Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Summary

Grubość skrawków tkanek ograniczała badanie morfologiczne unerwienia skóry. Niniejszy protokół opisuje unikalną technikę oczyszczania tkanek w celu wizualizacji włókien nerwowych skóry w grubych skrawkach tkanki o grubości 300 μm pod mikroskopią konfokalną.

Abstract

Unerwienie skóry jest ważną częścią obwodowego układu nerwowego. Chociaż badania skórnych włókien nerwowych postępują szybko, większość wiedzy na temat ich charakterystyki dystrybucyjnej i chemicznej pochodzi z konwencjonalnego barwienia histochemicznego i immunohistochemicznego na cienkich skrawkach tkanek. Wraz z rozwojem techniki oczyszczania tkanek możliwe stało się oglądanie włókien nerwowych skóry na grubszych odcinkach tkanki. Niniejszy protokół opisuje wielokrotne barwienie fluorescencyjne na skrawkach tkanek o grubości 300 μm od podeszwowej i grzbietowej skóry tylnej stopy szczura, dwóch typowych owłosionych i nagich miejsc skóry. W tym przypadku peptyd związany z genem kalcytoniny znakuje czuciowe włókna nerwowe, podczas gdy falloidyna i receptor hialuronianowy śródbłonka naczyń limfatycznych 1 znakują odpowiednio naczynia krwionośne i limfatyczne. Pod mikroskopem konfokalnym znakowane czuciowe włókna nerwowe były śledzone całkowicie na większą odległość, biegnąc w wiązkach w głębokiej warstwie skórnej i freestyle w warstwie powierzchownej. Te włókna nerwowe biegły równolegle do naczyń krwionośnych lub otaczały je, a naczynia limfatyczne tworzyły trójwymiarową (3D) sieć w owłosionej i nagiej skórze. Obecny protokół zapewnia bardziej efektywne podejście do badania unerwienia skóry niż istniejące konwencjonalne metody z perspektywy metodologicznej.

Introduction

Skóra, największy organ w ciele, służący jako kluczowy interfejs do środowiska, jest gęsto unerwiona przez wiele włókien nerwowych^1,2,3. Chociaż unerwienie skóry było wcześniej szeroko badane za pomocą różnych metod histologicznych, takich jak barwienie na całych skrawkach skóry i tkanek^4,5,6, szczegółowa skuteczna demonstracja skórnych włókien nerwowych jest nadal wyzwaniem^7,8. Biorąc to pod uwagę, w obecnym protokole opracowano unikalną technikę wyraźniejszego uwydatniania włókien nerwowych skóry w sekcji tkanki grubej.

Ze względu na ograniczenie grubością odcinków, obserwacja unerwionych włókien nerwowych skóry nie jest wystarczająco precyzyjna, aby dokładnie zobrazować związek między włóknami nerwowymi peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) a lokalnymi tkankami i narządami na podstawie uzyskanych informacji o obrazie. Pojawienie się technologii oczyszczania tkanek 3D zapewnia wykonalną metodę rozwiązania tego problemu^9,10. Szybki rozwój metod oczyszczania tkanek zaoferował wiele narzędzi do badania struktur tkankowych, całych narządów, projekcji neuronalnych i całych zwierząt w ostatnich czasach¹¹. Przezroczystą tkankę skórną można zobrazować w znacznie grubszym przekroju za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać dane do wizualizacji włókien nerwowych skóry.

W obecnym badaniu, podeszwowa i grzbietowa skóra tylnej stopy szczura zostały wybrane jako dwa docelowe miejsca owłosionej i nagiej skóry^3,4,7. Aby prześledzić włókna nerwowe skóry na większą odległość, tkankę skórną przecięto na grubość 300 μm w celu barwienia immunohistochemicznego i histochemicznego, a następnie poddano zabiegowi oczyszczania tkanek. CGRP został użyty do oznaczenia włókien nerwu czuciowego^12,13. Ponadto, aby podkreślić skórne włókna nerwowe na tle tkanki, falloidyna i receptor hialuronowy śródbłonka naczynia limfatycznego 1 (LYVE1) zostały dodatkowo użyte do oznaczenia naczyń krwionośnych i naczyń limfatycznych, odpowiednio^14,15.

Te podejścia dostarczyły prostej metody, którą można zastosować do zademonstrowania widoku włókien nerwowych skóry w wysokiej rozdzielczości, a także do wizualizacji korelacji przestrzennej między włóknami nerwowymi, naczyniami krwionośnymi i naczyniami limfatycznymi w skórze, co może dostarczyć znacznie więcej informacji do zrozumienia homeostazy normalnej skóry i zmian skórnych w warunkach patologicznych.

Protocol

Obecne badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (numer referencyjny D2018-04-13-1). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano trzy dorosłe samce szczurów (Sprague-Dawley, waga 230 ± 15 g). Wszystkie zwierzęta były trzymane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością oraz miał swobodny dostęp do pożywienia i wody.

1. Perfuzja i przygotowanie próbki

1. Wstrzyknąć 250 mg/kg roztworu tribromoetanolu (patrz tabela materiałów) dootrzewnowo szczurowi w celu wywołania eutanazji.
2. Gdy oddech przestanie oddychać, użyj nożyczek chirurgicznych ze stali nierdzewnej, aby otworzyć klatkę piersiową szczura. Użyj igieł 20 G do perfuzji przez lewą komorę serca¹³ z szybkością 3 ml / min ze 100 ml 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 250-300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4) (Rysunek 1A,B).
3. Po perfuzji użyj skalpela, aby usunąć skórę grzbietu i podeszwy z tylnej łapy.
   1. W przypadku próbek wymagających zamrożonego skrawka, po utrwaleniu tkanek w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PB przez 2 godziny, a następnie krioprotekcję tkanek w 25% sacharozie w 0,1 M PB przez ponad 24 godziny w temperaturze 4 °C
   2. W przypadku próbek o grubym przekroju, który wymaga oczyszczenia tkanek, należy następnie utrwalić tkanki w 4% paraformaldehydzie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) przez 2 godziny; następnie kriochronić tkanki w 1x PBS w temperaturze 4 °C (ryc. 1C-E).

2. Potrójne barwienie fluorescencyjne za pomocą CGRP, falloidyny i LYVE1, a następnie zabieg oczyszczania tkanek

UWAGA: Potrójne barwienie fluorescencyjne za pomocą CGRP, falloidyny i LYVE1 zostało zastosowane w celu odsłonięcia włókien nerwowych, naczyń krwionośnych i limfatycznych w owłosionej i nagiej skórze na skrawkach tkanek o grubości 300 μm po zabiegu oczyszczania tkanek.

1. Przygotuj 2% agarozy w 1x PBS, podgrzewając w kuchence mikrofalowej przez 2 minuty, aż agaroza się rozpuszcze (patrz tabela materiałów).
2. Po umyciu zanurz tkanki skóry w 2% agarozie w temperaturze 37 °C i umieść je w zamrażalniku w celu schłodzenia (Rysunek 1F,G).
3. Przymocuj zamontowaną tkankę do mikrotomu wibracyjnego za pomocą lodowatej wody i pokrój je na grubość 500 μm w kierunku poprzecznym. Użyj następujących parametrów, aby ustawić krajalnicę wibracyjną i zakończyć krojenie: prędkość, 0,50 mm/s i amplituda, 1,5 mm (Rysunek 1H-K).
4. Po pokrojeniu usuń agarozę z kawałków i przechowuj je w sześciodołkowej płytce z 1x PBS (pH 7,4) (Rysunek 1L).
5. Inkubować skrawki tkanek w roztworze 2% Triton X-100 w 1x PBS (TriX-PB) przez noc w temperaturze 4 °C. Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z następującą procedurą.
6. Umieścić skrawki tkanki w buforze blokującym i obracać z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Skład buforu blokującego to 10% normalnej surowicy osła, 1% Triton-X 100 i 0,2% azydku sodu w 1x PBS (patrz Tabela materiałów).
7. Przenieść skrawki tkanki do roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne anty-CGRP myszy (1:500) i owcze przeciwciało poliklonalne anty-LYVE1 (1:500) w buforze rozcieńczającym w probówce do mikrowirówek (patrz tabela materiałów) i obracać na wytrząsarce przez 2 dni w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Skład buforu rozcieńczającego to 1% normalna surowica osła, 0,2% Triton-X 100 i 0,2% azydek sodu w 1x PBS.
8. Skrawki chusteczek należy dwukrotnie przemyć buforem myjącym w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C w buforze do mycia.
   UWAGA: Skład buforu myjącego to 0,2% Triton-X 100 w 0,1 M PB (pH 7,4).
9. Następnego dnia przenieś skrawki tkanek do zmieszanego roztworu zawierającego drugorzędowe przeciwciała przeciwko mysim IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) i IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), a także falloidynie Alexa-Flour594 (1:1000) (patrz tabela materiałów) w probówce do mikrowirówki i obracaj z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez 5 godzin w temperaturze 4 °C.
10. Przemyć skrawki tkanek na sześciodołkowej płytce z buforem do przemywania przez 1 godzinę dwa razy w temperaturze pokojowej. Przechowywać skrawki tkanek w buforze myjącym na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
11. Przenieść skrawki tkanki do odczynnika do oczyszczania tkanek (patrz tabela materiałów, jego objętość była pięć razy większa niż objętość próbki) i delikatnie obracać z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Po tym zabiegu skrawki tkanek stają się przezroczyste (Ryc. 2B).
12. Zamontuj oczyszczone tkanki na szkiełku, okrąż chusteczki przekładką i przyklej szczelinę świeżym odczynnikiem do czyszczenia tkanek i szkiełkiem nakrywkowym.

3. Potrójne barwienie fluorescencyjne za pomocą CGRP, falloidyny i LYVE1 zgodnie z konwencjonalnym podejściem

UWAGA: Dla porównania, to samo barwienie przeprowadzono na skrawkach tkanek o grubości 30 μm zgodnie z konwencjonalnymi technikami.

1. Pokrój skrawki tkanki na mikrotomie z prędkością 30 μm w kierunku poprzecznym i zamontuj je na szkiełku.
2. Dodać roztwór blokujący z 3% normalną surowicą osła i 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PB i inkubować skrawki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć roztwór blokujący i inkubować skrawki z roztworem zawierającym pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne anty-CGRP myszy (1:500) i owcze przeciwciało poliklonalne anty-LYVE1 (1:500) w buforze rozcieńczającym przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Następnego dnia przemyć skrawki tkanek trzykrotnie 0,1 M PB (pH 7,4), dodać zmieszany roztwór zawierający wtórne przeciwciała anty-mysie IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) i anty-owce IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), a także falloidyny Alexa-Flour594 (1:1000) na skrawki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Przed obserwacją mikroskopową należy trzykrotnie umyć skrawki w 0,1 M PB (pH 7,4), a następnie przykryć je szkiełkami nakrywkowymi w 50% glicerynie.

4. Obrazowanie i analizy

1. Obserwuj barwione próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym, a następnie wykonaj zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego.
2. Uchwyć 30 obrazów (stosy Z), każdy w klatkach 10 μm, z każdego przekroju o grubości 300 μm i zintegruj pojedynczy obraz ostry za pomocą procesora obrazu systemu mikroskopii konfokalnej (patrz tabela materiałów).
   1. Wykonaj następujące czynności w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu konfiguracji konfokalnej do analizy trójwymiarowej (3D): Ustaw początkową płaszczyznę ogniskową | Ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej | Ustawianie rozmiaru kroku | Wybierz wzór głębokości | Przechwytywanie obrazu | Seria Z.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji sygnałów niebieskiej fluorescencji wynosiły odpowiednio 401 nm i 421 nm. Długości fal wzbudzenia i emisji sygnałów zielonej fluorescencji wynosiły odpowiednio 499 nm i 519 nm. Długości fal wzbudzenia i emisji sygnałów czerwonej fluorescencji wynosiły odpowiednio 591 nm i 618 nm. 152 μm to średnica otworka konfokalnego (soczewka obiektywu 10x, NA: 0,4). Rozdzielczość przechwytywania obrazu wynosiła 1024 × 1024 pikseli.
3. W przypadku konwencjonalnych próbek (krok 3) należy wykonać 30 obrazów (stosów Z) w ramkach 1 μm z każdego odcinka o grubości 30 μm i dalej traktować te obrazy, jak wspomniano powyżej (kroki 4.1-4.2).
4. Zademonstruj obrazy we wzorze rekonstrukcji 3D za pomocą systemu przetwarzania obrazu.
5. Wykonuj rekonstrukcje 3D, importując obrazy konfokalne stosu Z do Imaris 9.0 (oprogramowanie do obrazowania komórek, patrz tabela materiałów) i twórz renderingi powierzchni na podstawie intensywności plam: Dodawanie nowych powierzchni | Wybierz kanał źródłowy | Określ parametry w opcji gładkiej w oknie Szczegóły powierzchni | Określ parametry w opcji progowej Intensywność bezwzględna | Klasyfikowanie powierzchni | Koniec.
6. Zbieraj dane w obszarze dodatnich włókien nerwowych za pomocą oprogramowania do obrazowania komórek. Wybierz renderowany obraz | Statystyka | Szczegółowe | Konkretne wartości | Głośność.

Results

Po potrójnym barwieniu fluorescencyjnym, włókna nerwowe, naczynia krwionośne i limfatyczne zostały wyraźnie oznaczone odpowiednio CGRP, falloidyną i LYVE1 na owłosionej i nagiej skórze (Rysunek 3,4). Dzięki zabiegowi oczyszczającemu, włókna nerwowe CGRP-dodatnie, naczynia krwionośne dodatnie falloidyny i naczynia limfatyczne LYVE1-dodatnie mogą być obrazowane na większej głębokości, aby uzyskać pełną informację strukturalną skóry (Ryc. 3). Kiedy te struktury tkanko...

Discussion

Niniejsze badanie zapewnia szczegółową demonstrację włókien nerwowych skóry w owłosionej i nagiej skórze za pomocą immunofluorescencji na grubszych odcinkach tkanek z leczeniem oczyszczającym i widokiem 3D, aby lepiej zrozumieć unerwienie skóry. Ważny jest czas inkubacji przeciwciał do 1-2 dni i proces czyszczenia przez noc. Te dwa kluczowe etapy bezpośrednio wpływają na efekt barwienia immunofluorescencyjnego grubych skrawków. Kolejnym problemem był wybór przeciwciał, z których nie wszystkie nadają się do grubych odcink...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7,2-7,4, 0,01 mol
2,2,2-tribromoetanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Oślica przeciw myszom IgG H& L Alexa-Mąka488	Abcam plc.	ab150105
Przeciwciała przeciw owcom IgG H& L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
Rurka EP	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1,5 ml
System mikrotomów przesuwnych z fazą zamrażania	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Standardowy standard nożycowy	IRIS WPI (World Precision Instruments Inc.)
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Mikrokleszcze-Str	RWD	F11020-11
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CGRP	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutralnie buforowana formalina	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
normalna surowica osła	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Pompa perystaltyczna	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 rozwiązanie	SunJin Lab co.	RC152001	10 ml
Regularna agaroza	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 zęby Kleszczyki do tkanek-Str	RWD	F13038-12
Owcze poliklonalne przeciwciało anty-LYVE1	R& D Systems, Inc.	AF7939
Płytka sześciodołkowa	Corning Incorporated	3335
Azydek sodu	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sacharoza	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 ml
Uretan	Sigma Life Science	U2500	500 g
Nożyczki sprężynowe VANNAS	RWD	S1014-12
Mikrotom wibracyjny	Leica Biosystems	VT1200S