$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Protokół eksperymentalny otrzymał zgodę bioetyczną (nr 311 z 2022 roku) i został zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną Uniwersytetu Nauk Rolniczych i Medycyny Weterynaryjnej w Klużu-Napoce, zgodnie z prawem krajowym (Ustawa nr 43 z 2014 r.) i europejskim (Dyrektywa UE nr 63 z 2010 r.). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Protokół sekcji zwłok
UWAGA: Zaleca się, aby ten sam protokół sekcji zwłok był stosowany dla wszystkich prezentowanych gatunków, ze względu na łatwiejszy dostęp, do którego jest on wykonywany2,12. Poniższe kroki reprezentują sekcję zwłok przeprowadzoną u psa średniej wielkości. Dostosuj kroki podczas wykonywania sekcji zwłok na różnych obiektach.
- Zważ badany i połóż go na stole do sekcji zwłok po jego lewej stronie (Rysunek 1A). Przystąp do zewnętrznego badania pacjenta (poprzez oględziny i badanie palpacyjne skóry i błony śluzowej, zwracając uwagę na wszystkie zmiany w kolorze, konsystencji i objętości).
- Użyj noża (lub skalpela) i wykonaj nacięcie o długości 7 cm w prawej pachy (Rysunek 1A).
- Zlokalizuj skrzyżowanie koksofowo-obowe (Rysunek 1A,B). Otwórz kapsułkę nożem. Przeciąć więzadło głowy kości udowej (Rysunek 1B).
- Za pomocą noża przedłuż nacięcie skóry w pachowej części czaszki do spojenia żuchwy i doogonowo do krocza (Ryc. 1B).
- Usuń skórę skalpelem i odsłoń ścianę klatki piersiowej i brzucha od brzusznej linii środkowej do poziomu wyrostków poprzecznych kręgów (Ryc. 1B).
- Za pomocą skalpela i kleszczy utwórz płat przez ścianę brzucha, brzuszno-ogonowy do prawego łuku żebrowego. Otwórz jamę brzuszną nożyczkami - podążaj za ogonowym aspektem prawego podżebrza (Ryc. 1B).
- Przedłuż nacięcie doogonowo wzdłuż prawej okolicy przylędźwiowej, aż do zewnętrznego grzebienia biodrowego. Następnie przedłuż nacięcie aż do pojawienia się linii białej łonowego.
- Pokrótce zbadaj narządy jamy brzusznej in situ (zwracając uwagę na wszelkie zmiany w zmianach koloru, konsystencji, objętości i położenia narządów).
- Za pomocą skalpela i kleszczyków przebij membranę w najwyższym punkcie (Rysunek 1B).
- Dostać się do klatki piersiowej, usuwając prawą klatkę piersiową z dwoma podłużnymi odcinkami za pomocą kleszczy do cięcia kości. Przeciąć przymostkowy segment chrzęstny żeber. Następnie przekrój grzbietowy odcinek żeber, proksymalny do stawów żebrowo-żebrowych (Rysunek 1C).
- Zbadaj serce in situ (Rysunek 1C). Zwróć uwagę na rozmiar, położenie, kolor, połączenia z sąsiednimi tkankami, a po badaniu palpacyjnym wszelkie zmiany w konsystencji9.
UWAGA: Jeśli występuje zakrzepica lub wrodzona wada serca, serce musi zostać wypreparowane in situ (takie podejście pozwala na pełne badanie dużych naczyń).
- Za pomocą nożyczek zbadaj i otwórz jamę osierdzia z przekrojem podłużnym od podstawy do wierzchołka serca. Zbadaj jamę osierdzia i nasierdzie (zwracając uwagę na wszelkie zmiany w kolorze, konsystencji i objętości)12.
- Uwolnij serce nożyczkami, uzyskując poprzeczne odcinki aorty, pnia płucnego i obu żył głównych. Przekrój żyły głównej górnej co najmniej 1 cm powyżej wejścia do prawego przedsionka, aby zachować crista terminalis11,13.
- Zbadaj zewnętrzny kontur narządu, wygląd nasierdzia, wygląd mięśnia sercowego na podstawie przezroczystości nasierdzia oraz zewnętrzny wygląd dużych naczyń (Rycina 2A).
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, otwarcie i badanie osierdzia wykazuje pewne różnice między gatunkami. Badanie jamy osierdzia rozpoczyna się od zewnętrznej inspekcji i oceny poprzez przezroczystość osierdzia ogólnej zawartości osierdzia1,2. U kota lub psa osierdzie zazwyczaj zawiera około 0,25 ml/kg cienkiego, przezroczystego, przezroczystego do jasnożółtego płynu9. Jeśli występują jakiekolwiek patologiczne wysięki, należy je pobrać za pomocą sterylnej strzykawki lub probówki próżniowej.
2. Protokół sekcji
UWAGA: Do serca stosuje się kilka technik sekcji zwłok, z których każda ma kilka zalet. Dla tego protokołu wybrano dwie z najczęściej stosowanych technik: 1) "metodę dopływu-odpływu", która pozwala na lepsze badanie zastawek i wsierdzia i jest protokołem stosowanym dla większości gatunków2,11,12,16, oraz 2) technika "rozwarstwienia czterech komór"/"płaszczyzny echokardiograficznej", zwykle stosowana u kotów lub małych psów1,17.
- "Metoda dopływu-odpływu" w rozwarstwieniu serca2,11,12,16
- Umieść serce przedsionkiem skierowanym do góry (Rysunek 2A).
- Użyj nożyczek i bezzębnych kleszczy, aby szeroko przeciąć od żyły głównej ogona wzdłuż prawego przedsionka (Ryc. 2B). Kontynuuj cięcie do prawego uszu usznego, aby odsłonić crista terminalis/węzeł zatokowo-przedsionkowy (węzeł SA). Sprawdź zastawkę trójdzielną od strony grzbietowej.
- Wytnij odcinek od prawego przedsionka do połączenia prawej komory z przegrodą międzykomorową (Rysunek 2C). Wyświetl prawą zastawkę przedsionkowo-komorową.
- Przekrój ścianę wolną od prawej komory wzdłuż przegrody międzykomorowej. Kontynuuj sekcję aż do początku pnia płucnego (Rysunek 2C, D).
- Dokładnie zbadaj prawe zastawki przedsionkowo-komorowe, w tym struny ścięgniste i mięśnie brodawkowate (Rysunek 2D). Przetnij struny ścięgniste.
- Umieść kleszcze w pniu płucnym i przetnij tułów wzdłuż (Rysunek 2E). Zbadaj drogę odpływu płuc, pochodzenie pnia płucnego i zastawki półksiężycowate.
- Przeciąć lewe przedsionek od żył płucnych do końca lewej małżowiny usznej (Ryc. 2F). Sprawdź zastawkę dwupłatkową (mitralną) od strony grzbietowej.
- Umieść serce z przegrodą międzykomorową skierowaną w dół (Ryc. 2F). Wykonaj duże nacięcie w wolnej ścianie komory od podstawy komory do wierzchołka serca. Całkowicie wyświetl lewą zastawkę przedsionkowo-komorową.
- Przeciąć struny ścięgniste guzka lewej zastawki przedsionkowo-komorowej.
- Umieść kleszcze w drodze odpływu lewej komory i użyj jej jako wskazówki do otwarcia aorty (Rysunek 2G).
- Użyj roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć wszystkie skrzepy krwi. Po usunięciu wszystkich skrzepów krwi oceń i porównaj masę serca z masą ciała lub standardowymi tabelami masy serca (Tabela 1)11,13.
- Zważ serce.
- Jeśli punktem zainteresowania jest tylko węzeł SA, po badaniu lewej komory umieść całe serce w 10% neutralnie buforowanej formalinie (NBF) na 24 godziny i przyciąć prawy przedsionek, aby pobrać próbkę crista terminalis.
UWAGA: Dzięki tej technice można łatwo docenić lewą i prawą komorę. Stosunek grubości ściany lewej i prawej komory wynosi 3:1, z niewielkimi różnicami w zależności od gatunku i rasy; W przypadku serca płodu zwierzęcego stosunek ten wynosi 1:112.
3. Protokół pobierania próbek dla histologii16
- Za pomocą skalpela wykonaj dwa podłużne, równoległe nacięcia (w odległości około 5 mm od siebie) obejmujące prawy przedsionek, zastawkę trójdzielną i wolną ścianę prawej komory (Rysunek 2I)
- Wykonaj dwa równoległe nacięcia podłużne (w odległości około 5 mm od siebie) obejmujące lewy przedsionek, zastawkę mitralną, mięsień brodawkowaty grzbietowy i lewą komorę (Rysunek 2H).
- W grzbietowej górnej jednej trzeciej serca przekrój poprzecznie podstawę serca wzdłuż linii, obejmującej przegrodę międzykomorową, prawy przedsionek, aortę, zastawkę aortalną i zastawkę trójdzielną (Rysunek 2J).
- Wykonaj dwa równoległe cięcia wzdłużne obejmujące podstawę aorty i przegrodę międzykomorową (Rysunek 2J).
- Przytnij prawy przedsionek wokół crista terminalis i zapewnij kilka równoległych odcinków zorientowanych poprzecznie na osi podłużnej crista (około 3-4 mm od siebie), aby uzyskać sześć części węzła SA ( Rysunek 3, Rysunek 4I i Rysunek 5H).
- Pobrane tkanki należy przyciąć w kasetach histologicznych.
UWAGA: Zalecany protokół blokowania: krok 3.1.-blok histologiczny 1 (Rycina 6 pokazuje wynikowy slajd z tego bloku.), krok 3.2.-blok histologiczny 2 (Rysunek 7 pokazuje wynikowy slajd z tego bloku), krok 3.4.-blok histologiczny 3 (Rysunek 8 pokazuje wynikowy slajd z tego bloku), krok 3.5.-blok histologiczny 4 (Rysunek 9 pokazuje wynikowy slajd z tego bloku).
- Zanurz chusteczki w 10% NBF na co najmniej 48 godzin.
4. Pobieranie próbek tętnic wieńcowych3,10,14
- Użyj kleszczy i skalpela, aby wyciąć tętnice wieńcowe z rowka okołokanałowego serca (Rysunek 4K). Zamocuj tętnicę wieńcową na noc w 10% NBF.
- W razie potrzeby odpowiednio odwapnić w mieszaninie 1:1 8% kwasu mrówkowego i kwasu solnego.
- Wykonaj wiele cięć poprzecznych w odstępach co 3 mm. Umieść sekcje w kasecie, a następnie włóż kasetę w 10% NBF do momentu osadzenia.
UWAGA: Świnie mogą być używane jako model serca dla ludzi, zwłaszcza jeśli chodzi o chorobę niedokrwienną serca. W związku z tym zaleca się dodatkowe próbki i wycinki histologiczne tętnic wieńcowych3,10,14.
5. Technika preparacji serca w "czterech komorach"/"płaszczyźnie echokardiograficznej" class<="xref">1,17
UWAGA: Technika sekcji czterokomorowej polega na cięciu od podstawy do wierzchołka serca w celu uzyskania standardowego widoku1. Technikę "czterokomorową" najlepiej stosować do tkanek utrwalonych.
- Umieść całe serce w 10% NBF na co najmniej 48 godzin.
- Po unieruchomieniu serca w 10% NBF przez co najmniej 48 godzin (Ryc. 10A), umieść dwa bezzębne proste kleszcze preparacyjne, jeden przez jamę czaszki - prawy przedsionek - zastawkę trójdzielną - prawą komorę, a drugi przez żyłę płucną - lewy przedsionek - zastawkę mitralną - lewą komorę (Ryc. 10B).
- Wykorzystaj przestrzeń między ramionami kleszczy jako prowadnicę ostrza tnącego od podstawy do wierzchołka serca (Rysunek 10C). Zapewnić dodatkowy przekrój wzdłużny w odległości około 5 mm od przekroju opisanego w kroku 5.2. na segmencie serca, który obejmuje aortę.
- Z nacięciem poprzecznym całkowicie oddziel podstawę serca od wierzchołka. Umieść każdy segment tkanki w kasecie histologicznej.
UWAGA: Zalecany protokół blokowania: blok wierzchołkowo-histologiczny serca 5 (Rysunek 11A pokazuje wynikowy slajd z tego bloku), sercowy blok histologiczny podstawy 6 (Rysunek 11B pokazuje wynikowy slajd z tego bloku).
- Umieść kasety w 10% NBF do momentu osadzenia. Utrwal wszystkie próbki serca w 10% NBF (ponad 10 razy objętość tkanki), rutynowo przetwarzaj je w wosku parafinowym, sekcji o grubości 4 μm i zabarwiaj hematoksyliną i barwnikiem eozyny (barwienie H&E) zgodnie z wcześniej opisanym protokołem10.
UWAGA: W przypadku podejrzenia zapalenia mięśnia sercowego, "fragment świeżej tkanki serca powinien być przechowywany w sterylnych warunkach ze sterylnym materiałem chirurgicznym i sterylnym pojemnikiem na próbki do badań mikrobiologicznych i wirusowych"13.
6. Dokumentacja fotograficzna
UWAGA: Dokumentacja fotograficzna jest opcjonalnym krokiem w badaniu sekcji zwłok. Jednak fotografia i nagrania wideo są niezbędne, aby mieć "dokładną dokumentację normalnej i nieprawidłowej anatomii"3.
- Aby uzyskać prawidłową dokumentację fotograficzną, wykonaj zdjęcia cyfrowe podczas wykonywania "postępującej sekcji tkanek serca"13. Zapoznaj się z wytycznymi dotyczącymi dokumentacji fotograficznej i photograph15 ogólny widok przedni i tylny; kawałek serca; i wszelkie podejrzewane zmiany chorobowe.