na próbkę, aby zminimalizować utratę kulek. Zdolność wiązania PIB wynosi 3-5 mg/ml14,17.
  2. Przenieś odpowiednią ilość PIB do probówki o pojemności 1,5 ml i przemyj je 3x 0,5 ml buforu do lizy, delikatnie wirując, a następnie odwirowując przy 376 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej między płukaniami. Unikaj pipetowania kulek podczas usuwania buforu do lizy między praniami.
  3. Przygotować 50% roztwór PIB/bufor (vol/vol), dodając odpowiednią ilość buforu do lizy do przemytych PIB. Delikatnie pipetować w górę i w dół, a następnie zakręcić końcówką pipety w zawiesinie, aby ponownie zawiesić PIB.
  4. Przenieść 20 μl zawiesiny do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej już 0,5 ml buforu do lizy. Bufor do lizy w probówce pomaga w usuwaniu kulek z końcówki pipety. Rób to, aż będzie wystarczająca ilość probówek zawierających równą ilość PIB dla każdej próbki.
  5. Obracaj probówki z prędkością 376 x g przez 30 s przy RT. Upewnij się, że wszystkie probówki zawierają równą ilość żywicy perełkowej. Odrzucić sklarowany osad, pozostawiając tylko żywicę w postaci stałej i maksymalnie 50 μl buforu do lizy w każdej probówce.

3. Inkubacja PIB z lizatami

  1. Przenieść lizaty z Kroku 1.6 lub Kroku 1.7 do odpowiednio oznakowanej probówki zawierającej PIB z Kroku 2. Obracać lizat z prędkością 8 obr./min za pomocą PIB przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.

4. Mycie PIBów

  1. Odwirować PIB przy 376 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C w celu zebrania kulek. Usunąć i wyrzucić supernatant, zachowując w razie potrzeby podwielokrotność 100 μl do analizy po wzbogaceniu.
  2. Przemyć PIB 3x, dodając 0,5 ml buforu do lizy do kulek, odwracając probówki (nie zaleca się wirowania), zbierając kulki przez odwirowanie przy 376 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i usuwając bufor do lizy z osadzonych kulek, uważając, aby nie zakłócić osadu kulek.

5. Usuwanie PPP z PIB

  1. Po ostatnim płukaniu należy usunąć jak najwięcej buforu do lizy bez pipetowania któregokolwiek z PIB. Sporządzić bufor elucyjny zawierający 2% SDS (vol/vol) i wymyć PPP z PIB, dodając wystarczającą objętość buforu elucyjnego, aby była 4x-5x objętość PIB. Na przykład, jeśli stosuje się 10 μl PIB, należy użyć 50 μl buforu elucyjnego. Inkubować PIB z buforem elucyjnym w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę w celu wymycia PPP z PIB.
  2. Po elucji zebrać eluat przez odwirowanie probówek o stężeniu 376 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i pipetowanie eluatu do oddzielnej probówki, uważając, aby nie przenieść żadnych PIB. Użyć eluatu do analizy western blot lub do analiz spektrometrii mas. Eluaty mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.
  3. Aby zregenerować PIB do dalszego użycia, należy inkubować kulki w 2% SDS (vol/vol), obracając z prędkością 8 obr./min przy RT przez 1 h. Umyj je 3x-5x w 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) z rotacją przez 30 minut na pranie. Po wszystkich praniach przechowywać PIB w 25 mM buforze magazynującym Tris-HCl (pH 7,5) z azydkiem sodu (0,05% wag./obj.).
  4. Analizuj eluaty za pomocą western blot lub spektrometrii mas. Analiza spektrometrii mas eluatów PIB została opisana poniżej.

6. Usuwanie detergentów

UWAGA: Różne podejścia mogą być stosowane do usuwania detergentu z próbek eluatu do analizy MS. Odkryliśmy, że jednogarnkowe, wzmocnione w fazie stałej przygotowanie próbki (SP3), opisane przez Hughes et al., działa dobrze19.

  1. Dodaj 0,5 μl kulek SP3 do 50 μl eluatu z kroku 5.2 powyżej. Stosować kulki SP3 w proporcji 10:1 (μg:μg) lub co najmniej 0,5 μg/μl (roztwór podstawowy to 50 μg/μl). Delikatnie zmieszaj kulki i rozpuść.
  2. Dodać jedną objętość elucji 100% etanolu do mieszaniny kulka-eluat (np. jeśli użyto 50 μl eluatu, należy użyć 50 μl 100% etanolu). Inkubować próbki przez 5 minut w termomikserze ustawionym na wstrząsanie z prędkością 1000 obr./min w temperaturze 24 °C.
  3. Aby zebrać wszystkie koraliki, umieść je w magnetycznym stojaku na tuby. Gdy kulki się zbierzą, wyrzuć supernatant i umyj je 0,5 ml 80% etanolu (obj./obj.) 3x. Do prania ponownie zawiesić kulki przez wirowanie, zebrać kulki, umieszczając je w magnetycznym stojaku na probówki i wyrzucić supernatant między praniami.
  4. Umyj kulki jeszcze raz 0,5 ml 100% acetonitrylu (ACN), aby usunąć wszelkie ślady etanolu, usuwając jak najwięcej ACN.

7. Trawienie białek

  1. Rozcieńczyć trypsynę w stosunku 1:100 (końcowe stężenie 0,004 μg/μl) w 166 mM HEPES (pH 8,5) i dodać 30 μl tego roztworu trypsyny do każdej probówki z kulkami, ponownie zawieszając przez wirowanie.
  2. Inkubować mieszaninę SP3 z kulkami trypsyny w termomikserze przy 1000 obr./min w temperaturze 37 °C przez 5 godzin lub przez noc w temperaturze 30 °C. Umieścić probówki w stojaku magnetycznym, aby zebrać kulki i usunąć strawione składniki do nowych probówek.
  3. W przypadku analizy bez znaczników należy wygasić reakcję, dodając 20% kwasu trifluorooctowego (TFA) (obj./obj.) do końcowego stężenia 0,2% TFA (obj./obj.). Sprawdź, czy pH każdej próbki wynosi od 2 do 3 za pomocą bibułki do pomiaru pH. Jeśli nie, dodaj małe dodatkowe porcje 20% TFA, aż zostanie to osiągnięte. Próbki muszą być odpowiednio zakwaszone przed odsoleniem. Przejdź do kroku 8.
  4. W celu oznakowania próbek metodą TMT nie należy zakwaszać i przejść do kroku 9.

8. Odsalanie trawinu

  1. Przygotuj końcówkę stolika dla każdej próbki, pakując 200 μl końcówki kompatybilnej z rozpuszczalnikiem MS z żywicą C18, zgodnie z opisem Rappsilber et al.20. Użyj igły, aby docisnąć dwie krążki materiału C18, upewniając się, że krążki pozostają w igle. Przenieść krążki do końcówki kompatybilnej z rozpuszczalnikiem MS za pomocą tłoka z cienkiego drutu, aby usunąć krążki z igły.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby od tego punktu protokołu używać końcówek kompatybilnych z rozpuszczalnikiem MS, ponieważ inne końcówki do pipet mogą wypłukiwać substancje chemiczne do próbek, które można wykryć za pomocą spektrometrii mas.
  2. Zrównoważyć końcówkę każdego stopnia 30 μl 100% MeOH, następnie 30 μl 60% MeOH (vol/vol), a następnie 30 μl 0,1% TFA (vol/vol). Przepchnąć każdy roztwór przez końcówkę stolika za pomocą strzykawki. W razie potrzeby przymocować końcówkę pipety do końca strzykawki za pomocą przezroczystej folii, aby zwiększyć kontakt między strzykawką a końcówką strzykawki. Pamiętaj, aby nigdy nie dopuścić do wyschnięcia materiału C18 wewnątrz końcówki sceny.
  3. Dodaj zakwaszony trawienie peptydów z kroku 7.3 do oznaczonej końcówki etapu i przepchnij przez końcówkę etapu za pomocą strzykawki, ponownie uważając, aby końcówka etapu nie wyschła całkowicie.
  4. Przemyć każdą próbkę 2x 30 μl 0,1% TFA (obj./obj.). Eluuj peptydy z każdej końcówki stopnia, dodając 30 μl 60% MeOH (vol/vol) do każdej końcówki etapu i usuwając wszystko z końcówki pod ciśnieniem strzykawki do nowej, oznakowanej probówki. Jest to jedyny etap, w którym materiał C18 jest całkowicie wysuszony.
  5. Wysuszyć każdą próbkę przez odwirowanie próżniowe. Suszone peptydy można przechowywać w temperaturze -20°C przez kilka miesięcy. Próbki są teraz gotowe do analizy metodą spektrometrii mas bez użycia znaczników. Do analizy na spektrometrze masowym należy użyć tylko połowy próbki, a drugiej połowy do ponownego wstrzyknięcia, jeśli jest to konieczne. Zapewnić użycie odpowiedniej metody spektrometru mas do analizy.

9. Etykietowanie TMT

UWAGA: Etykietowanie znaczników tandem-mass służy do multipleksowania próbek do analizy ilościowej. Fiolka 0,8 mg odczynnika TMT wystarcza do znakowania do 0,8 mg białka21. W eksperymencie PIB pulldown rozpoczynającym się od 1 mg białka otrzymuje się 1-3 μg podjednostek fosfoproteiny. Poniższy protokół jest optymalny dla maksymalnie 10 μg białka.

  1. Rozpuścić jedną fiolkę 0,8 mg odczynnika TMT w 80 μl bezwodnego ACN.
  2. Oznacz każdą próbkę z kroku 7.4 inną etykietą TMT dla maksymalnie 18 kanałów. Pamiętaj, aby zanotować, która etykieta TMT jest dodawana do każdej próbki. Dodać 2 μl odczynnika TMT i 2 μl ACN do mineralizacji peptydów, delikatnie zmieszać, odwirować przy 376 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w celu zebrania próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w celu oznaczenia próbki.
  3. Aby przetestować skuteczność etykietowania TMT, należy pobrać próbkę kontrolną etykiety, łącząc 1 μl każdej reakcji etykietowania w probówce o pojemności 0,5 ml zawierającej 9 μl wody klasy LC-MS i 1 μl 10% hydroksyloaminy (obj./obj.) w celu wygaszenia reakcji. Pozostałe, niehartowane, oznakowane próbki umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Próbki mogą być przechowywane przez kilka dni, podczas których oceniana jest skuteczność etykietowania.
  4. Zakwasić próbkę kontrolną na etykiecie TMT, dodając 30 μl 0,1% TFA (obj./obj.). Sprawdź, czy pH wynosi 2-3. Jeśli nie, dodaj 20% TFA (vol/vol), aż do osiągnięcia tego pH. Odsolić próbkę kontrolną etykiety poprzez przechylanie etapu, zgodnie z opisem w krokach 8.1.-8.5.
  5. Przeanalizuj próbkę kontrolną etykiety TMT na spektrometrze mas, aby ocenić skuteczność etykietowania. Przefiltruj wyniki wyszukiwania do 1% współczynnika fałszywych wykryć (FDR) na poziomie peptydu i określ skuteczność etykietowania21,22.
  6. Peptydy w pełni znakowane TMT mają odczynnik TMT na N-końcu i we wszystkich lizynach. Określ ilościowo intensywność jonów reporterowych TMT i porównaj ich całkowitą sumę we wszystkich kanałach. Próbka jest wystarczająco oznakowana, gdy znakowane jest >95% wszystkich peptydów, a suma intensywności jonów reporterowych TMT jest porównywalna
    UWAGA: Oprócz niepełnego oznakowania, różnice w zsumowanych intensywnościach jonów reporterowych TMT mogą być wynikiem niedokładnego pipetowania próbki testowej o pojemności 1 μl. Może to również odzwierciedlać prawdziwą obserwację biologiczną, w którym to przypadku wszystkie repliki powinny wykazywać to samo zachowanie.
  7. Wyjąć niehartowane próbki z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmrozić je. Jeśli nie są one w pełni oznakowane, dodać 1 μl odpowiedniego odczynnika TMT do próbki, jak opisano powyżej, inkubować przez 1 godzinę i powtórzyć kontrolę etykiety TMT. Jeśli próbki są w pełni oznaczone, przejdź do kroku 9.8.
  8. Po całkowitym znakowaniu dodać 2 μl 10% hydroksyloaminy (obj./obj.) do reakcji TMT, aby ugasić znakowanie. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po schłodzeniu próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
  9. Połącz wszystkie wygaszone kanały TMT i dodaj 2 μl 20% TFA (vol/vol), aby zakwasić reakcję. Sprawdź pH połączonej reakcji, upewniając się, że mieści się w przedziale 2-3. Jeśli nie, dodaj małe porcje 20% TFA, aż do osiągnięcia pożądanego pH. Ma to kluczowe znaczenie dla prawidłowego odsalania.
  10. Usunąć ACN przez wirowanie próżniowe przez 30 minut i odsolić próbkę zgodnie z poniższym opisem.

10. Odsalanie próbki połączonej z etykietą TMT

  1. Do odsalania połączonego odczynnika TMT należy użyć płytki odsalającej SPE C18 o odpowiedniej pojemności białkowej (do tego zastosowania zwykle wystarcza 2 mg sorbentu). Zrównoważyć studzienkę z 200 μl 60% MeOH (obj./obj.) i 200 μl 10% MeOH/0,1% TFA (obj./obj.).
  2. Załaduj zakwaszone peptydy znakowane TMT z kroku 9.10. na płytkę odsalającą. Przemyć studzienki na próbkę 2x 200 μl 10% MeOH/0,1% TFA (obj./obj.).
  3. Eluować peptydy za pomocą 100 μl 60% MeOH (vol/vol). Wysuszyć próbki przez odwirowanie próżniowe. Wysuszoną próbkę oznaczoną etykietą TMT można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
  4. W przypadku analizy spektrometrii mas próbki znakowanej TMT, należy wstrzyknąć połowę próbki i zachować drugą połowę, jeśli wymagane jest ponowne wstrzyknięcie.
    UWAGA: Ilości iniekcji w spektrometrii mas będą się różnić w zależności od konkretnej kolumny, konfiguracji przyrządu i typu próbki.

11. Analiza danych

UWAGA: Metody filtrowania i analizy danych różnią się i wykraczają poza zakres tego protokołu, ale poniższe uwagi dotyczące analizy są dołączone, aby dostarczyć wskazówek specyficznych dla typu danych wynikających z tego protokołu.

  1. Przeszukaj surowe dane spektrometrii mas w bazie danych proteomu specyficznego dla gatunku w oparciu o pochodzenie użytych komórek lub tkanek próbki. W tym przypadku Comet został użyty jako algorytm wyszukiwania23.
  2. Przefiltruj wyniki wyszukiwania za pomocą 1% FDR, dostosowując parametry specyficzne dla algorytmu wyszukiwania22. W celu ilościowego określenia bez użycia znaczników należy użyć pomiarów powierzchni piku MS1 w celu ilościowego określenia danych. W przypadku próbek znakowanych TMT należy użyć intensywności jonów reporterowych pochodzących z MSn w celu określenia ilościowego. Aby uzyskać istotność statystyczną, należy przeanalizować próbki w biologicznych trzech egzemplarzach.
  3. Aby de novo zidentyfikować podjednostki PPP i ich interaktory, należy upewnić się, że porównano potrójne próbki biologiczne próbek z próbek hamowanych MCLR i próbek poddanych działaniu DMSO. Aby porównać PPPome w różnych warunkach lub po leczeniu farmakologicznym, należy upewnić się, że wygenerowano biologiczne triplekaty każdego schorzenia lub leczenia farmakologicznego.
  4. Przefiltruj dane tak, aby obecne były tylko białka o całkowitej liczbie peptydów >1 w co najmniej dwóch z trzech próbek kontrolnych DMSO. Konkurencja MCLR nie zawsze konkuruje ze wszystkimi katalitycznymi wiązaniami podjednostek. Ponadto niektóre podjednostki katalityczne PPP mogą niespecyficznie przylegać do żywicy sefarozy. Aby uwzględnić każdą z tych możliwości podczas filtrowania białek, które niespecyficznie wiążą się z żywicą, należy usunąć białka o całkowitej liczbie peptydów w warunkach traktowanych MCLR wyższej niż w przypadku jakiejkolwiek podjednostki katalitycznej PPP.
  5. Wyklucz z analizy powszechne zanieczyszczenia, takie jak keratyna, kolagen, białka rybosomalne 40S i 60S oraz heterogeniczne rybonukleoproteiny jądrowe, które nie są podjednostkami PPP, z analizy14.
  6. Zaimportuj przefiltrowane dane do Perseusa, klikając opcję Generic Matrix Upload (Przesyłanie macierzy ogólnej) w sekcji Load (Załaduj24,25. Log2 przekształć dane, przechodząc do pozycji Podstawowe > Przekształć, wybierając dane i określając funkcję transformacji, w tym przypadku log2(x).
  7. Imputuj brakujące wartości z rozkładu normalnego, przechodząc do opcji Imputation > Replace Missing Values from Normal Distribution, wybierając dane i określając szerokość (domyślnie 0,3) oraz przesunięcie w dół (domyślnie 1,8) dla obliczeń. Wykonaj normalizację kwantylu, przechodząc do pozycji Normalizuj > normalizacji kwantylu.
  8. Oblicz współczynniki logarytmu2 i wartości p testu Studenta T-test dla odpowiednich warunków. Najpierw dodaj adnotacje do danych, przechodząc do pozycji Wiersze adnotacji > kategorie. Wykonaj test T, przechodząc do sekcji Testy > testami dla dwóch prób i wybierając grupy do porównania, test do wykonania oraz metodę korekcji testowania wielu hipotez używaną do obcinania.
    UWAGA: Do identyfikacji >de novo białko uważa się za białko oddziałujące z PPP, jeśli jego obfitość jest statystycznie istotna w stanie traktowanym MCLR w porównaniu z DMSO, z logarytmiczną2-krotną zmianą większą niż minimalna zmiana krotności dowolnej specyficznie związanej znanej podjednostki PPP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza oddziaływań fosfataz, schemat kulek z inhibitorem fosfataz, LC-MS/MS, wykresy danych.
Rycina 2: Identyfikacja specyficznych binderów PIBs. (A) Za pomocą metody PIB-MS można analizować różne typy tkanek lub komórek. Komórki HeLa w trzech powtórzeniach biologi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

PIB-MS to podejście proteomiki chemicznej stosowane do ilościowego profilowania PPPomu z różnych źródeł próbki w jednej analizie. Wiele pracy wykonano przy użyciu kulek inhibitorów kinaz do zbadania kinomu i jego zmian w raku i innych stanach chorobowych 10,11,12,13. Jednak badania nad PPPome pozostają w tyle. Przewidujemy, że takie podejście jest w stanie wypełnić tę lukę i rzucić światło na r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

A.N.K. dziękuje za wsparcie ze strony NIH R33 CA225458 i R35 GM119455. Dziękujemy laboratoriom Kettenbach i Gerber za pomocną dyskusję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acetonitryl (ACN)HoneywellAH015-4UWAGA: ACN jest łatwopalny i toksyczny; nosić rękawice i pracować w osłonie przeciwchemicznej.
Bezwodny acetonitrylSigma-Aldrich271004-100ML UWAGA: ACN jest łatwopalny i toksyczny; nosić rękawice i pracować w okapie oparów chemicznych.
Wirówka stołowaEppendorfnr modelu 5424
Kwas beta-glicerofosforowy, sól disodowa pentahydratAcros Organics410991000
WirówkaEppendorfnr modelu 5810 R Wersja
Woda
DMSOFisher ScientificBP231-100
Tkanka do skażenia młynekFisherbrand Pellet Pestles12-141-363
Empore dysk do ekstrakcji fazy stałej, C18CDS Analytical76333-132
Probówki Eppendorf, 1,5 mlEppendorf22363204KRYTYCZNE: Inne probówki mogą wypłukiwać polimer do próbki, zanieczyszczając analizę.
Probówki Eppendorfa, 2 mlEppendorf22363352KRYTYCZNE: Inne probówki mogą wypłukiwać polimer do próbki, zanieczyszczając analizę.
Kolektor płytkowy ekstrakcyjnyWodyWAT097944
probówki Falcon, 50 mlVWR21008
Ogólna igła i tłok
Ogólny stojak
HEPESSigma-AldrichH3375
Chlorowodór (HCl)VWR Chemicals BDHBDH3028UWAGA: HCl jest; Nosić rękawice i pracować w okapie oparów chemicznych.
Roztwór hydroksyloaminy 50% (wt/vol)467804Sigma-Aldrich
, 65 ° CVWRmodel nr 1380FM
Koptec Czysty etanol, 200 ProofDecon LabsV1001
Metanol do HPLC (MeOH)Sigma-Aldrich34860-4L-RUWAGA: MeOH jest łatwopalny i toksyczny; nosić rękawice i pracować w okapie chemicznym.
Mikrocystyna LR (MCLR) CaymanChemical10007188UWAGA: MCLR jest toksyczny; Podczas obsługi należy nosić rękawice i unikać kontaktu ze skórą.
PBS, 1&x; bez wapnia i magnezu, pH 7,4 ± 0,1Corning  Paski testowe pH 21-040-CV
, takie jak paski testowe pH MilliporeSigma MColorpHast i papierki wskaźnikoweFisher Scientific M1095310001
PIBsAby zapoznać się z protokołem generowania PIB, patrz Moorhead et al., 2007.
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225
Końcówki do pipet, 10 μ LEppendorf22491504KRYTYCZNE: Inne końcówki mogą wypłukiwać polimer do próbek, zanieczyszczając analizę.
Końcówki do pipet, 1000 μ LEppendorf22491555KRYTYCZNE: Inne końcówki mogą wypłukiwać polimer do próbek, zanieczyszczając analizę.
Końcówki do pipet, 200 μ LEppendorf22491539KRYTYCZNE: Inne końcówki mogą wypłukiwać polimer do próbek, zanieczyszczając analizę.
plastikowa strzykawka, 10 mlBD309604
Koktajl inhibitorów proteazy IIIResearch Products InternationalP50700-1
Q Exactive Plus Hybrydowy spektrometr masowy kwadrupolowo-orbitrapowy, spektrometr masowy Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos lub spektrometr masowy Orbitrap Eclipse Tribrid Thermo Scientific
Wirówka stołowa z chłodzeniemEppendorfmodel nr 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)Thermo Scientific13-687-12QObrót 8 obr./min
Płytka do pobierania próbek, 96-dołkowa, 1 mlWodyWAT058957
SDS FisherScientificBP1311-1
Klasa sekwencjonowania zmodyfikowana trypsynaPromegaV511C
Azydek soduEMD ChemicalsSX0299-1UWAGA: Azydek sodu jest wybuchowy i toksyczny; nosić rękawice, pracować w dygestorium chemicznym i unikać kontaktu z metalami.
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ChemicalS27110
Sonicator (cyfrowy sonizator Branson)model nr. SFX 250
SPE C18 płyta odsalającaWody186001828BA
SpeedBeads magnetyczne cząstki modyfikowane karboksylanem (kulki SP3)Cytiva6.51521E+13
ThermomixerEppendorfnr modelu 5350
TMT10plex Zestaw odczynników do etykiet izobarycznych plus odczynnik do etykiet TMT11-131C, 3 &razy; 0,8 mg na znacznikThermoFisherA37725
Kwas trifluorooctowy (TFA)HoneywellT6508-25MLUWAGA: TFA jest i podrażnia skórę w kontakcie. Nosić rękawice i okulary ochronne oraz pracować w okapie oparów chemicznych.
Tris BaseResearch Products InternationalT60040
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Wirówka próżniowa i pułapka parThermo Scientificnr modelu. SpeedVac SPD120 i RVT5105
Vortexer (Vortex-Genie 2)Scientific Industries
Water LC-MSHoneywellLC365-4
15 ampdestylowanaz końcemdo separacji magnetycznejInkubator

Bibliografia

  1. Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
  2. Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
  3. Brautigan, D. L., Shenolikar, S. Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates. Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).
  4. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).
  5. Virshup, D. M., Shenolikar, S. From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover. Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).
  6. Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. The extended PP1 toolkit: designed to create specificity. Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).
  7. Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. 4D-networking by mitotic phosphatases. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).
  8. Heroes, E., et al. The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity. The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).
  9. Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).
  10. Bantscheff, M., et al. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).
  11. Klaeger, S., et al. Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).
  12. Duncan, J. S., et al. Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer. Cell. 149 (2), 307-321 (2012).
  13. Cooper, M. J., et al. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS ONE. 8 (6), 66755(2013).
  14. Lyons, S. P., et al. A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).
  15. Nasa, I., et al. Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry. Science Signaling. 13 (648), (2020).
  16. Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse. Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).
  17. Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose. Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).
  18. Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).
  19. Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  20. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  21. Zecha, J., et al. TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach. Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
  22. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  23. Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).
  24. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  25. Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins. Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

fosforylacja białekinteraktory PPPpodejście proteomicznekuleczki z inhibitorem fosfatazykwantyfikacja bez znakowaniamodyfikacje potranslacyjnedefosforylacja białekanaliza sieci
Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.