Method Article

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekła choroba nerek (PChN) dotyka 15% dorosłej populacji USA, ale wprowadzenie terapii celowanych zostało ograniczone przez brak funkcjonalnych modeli, które mogłyby dokładnie przewidzieć ludzkie reakcje biologiczne i nefrotoksyczność. Postępy w medycynie precyzyjnej nerek mogą pomóc w przezwyciężeniu tych ograniczeń. Jednak wcześniej ustalone modele in vitro kłębuszka nerkowego ludzkiego – głównego miejsca filtracji krwi i kluczowego celu wielu chorób i toksyczności leków – zazwyczaj wykorzystują heterogeniczne populacje komórek o ograniczonych cechach funkcjonalnych i niezrównanym tle genetycznym. Cechy te znacznie ograniczają ich zastosowanie w modelowaniu chorób specyficznych dla pacjenta i odkrywaniu terapii.

Ten artykuł przedstawia protokół, który integruje indukowany przez człowieka pluripotencjalny (iPS) nabłonek kłębuszków nerkowych (podocyty) i śródbłonek naczyniowy od jednego pacjenta w celu stworzenia izogenicznego i unaczynionego mikroprzepływowego chipa kłębuszków nerkowych. Powstały chip kłębuszków nerkowych składa się z warstw komórek śródbłonka i nabłonka pochodzących z komórek macierzystych, które wyrażają markery specyficzne dla linii, wytwarzają białka błony podstawnej i tworzą interfejs tkanka-tkanka przypominający barierę filtracji kłębuszkowej nerki. Zmodyfikowany chip kłębuszków nerkowych selektywnie filtruje cząsteczki i podsumowuje uszkodzenie nerek wywołane przez leki. Zdolność do odtworzenia struktury i funkcji kłębuszka nerkowego przy użyciu izogenicznych typów komórek stwarza możliwość modelowania choroby nerek ze specyficznością dla pacjenta i zwiększenia użyteczności narządów na chipach w medycynie precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowaniach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urządzenia typu organ-on-a-chip to dynamiczne modele 3D in vitro, które wykorzystują molekularną i mechaniczną stymulację, a także unaczynienie, do tworzenia interfejsów tkanka-tkanka, które modelują strukturę i funkcję określonych narządów. Wcześniej opracowane urządzenia typu organ-on-a-chip, które miały na celu rekapitulację kłębuszków nerkowych (chipy kłębuszków nerkowych), składały się z linii komórek zwierzęcych1 lub ludzkich pierwotnych i nieśmiertelnych linii komórkowych o heterogenicznych źródłach2,3. Wykorzystanie genetycznie heterogenicznych źródeł komórek przedstawia różnice, które znacznie ograniczają badania specyficznych dla pacjenta odpowiedzi oraz genetyki lub mechanizmów choroby4,5. Sprostanie temu wyzwaniu zależy od dostępności izogenicznych linii komórkowych pochodzących od konkretnych osobników z zachowanymi profilami molekularnymi i genetycznymi, aby zapewnić dokładniejsze mikrośrodowisko dla inżynierii modeli in vitro2,3,6. Izogeniczne linie komórkowe pochodzenia ludzkiego można teraz łatwo generować dzięki postępom w hodowli ludzkich komórek iPS. Ponieważ ludzkie komórki iPS są zazwyczaj pozyskiwane nieinwazyjnie, mogą samoodnawiać się w nieskończoność i różnicować w prawie każdy typ komórek, służą jako atrakcyjne źródło komórek do tworzenia modeli in vitro, takich jak chip kłębuszków nerkowych7,8. Bariera filtracji kłębuszkowej jest głównym miejscem filtracji krwi. Krew jest najpierw filtrowana przez śródbłonek naczyniowy, błonę podstawną kłębuszków nerkowych, a na końcu przez wyspecjalizowany nabłonek zwany podocytami. Wszystkie trzy składniki bariery filtracyjnej przyczyniają się do selektywnej filtracji cząsteczek. Przedstawiono tutaj protokół mający na celu stworzenie urządzenia typu narząd na chipie połączonego ze śródbłonkiem naczyniowym i nabłonkiem kłębuszków nerkowych z jednego źródła ludzkich komórek iPS. Chociaż protokół ten jest szczególnie przydatny do inżynierii izogenicznego i unaczynionego chipa w celu podsumowania bariery filtracji kłębuszkowej, zapewnia również plan rozwoju innych rodzajów spersonalizowanych narządów na chipach i platform wielonarządowych, takich jak izogeniczny system "ciało na chipie".

Protokół opisany tutaj zaczyna się od rozbieżnego różnicowania ludzkich komórek iPS na dwie oddzielne linie - boczne komórki mezodermy i komórki mezodermy, które następnie różnicują się odpowiednio w śródbłonek naczyniowy i nabłonek kłębuszków nerkowych. Aby wytworzyć boczne komórki mezodermy, ludzkie komórki iPS wysiewano na płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej 1 i hodowano przez 3 dni (bez wymiany pożywki) w pożywce N2B27 uzupełnionej aktywatorem Wnt, CHIR 99021 i silnym induktorem mezodermy, morfogenetycznym 4 (BMP4). Powstałe w ten sposób boczne komórki mezodermy były wcześniej charakteryzowane przez ekspresję brachyury (T), homeoboxu typu mix paired-like (MIXL) i eomesoderminy (EOMES)9. Następnie boczne komórki mezodermy hodowano przez 4 dni w pożywce uzupełnionej VEGF165 i forskoliną w celu indukcji komórek śródbłonka naczyniowego, które zostały posortowane na podstawie ekspresji VE-kadheryny i / lub PECAM-1 przy użyciu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Powstałe w ten sposób komórki śródbłonka naczyń krwionośnych (viEC) rozwinięto poprzez hodowlę ich w kolbach z powłoką 3 z macierzyą błony podstawnej, aż będą gotowe do wysiewu w urządzeniu mikroprzepływowym.

Aby wygenerować komórki mezodermy, ludzkie komórki iPS zostały wysiane na płytkach z matrycą błony podstawnej pokrytej 2 i hodowane przez 2 dni w pożywce zawierającej Aktywinę A i CHIR99021. Powstałe komórki mezodermy charakteryzowały się ekspresją HAND1, goosecoid i brachury (T), jak opisano wcześniej2,10,11. Aby indukować pośrednie różnicowanie komórek mezodermy (IM), komórki mezodermy hodowano przez 14 dni w pożywce uzupełnionej BMP-7 i CHIR99021. Powstałe komórki IM wyrażają guz Wilma 1 (WT1), sparowany gen pudełkowy 2 (PAX2) i nieparzyście pominięte białko pokrewne 1 (OSR-1)2,10,11.

Dwukanałowy mikroprzepływowy chip oparty na polidimetylosiloksanie (PDMS) został zaprojektowany w celu podsumowania struktury bariery filtracji kłębuszkowej in vitro. Kanał moczowy wynosi 1 000 μm x 1 000 μm (szer. x wys.), a wymiar kanału kapilarnego 1 000 μm x 200 μm (szer. x wys.). Cykliczne cykle rozciągania i relaksacji były ułatwione dzięki pustym komorom znajdującym się po obu stronach kanałów płynowych. Komórki wysiano na elastycznej błonie PDMS (o grubości 50 μm), która oddziela kanały moczowe i kapilarne. Membrana jest wyposażona w sześciokątne pory (średnica 7 μm, 40 μm odstęp od siebie), które pomagają promować sygnalizację międzykomórkową ( Rysunek 1A) 2,< sup class = "xref">12. Dwa dni przed zakończeniem indukcji IM chipy mikroprzepływowe zostały pokryte matrycą membrany podstawnej 2. viEC wysiewano do kanału kapilarnego chipa mikroprzepływowego za pomocą pożywki do konserwacji śródbłonka na 1 dzień przed zakończeniem indukcji IM, a chip odwrócono do góry nogami, aby umożliwić adhezję komórek po stronie podstawy membrany PDMS pokrytej ECM. W dniu, w którym zakończono indukcję IM, komórki zostały wysiane do kanału moczowego chipa mikroprzepływowego za pomocą pożywki uzupełnionej BMP7, Activiną A, CHIR99021, VEGF165 i całym kwasem trans retinowym w celu indukowania różnicowania podocytów w chipie. Następnego dnia zbiorniki pożywki napełniono pożywką do indukcji podocytów i pożywką do konserwacji śródbłonka, a następnie do chipów przyłożono 10% naprężenia mechanicznego przy 0,4 Hz i przepływie płynu (60 μl/h).

Komórkowe chipy mikroprzepływowe były hodowane przez dodatkowe 5 dni przy użyciu pożywki do indukcji podocytów (w kanale moczowym) i pożywki do konserwacji śródbłonka (w kanale naczyniowym). Powstałe w ten sposób chipy kłębuszków nerkowych hodowano przez okres do 7 dodatkowych dni w pożywkach podtrzymujących zarówno dla komórek podocytów, jak i śródbłonka. Zróżnicowane podocyty wykazywały dodatnią ekspresję białek specyficznych dla linii, w tym podocyny i nefryny13,14, podczas gdy viECs pozytywnie wyrażały białka identyfikujące linię PECAM-1 i VE-Cadherin, z których wszystkie są niezbędnymi cząsteczkami do utrzymania integralności kłębuszkowej bariery filtracyjnej15,16. Stwierdzono, że zarówno podocyty, jak i viEC wydzielają najliczniej występujące białko błony podstawnej kłębuszków nerkowych, kolagen IV, który jest również ważny dla dojrzewania i funkcjonowania tkanek.

>jove_content2,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj roztwory matryc membranowych i podłoża powlekane

  1. Matrycę membrany podstawnej 1 rozmrażać przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność zgodnie z sugestią producenta dotyczącą proporcji rozcieńczenia. Za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pipety dokładnie wymieszaj odpowiednią ilość matrycy membrany podstawnej 1 z 25 ml zimnego DMEM/F12, aż do całkowitego rozmrożenia i rozpuszczenia.
    1. Aby rozpuścić zamrożoną podwielokrotność, należy pobrać ~200 μl z 25 ml zimnego DMEM/F12 i przenieść ją do zamrożonej probówki z podwielokrotnością. Pipetować w górę i w dół, aż matryca zostanie dokładnie rozmrożona i rozpuszczona. Przenieś pełną zawartość rurki matrycy membrany podstawnej 1 do reszty zimnego DMEM/F12.
  2. Odpipetować 1 ml roztworu matrycy 1 membrany podstawnej do każdego dołka na płytce 6-dołkowej. Aby zużyć powlekane płytki tego samego dnia, inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    1. Alternatywnie, powlekane płyty można owinąć parafolią i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Przechowywaną płytkę, gdy jest ona gotowa do użycia, inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Rozcieńczyć matrycę błony podstawnej 2 w 9 ml sterylnej wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μg/ml. Odpipetować 700 μl roztworu matrycy 2 membrany podstawnej do każdego dołka na płytce 12-dołkowej. Owinąć płytki pokryte membraną podstawną 2 z membraną parafilmową i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  4. Rozpuść liofilizowaną matrycę błony podstawnej 3 do uzyskania końcowego stężenia 1 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, Ca + 2 i Mg+2 - wolne od nawozów fizjologicznych) zgodnie z zaleceniami producenta. Rozcieńczyć jedną podwielokrotność 250 μl do końcowego stężenia 25 μg/ml w 9,75 ml PBS (wolne od Ca+2 i Mg+2). Użyć 6 ml tego roztworu do pokrycia jednej kolby T75 (końcowe stężenie 2 μg/cm2). Kolby pokryte matrycą przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.

2. Hodowla ludzkich komórek iPS

UWAGA: Linia DU11 użyta w tym protokole została przetestowana i okazało się, że jest wolna od nieprawidłowości mykoplazmy i kariotypu.

  1. Inkubować płytki z membraną podstawną 1 pokryte w temperaturze 37°C przez 1-2 godziny.
  2. Przemyć każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 3x 1 ml ciepłego (37 °C) DMEM/F12. Dodać 2 ml pożywki do hodowli ludzkich komórek iPS (CCM) (tabela uzupełniająca S1) do każdego dołka na płytce 6-dołkowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, podczas gdy komórki są przygotowywane do wysiewu, jak opisano poniżej.
  3. Umyć każdą studzienkę 6-dołkowej płytki zawierającej ludzkie komórki iPS 1 ml ciepłego DMEM/F12.
  4. Zassać DMEM/F12. Dodać 1 ml buforu do oddzielania ciepłych komórek do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.
  5. Sprawdź wzrokowo każdą studzienkę pod mikroskopem pod kątem dysocjacji wokół krawędzi kolonii komórek. Ostrożnie odessać bufor odłączający komórki od komórek. Delikatnie umyj każdą studzienkę 1 ml ciepłego DMEM/F12.
  6. Sprawdź płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki nie oderwały się całkowicie od płytki lub nie zostały przypadkowo zassane.
  7. Dodać 3 ml ciepłego ludzkiego iPS CCM do każdego dołka 6-dołkowej płytki z komórkami. Za pomocą podnośnika komórkowego delikatnie zeskrob kolonie. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek w każdym dołku w górę i w dół.
  8. Wyjąć z inkubatora nową płytkę z membraną podstawną pokrytą matrycą 1. Przenieś 0,5 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki nowej płytki pokrytej 1 matrycą błony podstawnej. Przesuwaj płytkę ruchem ósemki, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  9. Odessać zużytą pożywkę i zastąpić 3 ml ludzkiego iPS CCM każdego dnia hodowli, aż komórki zlewają się w 70% (około 4 dni po pasażu).

3. Dni 0-16: różnicowanie ludzkich iPSC w pośrednie komórki mezodermy

  1. Dni 0-2: indukcja mezodermy
    1. Przenieść płytki powlekane membraną podstawową 2 z temperatury pokojowej do temperatury pokojowej na 2 godziny, aby zrównoważyć po przechowywaniu.
    2. Odessać zużyte podłoże z każdej studzienki 6-dołkowej płytki zawierającej około 70% zbiegających się ludzkich komórek iPS. Delikatnie umyj komórki 3x 1 ml ciepłego DMEM/F12.
    3. Zassać DMEM/F12. Dodać 1 ml buforu do odłączania komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki ludzkich komórek iPS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.
    4. Sprawdź wzrokowo każdą studzienkę pod mikroskopem pod kątem dysocjacji wokół krawędzi kolonii komórek. Za pomocą podnośnika komórkowego delikatnie zeskrob kolonie.
    5. Przenieś zawiesiny komórek ze wszystkich studzienek płytki 6-dołkowej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i użyj P1000 do kilkukrotnego pipetowania w górę i w dół, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę komórek iPS.
    6. Napełnić zawiesinę komórek w stożkowej probówce do 14 ml za pomocą DMEM/F12. Wirować przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 14 ml ciepłego DMEM/F12. Powtarzać wirowanie przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze pokojowej.
    8. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do indukcji mezodermy (tabela uzupełniająca S1). Policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć w pożywce do indukcji mezodermy, aby uzyskać końcowe stężenie 1 × 105 komórek/ml.
    9. Odessać powłokę z płyty pokrytej matrycą membrany podstawnej 2. Przepłukać każdą studzienkę matrycy membrany podstawnej 2-powlekanej płytką 2x 1 ml ciepłego DMEM/F12.
    10. Delikatnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół 2x. Przenieś 1 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki płytki pokrytej matrycą błony podstawnej 2. Delikatnie przesuwaj płytkę ruchem ósemki, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
    11. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia (dzień 1) odessać zużytą pożywkę z każdego dołka 12-dołkowej płytki. Zastąp 1 ml ciepłej pożywki do indukcji mezodermy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Dni 2-16: pośrednia indukcja mezodermy
    1. Zassać zużytą pożywkę do indukcji mezodermy. Zastąp 1 m l ciepłej pożywki do indukcji mezodermy (tabela uzupełniająca S1). Odsysaj zużytą pożywkę i zastępuj ją 1 ml ciepłej pożywki do indukcji mezodermy pośredniej codziennie przez 14 dni.

4. Dni 0-15: różnicowanie i ekspansja ludzkich iPSC do komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

  1. Dzień 0: wysiew ludzkich komórek iPS
    1. Przygotować 15 ml ludzkiego iPS CCM z inhibitorem ROCK (tabela uzupełniająca S1). Przechowywać w cieple w temperaturze 37 °C.
    2. Inkubować jedną płytkę pokrytą matrycą błony podstawnej 1 przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C. Odessać matrycę błony podstawnej 1. Przemyć 3x 1 ml ciepłego DMEM/F12.
    3. Zassać DMEM/F12. Dodaj 2 ml ludzkiego iPS CCM z inhibitorem ROCK do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, podczas gdy komórki są przygotowywane do wysiewu, jak opisano poniżej.
    4. Odessać zużyte podłoże z każdej studzienki 6-dołkowej płytki zawierającej około 70% zbiegających się ludzkich komórek iPS. Delikatnie umyj komórki 3x 1 ml ciepłego DMEM/F12.
    5. Zassać DMEM/F12. Dodać 1 ml buforu do odłączania komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki ludzkich komórek iPS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut w celu dysocjacji komórek na pojedyncze komórki.
      UWAGA: Ze względu na nieodłączne różnice między liniami komórkowymi iPS, użytkownik będzie musiał wizualnie sprawdzić komórki po 5 minutach, aby określić optymalny czas inkubacji.
    6. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić zawiesinę komórek do 14 ml ciepłym DMEM/F12, aby zneutralizować bufor odłączający. Wirować przez 5 minut w temperaturze 200× g w temperaturze pokojowej.
    7. Delikatnie odessać supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml ludzkiego iPS CCM z inhibitorem ROCK. Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    8. Wysiewaj komórki od 37 000 do 47 000 komórek/cm2 (355 200 do 451 200 komórek/dołek płytki 6-dołkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Ze względu na nieodłączne różnice między liniami komórkowymi iPS, użytkownik będzie musiał określić optymalną gęstość wysiewu.
  2. Dni 1-3: indukcja mezodermy bocznej
    1. Następnego dnia (dzień 1) odessać zużytą pożywkę z każdej studzienki 6-dołkowej płytki ludzkich komórek iPS. Zastąp każdą studzienkę 6-dołkowej płytki 5 ml pożywki do indukcji mezodermy bocznej (tabela uzupełniająca S1). Podczas zwiększania skali naczynia hodowlanego (np. kolb), zazwyczaj należy zastąpić 3-krotnością objętości roboczej w naczyniu hodowlanym.
    2. Nie zmieniaj tego podłoża przez 3 dni.
      UWAGA: Boczna pożywka indukcyjna mezodermy w studzienkach zwykle zmienia kolor z czerwonego na żółty, gdy komórki zużywają składniki odżywcze. Jednak mętne podłoże lub podłoże z rozwojem bakterii nie jest normalne i powinno zostać odkażone i wyrzucone jako takie.
  3. Dni 4-6: indukcja komórek śródbłonka
    1. Odessać zużyte podłoże z każdej studzienki 6-dołkowej płytki. Zastąp każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 3 ml ciepłej pożywki do indukcji śródbłonka (tabela uzupełniająca S1). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Przez następne 2 dni (5 i 6 dni) zbieraj zużyte podłoże ze wszystkich studzienek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać stożkową probówkę w temperaturze 4 °C. Uzupełnić komórki 3 ml ciepłej pożywki do indukcji śródbłonka. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C.
  4. Dzień 7: sortowanie komórek śródbłonka (viEC)
    1. Wyjąć 3 kolby z matrycą membrany podstawnej i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
    2. Przygotować 50 ml buforu MACS (tabela uzupełniająca S1).
    3. Umieścić bufor do odłączania komórek, bufor MACS, śródbłonkowy CCM i PBS (wolny od Ca2+ i Mg2+) na lodzie w kapturze do hodowli tkankowej.
    4. Umieść magnes na stojaku MACS. Umieść dwie probówki stożkowe o pojemności 50 ml i jedną probówkę stożkową o pojemności 15 ml w stożkowym uchwycie na probówki.
    5. Umieść stojak MACS (z dołączonym magnesem) i jedną kolumnę LS w kapturze do hodowli tkankowych. Ustaw stożkowy uchwyt rurki (ze stożkowymi rurkami wewnątrz) na stojaku MACS, pod magnesem (rysunek uzupełniający S1A).
    6. Zebrać zużyte podłoże z każdej studzienki płytki 6-dołkowej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z kroku 4.3.2. Przemyć każdą studzienkę płytki 6-dołkowej PBS (bez Ca2+ i Mg2+).
    7. Zassać PBS. Dodać 1 ml buforu do odrywania komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut, aby całkowicie dysocjować komórki.
    8. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Doprowadzić zawiesinę komórek do 15 ml za pomocą zimnego śródbłonka CCM. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu MACS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    10. Dodać 10 ml buforu MACS do zawiesiny komórek. Wirować przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze pokojowej.
    11. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 80 μl buforu MACS na 10 milionów komórek. Dodaj 20 μl na 10 milionów komórek odczynnika blokującego FcR, mikrogranulek CD31 i mikrogranulek CD144. Inkubować przez 15 minut na lodzie.
    12. Podczas inkubacji zawiesiny komórkowej odwirować pożywkę zebraną z indukcji śródbłonka (etap 4.3.2) o stężeniu 200 × g przez 10 minut.
    13. Zebrać supernatant w filtrze próżniowym o pojemności 500 ml 0,22 μm. Przygotować pożywkę kondycjonowaną śródbłonkiem (tabela uzupełniająca S1). Przefiltrować pożywkę w sterylnych warunkach i utrzymywać ją w cieple w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Szybkość proliferacji komórek śródbłonka zacznie się zmniejszać po pasażu 3. Aby osiągnąć wykładniczy wzrost po pasażu 3, pożywkę kondycjonowaną śródbłonkiem i podtrzymującą można uzupełnić 10 μM inhibitorem TGF-Beta (SB431542), zaczynając od pasażu 1.
    14. Po 15-minutowej inkubacji w kroku 4.4.11 dodać 10 ml buforu MACS na 10 milionów komórek (maksymalnie 30 ml buforu MACS) do zawiesiny komórek. Wirować przy 200 × g przez 5 min.
    15. Odessać supernatant. Zawiesić w 1 ml buforu MACS.
    16. Wziąć kolumnę LS i wyciągnąć tłok ze strzykawki. Umieścić tłok z powrotem w plastikowej osłonie. Umieść kolumnę na magnesie.
    17. Umieść pierwszą stożkową probówkę o pojemności 50 ml pod kolumną. Dodaj 1 ml buforu MACS do kolumny. Zebrać w stożkowej probówce o pojemności 50 ml znajdującej się pod spodem.
    18. Pozwól cieczy przepłynąć, choć nie do końca, aby zapobiec wyschnięciu kolumny. Gdy krople cieczy zaczną powoli spływać, dodaj zawiesinę komórkową do kolumny. Zebrać przepływ do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    19. Gdy krople cieczy zaczną powoli spływać, umieść następną stożkową rurkę o pojemności 50 ml pod kolumną. Dodaj początkowy przepływ (krok 4.4.18) do kolumny. Zebrać w stożkowej probówce o pojemności 50 ml znajdującej się pod spodem.
    20. Gdy krople cieczy zaczną powoli spływać, dodaj 500 μl buforu MACS 3x, aby umyć kolumnę.
    21. Zdejmij kolumnę z magnesu. Umieść kolumnę na stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 1 ml zimnego PBS do kolumny.
    22. Aby zebrać komórki, wyjmij tłok z plastikowej tulei i mocno wepchnij go do kolumny.
    23. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Doprowadzić zawiesinę komórek do 5 ml za pomocą PBS. Wirować przez 5 minut przy 200 × g.
    24. Podczas gdy komórki są poddawane wirowaniu, umyj kolbę z matrycą 3 z membraną podstawną 3 5 ml PBS, aby przygotować się do wysiewu komórek. Odessać PBS i dodać 20 ml pożywki kondycjonowanej śródbłonkiem do kolby 3-powlekanej matrycą błony podstawnej.
    25. Usunąć komórki z wirówki i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce kondycjonowanej śródbłonkiem, aby wysiać je z prędkością 26 000 komórek / cm2 (1,95 × 106 komórek / kolba T75). Zasiej komórki.
    26. Aby obliczyć wydajność sortowania i wydajność komórek, podziel liczbę komórek z kroku 4.4.23 przez liczbę komórek z kroku 4.4.9.
  5. Dni 8-15: rozbudowa viECs
    1. Następnego dnia (dzień 8) należy odessać zużytą pożywkę z kolby. Zastąp 10 ml pożywki kondycjonowanej śródbłonkiem. Pożywkę kondycjonowaną śródbłonkowo należy wymieniać co drugi dzień, aż kolba będzie zlewać się w 90% lub do całkowitego zużycia butelki z pożywką kondycjonowaną śródbłonkiem.
    2. Odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją 10 ml pożywki do konserwacji śródbłonka (tabela uzupełniająca S1) co drugi dzień w celu dalszego rozszerzania.
    3. Aby przejść przez viECs, należy przygotować dwie kolby T75 z membraną podstawną pokrytą 3. Pozostawić kolby w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Świeżo przygotowane kolby dokładnie umyć 3x 5 ml PBS.
    4. Zassać PBS. Dodać 10 ml ciepłej pożywki do konserwacji śródbłonka do każdej świeżo przygotowanej kolby. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, podczas gdy komórki są przygotowywane do wysiewu, jak opisano poniżej.
    5. Dodać 5 ml buforu do odrywania komórek do 90% zlewającej się kolby T75 z viECs. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml ciepłego DMEM/F12. Wirować przy 200 × g przez 5 min.
    6. Odessać supernatant. Zawiesić ponownie w 1 ml ciepłej pożywki do konserwacji śródbłonka. Dodać 500 μl zawiesiny komórek do każdej ze świeżo przygotowanych kolb T75.
    7. Następnego dnia odessaj zużyte podłoże. Zastąp 10 ml pożywki do konserwacji śródbłonka. Odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją 10 ml pożywki do konserwacji śródbłonka co drugi dzień, aż kolba będzie w 90% zlewna.

5. Dzień 14: przygotowanie mikroprzepływowych chipów narządowych do hodowli komórkowej

  1. Obróbka plazmowa i powlekanie membrany podstawnej Matrix 2
    1. Przygotować roztwór matrycy membrany podstawnej 2 (krok 1.3). Odłóż to na bok.
    2. W sterylnym kapturze do hodowli tkankowych rozpakuj sterylną okrągłą szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Umieść górną część szalki Petriego, skierowaną w dół, pod dno szalki Petriego (rysunek uzupełniający S1B).
    3. Za pomocą pęsety wyjmij chipsy mikroprzepływowe z opakowania i umieść je na szalce Petriego. Zamknij szalkę Petriego za pomocą pokrywki od spodu naczynia.
    4. Na asherze plazmowym umieść pokrywkę szalki Petriego pod szalką, górą skierowaną w dół, trzymając je razem jako jedną całość. Umieść szalkę Petriego w komorze ashera plazmowego. Uruchom asher plazmowy z tlenem o mocy 100 W, 15 SCCM, 30 s.
    5. Wrażliwy na czas: Po zakończeniu leczenia wyjmij szalkę Petriego z urządzenia do napełniania plazmą. Szybko i delikatnie przetrzyj pokrywkę szalki Petriego 70% etanolem rozpylonym na chusteczce laboratoryjnej. Przykryj szalkę Petriego pokrywką.
    6. Przynieś szalkę Petriego do sterylnego kaptura do hodowli tkankowych. Delikatnie dodaj 25 μl roztworu macierzy błony podstawnej 2 do kanału moczowego (górnego) chipa. Dodaj 20 μl roztworu macierzy membrany podstawnej 2 do kanału kapilarnego (dolnego) chipa.
    7. Weź dwie sterylne stożkowe nakrętki probówek o pojemności 15 ml i napełnij je sterylną wodą destylowaną (~500 μL). Umieść nakrętkę na szalce Petriego, aby zapobiec wysychaniu kanałów wiórowych i membrany. Umieść pokrywkę na naczyniu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

6. Wprowadzanie viEC i pośrednich komórek mezodermy do urządzeń mikroprzepływowych

  1. Dzień 15: viECs
    1. Odessać pożywkę z kolb T75 zawierających 90% zlewających się viEC. Dodać 5 ml buforu do oddzielania komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.
    2. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml DMEM/F12. Wirować przy 200 × g przez 5 min.
      UWAGA: Każda kolba T75 z około 90% zlewającymi się viEC da ~ 3 miliony komórek.
    3. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl pożywki do konserwacji śródbłonka, aby uzyskać około 2 milionów komórek/300 μl. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odłóż zawiesinę komórek na bok.
    4. Przenieść szalkę Petriego zawierającą chipy mikroprzepływowe do okapu do hodowli tkankowych. Przymocuj końcówkę barierową P200 do końcówki aspiratora.
    5. Przepłukać zarówno górny, jak i dolny kanał chipa mikroprzepływowego 200 μl DMEM/F12, jednocześnie zasysając obrzeża wylotu.
    6. Trzymaj chip mocno z końcówką bariery P200 przymocowaną do aspiratora, z dala od wylotu dolnego kanału. Mocno wstrzyknąć 20 μl zawiesiny viEC z około 134 000 komórek do kanału kapilarnego (dolnego) chipa. Ostrożnie zassać pożywkę z obrzeży wylotu.
    7. Sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma pęcherzyków powietrza lub nierównomiernej gęstości wysiewu viEC.
    8. Delikatnie odwróć chip, aby go odwrócić, tak aby viEC mogły przylegać do podstawowej strony elastycznej membrany PDMS. Umieść chip we wkładzie uchwytu. Dodaj 3 ml PBS do wkładu z uchwytem na wióry, aby zapobiec wyschnięciu membrany. Inkubować wióry w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
    9. Sprawdź, czy w dolnym kanale pod mikroskopem nie ma zlewającej się warstwy viEC przyczepionej do elastycznej membrany PDMS. Upuść 200 μl pożywki do konserwacji śródbłonka na wlocie dolnego kanału i pozwól mu przepłynąć przez kanał, aby przepłukać kanał z nieprzyłączonych komórek śródbłonka, ostrożnie zasysając od obrzeża wylotu kanału kapilarnego (dolnego).
    10. Włóż chip z powrotem do wkładu uchwytu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Dzień 16: pośrednie komórki mezodermy (IM)
    1. Delikatnie przepłucz kanał kapilarny (dolny) 200 μl pożywki do konserwacji śródbłonka, ostrożnie zasysając obrzeża portu wylotowego.
    2. Przepłukać kanał moczowy (górny) 200 μl DMEM/F12, ostrożnie zasysając obrzeża odpływu. Upuść ~50 μL DMEM/F12 na porty wlotowe i wylotowe.
    3. Odessać pośrednią pożywkę indukcyjną mezodermy z każdego dołka płytki 12-dołkowej.
      UWAGA: Każda studzienka na końcu różnicowania daje około 1,5 miliona komórek IM.
    4. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA do każdego dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    5. Delikatnie zeskrob komórki za pomocą podnośnika do komórek i pipetuj w górę iw dół, aby oddzielić komórki za pomocą P1000. Dodaj 2 ml roztworu neutralizującego trypsynę (tabela uzupełniająca S1) do każdego dołka. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Doprowadzić objętość zawiesiny komórek do 50 ml za pomocą DMEM/F12 i odwirować przy 200 × g przez 5 minut.
    6. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki do indukcji mezodermy, aby uzyskać około 3 milionów komórek/500 μl. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    7. Trzymaj chip mocno z końcówką bariery P200 przymocowaną do aspiratora, z dala od wylotu kanału moczowego (górnego). Mocno wstrzyknąć 25 μl zawiesiny komórkowej z około 112 500 komórkami IM do kanału moczowego (górnego) chipa i ostrożnie odessać pożywkę z obrzeży wylotu.
    8. Sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma pęcherzyków lub nierównomiernej gęstości wysiewu komórek IM. Dodaj 3 ml PBS do wkładu z uchwytem na wióry. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
    9. Przepłukać oba kanały 200 μl odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych, jednocześnie ostrożnie zasysając obrzeża wylotów chipów, aby zapobiec wstecznemu przepływowi zużytego podłoża i resztek komórek.
    10. Przymocuj puste końcówki bariery P200 do obu wylotów kanału moczowego i kapilarnego. Odpipetować 200 μl pożywki do konserwacji śródbłonka i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału kapilarnego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu, tak aby zarówno wlot, jak i wylot kanału były teraz przymocowane do końcówek pipet wypełnionych medium.
    11. Odpipetować pipetą 200 μl pożywki podtrzymującej IM i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału moczowego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu, tak aby zarówno wlot, jak i wylot kanału były teraz przymocowane do końcówek pipet wypełnionych medium. Inkubować chipsy z końcówkami osadzonymi w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Podłącz chipy do bioreaktora Organ Chip, aby zastosować przepływ płynu i naprężenia mechaniczne.
    1. Usuń końcówki P200 z kanałów moczowych i kapilarnych. Dodaj kropelki odpowiednich pożywek do wlotu i wylotu kanałów moczowych i kapilarnych, aby zapobiec wysuszeniu.
    2. Dodać 3 ml ciepłej pożywki do indukcji podocytów (tabela uzupełniająca S1) do zbiornika wlotowego moczu. Dodaj 3 ml ciepłej pożywki do konserwacji śródbłonka do zbiornika wlotowego kapilary.
    3. Dodać 300 μl ciepłej pożywki do indukcji Podocytów do zbiornika wylotowego kanału moczowego bezpośrednio nad portem wylotowym. Dodaj 300 μl ciepłej pożywki do konserwacji śródbłonka do zbiornika wylotowego kanału kapilarnego bezpośrednio nad portem wylotowym.
    4. Wsuń saszetki na tacę i do bioreaktora z chipami narządowymi.
    5. Użyj pokrętła na bioreaktorze z chipami organowymi, aby wybrać i rozpocząć cykl Prime (2 min). Sprawdź wzrokowo spód kapsuły pod kątem małych kropelek we wszystkich czterech portach fluidycznych.
    6. Aby uzyskać kontakt płyn-płyn między spodem kapsułki a mikroprzepływowymi portami chipów, delikatnie wsuń nośnik wiórów do kapsuły. Delikatnie wciśnij zaczep uchwytu na wióry do środka i do góry. Odessać nadmiar medium z powierzchni wióra.
    7. Ustaw natężenie przepływu w bioreaktorze Organ Chip na 60 μL/h. Ustaw napięcie cykliczne na 10% przy 0,4 Hz. Użyj pokrętła na bioreaktorze z chipami narządowymi, aby wybrać cykl regulacji i działać przez 2 godziny.
    8. Sprawdź wzrokowo zbiorniki wylotowe pod kątem wzrostu poziomu medium.
    9. Użyj pokrętła na bioreaktorze Organ Chip, aby wybrać cykl regulacji.

7. Dni 17-21 i później: indukcja podocytów i utrzymanie chipów

  1. Odessać pożywkę ze zbiorników wylotowych kanału moczowego po przekątnej od portu, ale trzymaj trochę pożywki w zbiorniku każdego dnia hodowli. Uzupełniaj zbiornik wlotowy kanału moczowego do 3 ml pożywki do indukcji podocytów co 2 dni przez 5 dni.
    1. Po 5 dniach odessać pożywkę z kanału moczowego, ale zachować trochę pożywki w zbiorniku. Codziennie uzupełniaj zbiornik wlotowy kanału moczowego 3 ml pożywki podtrzymującej Podocyty.
  2. Zasysaj pożywkę ze zbiorników wylotowych kanału kapilarnego po przekątnej od portu, ale utrzymuj trochę pożywki w zbiorniku każdego dnia hodowli. Codziennie uzupełniaj zbiornik wlotowy kanału kapilarnego do 3 ml pożywki do konserwacji śródbłonka.

8. Test funkcjonalny i obrazowanie immunofluorescencyjne

UWAGA: Zobacz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat analizy cytometrii przepływowej, testu ELISA dla ścieków z chipów i izolacji mRNA.

  1. Test funkcjonalny (filtracja molekularna) z użyciem inuliny i albuminy
    1. Zassać pożywkę ze zbiornika wylotowego kanału kapilarnego po przekątnej od portu, ale zachować trochę pożywki w zbiorniku. Zastąp 3 ml pożywki do konserwacji śródbłonka uzupełnionej inuliną i albuminą (tabela uzupełniająca S1) na 6 godzin.
    2. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml zmierzyć objętość (w ml) pożywki z kanału moczowego i przenieść do stożkowej rurki o pojemności 15 ml. Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem i zminimalizować fotowybielanie inuliny i albuminy sprzężonej z fluoroforem. Uzupełnij zbiornik 3 ml pożywki podtrzymującej podocyty.
    3. Przygotować podstawowy roztwór inuliny w pożywce podtrzymującej Podocyty. Zaczynając od 25 μg/ml inuliny, przygotuj osiem wzorców inuliny poprzez 2-krotne seryjne rozcieńczenie w pożywce podtrzymującej podocyty.
    4. Podobnie przygotuj roztwór podstawowy albuminy w pożywce podtrzymującej podocyty. Zaczynając od 150 μg/ml albuminy, przygotuj osiem wzorców albuminy poprzez 2-krotne seryjne rozcieńczenie w pożywce podtrzymującej podocyty.
    5. Odpipetować dwukrotnie 100 μl każdego wzorcowego stężenia inuliny do każdego dołka na czarnej, 96-dołkowej płytce (lub łącznie 16 dołkach inuliny). Odpipetować podwójnie 100 μl każdego wzorcowego stężenia albuminy do każdego dołka tej samej płytki 96-dołkowej (łącznie 16 dołków albuminy). Odpipetować w podwójnej pożywce 100 μl Podocyte Maintenance, która posłuży jako ślepa próba (lub łącznie dwie studzienki pożywki Podocyte Maintenance Systems).
    6. Odpipetować dwukrotnie 100 μl pożywki ściekowej z kanału moczowego do każdej studzienki tej samej 96-dołkowej płytki. Odpipetować w podwójnej ilości 100 μl pożywki ściekowej z kanału kapilarnego.
    7. Włóż płytkę do czytnika płytek i zmierz fluorescencję albuminy przy wzbudzeniu 550 nm i emisji 615 nm. Zmierzyć tę samą płytkę dla inuliny przy wzbudzeniu 513 nm i emisji 577 nm.
    8. Z wygenerowanych danych uśrednij zduplikowane pomiary (na chip). Odejmij wartość pustą odpowiadającą temu odczytowi tabliczki od pozostałych danych na arkuszu.
    9. Wykreślić wartości odpowiadające wzorcom albuminy, aby utworzyć krzywą wzorcową o stężeniu [μg/ml] na osi x i fluorescencji na osi y. Wykreślić wartości odpowiadające wzorcom inuliny, aby utworzyć krzywą wzorcową ze stężeniem [μg/ml] na osi x i fluorescencją na osi y.
    10. Użyj pakietu oprogramowania do analizy statystycznej i interpolacji liniowej, aby określić stężenie odpowiednio inuliny i albuminy w moczu w środowisku ściekowym z chipów.
    11. Określić klirens inuliny/albuminy z chipów za pomocą równania (1)2:
      Klirens z moczem = ([U] × UV) / [P] (1)
      Gdzie [U] jest stężeniem w moczu z kroku 8.1.10, UV jest objętością zebranych ścieków z kanału moczowego z kroku 8.1.2, a [P] jest stężeniem kapilarnym inuliny lub albuminy (10 μg/ml inuliny lub 100 μg/ml albuminy).
  2. Obrazowanie immunofluorescencyjne
    1. Wstrzyknąć pustą końcówkę P200 do otworów wylotowych kanałów moczowych i kapilarnych. Aby utrwalić komórki, odpipetuj 200 μl 4% formaldehydu i wstrzyknij połowę do dolnego wlotu kanału. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu.
    2. Odpipetować 200 μl 4% formaldehydu i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału moczowego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu w taki sposób, aby zarówno wlot, jak i wylot kanału były teraz przymocowane do końcówek pipet wypełnionych utrwalaczem.
    3. Inkubować frytki w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    4. Po 20 minutach wyrzuć wszystkie końcówki pipet. Wstrzyknąć czyste, puste końcówki P200 do otworów wylotowych kanałów moczowych i kapilarnych. Aby przeniknąć komórki, należy odpipetować 200 μl 0,125% Triton X-100/PBS i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału kapilarnego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu.
    5. Odpipetować 200 μl 0,125% Triton X-100/PBS i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału moczowego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu. Inkubować chip w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    6. Wyrzuć wszystkie końcówki pipet. Wstrzyknąć czyste, puste końcówki P200 do otworów wylotowych kanałów moczowych i kapilarnych. Aby zablokować komórki, należy pobrać pipetę 200 μl 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 0,125% Triton X-100/PBS i wstrzyknąć połowę jej do wlotu kanału kapilarnego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu.
    7. Odpipetować 200 μl 1% BSA w 0,125% Triton X-100/PBS i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału moczowego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    8. Wyrzuć wszystkie końcówki pipet. Przemyj oba kanały 3x, pipetując 200 μl 0,125% Triton X-100/PBS do każdego kanału i inkubując w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    9. Przygotować 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego na kanał w rozcieńczeniu zalecanym przez producenta w 0,125% Triton X-100/PBS. Wstrzyknąć czyste, puste końcówki P200 do otworów wylotowych kanałów moczowych i kapilarnych. Odpipetować 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego i wstrzyknąć połowę do odpowiednich kanałów. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu.
    10. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub, dla lepszych wyników, przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Można jednocześnie zastosować wiele przeciwciał pierwszorzędowych; Jednak roztwór przeciwciała pierwszorzędowego należy rozcieńczyć zgodnie z instrukcjami producenta.
    11. Umyj kanały 3 x 10 minut zgodnie z opisem w kroku 8.2.8.
    12. Przygotować 100 μl przeciwciała drugorzędowego na kanał o współczynniku rozcieńczenia zalecanym przez producenta w 0,125% Triton X-100/PBS. Wstrzyknąć czyste, puste końcówki P200 do otworów wylotowych kanałów moczowych i kapilarnych. Odpipetować 100 μl przeciwciała wtórnego i wstrzyknąć połowę do odpowiednich kanałów. Zwolnij końcówki pipet znajdujące się we wlocie. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Każde przeciwciało drugorzędowe musi być stosowane osobno. Myć co najmniej 3 x 10 minut między każdą aplikacją zgodnie z krokiem 8.2.8.
    13. Umyj kanały 3 x 10 minut zgodnie z opisem w kroku 8.2.8.
    14. Przepłukać oba kanały raz 200 μl wody destylowanej, jednocześnie zasysając resztki płynu z obrzeży portów wylotowych chipów.
    15. Wstrzyknąć czysty, pusty P200 do otworów wylotowych kanałów moczowych i kapilarnych. Aby przeciwdziałać barwieniu komórek, należy pobrać pipetę 200 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI, rozcieńczenie 1:1000 w wodzie destylowanej) i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału kapilarnego. Zwolnij końcówkę pipety wewnątrz wlotu, odpipetuj 200 μl DAPI i wstrzyknij połowę pipety do wlotu kanału moczowego. Zwolnij końcówkę pipety z wlotu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    16. Wyrzuć wszystkie końcówki pipet. Wstrzyknąć czyste, puste końcówki P200 do otworów wylotowych kanałów moczowych i kapilarnych. Aby przeciwdziałać barwieniu komórek, należy pobrać pipetą 200 μl falloidyny (rozcieńczenie 1:1000 w PBS bez Ca2+ i Mg2+) i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału kapilarnego i zwolnić końcówkę pipety wewnątrz wlotu. Odpipetować 200 μl falloidyny (rozcieńczenie 1:1 000 w PBS bez Ca2+ i Mg2+) i wstrzyknąć połowę do wlotu kanału moczowego i zwolnić końcówkę pipety wewnątrz wlotu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    17. Przepłukać kanały 3x 200 μL PBS bez Ca2+ i Mg2+ i odessać nadmiar płynu z obrzeży portów wylotowych.
    18. Wizualizuj żetony.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, że funkcjonalny model 3D in vitro kłębuszków nerkowych może być unaczyniony i nabłonkowany z izogenicznego źródła ludzkich komórek iPS. W szczególności protokół ten zawiera instrukcje dotyczące stosowania technologii ludzkich komórek iPS, w szczególności ich zdolności do różnicowania się w wyspecjalizowane typy komórek, do generowania nabłonka kłębuszków nerkowych (podocytów) i śródbłonka naczyniowego (viEC), które można zintegrować z urządzeniami mikroprzepływowymi w celu modelowania struktury...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym raporcie przedstawiamy protokół uzyskiwania śródbłonka naczyniowego i nabłonka kłębuszków nerkowych (podocytów) z izogenicznej ludzkiej linii komórkowej iPS oraz wykorzystania tych komórek do inżynierii systemu 3D narządów na chipie, który naśladuje strukturę, interfejs tkanka-tkanka i funkcję filtracji molekularnej kłębuszków nerkowych. Ten chip kłębuszków nerkowych jest wyposażony w śródbłonek i nabłonek kłębuszków nerkowych, które razem stanowią barierę dla selektywnego filtrowania cząsteczek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. jest wynalazcą patentu związanego z różnicowaniem podocytów od ludzkich komórek iPS. Drugi autor nie ma nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Pratt School of Engineering na Duke University, Division of Nephrology na Duke Department of Medicine, stypendium Whitehead w badaniach biomedycznych oraz Genentech Research Award dla S. Musah. Y. Roye jest laureatem stypendium Duke University-Alfred P. Sloan Foundation oraz William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship z Duke University's Department of Biomedical Engineering. Linia komórkowa iPS DU11 (klon Duke University #11) została wygenerowana w Duke iPSC Core Facility i dostarczona nam przez Bursac Lab na Uniwersytecie Duke'a. Autorzy dziękują N. Abutalebowi, J. Holmesowi, R. Bhattacharyi i Y. Zhou za pomoc techniczną i pomocne dyskusje. Autorzy pragną również podziękować członkom Musah Lab za pomocne komentarze do manuskryptu. Autorzy dziękują Segura Lab za dar cytometru przepływowego Acuri C6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciała
Alexa Fluor 488- i Alexa Fluor 594 sprzężone z przeciwciałami drugorzędowymiThermo/Life TechnologiesA32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Kolagen IVThermo/Life Technologies14-9871-82
Progen nefrynyGP-N2
PECAM-1R& D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
Matryce membran podstawnych
Corning Fibronectin, HumanCorning356008Membrana podstawna (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentIwai Ameryka PółnocnaN8922012Macierz błony podstawnej (2)
Matrigel Matryca kwalifikowana do hESC, fiolka 5 mlBD Biosciences354277Macierz błony podstawnej (1); może wykazywać zmienność między partiami
komórki
DU11 ludzkie komórkiiPSLinia komórkowa iPS DU11 (klon Duke University #11) została wygenerowana w Duke iPSC Core Facility i dostarczona nam przez Bursac Lab na Uniwersytecie Duke'a. Linia została przetestowana i stwierdzono, że jest wolna od mykoplazmy (ostatnie badanie w listopadzie 2021 r.) i nieprawidłowości kariotypu (lipiec 2019 r.)
pożywki i suplementy pożywki
0,5M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
2-merkaptoetanolThermo/Life Technologies21985023
Albumina z surowicy bydlęcej, Texas Red koniugatThermo/Life TechnologiesA23017
Kwas all-trans retinowy (500 mg)Stem Cell Technologies72262
B27 suplement bez surowicyThermo/Life Technologies17504044
suplement B-27 (50x) bez witaminy AThermo/Life Technologies12587010
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004Może wykazywać różnice między partiami
Kompletny zestaw pożywek z systemami komórkowymi CultureBoost-R4Z0-500-RPożywki do konserwacji podocytów
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
DMEM/F12 z suplementem GlutaMAXThermo/Life Technologies10565042DMEM/F12 z glutaminą
Forskolina (aktywator cyklazy adenylowej)Abcamab120058
Suplement GlutaMAXThermo/Life Technologies35050061suplement glutaminy
Inaktywowany termicznie FBSThermo/Life Technologies10082147
Roztwór heparynyTechnologie macierzyste7980
Human Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
Ludzki BMP4Preprotech120-05ET
Ludzki BMP7Technologie Thermo/LifePHC9544
Ludzkie technologie VEGFThermo/Life PHC9394
Inulina-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 średnietechnologie komórek macierzystych05850Pożywki do hodowli ludzkich komórek iPS (CCM). Dodaj 5x suplement według producenta. Ludzki iPS CCM może być przechowywany przez okres do 6 miesięcy w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Suplement N-2 (100x)Technologie Thermo/Life17502048
Media neurobazalneTechnologie Thermo/Life 21103049Boczne podłoże bazowe mezodermy
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Thermo/Life Technologies14190-250
Penicylina-streptomycyna, płyn (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK inhibitor (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011Pożywka do hodowli komórek śródbłonka (CCM). Dodaj suplement według producenta. Śródbłonek CCM może być przechowywany do dwóch tygodni w temperaturze 4 & stopni; C lub -20 ° C przez okres do 6 miesięcy.
Inhibitor TGF-Beta (SB431542)Technologie komórek macierzystych72234
Enzymy i inne odczynniki
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Bufor do odłączania komórek
Sultlenek dimetylu (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Roztwór etanolu, 70% (obj./obj.), klasa biotechnologicznaVWR97065-058
Paraformaldehyd (PFA)Thermo/Life Technologies28906
Sterylna woda destylowanaThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) Moduł koncentratoraEmulacjaORB-HM1
Okrągła szalka Petriego 100 mm x 15 mmFisherbrandFB087579B
kwadratowa miska do hodowli komórkowych 120 x 120 mmVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Pipety zasysające, pakowane pojedynczoCorning29442-462
Jednostka zasysającaSP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R WirówkaBeckman CoulterB99516
Stożkowa probówka wirówkowa, 15 mlCorning352097
Stożkowa probówka wirówkowa, 50 mlCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000Mikroskop fluorescencyjny do wykonywania zdjęć utrwalonych i barwionych Komórek.
HemocytometrVWR100503-092
Inkubator CO2 Heracell VIOS 160iThermo/Life Technologies51030403
Odwrócony Zeiss Axio Observer wyposażony w kamerę AxioCam 503Carl Zeiss Micrscopy491916-0001-000 (mikroskop) ; 426558-0000-000(kamera)
Rękawice nitrylowe Kimberly-ClarkVWR40101-346
Chusteczki Kimbre, dużeVWR21905-049
Leoca SP8 Pionowy mikroskop
Zbiornik mediów (moduł przenośny POD)EmulujPOD-1
Wytrząsarka do mikropłytekVWR12620-926
Chip do organówEmulacjaS-1 Uchwyt
na chip do organówEmulujAK-CCR
P10 precyzyjne końcówki do pipet barierowychDenville ScientificP1096-FR
P100DenvilleScientific P1125
P1000KońcówkiP1121
P20Denville ScientificP1122
P200Denville ScientificP1122
Plasma AsherQuorum techK1050X RFTen wytrawiacz plazmowy / spopielnik / środek czyszczący był używany jako część Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF) Uniwersytetu Duke'a.
Probówka z polistyrenu z okrągłym dnem z zatrzaskiem sitka Corning352235
Pipeta serologiczna, 10 ml, indywidualnie pakowanaCorning356551
Pipeta serologiczna, 25 mL, indywidualnie pakowanaCorning356525
Pipeta serologiczna, 5 mL, indywidualnie pakowanaCorning356543
Steriflip, 0,22 i mikro; m, PESEMD MilliporeSCGP00525
sterylne probówki do mikrowirówekThomas Scientific1138W14
T75cm2 kolba do hodowli komórkowych z nasadką odpowietrzającąCorning430641U
Płytki 12-dołkowe poddane hodowli tkankowejCorning353043
Płytki 6-dołkowe poddane kulturze tkankowejCorning353046
Modulator próżni i pompa perstaltyczna (moduł hodowli Zoe)Emulujbioreaktor ZOE-CM1Organ Chip
VE-Cadherin CD144 przeciwciało antyludzkie - APC sprzężoneMiltenyi Biotec130-126-010
Podnośnik komórkowy z szerokim skosemCorning3008
MACS
CD144 MicroBeads, ludzkieMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 Zestaw mikrokulek, człowiekMiltenyi Biotec130-091-935
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
konfokalny chipa Końcówki do pipet barierowych Końcówki do pipet barierowych do pipet barierowych Denville Scientific Końcówki do pipet barierowych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656(2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12(2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812(2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967(2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010(2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394(2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kidney Glomerulus ChipInduced Pluripotent Stem CellsIsogenic Organ ChipGlomerular Filtration BarrierPodocyte DifferentiationVascular Endothelial CellsMicrofluidic ChipNephrotoxicity TestingPrecision MedicinePatient Specific Disease Modeling

Related Articles