Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63814

⸱

6 października 2022

 ,  , 
1Nanotechnology Engineering Program, Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering, COPPE, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 23D Biofabrication Training and Innovation Center, BioEdtech

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Streszczenie

Postępy w hodowli komórek 3D pozwoliły na opracowanie bardziej fizjologicznie istotnych modeli in vitro, takich jak sferoidy tkankowe. Komórki hodowane jako sferoidy mają bardziej realistyczne reakcje biologiczne, które przypominają środowisko in vivo. Ze względu na swoje zalety, sferoidy tkankowe reprezentują wyłaniający się trend w kierunku lepszych, bardziej wiarygodnych i bardziej predykcyjnych modeli badawczych o szerokim zakresie zastosowań biotechnologicznych. Jednak powtarzalne platformy, które mogą umożliwić produkcję sferoidów tkankowych na dużą skalę, stały się niezaspokojoną potrzebą w pełnym zbadaniu i zwiększeniu ich potencjału. W tym przypadku produkcja na dużą skalę jednorodnych sferoidów tkankowych jest raportowana przy użyciu taniej i efektywnej czasowo metodologii. Wydrukowane w 3D urządzenie przypominające stempel zostało opracowane w celu wygenerowania do 4,716 sferoid na płytkę 6-dołkową. Urządzenie wytwarzane jest metodą stereolitografii przy użyciu żywicy fotoutwardzalnej. Końcowe urządzenie składa się z cylindrycznych mikroszpilek o wysokości 1,3 mm i szerokości 650 μm. Takie podejście pozwala na szybkie generowanie jednorodnych sferoid i sferoid z kokulturą o jednolitym kształcie i wielkości oraz żywotności komórek na poziomie >95%. Co więcej, urządzenie przypominające stempel jest dostrajalne dla różnych rozmiarów płytek studzienkowych i szalek Petriego. Jest łatwy do sterylizacji i może być ponownie używany przez długi czas. Wydajna produkcja na dużą skalę jednorodnych sferoidów tkankowych jest niezbędna do wykorzystania ich translacji w wielu dziedzinach przemysłu, takich jak inżynieria tkankowa, opracowywanie leków, modelowanie chorób i medycyna spersonalizowana na żądanie.

Wprowadzenie

Sferoidy tkankowe to mikro-tkanki 3D utworzone przez zawiesiny komórek, które ulegają samoorganizacji bez użycia sił zewnętrznych1. Te sferoidy są szeroko stosowane w protokołach biofabrykacji ze względu na ich podobieństwo do kluczowych cech ludzkiego układu fizjologicznego2,3. Sferoidy tkankowe zapewniają bardziej podobny metabolizm, dynamikę cytoszkieletu, żywotność komórek oraz aktywność metaboliczną i wydzielania niż tradycyjna hodowla komórkowa jednowarstwowa1. Ze względu na ich zdolność do fuzji, mogą być również używane jako elementy budulcowe (np. protokoły biodruku) do tworzenia złożonych konstruktów inżynierii tkankowej o zwiększonym znaczeniu biologicznym4,5.

Ze względu na ich biologiczne znaczenie, sferoidy tkankowe były używane jako narzędzie biotechnologiczne dla protokołów obejmujących inżynierię tkankową, rozwój leków, modelowanie chorób i ocenę nanotoksykologiczną, redukując czas, koszty przestrzeni i testy na zwierzętach3,6,7,8. Niemniej jednak, aby w pełni zbadać i wykorzystać potencjał sferoid tkankowych, bardzo potrzebne są niezawodne i powtarzalne metody mające na celu ich produkcję na dużą skalę, które pozostają ciągłym wyzwaniem.

Kilka metodologii tworzy sferoidy, takie jak wiszące krople, powlekane studnie denne w kształcie litery U, mikrofluidyka i użycie matrycy polimerowej9,10. Chociaż metodologie te utorowały drogę na rynku produkcji sferoidów, nadal są złożone, czasochłonne, pracochłonne lub drogie10.

Obecny protokół informuje o produkcji na dużą skalę sferoidów jednorodnych tkanek przy użyciu taniej i efektywnej czasowo metodologii. Opracowaliśmy wydrukowane w 3D urządzenie przypominające stempel, aby wygenerować do 4,716 sferoid na płytkę 6-dołkową. Co więcej, urządzenie przypominające stempel można dostosować do wytwarzania większej liczby sferoid na studzienkę, co jest odpowiednie dla różnych płytek do hodowli komórkowych. Jest łatwy do sterylizacji i może być ponownie używany przez długi czas. Wydajna produkcja sferoid tkankowych o wysokiej wydajności na dużą skalę jest niezbędna do zastosowania ich w klinikach, przyczyniając się do rozwoju wielu dziedzin przemysłu, takich jak inżynieria tkankowa, opracowywanie leków, modelowanie chorób i medycyna spersonalizowana na żądanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Linia komórkowa L929, fibroblasty myszy, została wykorzystana w niniejszym badaniu. Przypominające pieczęć biourządzenie wydrukowane w 3D zostało uzyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Dobra praktyka hodowli komórkowych i sterylne techniki były przestrzegane przez cały protokół. Sfabrykowane urządzenie zostało wysterylizowane poprzez przetarcie go 70% alkoholem i wystawienie na działanie światła UV przez 15 minut. Pożywki i roztwory do hodowli komórkowych podgrzano do temperatury 37 °C przed kontaktem z komórkami lub sferoidami tkankowymi. Schematyczne przedstawienie protokołu jest pokazane w Rysunek 1.

1. Przygotowanie nieprzylegających form z urządzenia przypominającego stempel

  1. Przygotuj 2% (w/v) żel agarozowy, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Rozcieńczyć proszek agarozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) i homogenizować powstałą zawiesinę ruchami okrężnymi.
      UWAGA: Ten roztwór można umieścić w szklanej butelce. Na tym etapie roztwór agarozy nie będzie półprzezroczysty.
    2. Umieść szklaną butelkę w kuchence mikrofalowej i ustaw ją na 30 sekund. Co 5 s zatrzymaj kuchenkę mikrofalową, wyjmij szklaną butelkę i ręcznie homogenizuj roztwór okrężnymi ruchami. Proces ogrzewania należy przeprowadzać, aż roztwór osiągnie stan płynno-przezroczysty.
      UWAGA: Płyta grzejna może być również używana jako alternatywa dla kuchenki mikrofalowej. Po procesie podgrzewania roztwór musi być półprzezroczysty/przezroczysty.
    3. Dodaj 1 ml roztworu agarozy do każdego dołka na 6-dołkowej płytce przewidzianej do eksperymentu.
    4. Odczekaj ~15 min lub do momentu, aż agaroza zastygnie.
      UWAGA: W celu skrócenia czasu krzepnięcia można użyć płyty chłodzącej.
    5. Dodać 1-2 ml roztworu agarozy i delikatnie włożyć urządzenie nad płynną agarozę.
      UWAGA: Umieszczenie urządzenia należy wykonać ostrożnie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza na styku agarozy-urządzenia.
    6. Poczekaj ~30 min lub do momentu, aż agaroza zastygnie.
      UWAGA: W celu skrócenia czasu krzepnięcia można użyć płyty chłodzącej.
    7. Delikatnie wyjmij urządzenie z agarozy.
      UWAGA: Usunięcie ma kluczowe znaczenie. Należy go ostrożnie usunąć, aby zachować nienaruszone cechy agarozy; W przeciwnym razie agaroza może zostać zakłócona.
    8. Dodaj 2 ml pożywki DMEM, odczekaj 10 minut, wyrzuć pożywkę i zastąp ją świeżym DMEM. Powtórz to trzy razy, aby prawidłowo umyć studnię.
    9. Dodać 2 ml DMEM i umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 80%) aż do wysiewu komórek (Rysunek 2A-F, Dodatkowe wideo 1).

2. Generowanie sferoidów tkankowych

UWAGA: Różne linie komórkowe mają różne właściwości adhezyjne. W związku z tym, stosując tę metodologię, niektóre typy komórek mogą nie tworzyć prawidłowo sferoid tkankowych.

  1. Hoduj komórki zgodnie z tradycyjną hodowlą jednowarstwową (tj. hoduj komórki w kolbach do hodowli komórkowych przy użyciu DMEM z niską glukozą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) (patrz tabela materiałów). Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i monitoruj, aż osiągną 80% konfluencji.
  2. Po osiągnięciu pożądanego zbiegu, umyj komórki 1x PBS.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie 5 ml w przypadku kolb 2 cm, 10 ml w przypadku kolb 75 cm2 i 15 ml w przypadku kolb 2 150 cm.
  3. Dodać enzym dysocjacyjny i inkubować komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotności 80%.
    UWAGA: W niniejszym badaniu użyto 0,125% trypsyny z 0,78 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) jako enzymu dysocjacji (patrz tabela materiałów).
  4. Obserwuj oderwanie komórek od kolb do hodowli komórkowych i dodaj pożywkę wzrostową uzupełnioną FBS w celu zneutralizowania enzymu dysocjacji komórek.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano DMEM z niskim poziomem glukozy (patrz Tabela materiałów) uzupełniony 10% FBS.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie policz komórki ręcznie.
  6. Weź 50 x 105 komórek na probówkę i dodaj 5 ml 1x PBS.
    UWAGA: Liczba wysianych komórek wpływa na ostateczną średnicę sferoidy tkanki. W związku z tym można zwiększyć liczbę komórek, aby wygenerować sferoidy tkankowe o większych średnicach.
  7. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usunąć supernatant za pomocą pipety, dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych i homogenizować roztwór.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano kompletną pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełnioną 10% FBS, 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  9. Usuń 2 ml pożywki z płytki 6-dołkowej (krok 1.1.9) i dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do środka formy agarozowej utworzonej przez biourządzenie wydrukowane w 3D (krok 1.1.7). Poczekaj, aż komórki osadzą się w mikroresekcjach (~20-30 min) i ostrożnie dodaj 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do studzienki.
    UWAGA: Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność. Zaleca się delikatne dodanie pożywki, umieszczenie końcówki pipety blisko ścianki studzienki i dozowanie w małych ilościach.
  10. Umieść 6-dołkową płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 80%) w celu utworzenia sferoid tkankowych (około 24-48 godzin, w zależności od typu komórki) (Rysunek 3).
    UWAGA: Różne typy komórek (np. komórki rakowe, komórki pierwotne) mają różną kinetykę samoorganizacji11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowanie jednorodnych mikroresekcji przy użyciu urządzenia przypominającego stempel wydrukowanego w technologii 3D
Urządzenie przypominające stempel wydrukowane w technologii 3D zostało z sukcesem wykonane metodą stereolitografii12 z wykorzystaniem żywicy światłoutwardzalnej (Rycina 2A). Końcowe urządzenie składało się z cylindrycznych mikropinów o wysokości 1,3 mm i szerokości 650 µm (Rycina 2A). Zastosowanie go j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje prostą, szybką i niedrogą metodę produkcji sferoid tkankowych na dużą skalę. Jako forma główna użyto urządzenia wydrukowanego w 3D przypominającego stempel, które wygenerowało do 4,716 sferoid na płytkę 6-dołkową. Wykazano, że komórki hodowane jako sferoidy mają bardziej realistyczne reakcje biologiczne, które bardzo przypominają środowisko in vivo 1. Ze względu na swoje zalety, sferoidy tkankowe reprezentują wyłaniający się trend w kierunku lepszych, bardziej w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wydrukowane w 3D urządzenia przypominające stemple zostały zaoferowane przez startup Bioedtech, w którym Janaína Dernovsek jest współzałożycielką i dyrektorem ds. innowacji. Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Wspierania Badań Stanu Rio de Janeiro (FAPERJ, Brazylia), Koordynację na rzecz Doskonalenia Kadry Szkolnictwa Wyższego (CAPES, Brazylia) oraz Brazylijską Narodową Radę Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq, Brazylia). Dziękujemy firmie Bioedtech za dostarczenie urządzeń przypominających stemple użytych w tym badaniu oraz profesorowi Bartirze Bergmannowi z Laboratorium Immunofarmakologii za korzystanie z urządzeń do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 6-dołkowaMerckCLS3516
AgarozaPromegaV3121
Biodevice biologicznego Bioedtech
ThermoFisher 
51029701 WirówkaThermoFisher 
Probówki wirówkowe Corning 50 ml MerckCLS430829-500EA
Kolby do hodowli komórkowych Corning Powierzchnia 75 cm2MerckCLS430641
Draft Resin FormLabsFLDRBL01
Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - niska glukozaMerckD6046
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ThermoFisher 
16000044 Form 2Inkubator FormLabs
ThermoFisher 
Linie komórkowe L929Umieszczone w laboratorium 
Penicylina i Streptomycyna (PS)ThermoFisher 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Merck806552
Trypsyna z EDTAMerckT3924
Szafa bezpieczeństwa 750040315103378215140122

Bibliografia

  1. Laschke, M., Menger, M. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  2. Mekhileri, N., et al. Automated 3D bioassembly of micro-tissues for biofabrication of hybrid tissue engineered constructs. Biofabrication. 10 (2), 024103(2018).
  3. Itoh, M., et al. Scaffold-free tubular tissues created by a bio-3D printer undergo remodeling and endothelialization when implanted in rat aortae. PLoS One. 10 (12), 0145971(2015).
  4. Kronemberger, G., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  5. Mironov, V., et al. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  6. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  7. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  8. Charelli, L., et al. Biologically produced silver chloride nanoparticles from B. megaterium modulate interleukin secretion by human adipose stem cell spheroids. Cytotechnology. 70 (6), 1655-1669 (2018).
  9. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877(2017).
  10. Achilli, T., Meyer, J., Morgan, J. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opinion on Biological Therapy. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  11. Rolver, M., Elingaard-Larsen, L., Pedersen, S. Assessing cell viability and death in 3D spheroid cultures of cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (148), e59714(2019).
  12. Quan, H., et al. Photo-curing 3D printing technique and its challenges. Bioactive Materials. 5 (1), 110-115 (2020).
  13. Rodriguez-Salvador, M., Perez-Benitez, B., Padilla-Aguirre, K. Discovering the latest scientific pathways on tissue spheroids: Opportunities to innovate. International Journal of Bioprinting. 7 (1), 331(2021).
  14. Baptista, L., et al. Adult stem cells spheroids to optimize cell colonization in scaffolds for cartilage and bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1285(2018).
  15. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  16. vander Valk, J. Fetal bovine serum (FBS): Past - present - future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  17. vander Valk, J., Brunner, D., et al. Optimization of chemically defined cell culture media - Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicology in Vitro. 24 (4), 1053-1063 (2010).
  18. Smyrek, I., et al. microtubules and FAK dominate different spheroid formation phases and important elements of tissue integrity. Biology Open. 8 (1), 037051(2018).
  19. McMillen, P., Holley, S. Integration of cell-cell and cell-ECM adhesion in vertebrate morphogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 36, 48-53 (2015).
  20. Tung, Y., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  21. Guo, X., Li, S., Ji, Q., Lian, R., Chen, J. Enhanced viability and neural differential potential in poor post-thaw hADSCs by agarose multi-well dishes and spheroid culture. Human Cell. 28 (4), 175-189 (2015).
  22. Andréa Dernowsek, J., Rezende, R., Lopes daSilva, J. The role of information technology in the future of 3D biofabrication. Journal of 3D Printing in Medicine. 1 (1), 63-74 (2017).
  23. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  24. Skardal, A., et al. Multi-tissue interactions in an integrated three-tissue organ-on-a-chip platform. Scientific Reports. 7, 8837(2017).
  25. Armoiry, X., et al. Autologous chondrocyte implantation with chondrosphere for treating articular cartilage defects in the knee: An evidence review group perspective of a NICE single technology appraisal. PharmacoEconomics. 37 (7), 879-886 (2018).
  26. Nakamura, A., et al. Bio-3D printing iPSC-derived human chondrocytes for articular cartilage regeneration. Biofabrication. 13 (4), 044103(2021).
  27. Mesquita, C., Charelli, L., Baptista, L., Naveira-Cotta, C., Balbino, T. Continuous-mode encapsulation of human stem cell spheroids using droplet-based glass-capillary microfluidic device for 3D bioprinting technology. Biochemical Engineering Journal. 174, 108122(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa hodowla komórekwielkoskalowa produkcja sferoidówurządzenie drukowane w 3Dmetoda stereolitografiiforma agarozowawysiew komórekinżynieria tkankowaopracowywanie lekówmodelowanie chorób
Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.