Bezznacznikowe obrazowanie w superrozdzielczości możliwe dzięki obrazowaniu wibracyjnemu spuchniętej tkanki i analizie

Podsumowanie

Łącząc chemię hydrożelu z ekspandowaniem próbki z bezznacznikową, specyficzną chemicznie, stymulowaną mikroskopią rozpraszania Ramana, protokół opisuje, jak osiągnąć bezznacznikowe obrazowanie wolumetryczne w superrozdzielczości w próbkach biologicznych. Dzięki dodatkowemu algorytmowi segmentacji obrazu opartego na uczeniu maszynowym uzyskano wieloskładnikowe obrazy specyficzne dla białka w tkankach bez znakowania przeciwciałami.

Streszczenie

Uniwersalne zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej, zwłaszcza mikroskopii superrozdzielczej, znacznie poszerzyło wiedzę o współczesnej biologii. Z drugiej strony, wymóg znakowania fluoroforem w technikach fluorescencyjnych stwarza poważne wyzwania, takie jak fotowybielanie i niejednolite znakowanie sond fluorescencyjnych oraz długotrwałe przetwarzanie próbek. W protokole przedstawiono szczegółowe procedury pracy w zakresie obrazowania i analizy wibracyjnej pęczniejących tkanek (VISTA). VISTA omija przeszkody związane z fluoroforami i osiąga bezznacznikowe obrazowanie wolumetryczne w superrozdzielczości w próbkach biologicznych z rozdzielczością przestrzenną do 78 nm. Procedura jest ustalana poprzez osadzenie komórek i tkanek w hydrożelu, izotropowe rozszerzanie hybrydy próbki hydrożelu i wizualizację endogennych rozkładów białek za pomocą obrazowania wibracyjnego za pomocą stymulowanej mikroskopii rozpraszania Ramana. Metodę demonstruje się zarówno na komórkach, jak i tkankach mózgowych myszy. Zaobserwowano wysoce skorelowane obrazy VISTA i immunofluorescencyjne, potwierdzając białkowe pochodzenie specyficzności obrazowania. Wykorzystując tę korelację, przeszkolono algorytm segmentacji obrazów oparty na uczeniu maszynowym, aby uzyskać wieloskładnikowe przewidywanie jąder, naczyń krwionośnych, komórek nerwowych i dendrytów na podstawie obrazów mózgu myszy bez znaczników. Procedura została następnie dostosowana do badania patologicznych agregatów poliglutaminy (polyQ) w komórkach i blaszek beta-amyloidu (Aβ) w tkankach mózgowych o wysokiej przepustowości, co uzasadnia jej potencjał w przypadku dużych próbek klinicznych.

Wprowadzenie

Rozwój metod obrazowania optycznego zrewolucjonizował zrozumienie współczesnej biologii, ponieważ dostarczają one bezprecedensowych informacji przestrzennych i czasowych o celach w różnych skalach, od białek subkomórkowych po całe narządy¹. Wśród nich mikroskopia fluorescencyjna jest najbardziej ugruntowana, z dużą paletą barwników organicznych o wysokich współczynnikach ekstynkcji i wydajności kwantowej², łatwe w użyciu genetycznie kodowane białka fluorescencyjne³ oraz metody superrozdzielcze, takie jak STED, PALM i STORM do obrazowania struktur w skali nanometrowej^4,5. Ponadto najnowsze osiągnięcia w inżynierii próbek i chemii konserwującej, które rozszerzają próbki osadzone w pęczniejących hydrożelach polimerowych^6,7,8, umożliwiają subdyfrakcyjną ograniczoną rozdzielczość w konwencjonalnych mikroskopach fluorescencyjnych. Na przykład typowa mikroskopia ekspansywna (ExM) skutecznie zwiększa rozdzielczość obrazu czterokrotnie dzięki czterokrotnemu rozszerzeniu próbki izotropowej⁷.

Pomimo swoich zalet, mikroskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości ma swoje ograniczenia, które wynikają z oznaczania fluoroforami. Po pierwsze, fotowybielanie i inaktywacja fluoroforów ograniczają zdolność do powtarzalnych i ilościowych ocen fluorescencji. Fotobielenie jest nieuniknionym zjawiskiem, gdy światło pompuje elektrony w stany wzbudzone elektronowo⁹. Po drugie, znakowanie fluoroforów do pożądanych celów nie zawsze jest prostym zadaniem. Na przykład barwienie immunologiczne wymaga długiego i pracochłonnego procesu przygotowania próbki i utrudnia wydajność obrazowania¹⁰. Może również wprowadzać artefakty spowodowane niejednorodnym znakowaniem przeciwciał, szczególnie głęboko w tkankach¹¹. Co więcej, właściwe strategie znakowania, które są ukierunkowane na fluorofory dla pożądanych białek, mogą być słabo rozwinięte. Na przykład konieczne były szeroko zakrojone badania przesiewowe, aby znaleźć skuteczne przeciwciała przeciwko blaszkom Aβ¹². Mniejsze barwniki organiczne, takie jak czerwień kongijska, często mają ograniczoną specyficzność, barwiąc tylko rdzeń płytki Aβ. W związku z tym wysoce pożądane jest opracowanie bezznacznikowej metody superrozdzielczości, która omija wady znakowania fluoroforowego i zapewnia uzupełniające obrazowanie w wysokiej rozdzielczości od komórek do tkanek, a nawet do dużych próbek ludzkich.

Mikroskopia Ramana zapewnia bezznacznikowy kontrast dla struktur specyficznych dla substancji chemicznych i odwzorowuje rozkład niewidocznych w inny sposób wiązań chemicznych, patrząc na wzbudzone przejścia wibracyjne¹³. W szczególności wykazano, że obrazowanie wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS) na próbkach bezznacznikowych lub drobno znakowanych ma podobną szybkość i rozdzielczość do mikroskopii fluorescencyjnej^14,15. Na przykład zdrowy obszar mózgu został łatwo odróżniony od regionu naciekanego przez nowotwór w tkankach ludzkich i myszy^16,17. Blaszki Aβ zostały również wyraźnie zobrazowane poprzez celowanie w wibracje białka CH₃ (2940 cm⁻¹) i amid I (1660 cm⁻¹) na świeżo zamrożonym wycinku mózgu bez żadnego oznakowania¹⁸. Rozpraszanie Ramana zapewnia zatem solidny kontrast bez znaczników, który pokonuje ograniczenia fluoroforów. Pojawiło się zatem pytanie, w jaki sposób można osiągnąć zdolność superrozdzielczości za pomocą rozpraszania Ramana, które może ujawnić szczegóły strukturalne w nanoskali i implikacje funkcjonalne w próbkach biologicznych.

Chociaż podjęto znaczne wysiłki, aby osiągnąć superrozdzielczość dla mikroskopii Ramana za pomocą eleganckich instrumentów optycznych, zwiększenie rozdzielczości na próbkach biologicznych było raczej ograniczone^19,20,21. Tutaj, w oparciu o ostatnie prace^22,23, prezentujemy protokół, który łączy strategię ekspansji próbki ze stymulowanym rozpraszaniem Ramana w celu obrazowania wibracyjnego bez znaczników o superrozdzielczości, o nazwie Obrazowanie Wibracyjne Spuchniętych tkanek i Analiza (VISTA). Po pierwsze, komórki i tkanki osadzono w matrycach hydrożelowych za pomocą zoptymalizowanego protokołu hybrydyzacji białkowo-hydrożelowego. Hybrydy tkanek hydrożelowych inkubowano następnie w roztworach bogatych w detergenty w celu delipidacji, a następnie ekspansji w wodzie. Rozszerzone próbki zostały następnie zobrazowane za pomocą zwykłego mikroskopu SRS, celując w wibracje_CH3 z zatrzymanych białek endogennych. VISTA, dzięki funkcji obrazowania bez etykietowania, omija fotowybielanie i niejednorodne znakowanie wynikające z etykietowania fluoroforowego, przy znacznie wyższej przepustowości przetwarzania próbek. Jest to również pierwsze odnotowane obrazowanie bez znaczników w zakresie poniżej 100 nm (do 78 nm). Nie jest wymagane żadne dodatkowe oprzyrządowanie optyczne poza typową konfiguracją SRS^22,24, dzięki czemu jest łatwo stosowane. Dzięki korelacyjnym obrazom VISTA i immunofluorescencji przeszkolono sprawdzony algorytm segmentacji obrazów oparty na uczeniu maszynowym^25,26 w celu generowania specyficznych dla białek obrazów multipleksowych z obrazów jednokanałowych. Metodę tę zastosowano następnie do zbadania blaszek Aβ w tkankach mózgowych myszy, uzyskując całościowy obraz nadający się do subfenotypowania w oparciu o dokładne widoki rdzenia płytki nazębnej i włókien obwodowych otoczonych jądrami komórkowymi i naczyniami krwionośnymi.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Kalifornijski Instytut Technologii Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), a procedury protokołu były zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych do utrwalania i rozszerzania próbki

1. Przygotować 40 ml roztworu utrwalającego, rozpuszczając najpierw 12 g stałego akrylamidu (30% w/v) w 26 ml wody wolnej od nukleaz. Następnie dodaj 10 ml 16% roztworu podstawowego PFA do mieszaniny. Na koniec dodaj 4 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4). Przygotowany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
   UWAGA: Akrylamid jest niebezpieczny, dlatego etap rozpuszczania akrylamidu w postaci stałej w wodzie powinien odbywać się w dygestorium.
2. Przygotować roztwór żelujący (zapas X), rozpuszczając 70 mg akrylanu sodu (7% w/v), 200 mg amidu akrylu (20% w/v) i 50 μl N, N′-metylenobisakryloamidu (0,1% w/v) w 420 μl ultraczystej wody. Na koniec dodać 57 μl sterylnie przefiltrowanego 10x PBS (pH 7,4) i przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C przez okres do 1 tygodnia.
   UWAGA: Unikaj stałego akrylanu sodu, który tworzy grudki; Upewnij się, że użyty akrylan sodu ma postać proszków dyspersyjnych. Wyprodukowany zapas X będzie bezbarwną cieczą; Jeśli ciecz wygląda na jasnożółtą, uzyskaj nowy akrylan sodu.
3. Przygotować roztwór inicjujący polimeryzację, rozpuszczając 1 g nadsiarczanu amonu (APS, 10% m/w) w 9 ml wody wolnej od nukleaz. Podobnie przygotować roztwór przyspieszacza polimeryzacji, rozpuszczając 1 g tetrametyloetylenodiaminy (TEMED, 10% w/w) w 9 ml wody wolnej od nukleaz. Otrzymane roztwory podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować 50 ml buforu denaturującego, rozpuszczając 2,88 g dodecylosiarczanu sodu (SDS, 200 mM), 0,584 g chlorku sodu (200 mM) i 2,5 ml 1M buforu Tris-HCl (50 mM, pH 8) w wodzie wolnej od nukleaz.
   UWAGA: Stężenie SDS jest zbliżone do stanu nasycenia. Pewna krystalizacja w buforze jest normalna. Lekkie podgrzanie go do temperatury 37 °C może sprawić, że roztwór będzie klarowny i gotowy do użycia.

2. Przygotowanie próbek komórek ssaków

1. Wysiewać 3,5 x 10⁴ komórki HeLa na 12-milimetrowym borokrzemianowym szkiełku nakrywkowym (#1,5) na 24-dołkowej płytce, a następnie hodować komórki w 400 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% antybiotykami penicylinowo-streptomycynowymi (kompletny DMEM) w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Aby uzyskać komórki w różnych stadiach mitotycznych, inkubuj komórki w pełnym DMEM aż do 60% zgrywki. Następnie potraktuj komórki DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej przez 20 godzin, aby zsynchronizować etapy komórkowe. Po synchronizacji przełącz pożywkę, aby komórki ukończyły DMEM i inkubuj przez kolejne 2-6 godzin, aby celować w różne etapy mitozy.
3. Umyć komórki HeLa na szkiełkach nakrywkowych sterylnym PBS i inkubować je z roztworem utrwalającym (4% PFA, 30% akryloamidu [AA] w PBS) w temperaturze 37 °C przez 7-8 godzin przed dalszym przetwarzaniem.
   UWAGA: Wyższa temperatura wiązania w połączeniu z wysokim stężeniem akrylamidu pomaga wygasić międzycząsteczkowe sieciowanie między białkami podczas procesów wiązania i jest zgłaszane w celu zachowania szczegółowych ultrastruktur białek⁸.
4. W przypadku komórek z agregatami polyQ hoduj komórki w pełnym DMEM, aż osiągną 70%-90% konfluencji. Po zmianie na nowy kompletny DMEM, transfekcja 1 μg plazmidu kodującego mHtt97Q-GFP do komórek za pomocą środka transfekcyjnego (szczegóły w Tabeli Materiałów). Wykonaj transfekcję zgodnie z protokołem producenta.
5. Po 24-48 godzinach transfekcji usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 800 μl roztworu utrwalającego (4% PFA, 30% AA) do szkiełek nakrywkowych z komórkami. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin. Umyj szkiełko nakrywkowe PBS 3x, a powstałe próbki komórek są gotowe do dalszej obróbki.

3. Przygotowanie próbek mózgu myszy

1. Kup myszy C57BL/6J (6 do 8 tygodni, samiec i samica, sześć myszy) i myszy z chorobą Alzheimera (9 miesięcy, samica, trzy myszy) ze źródeł komercyjnych (szczegóły w Tabeli materiałów). Przeprowadzić eutanazję za pomocą narkozy dwutlenkiem węgla zgodnie ze standardowym protokołem²⁷. Krótko mówiąc, umieść myszy w komorze i napełnij komorę przepływem 100% CO₂ w rzędzie 30%-70% objętości komory/min i utrzymuj przepływ przez co najmniej 1 minutę po śmierci klinicznej.
2. Po potwierdzeniu humanitarnej eutanazji szybko odetnij głowy myszom za pomocą nożyczek. Odsłoń czaszkę z dużym nacięciem przez skórę wzdłuż linii środkowej. Pociągnij skórę w kierunku nosa zwierzęcia, aby całkowicie odsłonić czaszkę.
3. Rozetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej cienkimi nożyczkami i oderwij dwie połówki czaszki na bok. Użyj pęsety, aby zgarnąć mózg na szalkę Petriego na lodzie za pomocą PBS. Umyj świeży mózg myszy lodowatym PBS i przenieś mózg do 10 ml buforu utrwalającego (4% PFA, 30% AA).
4. Inkubować mózg myszy w buforze utrwalającym w temperaturze 4 °C przez 24–48 godzin, a następnie przenieść go do temperatury 37 °C na noc. Po umyciu go sterylnym PBS, pokrój mózg myszy na odcinki 150 μm za pomocą wibratomu i przechowuj w PBS w temperaturze 4 °C.

4. Osadzanie, denaturacja i ekspansja hydrożelu w próbkach komórek i tkanek

1. Upewnij się, że próbki były inkubowane w buforze utrwalającym przez wymagany czas, jak wskazano powyżej. Rozmrozić roztwory wyjściowe X, inicjatora wolnych rodników i akceleratora i utrzymywać je na lodzie podczas całego procesu.
   UWAGA: Niewystarczający czas inkubacji może spowodować zmniejszenie liczby białek zatrzymanych na hybrydzie hydrożelowej, a tym samym spowodować spadek sygnału.
2. Podnieś szkiełko nakrywkowe z komórkami i umieść je na szklanym szkiełku za pomocą pęsety. Wybierz plastry mózgu (o grubości 150 μm) i umieść je na innym szkiełku za pomocą pędzla z miękkiej wełny, upewniając się, że są płaskie. Pozbądź się nadmiaru płynu, który jest dostarczany z próbkami.
3. Ułóż dwa szkiełka nakrywkowe (#1.5), dodając między nimi krople wody, po obu stronach próbki na szkiełku podstawowym, aby utworzyć komorę żelowania. Umieścić szkiełko podstawowe z próbką skierowaną do góry na lodowatym bloku grzewczym i schłodzić go do temperatury 4 °C przez 1 minutę.
4. Dodaj 10% (w/w) TEMED do zapasu X, a następnie 10% roztworu APS. Szybko przeprowadź wirowanie i w ciągu 1 minuty po wymieszaniu powoli upuść powstały roztwór do komory na próbki, aby pokryć powierzchnię próbki, unikając pęcherzyków powietrza. Roztwór i próbki należy przechowywać na lodzie (lub lodowatym bloku grzewczym), aby uniknąć tworzenia się żelu (wysoki stopień polimeryzacji) przed dodaniem do próbki.
5. Gdy próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze, umieść płaskie, przezroczyste, pokryte folią szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki jako pokrywę komory. Pozostaw komorę na lodzie lub lodowatym bloku grzewczym na kolejny 1 minutę przed inkubacją w inkubatorze nawilżającym w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
6. Wyjąć komorę żelowania znajdującą się na szkiełku podstawowym z inkubatora o temperaturze 37 °C. Po zdjęciu pokrywki należy obserwować nieprzezroczysty żel. Pobrać żel, przecinając żyletką lub, alternatywnie, umieścić szkiełko w buforze denaturującym w temperaturze pokojowej na 15 minut. Żel oddzieli się od szkiełka podstawowego.
7. Wyizolowany żel należy inkubować w buforze denaturującym w warunkach termicznych, aby osiągnąć dalszą denaturację i delipidację. W przypadku próbek komórkowych denaturować w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę. W przypadku plastrów mózgu o grubości 150 μm denaturować w temperaturze 70 °C przez 3 godziny, a następnie 95 °C przez 1 godzinę
   UWAGA: Żel może stać się kędzierzawy po pierwszej inkubacji z buforem denaturującym w temperaturze pokojowej. Jest to normalne i stanie się płaskie po denaturacji w wysokiej temperaturze. Podczas pracy z grubszymi próbkami tkanek potrzebny jest dłuższy czas denaturacji.
8. Po obróbce cieplnej zdenaturowaną próbkę przemywać 3x PBS przez 10 min. W tym momencie żel powinien rozszerzyć się do około 1,5 raza w stosunku do pierwotnego rozmiaru. Inkubuj umyty żel z ultraczystą wodą w dużym pojemniku (co najmniej 20-krotność objętości żelu), aby uzyskać wyższy współczynnik rozszerzalności. Zmieniaj wodę co 1 h 3x i pozostaw próbkę w ciemności na noc. Powstały żel jest gotowy do obrazowania.
   UWAGA: Współczynnik rozszerzalności w dużej mierze zależy od właściwości mechanicznych oryginalnej próbki. Uzyskano 4,2-krotną ekspansję dla próbek komórek i 3,4-krotną ekspansję dla próbki tkanki mózgowej.

5. Bezznacznikowe obrazowanie endogennego rozkładu białek w rozszerzonych próbkach komórek i tkanek

1. Próbki ekspandowanego żelu należy przechowywać w wodzie podczas procesu obrazowania. Żel jest kruchy po rozprężeniu, dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie. Ekspandowany żel zawierający próbkę umieścić na szkiełku mikroskopowym (o grubości 1 mm) z przekładką mikroskopową o odpowiednich rozmiarach i głębokościach, wypełnionym wodą. Przykryj przekładkę szkiełkiem nakrywkowym (#1.5) i upewnij się, że jest odpowiednio uszczelniona, aby uniknąć ruchu próbki.
2. Umieść próbkę z rozciągniętą komórką lub tkanką na zmotoryzowanym stoliku ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu. Kliknij Ocular w oprogramowaniu, aby zmienić ścieżkę światła na jasne pole i wyregulować pozycję z za pomocą pokrętła ręcznego.
3. Dodaj olejek immersyjny na wierzch próbki i ustaw kondensator we właściwej pozycji dla oświetlenia Köhlera, obserwując w jasnym polu z 25-krotnym powiększeniem od obiektywu. Wprowadź 791,3 nm w oknie długości fali OPO na panelu laserowym, aby celować w wibracje białka CH₃ na wysokości 2940 cm⁻¹.
4. Przełącz światło mikroskopu z jasnego pola (okularu) na tryb skanowania laserowego, klikając przycisk LSM i otwórz migawkę laserową SRS, naciskając przycisk migawki na panelu sterowania lasera. Naciśnij przycisk LIVE w oprogramowaniu mikroskopu, aby rozpocząć akwizycję obrazu w czasie rzeczywistym.
5. Znajdź właściwą ostrość, zmieniając z podczas patrzenia na obraz SRS w krótkim czasie przebywania pikseli (12,5 μs/piksel) i niskiej rozdzielczości obrazu (256 x 256 pikseli). Po znalezieniu idealnej pozycji Z zmień rozmiar skanu i czas przebywania pikseli, pociągając za odpowiedni pasek w oprogramowaniu mikroskopu.
6. Uzyskaj obraz, naciskając przycisk LSM, używając warunków super-próbkowania (1024 piksele x 1024 piksele) z dłuższym czasem przebywania pikseli (80 μs/piksel), który odpowiada stałej czasowej wzmacniacza lock-in. Uzyskuj obrazy wolumetryczne, zbierając stos z krokiem o rozmiarze 1 μm w kierunku z. Przetwarzaj i analizuj zapisany plik OIR z oprogramowania za pomocą ImageJ.
   UWAGA: Szczegółowa konfiguracja SRS została niedawno opisana w Mutlu et al.²⁴. W tym przypadku przestrajalny laser pikosekundowy o częstotliwości powtarzania 80 MHz i szerokości pasma 2 ps dla pompy (770-990 nm) i stoków (1031,2 nm) został skierowany do laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (szczegółowo opisanego w Tabeli Materiałów). Zoptymalizuj czasowe i przestrzenne nakładanie się dwóch wiązek dla sygnałów o czystym_D2O. Znalezienie odpowiedniego z dla rozszerzonej próbki w jasnym polu wymaga pewnego wysiłku, ponieważ współczynnik załamania światła jest bardzo jednorodny w całym żelu.
7. Określ rozdzielczość VISTA, wykonując zdjęcie SRS kulek polistyrenowych (100 nm) przy użyciu zarówno obiektywu 25x, jak i obiektywu 60x. Ustaw laser pompy na 784,5 nm, co odpowiada przesunięciu Ramana wynoszącemu 3050 cm⁻¹, charakterystycznemu dla aromatycznego C-H rozciąga drgania polistyrenu.
   UWAGA: Zastosowana tutaj długość fali lasera pompy jest podobna do tej używanej w VISTA dla białek.
8. W przypadku obiektywu 60x eksperymentalne półmaksimum pełnej fali (FWHM, czyli szerokość kształtu linii w połowie amplitudy) obrazu koralika wynosiło 276,17 nm. Modelowanie funkcji obiektu ściegu jako półkoła.
   UWAGA: Gdy funkcja Gaussa PSF ma c (σ) = 269 nm/2,35, obraz konwolucyjny koralika miałby zmierzoną wartość FWHM wynoszącą 276,17 nm. W rezultacie rozdzielczość układu SRS wynosi 269 nm × 1,22 = 328 nm według kryterium Rayleigha. Ponieważ VISTA ma średnio 4,2-krotną ekspansję próbek komórek, efektywna rozdzielczość spadła do 328 nm/4,2 = 78 nm.

6. Korelacyjny VISTA i obrazowanie fluorescencyjne znakowanych immunologicznie i rozszerzonych próbek tkanek

1. Po denaturacji należy wstępnie inkubować próbki zatopione w hydrożelu (np. 150 μm wycinek korony mózgu) w 1% (v/v) Triton X-100 (PBST) przez 15 minut. Zmienić bufor inkubacyjny na PBST z przeciwciałem pierwszorzędowym w rozcieńczeniu 1:100. Jeśli do obrazowania multipleksowego potrzebnych jest wiele docelowych białek, należy rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe dla różnych celów do odpowiednich stężeń w tym samym koktajlu i jednocześnie inkubować z próbkami.
2. Inkubować żele z rozcieńczonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze 37 °C z delikatnym wstrząsaniem przy 80 obr./min przez 16-18 godzin, a następnie intensywnie przemywać 3x PBST przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C. Odwrócić żel podczas inkubacji, aby zapobiec niejednorodnemu znakowaniu przeciwciał tutaj i we wszystkich kolejnych inkubacjach.
3. Próbki inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi odpowiednich gatunków docelowych w rozcieńczeniach 1:100 z PBST w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin, chroniąc je przed światłem. Oznakowane próbki hydrożelu myć 3x PBST przez 1-2 h w temperaturze 37 °C z delikatnym wstrząsaniem.
4. Rozcieńczyć DAPI do końcowego stężenia 3 μM w PBS. Dodać wystarczającą objętość roztworu DAPI do próbki hydrożelu, tak aby żel był zanurzony w roztworze. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem przy 80 obr./min. Przemyć próbkę 3x PBS.
5. Rozszerz próbki żelu znakowanego immunologicznie, inkubując z dużą objętością podwójnie dejonizowanego_H2O. Zmieniaj wodę co 1 godzinę 3x i inkubuj próbki w_H2Oprzez noc, chroniąc przed światłem. Podczas znakowania żel powinien rozszerzać się 1,5 raza w porównaniu z buforem PBS.
6. Przygotować próbkę obrazową zgodnie z opisem w kroku 5.1. Umieść próbkę obrazowania na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym z obiektywem zanurzeniowym 25x, 1,05 NA, zanurzonym w wodzie do obrazowania fluorescencyjnego.
7. Wybierz odpowiedni kanał za pomocą odpowiedniego lasera wzbudzającego (405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm) i pary PMT zgodnie z docelowymi przeciwciałami w menu rozwijanym w oprogramowaniu mikroskopu. Naciśnij przycisk LIVE, aby uzyskać obraz w czasie rzeczywistym.
8. Dostosuj pozycję ostrości za pomocą pokrętła ręcznego w oparciu o sygnał fluorescencji w czasie rzeczywistym. Zoptymalizuj moc lasera, czas przebywania pikseli i wzmocnienie PMT w oprogramowaniu mikroskopu zgodnie z sygnałem fluorescencji w czasie rzeczywistym, aby uniknąć słabego sygnału lub przesycenia.
   UWAGA: Oceń wygląd i cechy na podstawie zgłoszonych struktur różnych przeciwciał, aby wyeliminować potencjalne reaktywności krzyżowe przeciwciał i uniknąć przesłuchów między różnymi kanałami fluorescencyjnymi.
9. Naciśnij przycisk LSM, aby rozpocząć pobieranie korelacyjnych obrazów SRS i fluorescencyjnych. Najpierw zbierz wolumetryczne obrazy fluorescencyjne na próbkach znakowanych immunologicznie. Po zakończeniu obrazowania fluorescencyjnego przełącz ścieżkę światła mikroskopu na stan przezroczysty w podczerwieni (IR).
10. Zmień kanał detekcji z fluorescencji PMT na SRS w oprogramowaniu mikroskopu. Otwórz migawkę lasera SRS i wykonaj obrazowanie wolumetryczne SRS na polu widzenia tej samej próbki o tym samym zakresie z. Normalny zakres wynosi od 100 do 200 μm i może sięgać do 700 μm.
    UWAGA: Istnieje niewielka aberracja chromatyczna, która powoduje przesunięcie pozycji Z między obrazami fluorescencyjnymi a obrazami SRS z powodu różnicy długości fal w laserach wzbudzających. Konieczne jest ręczne porównanie obok siebie obrazów SRS i fluorescencji z-stack. Poszukaj dokładnie pasujących cech zarówno w SRS, jak i kanale fluorescencji, aby dokładnie dopasować pozycję z.

7. Budowa, szkolenie i walidacja architektury U-Net

UWAGA: Zalecana jest instalacja na Linuxie. Wymagana jest karta graficzna z >10 GB pamięci RAM.

1. Konfigurowanie środowiska
   1. Zainstaluj Anacondę lub Minicondę na x86_64 3-5.3.0-linux. Sklonuj lub pobierz następujące pliki: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Utwórz środowisko Conda dla platformy przy użyciu następującego wiersza polecenia:
      conda env create -f environment.yml
2. Trenowanie modelu predykcyjnego
   1. Sparuj katalogi odpowiednich obrazów SRS z obrazami prawdy podstawowej w pliku csv. Umieść katalogi obrazów SRS w path_signal i obrazy prawdy naziemnej w kolumnach path_target.
   2. Umieść plik csv w folderze data/csvs. W razie potrzeby zmodyfikuj konfigurację w skryptach/train_model_2d.sh. Aktywuj środowisko za pomocą wiersza poleceń:
      conda aktywuj fnet
   3. Inicjowanie trenowania modelu przy użyciu wiersza polecenia:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      Następnie rozpocznie się szkolenie. Straty dla każdej iteracji zostaną pokazane w wierszu poleceń i zapisane wraz z modelem w folderze save_models/.
3. Sprawdź poprawność obrazów w zestawie treningowym i zestawie testowym przy użyciu wiersza poleceń:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Wyniki przewidywania zostaną zapisane w folderze results/.

8. VISTA w połączeniu z przewidywaniami U-Net dla multipleksacji specyficznej dla białka na obrazach bez znaczników

1. Zmodyfikuj plik csv w data/csvs//test.csv. Zastąp katalogi zarówno path_signal, jak i path_target katalogiem nowych obrazów SRS.
2. Usuń wyniki przewidywania z trenowania, które są folderem results/. Uruchamianie przewidywań przy użyciu wiersza poleceń:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Wyniki przewidywania zostaną zapisane w folderze results//test.

Wyniki

Po ustaleniu zasady działania metody obrazowania i analizy, przeprowadzono rejestrację obrazu, aby ocenić współczynnik rozszerzalności i zapewnić izotropową ekspansję podczas przetwarzania próbki (Rysunek 1A,B). Zarówno próbki niepoddane obróbce, jak i VISTA zostały zobrazowane podczas celowania w wibracje wiązania na wysokości 2940 cm⁻¹, które pochodzą z CH₃ białek endogennych. W próbkach niepoddanych działaniu substancji struktury bogate w białka, takie jak jąd...

Dyskusja

Podsumowując, przedstawiamy protokół dla VISTA, który jest bezznacznikową modalnością obrazowania bogatych w białka struktur komórkowych i subkomórkowych komórek i tkanek. Poprzez celowanie w endogenny CH₃ z białek w komórkach i tkankach zanurzonych w hydrożelu, metoda osiąga efektywną rozdzielczość obrazowania do 78 nm w próbkach biologicznych i rozwiązuje niewielkie wytłaczanie w agregatach huntingtyny i włókienkach w blaszkach Aβ. Technika ta jest pierwszym przypadkiem, w którym rozdzielczość poniżej 100 nm...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa nauka	15710	rozcieńczony do 4% w PBS
25x obiektyw zanurzeniowy w wodzie	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Myszy	z mutacjami Zasoby i Centra Badawcze oraz Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Mózg Alzheimera
60-krotny obiektyw zanurzenia w wodzie	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Akrylamid	Sigma-Aldrich	A9099
nadsiarczan amonu	Sigma-Aldrich	A3678
anty-MAP2	Technologia sygnalizacji komórkowej	8707
Technologia sygnalizacji komórkowej	anty-NeuN	24307
Szkiełko nakrywkowe borokrzemianowe #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Myszy	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normalne myszy
D2O	Sigma-Aldrich	151882	do kalibracji SRS
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
szkiełko szkiełkowe 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
kozia anty-kurza IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
kozia anty-szczurza IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Izolatory silikonowe Press-To-Seal Grace Bio-Labs	Sigma-Aldrich	GBL664108	dystans mikroskopu
Htt-97Q-GFP Plazmid	Prezent od prof. R. Kopito i prof. F.-U.Hartl.
Laserowy mikroskop skaningowy	Olympus	FV3000	laserowy skaningowy mikroskop konfokalny
lipofektamina 3000	Thermo Fisher	L3000001	środek do transfekcji
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight® 594 (lektyna)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Przekładka mikroskopowa	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-metylenobisakryloamid (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	kupiony jako 2% roztwór w wodzie
Woda wolna od nukleaz	Thermo Fisher	10977-015
Penicylina-Streptomycyna	GIBCO	15140-122
Koraliki poliestrowe	Sigma-Aldrich	43302	do charakteryzacji rozdzielczości
Akrylan sodu	Sigma-Aldrich	408220
dodecylosiarczan sodu	Sigma-Aldrich	71725
pędzel z miękkiej wełny #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoSzmaragd	o szerokości
impulsu 2pstetrametyloetylenodiamina	Sigma-Aldrich	T9281
Kolba do hodowli tkankowych 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
pęseta	Fine Science Tool	11295-51
Wibrotomium	Leica	VT1200S	wibratomie