Artykuł metodologiczny

Wizualizacja rozwoju blizn za pomocą testu SCAD - test bliznowacenia skóry ex-situ

DOI:

10.3791/63808

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Regenerative Biology and Medicine, Helmholtz Zentrum München, 2School of Medicine, Klinikum Rechts der Isar, Department of Plastic and Hand Surgery, Technical University of Munich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wytwarzanie eksplantatu skórno-powięziowego, określanego jako "SCar like tissue in A Dish" lub SCAD. Model ten pozwala na niespotykaną dotąd wizualizację pojedynczych fibroblastów podczas tworzenia blizn.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Globalną reakcją ssaków na uszczelnianie głębokich ran tkankowych jest tworzenie blizn i kurczenie się tkanek, w których pośredniczą wyspecjalizowane fibroblasty powięzi. Pomimo klinicznego znaczenia powstawania blizn i upośledzonego gojenia się ran, nasza wiedza na temat dynamiki fibroblastów powięzi w gojeniu się ran jest pobieżna ze względu na brak odpowiednich testów, które umożliwiają bezpośrednią wizualizację choreografii i dynamiki fibroblastów w złożonych środowiskach, takich jak rany skóry. W artykule przedstawiono protokół generowania blizn skórnych ex-situ za pomocą SCAD lub "SCar-like tissue in A Dish", które naśladują złożone środowisko ran skóry. W tym teście skóra o pełnej grubości 2 mm jest wycinana i hodowana do góry nogami w pożywce przez 5 dni, podczas których blizny i przykurcze skóry rozwijają się równomiernie. Ta metodologia, w połączeniu z transgenicznymi modelami myszy specyficznymi dla linii fibroblastów, umożliwia wizualizację poszczególnych linii fibroblastów w całym procesie gojenia się ran. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pomaga naukowcom w zrozumieniu podstawowych procesów i mechanizmów gojenia się ran, bezpośrednio badając wpływ modulatorów na wyniki gojenia się ran.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gojenie ran to proces przywracania uszkodzonych ran. Urazy tkanek u bezkręgowców skutkują częściową lub całkowitą regeneracją. W przeciwieństwie do tego, ssaki reagują na głębokie obrażenia bliznowaceniem, procesem dostosowanym do szybkiego uszczelniania ran za pomocą gęstych zatyczek włókien matrycy, które minimalizują naruszony obszar i jednocześnie trwale deformują uszkodzone miejsce1,2,3. Duże oparzenia skóry lub głęboko otwarte rany u ssaków skutkują patologicznymi fenotypami, takimi jak blizny przerostowe lub keloidowe4,5. Te wybujałe blizny stanowią ogromne obciążenie dla klinicznych i globalnych systemów opieki zdrowotnej. W samych Stanach Zjednoczonych leczenie blizn kosztuje około 10 miliardów dolarów rocznie6,7. W związku z tym konieczne jest opracowanie odpowiednich metodologii, aby lepiej zrozumieć podstawowe procesy i mechanizmy związane z powstawaniem blizn.

W ostatnich latach szeroki zakres badań na myszach ujawnił niejednorodne populacje fibroblastów o różnych potencjach funkcjonalnych w oparciu o ich pochodzenie w określonych miejscach skóry8,9,10. W skórze pleców Rinkevich i in., 2015, zidentyfikowali, że specyficzna populacja fibroblastów z wczesną embrionalną ekspresją Engrailed-1 (En1), określaną jako EPF (Engrailed dodatni fibroblast) przyczynia się do bliznowacenia skóry po zranieniu. I odwrotnie, inna linia fibroblastów bez historii ekspresji Engrailed, Engrailed negative fibroblast (ENF), nie przyczynia się do powstawania blizn8. Mapowanie losów tych linii En1 przy użyciu transgenicznych linii myszy sterowanych przez Cre skrzyżowanych z fluorescencyjnymi liniami reporterowymi myszy, takimi jak R26mTmG (En1Cre xR26 mTmG), umożliwia wizualizację populacji EPF i ENF.

Badanie migracji fibroblastów in vivo przez kilka dni jest ograniczone ograniczeniami etycznymi i technicznymi. Co więcej, badania przesiewowe biblioteki przeciwciał złożonych, wirusowych i neutralizujących w celu modulacji szlaków zaangażowanych w bliznowacenie są technicznie trudne. Poprzednio używane modele in vitro lub ex vivo nie mają możliwości wizualizacji migracji fibroblastów i powstawania blizn w prawdziwych mikrośrodowiskach skóry, jednorodności w rozwoju blizny, a także złożoności tkanek, które emulują środowiska skóry in vivo11,12. Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, opracowaliśmy test bliznowacenia ex vivo o nazwie SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Ten prosty test można przeprowadzić, wycinając 2 mm skóry o pełnej grubości zawierającej naskórek, skórę właściwą i podskórne obszary powięzi i hodując je w pożywce DMSO uzupełnionej surowicą przez okres do 5 dni. Blizny wygenerowane za pomocą SCAD niezawodnie odtwarzają transkryptomiczne i proteomiczne cechy charakterystyczne blizn in vivo. Ponadto SCAD wygenerowane z odpowiednich linii myszy transgenicznych (np. myszy En1) skrzyżowanych z fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych umożliwiają wizualizację dynamiki migracji fibroblastów i rozwoju blizn w niespotykanej dotąd rozdzielczości. Co więcej, model ten można łatwo dostosować do dowolnych zastosowań o wysokiej przepustowości (np. biblioteki związków, biblioteki przeciwciał lub badań przesiewowych wirusów)13,14. W tym artykule opisujemy zoptymalizowany protokół do generowania SCAD i późniejszych aplikacji przetwarzania w celu zbadania dynamiki komórkowej i macierzy w rozwoju blizn.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model przedstawiony poniżej zawiera szczegółowy opis generacji testu SCAD krok po kroku, jak pokrótce opisano w Jiang et al., 202013. Przygotowanie próbek SCAD przeprowadzono po złożeniu zwierząt w ofierze zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi i wytycznymi rządu Górnej Bawarii. Zwierzęta były trzymane w ośrodku dla zwierząt w Centrum Helmholtza w Monachium. W pomieszczeniach utrzymywano optymalną wilgotność i stałą temperaturę z 12 godzinnym cyklem świetlnym. Zwierzęta były zaopatrywane w pokarm i wodę ad libitum.

1. Przygotowanie tkanek SCAD

  1. Uśmiercaj nowonarodzone szczenięta w dniu poporodowym 0 lub dniu 1 (P0 lub P1).
  2. Ostrożnie wyciąć skórę grzbietu grzbietu o wymiarach co najmniej 1,5 cm x 1,5 cm pełnej grubości aż do warstwy mięśni szkieletowych za pomocą sterylnego skalpela chirurgicznego.
  3. Peeluj skórę za pomocą sterylnych, zakrzywionych kleszczy, upewniając się, że powierzchowna powięź jest nienaruszona z leżącym poniżej mięśniem panniculus carnosus.
  4. Umyj wyciętą tkankę 50-100 ml zimnego podłoża DMEM/F-12 w celu usunięcia zanieczyszczającej krwi.
  5. Umyj raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS), aby utrzymać żywotność tkanek i komórek.
  6. Umieść skórę do góry nogami (powięź powierzchowna na górze) na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę DMEM/F12.
  7. Za pomocą jednorazowego dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm należy wyciąć okrągłe kawałki skóry o pełnej grubości, upewniając się, że powięź powierzchowna jest nienaruszona z leżącym pod nią mięśniem panniculus carnosus, aż do naskórka, aby wytworzyć tkanki SCAD.
  8. Przygotuj i napełnij 200 μL kompletnego podłoża DMEM/F12 (bez czerwieni fenolowej) - pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM aminokwasy endogenne i 1x Penicylina/streptomycyna do pojedynczych dołków 96-dołkowej płytki.
  9. Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przenieś i całkowicie zanurz pojedynczą tkankę SCAD do góry nogami (powięź skierowana do góry) do dołków 96-dołkowej płytki.
  10. Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych utrzymywanego w standardowych warunkach (37 °C, 21% (v/v) tlenu, 5% (v/v) C02 i 95% wilgotności).

2. SCAD - Hodowla tkankowa

  1. Hodowla SCAD w inkubatorze przez okres do 5 dni.
  2. W 2. i 4. dniu hodowli zastąp pożywkę 200 μl świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM/F12, aby zapewnić ciągłe warunki żywotności komórek i tkanek. Wymieniaj związki do uzdatniania podczas każdej zmiany podłoża.
    UWAGA: Upewnij się, że w studzience pozostało 10 μl pożywki, aby chusteczki nie przywierały do studzienek.
  3. Przygotuj SCAD do następujących eksperymentów: obrazowanie na żywo (sekcja 3) oraz pobieranie tkanek i barwienie immunofluorescencyjne 2D/3D (sekcja 4).

3. Obrazowanie SCAD na żywo

  1. Przygotuj co najmniej 30 ml niskotopliwego roztworu agarozy o stężeniu 2%-3% (w/v) w PBS w szklanej butelce, podgrzewając go w kuchence mikrofalowej do wrzenia.
  2. Natychmiast przenieść butelkę i schłodzić płynny roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C.
  3. Przenieś tkankę SCAD z powięzią/blizną skierowaną do góry na środek szalki o średnicy 35 mm.
  4. Osadź SCAD w temperaturze pokojowej (RT), powoli przenosząc ciekłą agarozę o temperaturze 40 °C na szalkę o średnicy 35 mm za pomocą pipety Pasteura. Agaroza polimeryzuje w ciągu 2 minut.
  5. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM/F12 (bez wskaźnika czerwieni fenolowej).
  6. Pozyskiwanie zdjęć poklatkowych SCAD dnia 0 do 48 godzin za pomocą mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego wyposażonego w odpowiedni system inkubacji ustawiony na 37 °C, 21% (v/v) tlenu, 5% (v/v) C02 i wilgotność 95%.

4. Pobieranie tkanek i barwienie immunofluorescencyjne 2D/3D

  1. Umyj chusteczki w odpowiednich punktach czasowych, zastępując pożywkę sterylnym PBS.
  2. Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przenieś poszczególne SCAD do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl 2% paraformaldehydu, aby utrwalić tkanki przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Umyj tkanki trzykrotnie PBS i przystąp do barwienia immunofluorescencyjnego 2D/3D.
  4. Barwienie immunofluorescencyjne 3D
    1. Przepuszczalność tkanek przez inkubację w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl PBS uzupełnionego 0,2% żelatyny, 0,5% Triton-X100 i 0,01% tiomersalu (PBSGT) w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
    2. Przygotować odpowiednią ilość przeciwciał pierwszorzędowych zgodnie z instrukcjami producenta i inkubować tkanki SCAD w 150 μl roztworu PBSGT przez 24 godziny w temperaturze RT.
      UWAGA: Jeśli producent nie poda optymalnego stężenia przeciwciał dla fluorescencji immunologicznej, należy wcześniej przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał na tkankach kontrolnych przy użyciu różnych stężeń (np. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
    3. Delikatnie przemyć SCAD trzy razy PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe.
    4. Inkubować tkankę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor w 1:1000 w PBS przez noc w RT.
    5. Delikatnie myj tkankę przez 30 minut w PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.
    6. Przenieść tkankę na naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w celu obrazowania konfokalnego lub wielofotonowego.
      UWAGA: W przypadku korzystania z obiektywów zanurzonych w wodzie, należy osadzić SCAD w agarozie o niskiej temperaturze topnienia 2%, aby unieruchomić tkankę i zapobiec dryfowaniu podczas akwizycji obrazu
  5. Barwienie immunofluorescencyjne 2D
    1. Przenieś tkankę do krioformy i delikatnie wypełnij ją związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby całkowicie zanurzyć tkankę.
    2. Delikatnie wyreguluj orientację tkanki, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza, aby uzyskać przekrój lub przekrój pionowy.
    3. Umieść formę na suchym lodzie na 20-30 minut i inkubuj blok w temperaturze -80 °C przez noc.
    4. Ustawić temperaturę ostrza na -25 °C, a temperaturę bloku próbki na -17 °C. Przygotować kriosekcję 6 μm za pomocą kriostatu, przenieść skrawki na szkiełko adhezyjne i przechowywać szkiełka w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
    5. Przepłukać szkiełka trzykrotnie w PBS i inkubować szkiełka w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w/v w PBST (PBS uzupełniony 0,05% Tween) przez 1 godzinę.
    6. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego do 150 μl PGST i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C
      UWAGA: Jeżeli producent nie poda optymalnego stężenia przeciwciał dla fluorescencji immunologicznej, należy wcześniej przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał na odcinkach kontrolnych przy użyciu różnych stężeń (np. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
    7. Delikatnie przemyj skrawki trzykrotnie PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe.
    8. Inkubować tkankę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor w skali 1:1000 w PBS przez noc w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    9. Delikatnie myj tkankę przez 5 minut w PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.
    10. Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego zawierającego DAPI i wysusz szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej.
    11. Zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie SCAD-ów można podzielić na trzy zasadnicze etapy: pobieranie skóry od myszy P0-P1, generowanie pełnogrubych stempli biopsyjnych, a następnie hodowla pojedynczych scadów do 5 dni na 96-dołkowych płytkach. Jako odczyt, test ten może być dalej stosowany do analizy przestrzennych i czasowych aspektów bliznowacenia. Analiza przestrzenna wykorzystuje znakowanie immunologiczne tkanek 2D i 3D do badania lokalizacji przestrzennej składników komórkowych i macierzy w rozwijającej się tkance bliznowatej. Badania czasoprz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano już kilka modeli, aby zrozumieć powstawanie blizn po urazie. Chociaż poczyniono w tym zakresie wiele postępów, rzeczywiste mechanizmy nadal nie są jasne. W przeciwieństwie do poprzedniej techniki, model SCAD obejmuje wszystkie typy komórek i warstwy skóry, zachowując w ten sposób złożoność natywnej skóry18,19. Metodologia ta jest w stanie wygenerować podstawowe zestawy danych, które są ważne w zrozumieniu mechanizmów molekularnych napędzających powstaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim współautorom Jiang et al. 2020 za wkład w rozwój metodologii SCAD13. Dziękujemy dr. Steffenowi Dietzelowi i centralnemu ośrodkowi bioobrazowania na Uniwersytecie Ludwiga-Maximilansa za dostęp do systemu Multiphoton. Projekt Y.R. był wspierany przez Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), Europejski Komitet ds. Badań Naukowych Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) oraz Fundację LEO (LF-OC-21-000835).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% Tween 20, Niejonowy detergentBiorad Laboratories1610781
Albumina surowicy bydlęcej, fract zimnego etanoluSigmaA4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, bez czerwieni fenolowej-500 mLLIFE Technologies11039021
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190169
Epredia Cryostar NX70 CryostatThermo Preparaty
Epredia SuperFrost Plus FisherscientificJ1800AMNZSzkiełka adhezyjne
Surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, atestowana przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej-500 mlLIFE Technologies 
Fluoromount-G z technologiami DAPILife 004959 52Medium montażowe z DAPI
Kleszcze zakrzywione z drobnymi punktami z prowadnicąstal nierdzewna (pęseta)Długość 125 mmFisher Scientific12381369
Żelatyna ze skóry świniSigmaG2500-100G
GlutaMAX Suplement-100 mlLIFE Technologies35050038
HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej-500 mlLIFE Technologies14025092
Ibidi System inkubacji gazów do CO2 i O2Ibidi11922
System grzewczy Ibidi10915
Mikroskop pionowy Leica SP8 - wzbudzenie wielofotonowe 680– 1300 nmLeicaWyposażony w obiektyw do zanurzania w wodzie 25x (HC IRAPO L 25x/1.00  W) w połączeniu z przestrajalnym laserem (Spectra-Physics, InSight DS +  Pojedyncze)
Aminokwasy endogenneLIFE Technologies11140035
NuSieve GTG Agaroza, 25 g Biozym/ Lonza859081
OCT Matryca do zatapianiaCarlroth6478.1
Paraformaldehyd, 16% w/v AQ. 10 x10 mLVWR International43368.9M
Pen-StrepGibco15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mmStiefel270130
Proste ostre/Ostre nożyczki preparacyjne 11,4 cmFisher Scientific15654444
Tiomersal Bioxtra, 97%– Mikroskop pionowy 101%Sigma-AldrichT8784-1G
Zeiss Axioimager M2Zeiss
adhezyjne Scientific 10500064

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
  2. desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
  3. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
  4. Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11(2020).
  5. Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
  6. Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
  7. Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
  8. Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151(2015).
  9. Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356(2020).
  10. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  11. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  12. Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
  13. Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).
  14. Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
  15. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).
  16. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  17. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  18. Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  19. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Powstawanie bliznfibroblasty powi ziowemigracja fibroblast wkurczenie si tkankibarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia konfokalnagojenie ran

Powiązane artykuły