Artykuł metodologiczny

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

DOI:

10.3791/63819

⸱

10 maja 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieci mikrotubul są wykorzystywane w komórkach do wykonywania szerokiego zakresu zadań, począwszy od działania jako ścieżki transportu pęcherzyków, a skończywszy na pracy jako wyspecjalizowane układy podczas mitozy w celu regulacji segregacji chromosomów. Białka, które oddziałują z mikrotubulami, obejmują silniki, takie jak kinezyny i dyneina, które mogą generować aktywne siły i ruch kierunkowy, a także białka niemotoryczne, które sieciują włókna w sieci wyższego rzędu lub regulują dynamikę włókien. Do tej pory badania biofizyczne białek związanych z mikrotubulami w przeważającej mierze koncentrowały się na roli pojedynczych białek motorycznych potrzebnych do transportu pęcherzyków i poczyniono znaczne postępy w wyjaśnianiu właściwości generujących siły i mechanochemicznej regulacji kinezyn i dynein. Jednak w przypadku procesów, w których mikrotubule działają zarówno jako ładunek, jak i tor, na przykład podczas przesuwania się filamentu w wrzecionie mitotycznym, znacznie mniej wiadomo na temat biofizycznej regulacji zespołów zaangażowanych w sieciowanie białek. W tym miejscu szczegółowo opisujemy naszą metodologię bezpośredniego sondowania generowania siły i odpowiedzi w usieciowanych sieciach minimalnych mikrotubul odtworzonych z oczyszczonych mikrotubul i białek mitotycznych. Pary mikrotubul są sieciowane przez białka będące przedmiotem zainteresowania, jedna mikrotubula jest unieruchomiona na szkiełku nakrywkowym mikroskopu, a druga mikrotubula jest manipulowana przez pułapkę optyczną. Jednoczesna mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem pozwala na wielokanałową wizualizację wszystkich elementów tej sieci mikrotubul, gdy włókna rozsuwają się w celu wytworzenia siły. Pokazujemy również, w jaki sposób techniki te można wykorzystać do badania sił pchających wywieranych przez zespoły kinezyny-5 oraz jak powstają siły hamowania lepkiego między przesuwającymi się parami mikrotubul usieciowanych przez mitotyczny MAP PRC1. Testy te dostarczają informacji na temat mechanizmów montażu i funkcji wrzeciona i mogą być szerzej przystosowane do badania mechaniki gęstej sieci mikrotubul w różnych kontekstach, takich jak aksony i dendryty neuronów oraz polarne komórki nabłonkowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki wykorzystują sieci mikrotubul do wykonywania szerokiej gamy zadań mechanicznych, począwszy od transportu pęcherzyków1,2,3 do segregacji chromosomów podczas mitozy4,5,6. Wiele białek, które oddziałują z mikrotubulami, takich jak molekularne białka motoryczne kinezyna i dyneina, generuje siły i jest regulowanych przez obciążenia mechaniczne. Aby lepiej zrozumieć, jak funkcjonują te krytyczne cząsteczki, naukowcy zastosowali metody biofizyczne pojedynczych cząsteczek, takie jak pułapkowanie optyczne i mikroskopia TIRF, do bezpośredniego monitorowania krytycznych parametrów, takich jak szybkość kroku bez obciążenia, procesywność i zależności między siłą a prędkością dla poszczególnych białek. Najczęściej stosowaną geometrią eksperymentalną było dołączanie białek motorycznych bezpośrednio do kulek pułapkowych, których sferyczna geometria i rozmiar naśladują pęcherzyki poddawane transportowi napędzanemu silnikiem. Liczne kinezyny, w tym kinesin-17,8,9, kinesin-210,11,12, kinesin-313,14,15,16 kinesin-517,18, kinesin-819,20, a także dynein i kompleksy dyneinowe21,22,23,24,25, zostały zbadane tymi metodami.

Jednak w wielu procesach komórkowych białka motoryczne i niemotoryczne wykorzystują mikrotubule zarówno jako tor, jak i ładunek26,27. Co więcej, w tych scenariuszach, w których włókna mikrotubul są sieciowane w wiązki wyższego rzędu, białka te funkcjonują jako zespoły, a nie pojedyncze jednostki. Na przykład w dzielących się komórkach somatycznych gęste sieci włókien samoorganizują się, tworząc aparat wrzeciona mitotycznego28,29,30. Międzybiegunowa sieć mikrotubul wrzeciona jest bardzo dynamiczna i jest w dużej mierze ułożona z końcami ujemnymi skierowanymi w stronę biegunów wrzeciona i końcami dodatnimi zachodzącymi na siebie w pobliżu równika wrzeciona. Filamenty we wrzecionie są sieciowane przez białka motoryczne, takie jak kinesin-531,32,33, kinesin-1234,35,36, and kinesin-1437,38,39, lub białka niemotoryczne, takie jak PRC140,41,42,43 lub NuMA44,45,46. Często poruszają się lub doświadczają naprężeń mechanicznych podczas procesów takich jak przepływ w kierunku bieguna lub podczas koordynowania centrowania chromosomów podczas metafazy lub segregacji chromosomów podczas anafazy47,48,49,50,51,52. Integralność aparatu wrzeciona w skali mikronowej poprzez mitozę opiera się zatem na starannie regulowanej równowadze sił pchających i ciągnących generowanych i podtrzymywanych przez tę sieć oddziałujących ze sobą włókien. Jednak narzędzia potrzebne do zbadania tej mechanicznej regulacji i wyjaśnienia, w jaki sposób zespoły białkowe współpracują ze sobą, aby koordynować ruchy mikrotubul i wytwarzać siły potrzebne do prawidłowego montażu wrzeciona, zostały opracowane dopiero niedawno, a my dopiero zaczynamy rozumieć zasady biofizyczne, które definiują dynamiczne sieci mikrotubul.

Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie kroków wymaganych do odtworzenia usieciowanych par mikrotubul in vitro, unieruchomienia tych wiązek w komorze mikroskopowej, która pozwala na jednoczesną wizualizację fluorescencyjną zarówno mikrotubul, jak i białek sieciujących oraz pomiar siły w nanoskali, oraz solidne przetwarzanie tych danych. Szczegółowo opisujemy kroki potrzebne do stabilnej polimeryzacji mikrotubul znakowanych fluorescencją, przygotowania szkiełek nakrywkowych mikroskopu do mocowania, przygotowania kulek polistyrenowych do eksperymentów z pułapką optyczną oraz montażu usieciowanych sieci włókien, które zachowują swoją funkcjonalność in vivo, umożliwiając jednocześnie bezpośrednią manipulację biofizyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mikrotubul

UWAGA: W przypadku stosowania białek sieciujących znakowanych GFP, znakowanie mikrotubul kolorem czerwonym (np. rodamina) i dalekim czerwonym (np. biotynylowany HiLyte647, określany w dalszej części tekstu jako biotynylowany far red) działa dobrze. Minimalny przesłuch między wszystkimi trzema kanałami można osiągnąć podczas obrazowania dzięki zastosowaniu wysokiej jakości czteropasmowego filtra fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF).

  1. Przygotowanie zapasów nasion mikrotubul GMPCPP
    1. Zawiesić 1 mg nieznakowanej liofilizowanej tubuliny w 84 μl lodowatego 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), z dodaniem DTT do końcowego stężenia 1 mM tuż przed użyciem. Zawiesić 60 μg liofilizowanej tubuliny znakowanej fluoroforem w 6 μl zimnego 1x BRB80 z 1 mM DTT. Zawiesić 60 μg liofilizowanej tubuliny znakowanej biotyną w 6 μl zimnej 1x BRB80 z 1 mM DTT.
    2. Aby przygotować niebiotynylowany bulinowy wywar siewny tubuliny znakowany rodaminą o stosunku znakowania 1:10, dodaj 84 μl nieznakowanej tubuliny, 6 μl tubuliny znakowanej fluoroforem i 10 μl 10 mM roztworu podstawowego GMPCPP do probówki o pojemności 0,5 ml. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując i trzymać na lodzie.
      UWAGA: Polimeryzacja GMPCPP jest preferowana w tych testach, ponieważ mikrotubule są bardziej stabilne i podatne na bezpośrednią manipulację za pomocą pułapki optycznej niż w przypadku polimeryzacji GTP lub pominięcia taksolu.
    3. Aby przygotować biotynylowany, znakowany na czerwono materiał siewny tubuliny o stosunku znakowania fluorescencyjnego 1:10, dodaj 80 μl nieznakowanej tubuliny, 6 μl tubuliny znakowanej fluoroforem, 4 μl tubuliny znakowanej biotyną i 10 μl 10 ml roztworu podstawowego GMPCPP o proporcji 10 ml do probówki o pojemności 0,5 ml. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując i trzymaj na lodzie. Inkubować materiał siewny na lodzie przez 5 minut.
    4. Przenieść roztwór tubuliny do probówki poliwęglanowej odpowiedniej do wirowania z dużą prędkością. Odwirować materiał siewny przy ~350 000 x g przez 5 minut w temperaturze 2 °C, aby zapobiec polimeryzacji mikrotubul i odzyskać supernatant do porcjowania. Ostateczne szacowane stężenie tubuliny na tym etapie wynosi ~50 μM.
    5. Używając probówek PCR o pojemności 0,2 ml, przygotuj 2 μl porcji materiału siewnego i błyskawicznie zamroź ciekłym azotem. Podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Polimeryzacja mikrotubul
    1. Przygotuj 500 μl 1x BRB80 i umieść na lodzie. Umieścić po jednej porcji nasion rodaminy o biotynylowanej dalekiej czerwieni i niebiotynylowanej na lodzie do rozmrożenia.
    2. Inkubować zapasy nasion na lodzie przez 5 minut. Pod koniec okresu inkubacji natychmiast dodać 26 μL 1x BRB80 do każdej probówki. Jeśli pożądane są dłuższe mikrotubule, należy zwiększyć objętość BRB80 o 5-10 μl, natomiast w przypadku krótszych mikrotubul zmniejszyć objętość polimeryzacji o 5 μl.
    3. Inkubować materiał siewny mikrotubul przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Połączyć 298,5 μl temperatury pokojowej 1x BRB80 i 1,5 μl 4 mM roztworu podstawowego taksolu, aby uzyskać 20 μM roztwór taksolu. Przygotuj 300 μl 1x BRB80 i utrzymuj obie probówki w temperaturze pokojowej.
    4. Podgrzać odpowiedni wirnik wysokoobrotowy do temperatury 30 °C. Można to zrobić w ultrawirówce stołowej ustawionej na 30 °C. Wyjmij mikrotubule z łaźni wodnej i trzymaj w temperaturze pokojowej na blacie przez 10-15 minut.
  3. Klarowanie mikrotubul
    1. Dodać 100 μl 1x BRB80 o temperaturze pokojowej do roztworu wzrostu mikrotubul i wymieszać, przesuwając probówkę ~10 razy lub delikatnie pipetując. Przenieść roztwór do wzrostu mikrotubul do probówki wirówkowej z poliwęglanu.
    2. Zaznacz jedną stronę rurki poliwęglanowej, która będzie skierowana na zewnątrz w stosunku do obrotu wirówki. Pomoże to w zlokalizowaniu granulki mikrotubul, która będzie ledwo widoczna ze względu na małą objętość materiału.
    3. Odwirować roztwór mikrotubul o stężeniu ~350 000 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C. Po odwirowaniu sprawdź, czy w probówce zawierającej mikrotubule nie ma osadu. Ostrożnie usuń wszystkie oprócz ostatnich kilku mikrolitrów płynu, nie naruszając osadu. Jeśli granulka nie jest wyraźnie widoczna, należy użyć oznaczenia wykonanego jako wskazówki, aby uniknąć naruszenia obszaru, w którym znajduje się granulka.
    4. Natychmiast dodać 100 μL 1x BRB80 + 20 μM taksolu do probówki mikrotubul. Można go dodać bezpośrednio do granulki; Przerwanie osadu na tym etapie nie ma znaczącego wpływu na proces klarowania.
    5. Ponownie odwirować mikrotubule przy ~ 350 000 x g przez 10 minut, uważając, aby zaznaczona część probówki była ponownie zorientowana na zewnątrz w stosunku do obrotu wirówki.
    6. Usunąć wszystkie oprócz kilku mikrolitrów roztworu, jak poprzednio, ponownie uważając, aby nie zakłócić działania granulki mikrotubul. Powtórz kroki 1.3.4.-1.3.5. a następnie ponownie zawiesić osad mikrotubuli w 20-50 μL 1x BRB80 + 20 μM taksolu.
    7. Zawiesić ponownie, pipetując większość objętości zawiesiny i delikatnie wyrzucając ją bezpośrednio na granulkę, powtarzając 20-30 razy lub do momentu, gdy osadka zostanie całkowicie zawieszona. Należy to robić ostrożnie, aby nie ścinać mikrotubul przez zbyt energiczne pipetowanie. Przecięcie końcówki pipety w celu zwiększenia rozmiaru otworu może być również pomocne w zmniejszeniu ścinania mikrotubul.
    8. Przechowuj mikrotubule w temperaturze pokojowej, owijając probówkę folią, aby osłonić fluorofory przed światłem i trzymając na blacie. Mikrotubule są na ogół użyteczne przez 2-3 dni po klarowaniu.
  4. Ocena mikrotubul za pomocą mikroskopii
    1. Przygotować rozcieńczenie 1:10 oczyszczonego roztworu mikrotubul, mieszając 1 μl mikrotubul i 9 μl temperatury pokojowej 1x BRB80. Natychmiast zobrazuj ten roztwór, pipetując 10 μl na szkiełko mikroskopowe, a następnie umieszczając szkiełko nakrywkowe na kropli, aby utworzyć kabaczek.
    2. Upewnij się, że mikrotubule o długości od 8 do 25 μm przy dużej gęstości (kilkaset na pełne pole widzenia ułożone warstwami w gęstej siatce) są widoczne podczas wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i 100-krotnego obiektywu skupionego na powierzchni szkiełka nakrywkowego w kontakcie z rozcieńczeniem mikrotubul.

2. Przygotowanie pasywowanych szkiełek nakrywkowych

  1. Mycie szkiełek nakrywkowych
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm w niereaktywnych plastikowych stojakach, a następnie umieść każdy ruszt w zlewce o pojemności 100 ml. Umieść po jednym szkiełku nakrywkowym na szczelinę w stojakach, ponieważ konieczne jest czyszczenie szkiełek nakrywkowych po obu stronach.
    2. Sonikacja za pomocą sonikatora kąpielowego przez 5 minut, przy użyciu 50 ml następujących roztworów w kolejności podanej dla każdego cyklu sonikacji: (1) woda dejonizowana (o rezystywności 18,3 MΩ-cm), (2) 2% roztwór Micro-90, (3) woda dejonizowana, (4) świeżo przygotowana 0,1 M KOH, (5) woda dejonizowana (Rysunek 1A). Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie pokryte płynem. Pomiędzy cyklami sonikacji, opłucz każdy stojak szkiełek nakrywkowych w wodzie dejonizowanej za pomocą pęsety, aby zanurzyć stojak w górę iw dół 10-20 razy w wodzie dejonizowanej, wymień wodę i powtórz proces płukania 2 razy.
    3. Opłucz szkiełka nakrywkowe 3x w wodzie, a następnie napełnij zlewki 100% etanolem i włóż stojaki z powrotem do zlewek. Przenieś zlewki do dygestorium i rozłóż tyle chusteczek higienicznych, aby zrobić miejsce na wszystkie stojaki na szkiełka nakrywkowe. Następnie zdejmij stojaki pęsetą i połóż na chusteczkach chusteczki.
    4. Używając strumienia suchego azotu, zdmuchnij etanol z szkiełek nakrywkowych i ich stojaków, aż wyschną. Pozbądź się pozostałego etanolu ze zlewek i podobnie wysusz je za pomocą strumienia suchego azotu gazowego (Rysunek 1A).
  2. Funkcjonalizacja powierzchni aminosilu na szkiełkach nakrywkowych
    1. Przygotować roztwór odczynnika (3-aminopropylo)tietyetoksysilanu (APTES), dodając 40 ml acetonu i 400 μl odczynnika APTES do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, szczelnie zamykając i mieszając przez odwrócenie 10x.
    2. Przenieść jeden stojak szkiełek nakrywkowych do odpowiedniej suchej zlewki, a następnie całkowicie zanurzyć w roztworze APTES. Inkubuj przez 5 minut (Rysunek 1A). Przenieść stojak poddany działaniu APTES do nowej suchej zlewki i przenieść nowy stojak do APTES, aby inkubować przez 5 m.
    3. Opłucz uzdatniony stojak wodą dejonizowaną, zanurzając ruszt 10-20 razy, jak opisano w kroku 2.1.2., wymieniając wodę 5 razy. Powtarzaj, aż wszystkie szkiełka nakrywkowe zostaną poddane obróbce i umyte.
  3. PEGylacja powierzchni aminosilanu
    1. Przygotuj dwa roztwory PEG, jeden o objętości ~100 μl z 25% w/v PEG, a drugi o zawartości ~10 μl z 10% w/v biotyny-PEG, oba zawieszone w świeżo przygotowanym 0,1 M NaHCO3, wystarczającym do pokrycia 24 szkiełek nakrywkowych. Odwirować 25% roztwór PEG o stężeniu 3,000 x g przez 20 s po dodaniu 0,1 M NaHCO3 w celu całkowitego rozpuszczenia PEG; Roztwór może pozostać mętny. Wymieszaj biotynę-PEG przez delikatne pipetowanie (Rysunek 1B).
    2. Przygotować mieszaninę roztworów PEG i biotyny-PEG o objętości 33,3 razy większej niż PEG na 1 objętość biotyny-PEG (np. 100 μl roztworu PEG i 3 μl roztworu biotyny-PEG).
    3. W dygestoriach rozłóż kilka sterylnych i niestrzępiących się chusteczek. Przenieś stojaki na szkiełka nakrywkowe na chusteczki i wysusz je suchym strumieniem azotu, tak jak poprzednio. Na kilku nowych i suchych chusteczkach ułóż teraz całkowicie wysuszone szkiełka nakrywkowe ułożone parami i oznacz każde z nich w prawym dolnym rogu asymetrycznym symbolem, takim jak "b". Oznaczenie to będzie znajdować się naprzeciwko powierzchni próbki szkiełka nakrywkowego i nie będzie kolidować z eksperymentem (Rysunek 1B).
    4. Odwróć po jednym szkiełku nakrywkowym w każdej parze za pomocą pęsety. Na każdym odwróconym szkiełku nakrywkowym umieść 6 μl mieszaniny PEG/biotyny-PEG i umieść drugie szkiełko nakrywkowe na wierzchu tak, aby obie etykiety "b" były skierowane na zewnątrz.
    5. Wyrównaj krawędzie szkiełka nakrywkowego i umieść w wilgotnej i hermetycznej komorze, aby zapobiec wysuszeniu. Szkiełka nakrywkowe inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
    6. Po inkubacji wyjmij szkiełka nakrywkowe z komory wilgotnościowej, ostrożnie oddziel pary szkiełek nakrywkowych i umieść je z powrotem w stojakach. Umyj każdy kosz w wodzie dejonizowanej tak jak poprzednio, zanurzając ruszty za pomocą pęsety 10-20x i wymieniając wodę w sumie 5x.
    7. Umieść wszystkie PEGylowane boki szkiełek nakrywkowych skierowane w tym samym kierunku, tak aby żadne dwie PEGylowane powierzchnie szkiełek nakrywkowych nie były zwrócone do siebie. Powierzchnia pokryta PEGylacją będzie bardzo lepka, dopóki całkowicie nie wyschnie, więc należy zachować szczególną ostrożność, aby szkiełka nakrywkowe się nie stykały. Wysuszyć każdy stojak i szkiełka nakrywkowe tak jak poprzednio, używając suchego strumienia azotu (Rysunek 1B).
    8. Po całkowitym wysuszeniu szkiełek nakrywkowych i ich stojaków należy przechowywać w eksykatorze próżniowym, aby zapobiec degradacji powłoki powierzchniowej. Prawidłowo przechowywany w próżni i ze środkiem osuszającym, aby zapobiec uszkodzeniu powłoki PEG przez wilgoć; Szkiełka nakrywkowe można stosować przez około 1 tydzień.

3. Przygotowanie koralików pokrytych kinezyną

  1. Dobór i przygotowanie konstruktu kinezyny rygorowej
    1. Wyrażaj i oczyszczaj rygorowe konstrukcje kinezynowe zgodnie z opublikowanymi protokołami53,54. Błyskawiczne zamrożenie 5 μl porcji 0,02 mg/ml roztworów kinezyny i przechowywanie w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
      UWAGA: Białka kinezyny Rigor mają mutację punktową G234A, która zapobiega hydrolizie ATP. W przypadku sprzężenia z mikrogranulkami, interakcje o wysokim powinowactwie z mikrotubulą pozwalają kulkom wytrzymać obciążenie 10-20 pN przez kilka minut. Zmutowane wersje zarówno powszechnie stosowanego homodimeru kinezyny-1 K56053, jak i bardziej zoptymalizowanego konstruktu55 również zostały z powodzeniem zastosowane w tych testach54. Ten ulepszony konstrukt K439 zawiera domenę dimeryzacji EB1 w celu zwiększenia stabilności i C-końcowy znacznik 6-His do specyficznego wiązania z przeciwciałem 6-His, jak opisano poniżej.
  2. Wiązanie przeciwciała 6-He z kulkami pokrytymi streptawidyną
    1. Dodać 50 μl kulek polistyrenowych pokrytych streptawidyną o średnicy 1 μm do probówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Sonikacja przez 30 s.
    2. Dodaj 10 μL 200 mM DTT do 790 μL 1x BRB80. Dodaj 10 μl sonikowanych kulek do 40 μl tego 1x BRB80 + 2,5 mM bufora DTT.
    3. Połączyć 1 μl biotynylowanego przeciwciała 6-His i 49 μl 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; krótko odmieszać, aby wymieszać.
    4. Połączyć 50 μl rozcieńczonej mieszaniny kulek i 50 μl rozcieńczonej przeciwciała w nowej probówce. Umieścić probówkę w rotatorze probówek w temperaturze 4 °C i obracać przez 1 godzinę. Wirować mieszaninę kulek przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl roztworu kazeiny o stężeniu 2 mg/ml w 1x BRB80. Powtórzyć to odwirowanie i ponowne zawieszenie 2 razy.
  3. Dodanie kinezyny rygorowej
    1. Zawiesić ostatnią osadkę w 100 μl roztworu kazeiny o stężeniu 2 mg/ml. W probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml wymieszaj 5 μl kinezyny rygorowej 0,02 mg/ml i 5 μl kulek, delikatnie mieszając, lekko przesuwając probówkę ~10x.
    2. Utrzymuj zarówno zawieszenie stopki K439 G234A, jak i pozostałe 6-jego stopki na wirniku w temperaturze 4 °C, gdy nie są używane. Koraliki muszą być przygotowane świeże i użyte tego samego dnia do eksperymentów, ponieważ mają tendencję do zbijania się w grudki i utraty aktywności po upływie tego czasu.

4. Montaż komory mikroskopowej

  1. Przygotowanie szkiełek i budowa komór
    1. Szkiełka mikroskopowe o wymiarach 75 mm x 25 mm należy najpierw przepłukać wodą ultraczystą, następnie środkiem do czyszczenia szkła bez smug amoniaku, a następnie ponownie wodą ultraczystą. Wstrząśnij, aby usunąć nadmiar kropelek wody. Osusz szkiełka za pomocą strumienia azotu, aby nie pozostały smugi i połóż szkiełka na ręczniku papierowym (Rysunek 2A).
    2. Nożyczkami pokrój taśmę dwustronną na paski o wymiarach ~2-3 mm x 2,5 cm (2 paski na pojedynczą komorę i 3 na podwójną komorę).
    3. Za pomocą kleszczy połóż dwa paski taśmy na jednym szkiełku tak, aby między nimi było ~0,5 cm przestrzeni do zbudowania pojedynczej komory. W przypadku podwójnych komór należy stosować te same odstępy, ale z trzema paskami taśmy (Rysunek 2B). Objętość kanału próbki przy użyciu tej metody wynosi około 10 μL.
      UWAGA: Im szersza komora, tym większe prawdopodobieństwo, że podczas napływu roztworów utworzą się pęcherzyki; Jednak komory o szerokości mniejszej niż 0,5 cm mogą być trudne w użyciu ze względu na zmniejszoną powierzchnię do obrazowania.
    4. Zeskrob każdy pasek taśmy za pomocą kleszczy, aby taśma była mocno przyklejona do szkiełka
      5. podstawowego.
    5. Zwolnić ciśnienie z eksykatora i za pomocą kleszczy usunąć jedno biotynylowane szkiełko nakrywkowe ze stojaka do przechowywania. Umieść jedno biotynylowane szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku za pomocą kleszczy. Upewnij się, że strona biotynylowana jest skierowana do wewnątrz, w kierunku szkiełka podstawowego.
    6. Używając płaskiego tylnego końca kleszczy, delikatnie dociśnij szkło w miejscu, w którym szkiełko nakrywkowe styka się z taśmą, aby bezpiecznie uszczelnić komory. Należy użyć lekkiego nacisku, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe nie pęknie (Rysunek 2C).
    7. Przechowuj gotowe komory mikroskopowe w hermetycznym pojemniku, z dala od bezpośredniego światła, aż do użycia (Rysunek 2D).
      UWAGA: Zaleca się korzystanie z komór w tym samym dniu, w którym zostały wykonane, ponieważ biotynylowane szkiełka nakrywkowe ulegają degradacji pod wpływem powietrza.
  2. Napływ odczynników mikroskopowych
    1. Zbuduj komorę wilgotnościową, umieszczając złożoną, niestrzępiącą się chusteczkę zwilżoną ultraczystą wodą na dnie pustego pudełka z końcówkami do pipet. Komory na próbki powinny być przechowywane w tym pudełku między etapami przepływu, aby zmniejszyć parowanie roztworów z kanału.
    2. Wprowadzić wszystkie odczynniki, pipetując płyn na jednym końcu kanału i odprowadzając płyn na drugi koniec. Aby uzyskać, przekręć jeden koniec tkanki i delikatnie umieść go po stronie wyjściowej komory, pozwalając na działanie kapilarne w celu równomiernego rozprowadzenia odczynnika (Rysunek 3A). Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej tuż przed wpłynięciem, aby zapobiec depolimeryzacji mikrotubul.
    3. Używając końcówki pipety o pojemności 20 μl ustawionej pod kątem tak, aby dotykała strony wejściowej jednej z komór, powoli wlej 10 μl 0,5 mg/ml streptawidyny lub neutrawidyny. Używaj mniejszych końcówek do pipet i powolnego, stałego dopływu odczynników, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo uzyskania pęcherzyków w komorze (Rysunek 3B).
    4. Inkubować szkiełko w komorze wilgotnościowej przez 4 minuty stroną szkiełka nakrywkowego skierowaną w dół. Taka orientacja pozwoli większym obiektom, takim jak mikrotubule lub koraliki, zatonąć w pobliżu powierzchni pegylowanej.
    5. Przepłucz komorę za pomocą 20 μl 1x BRB80, używając niestrzępiącej się chusteczki do wyciągnięcia płynów. Jeśli w komorze występuje nieszczelność, wyrzuć szkiełko i zacznij od innego; Małe pęcherzyki, które występują w komorze, nie wpływają negatywnie na obrazowanie.
    6. Powtórz etapy wlewu, inkubacji i płukania z 10 μl 0,5 mg/ml roztworu blokującego kazeinę (Rysunek 3C). Rozcieńczyć biotynylowane mikrotubule dalekiej czerwieni ~ 1:20 i wlać 10 μl do komory. Inkubować przez 5 minut i przepłukać komorę 20 μl 1x BRB80 (Rysunek 3D). Optymalna gęstość tych mikrotubul w polu widzenia obrazowania 100 μm x 100 μm powinna wynosić 10-20; Rozcieńczenie na tym etapie powinno być dostosowane do osiągnięcia tego stosunku wiązania powierzchniowego.
    7. Powtórz etapy wlewu, inkubacji i płukania z 10 μl o odpowiednim stężeniu (zwykle 1-10 nM) sieciującym białko motoryczne lub niemotoryczne, które ma być badane (Rysunek 3E).
    8. Przepłynąć 10 μl mikrotubul rodaminy rozcieńczonych do podobnego stężenia, jak poprzednie biotynylowane mikrotubule dalekiej czerwieni. Powtórz kroki inkubacji i spłukiwania (Rysunek 3F).
    9. Połącz 1 μl kulek pokrytych kinezyną rigor i 19 μl buforu reakcyjnego zoptymalizowanego pod kątem aktywności białek sieciujących. Na przykład do analizy aktywności kinezyny-5 należy użyć buforu reakcyjnego z 1 mM łamaczem wiązań TCEP, 0,2 mg/ml alfa kazeiny, 70 mM KCl, systemem oczyszczania tlenu (4,5 mg/ml glukozy, 350 jednostek/ml oksydazy glukozowej, 34 jednostki/ml katalazy), 1 mM DTT i ATP w pożądanym stężeniu (np. 1 mM dla warunków maksymalnej prędkości kinezyny) w 1x BRB80 (Rysunek 3G)). W przypadku analizy białek niemotorycznych należy pominąć ATP i zmienić stężenie KCl, aby modulować siłę interakcji białko-mikrotubula w tych testach.
    10. Uszczelnij obie krawędzie komory przezroczystym lakierem do paznokci i poczekaj, aż lakier wyschnie przed obrazowaniem (Rysunek 3H). Pomyślnie zbudowana komora nie będzie miała żadnych wycieków i minimalnych pęcherzyków.

5. Pakiety mikrotubul do obrazowania z 3-kolorowym TIRF

  1. Zastosuj instrument z odwróconym mikroskopem, który ma możliwości obrazowania TIRF i w którym skonstruowano jednowiązkową pułapkę optyczną (Rysunek 4).
    UWAGA: W opisanych tutaj badaniach użyto mikroskopu odwróconego z soczewką obiektywu olejowego 100x/NA1.49, modułem TIRF i trzema laserami o długości fali 488 nm, 561 nm i 640 nm odpowiednio dla białka znakowanego GFP, mikrotubul znakowanych rodaminą i biotynylowanych mikrotubul znakowanych daleko na czerwono.
    1. Dodaj jedną kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe komory próbki. Nadmiar oleju może uszkodzić obiektyw mikroskopu. Trzymając szkiełko nakrywkowe komory na próbkę skierowaną w dół, umieść próbkę, która ma być zobrazowana, na platformie mikroskopu.
    2. Powoli podnieś obiektyw do góry, tak aby zarówno szkiełko nakrywkowe, jak i obiektyw stykały się z olejem. Wyregulować wysokość obiektywu tak, aby powierzchnia szkiełka nakrywkowego w komorze próbki była ostra.
    3. Rejestruj obrazy pojedynczej klatki próbki we wszystkich trzech kanałach. W przypadku eksperymentów tutaj użyj 100-200 ms ekspozycji jako optymalnego czasu obrazowania we wszystkich trzech kanałach; Dłuższe czasy naświetlania mogą powodować zwiększone fotowybielanie.
    4. Dostosuj moc lasera, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu z próbek, jednocześnie minimalizując fotowybielanie w ciągu 2-5 minut, gdy badany jest pojedynczy pakiet. Dla zastosowanego tutaj lasera (Rysunek 4 i Rysunek 5) należy użyć optymalnej mocy lasera 5 mW dla kanału GFP i 3 mW dla obu kanałów mikrotubul.
      UWAGA: Pomyślnie zmontowane wiązki powinny składać się z jednej mikrotubuli unieruchomionej powierzchniowo w kanale dalekiej czerwieni, współekstensywnego obszaru o wielkości kilku mikronów ze znaczącym sygnałem białka GFP oraz mikrotubuli rodaminy nakładającej się na te regiony, a następnie rozciągającej się o kilka mikronów od wiązki (Rysunek 5B,C i Rysunek 6). Obrazowanie na żywo mikrotubuli rodaminy powinno ujawnić subtelne fluktuacje na końcu mikrotubuli nieusieciowanej, co wskazuje, że włókno to nie jest przyłączone do powierzchni lub innych białek w komorze.
    5. Obserwuj częstotliwość występowania wiązek mikrotubul w polu widzenia. W przypadku pomyślnie przygotowanej próbki powinno znajdować się około 3-4 wiązek mikrotubul na 100 μl x 100 μl pola widzenia na komorę.

6. Przeprowadzanie eksperymentów z pułapkami optycznymi na wiązkach mikrotubul

  1. Przedeksperymentalna kalibracja warunków
    1. Do przeprowadzenia tych eksperymentów należy użyć jednowiązkowej pułapki optycznej o sztywności 0,05-0,1 pN/nm. Włącz optykę pułapki i fotodetektor czuły na położenie do mikroskopu odwróconego obsługującego TIRF, wprowadzając filtry krótkoprzepustowe odpowiednio tuż poniżej obiektywu i powyżej kondensora (Rysunek 4).
    2. Ponadto dodaj stolik do nanopozycjonowania, na którym znajduje się próbka, aby umożliwić użytkownikowi przesuwanie mikrotubul z precyzją w skali nanometrowej w kontrolowany sposób podczas tych testów. System używany tutaj do pozyskiwania reprezentatywnych danych został opisany w opublikowanym work27,53,54,56,57.
      UWAGA: Chociaż wykracza to poza zakres tego protokołu, dostępnych jest wiele zasobów, które szczegółowo opisują budowę i kalibrację pułapki optycznej z pojedynczą wiązką58,59,60.
    3. Obserwuj gęstość kulek w próbce za pomocą kanału jasnego pola lub kanału DIC i obiektywu 100x w mikroskopie. Mikroskopii jasnego pola należy używać tylko do identyfikacji i manipulowania kulkami, a nie do jednoczesnego rejestrowania z akwizycją obrazu fluorescencyjnego. Odstępy między kulkami powinny wynosić średnio co najmniej 10 μm i upewnić się, że są wolne od wszelkiego rodzaju ograniczeń lub przyczepień powierzchniowych i nie są połączone ze sobą ani w inny sposób się nie grupują.
    4. Upewnij się, że biotynylowane mikrotubule dalekiej czerwieni są mocno przymocowane do powierzchni szkiełka nakrywkowego, bez widocznych ruchów Browna, takich jak ruchy wzdłuż osi mikrotubul lub wolne końce mikrotubul wahające się w roztworze.
    5. Upewnij się, że mikrotubule rodaminy są przyłączone do biotynylowanych mikrotubul za pomocą sieciującego MAP i widocznie ulegają wahaniom na swoich wolnych końcach. Przyczepienie powierzchniowe niebiotynylowanych mikrotubul często wskazuje, że pegylacja mogła się nie powieść lub że powłoka PEG uległa degradacji.
  2. Pomiary poślizgu mikrotubul z napędem silnikowym
    1. Ekspresja i oczyszczanie interesującego białka motorycznego zgodnie z opublikowanymi protokołami. Na przykład, białka kinezyny-5 oznaczone GFP o pełnej długości zostały pomyślnie oczyszczone i zastosowane w tych testach53,61, a także nieznakowane kinesin-1262 i kinesin-1463. Złóż i zwizualizuj usieciowane wiązki białko motoryczne, jak opisano powyżej w krokach 4 i 5.
    2. Uchwyć za pomocą pułapki optycznej wolny pojedynczy koralik w roztworze, który wykazuje ruchy Browna. W razie potrzeby wyreguluj optykę pułapki, aby przesunąć koralik do środka pola view. Upewnij się, że odbity wzór interferencyjny od wiązki pułapki jest symetryczny i wyreguluj optykę pułapki, aby rozwiązać wszelkie asymetrie wiązki.
    3. Przesunąć stolik próbki tak, aby wolny koniec mikrotubuli rodaminy w wiązce znajdował się bezpośrednio pod kulką, a kulka znajdowała się kilka mikronów od obszaru nakładania się zawierającego białka sieciujące, aby zminimalizować fotowybielanie wywołane wiązką pułapki. Opuść koralik w osi Z, aż zderzy się z mikrotubulą. Należy uważać, aby delikatnie opuścić stopkę i nie dociskać jej do powierzchni szkiełka nakrywkowego, ponieważ może to spowodować przywieranie do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    4. Na krótko wyłącz pułapkę, aby obserwować kanałem jasnego pola ruchliwość koralika przyczepionego do przesuwającej się mikrotubuli. Podczas wykonywania testów białek motorycznych dołączony koralik będzie się poruszał w kierunku, gdy mikrotubule będą się od siebie rozsuwać. Ponownie aktywuj pułapkę i ponownie chwyć koralik.
    5. Rozpocznij rejestrowanie danych fluorescencyjnych w trzech kanałach (488 nm, 561 nm, 640 nm) z szybkością 1-2 klatek na sekundę, korzystając z mocy lasera i czasów naświetlania, które zostały zoptymalizowane w kroku 5 powyżej.
    6. Korzystając z oprogramowania komputerowego do pułapkowania, rejestruj dane o napięciu z fotodetektora czułego na położenie (sygnały intensywności X, Y i SUM), stopnia nanopozycjonowania (współrzędne X, Y i Z) oraz stanu migawki kamery TIRF. Rozpocznij digitalizację tych wartości napięcia pułapki za pomocą dedykowanej płytki akwizycji danych wejściowych napięcia kontrolowanej przez odpowiednie oprogramowanie (takie jak niestandardowy kod LabView) z częstotliwością 1-10 kHz, w zależności od wymagań eksperymentalnych.
    7. Monitoruj sygnał siły w miarę pozyskiwania danych i zwracaj szczególną uwagę na wszelkie anomalie, które mogłyby zakłócić pomyślne zbieranie danych.
      UWAGA: Anomalie obejmują między innymi (1) inne koraliki przemieszczające się do pułapki, (2) koralik przedwcześnie uciekający z pułapki oraz (3) nagłe spadki siły i późniejszy brak ponownego zainicjowania siły przeciwko pułapce, co wskazuje na problemy z cząsteczkami kinezyny na powierzchni koralika.
    8. Po pomiarze dezaktywować pułapkę, aby uwolnić kulkę i powtarzać z nową kulką i nową mikrotubulą, aż do uzyskania wymaganej liczby powtórzeń doświadczalnych.
  3. Pasywne pomiary rezystancji sieciowania
    1. Ekspresja i oczyszczanie interesujących nas niemotorycznych białek sieciowych zgodnie z opublikowanymi protokołami. Na przykład pełnowymiarowy PRC143,54,57 oraz dimeryczny skrócony konstrukt NuMA56 zostały z powodzeniem zastosowane w tych testach. Zmontuj i zwizualizuj usieciowane wiązki zgodnie z powyższym opisem w krokach 4 i 5.
    2. Zidentyfikować odpowiedni wiązkę mikrotubul, która zawiera tylko dwie mikrotubule, jedną biotynylowaną z przyłączeniem na całej powierzchni i jedną niebiotynylowaną mikrotubulę, która jest częściowo wolna w roztworze; daje to wolny koniec do przymocowania kulki i gwarantuje, że kulka nie jest przymocowana do mikrotubuli związanej powierzchniowo i jest wyrównana na osi X lub Y, tak, że ruch stołu montażowego będzie przebiegał tylko wzdłuż jednej osi.
    3. Użyj pułapki optycznej, aby uchwycić swobodny koralik podlegający ruchom Browna. Po uwięzieniu kulki ostrożnie przenieś ją do wybranej wiązki mikrotubul, upewniając się, że żadne inne kulki nie zostaną wciągnięte do pułapki. Upewnij się, że kulka znajduje się w odległości kilku mikronów od obszaru nakładania się zawierającego białka sieciujące, aby zminimalizować fotowybielanie znacznika GFP.
    4. Ostrożnie opuść koralik w osi Z, aż zetknie się z krawędzią wolnego segmentu mikrotubuli rodaminy. Delikatnie pociągnij do góry i przesuń prostopadle do osi mikrotubul, aby sprawdzić przyczepienie, obserwując zginanie mikrotubuli rodaminy i podążając za pozycją ściegu. Jeśli nie jest przymocowany, powtórz delikatne uderzanie koralika o mikrorurkę, aż do przyczepienia.
    5. Ostrożnie wyrównaj mikrotubulę rodaminy wzdłuż osi mikrotubuli mikrotubuli przymocowanej powierzchniowo, przesuwając stolik nanopozycjonowania i ustaw parametry automatycznego ciągnięcia wiązki mikrotubul. Ustaw kierunek wzdłuż równoległej osi mikrotubul, ustaw żądaną prędkość ciągnięcia (25-200 nm/s to użyteczny zakres prędkości) i żądany czas ciągnięcia (około 30 s do 2 min) w zależności od długości zakładki.
    6. Rozpocznij rejestrację danych fluorescencyjnych w trzech kanałach (488 nm, 561 nm, 640 nm) z szybkością 1-2 klatek na sekundę. Użyj mocy lasera i czasów naświetlania zoptymalizowanych w kroku 5 powyżej.
    7. Inicjuj zautomatyzowany ruch stołu montażowego i rejestruj dane dotyczące zalewkowania z czułego na położenie detektora, stolika i stanu kamery TIRF. Monitoruj wszelkie czynniki, które mogą zakłócać gromadzenie danych, w tym między innymi (1) wejście kolejnego koralika do pułapki, (2) przedwczesną utratę sieciowania mikrotubul lub (3) oderwanie się kulki od mikrotubuli rodaminy.
    8. Wyłącz pułapkę, aby zwolnić koralik i powtórz eksperyment zgodnie z potrzebami. Typowa komora na próbki może być używana przez około 30 minut, zanim dojdzie do degradacji wiązek i utraty aktywności białka.
      UWAGA: Efekty degradacji będą się różnić w zależności od zastosowanego środka sieciującego, ale mogą objawiać się tworzeniem się statycznych punktów punktowych na mikrotubulach lub powierzchni, utratą fluktuacji mikrotubul wskazujących na niespecyficzne wiązanie lub niezdolnością do stabilnego przyłączania kulek do mikrotubul.

7. Analiza danych i korelacja obrazów fluorescencyjnych z zapisami pułapek optycznych

UWAGA: Aby zoptymalizować zbieranie danych, korzystne jest zastosowanie dwóch oddzielnych komputerowych systemów sterowania: jednego dla oprogramowania do pułapkowania optycznego, a drugiego dla obrazowania fluorescencyjnego. Taka konfiguracja pozwala na szybkie pozyskiwanie danych w obu modalnościach eksperymentalnych i eliminuje nano- i mikrosekundowe opóźnienia w wykonywaniu operacji wprowadzanych do danych, które mogą wystąpić w przypadku korzystania z jednego procesora.

  1. Digitalizacja danych pułapkowania optycznego z szybkością zoptymalizowaną dla zastosowanych motorycznych lub niemotorycznych białek sieciujących oraz ich oczekiwanych szybkości kroku (np. zwykle w zakresie 1-10 kHz).
  2. Rejestruj sygnały napięciowe X, Y i SUM z fotodetektora czułego na położenie, a także dane pozycyjne X, Y i Z stolika nano-pozycjonowania za pomocą dedykowanego oprogramowania do sterowania pułapką optyczną i próbkowania cyfrowych sygnałów napięciowych z tych komponentów.
  3. Zarejestruj cyfrowy sygnał migawki w stanie otwartym z kamery z dodatkowym kanałem wejściowym napięcia na płytce akwizycji danych pułapki optycznej. Pozwala to na korelację danych obrazowania fluorescencyjnego ze śladami czasu pułapkowania optycznego. Rozpocznij zbieranie danych od pułapki optycznej przed rozpoczęciem obrazowania, aby sygnał kamery z pierwszej klatki został prawidłowo zarejestrowany.
  4. Uśredniaj nieprzetworzone dane szeregów czasowych uzyskane przy wysokich częstotliwościach próbkowania przy użyciu odpowiedniej metody filtrowania, takiej jak okno przesuwne, filtr mediany lub filtr Gaussa, w zależności od potrzeb.
  5. Określ ilościowo dane szeregów czasowych obrazu fluorescencji za pomocą metod takich jak analiza liniowa, w której obliczana jest wartość intensywności piksela na całej długości obszaru mikrotubul. Na podstawie tych liniiskanuj trajektorie, zidentyfikuj krawędzie mikrotubul, a tym samym obszary nakładające się. Ponadto użyj intensywności fluorescencji z kanału białka sieciującego, aby obliczyć lokalizację, stężenie i gęstość białka.
  6. Korelacja siły i danych obrazowych jest istotnym wynikiem tego eksperymentalnego systemu. Na przykład, wybierz i uśrednij wszystkie punkty danych siły w danym obszarze ekspozycji kamery (wskazywane przez odpowiedni skok sygnału cyfrowego w kanale kamery), aby bezpośrednio porównać z odpowiednią klatką obrazu fluorescencji. Następnie wyodrębnij zależności między wielkością siły a liczbą białek sieciujących, długością nakładania się lub rozkładem środków sieciujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie wiązek mikrotubul nadających się do analizy biofizycznej uważa się za udane, jeśli spełnionych jest kilka kluczowych kryteriów. Po pierwsze, obrazowanie w trzech kolorach powinno ujawnić dwie wyrównane mikrotubule z koncentracją białka sieciującego, preferencyjnie zdobiącego obszar nakładania się ( Rysunek 5B, C i Figura 6B). Idealnie, odległość między krawędzią zachodzącą na siebie a wolnym końcem mikrotubuli rodaminy powinna wynosi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieci mikrotubul są wykorzystywane przez niezliczone typy komórek do wykonywania szerokiego zakresu zadań, które mają zasadniczo charakter mechaniczny. Aby opisać, w jaki sposób komórki funkcjonują zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym, kluczowe jest zrozumienie, w jaki sposób te sieci w skali mikronowej są zorganizowane i regulowane przez białka o rozmiarach nanometrów, które wspólnie je budują. Narzędzia biofizyczne, takie jak pęseta optyczna, są dobrze przystosowane do badania mechanochemii kluczowych białek w te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony R21 AG067436 (dla JP i SF), T32 AG057464 (dla ET) oraz Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (dla SF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser światłowodowy iterbowy o mocy 10 W, 1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
405/488/561 / 640nm Czterozakresowy zestaw laserowy do zastosowań TIRFChromaTRF89901v2
6x Przeciwciało Tag His, koniugat biotynyInvitrogen#MA1-21315-BTIN
Aceton, klasa HPLCFisher Scientific18-608-395
Alfa kazeina z mleka krowiegoSigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
BenzonazaNovagen70746-3
Biotyna-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.
BL21 (DE3) Rosetta CellsMillipore Sigma71-400-3
KatalazaMP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA zanurzeniowy w oleju Obiektyw TIRFNikonN/A
ChloramfenikolACROS Organics227920250
Szkiełko nakrywkowe, na 8 szkiełek nakrywkowychFisher ScientificC14784
Wycieraczki do delikatnych zadańKimberly-Clark34120
Dekstroza bezwodnaFisher ScientificBP3501
D-sacharozaFisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline Termostat zanurzeniowy E100 z wanną 003LAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIDŻI / Obraz Jhttps://fiji.sc/N/A
Matowe szkiełka mikroskopoweCorning12-553-1075mmx25mm, o grubości 0,9-1,1mm
Oksydaza glukozowaMP Biomedicals LLC195196Typ VII, bez dodatku tlenu
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405SMoże być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze -20 ° C i do roku przy -80 ° C
Złota uszczelka SzkłoThermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
ImidazolFisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
Bel-Art999320237rozmiar płytki 190mm
Siarczan KanamycynyFischer ScientificBP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
KimwipeKimberley ClarkZ188956niestrzępiący
się olejek immersyjnyCargille16484
SoczewkaThorLabsMC-5
LuNA Uruchomienie lasera (4 kanały: 405, 488, 561, 640nm)NikonN/A
LizozymMP Biomedicals LLC100834
Tetrahydrat octanu magnezuFisher ScientificBP215-500
Microfuge 18Beckman Coulter367160
MPEG-SVA MW-5000Laysan Bio, Inc.
NeutravadinInvitrogenPI31000
Mikroskop odwrócony Nikon Ti-ENikonN/ANikon LuN4 Laser
Ni-NTA Żywica ThermoScientific88221
Oligonukleotyd - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
Oligonukleotyd - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
Otwarta grubościenna rurka poliwęglanowa, 0,2 mL, 7 mm x 22 mmRedlica Beckman 343755
Optima-TLX UltrawirówkaBeckman Coulter361544
paklitaksel (odpowiednik Taxol)Rury Thermo Fisher ScientificP3456
ACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
Tubulina wieprzowa, etykieta biotynyCytoskeleton, Inc.T333P
Tubulina wieprzowa, cytoszkielet fluorowy HiLyte 647Inc.TL670Mdaleko oznaczona na czerwono
tubulina wieprzowa,cytoszkielet rodaminowy, Inc.TL590M
Tubulina wieprzowa, cytoszkielet białka tubuliny, Inc.T240
Octan potasuFisher ScientificBP364-500
Prime 95B Kamera sCMOSFotometrycznagłowica czujnika detektora kwadrantowego Nie dotyczy
ThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning KitAgilent Technologies210518
Wodorowęglan soduFisher ScientificS233-500
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisher ScientificBP332-500
Kwadratowe okulary ochronneCorning12-553-45018 mm x 18 mm, o grubości 0,13-0,17 mm
Streptawidin MicrospheresPolysciences Inc.24162-1
Kolumna Superose-6GE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100 Wirnik o stałym kącieBeckman Coulter343840
Myjka ultradźwiękowa (Sonicator)VevorJPS-08A(DD)304 stal nierdzewna, częstotliwość 40 kHz, moc 60 W
Rozwiązanie Vectabond APTESWektor LaboratoriesSP-1800-7
Windex Zasilany płyn do mycia szyb z amoniakiem-DS.C. JohnsonSJN695237
NC0479433 Eksykator laboratoryjny do chusteczek, typ B NC0107576, nachylenia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8(2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227(2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257(2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544(2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55(2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724(2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659(2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001(2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131(2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar si ypu apka optycznamikroskopia TIRFmotory kinezyny 5lizganie mikrotubulbia ka sieciuj cemechanika wrzecionasieci cytoszkieletowebia ko PRC1

Powiązane artykuły