Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Łącząc chemię hydrożelu z ekspandowaniem próbki z bezznacznikową, specyficzną chemicznie, stymulowaną mikroskopią rozpraszania Ramana, protokół opisuje, jak osiągnąć bezznacznikowe obrazowanie wolumetryczne w superrozdzielczości w próbkach biologicznych. Dzięki dodatkowemu algorytmowi segmentacji obrazu opartego na uczeniu maszynowym uzyskano wieloskładnikowe obrazy specyficzne dla białka w tkankach bez znakowania przeciwciałami.
Uniwersalne zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej, zwłaszcza mikroskopii superrozdzielczej, znacznie poszerzyło wiedzę o współczesnej biologii. Z drugiej strony, wymóg znakowania fluoroforem w technikach fluorescencyjnych stwarza poważne wyzwania, takie jak fotowybielanie i niejednolite znakowanie sond fluorescencyjnych oraz długotrwałe przetwarzanie próbek. W protokole przedstawiono szczegółowe procedury pracy w zakresie obrazowania i analizy wibracyjnej pęczniejących tkanek (VISTA). VISTA omija przeszkody związane z fluoroforami i osiąga bezznacznikowe obrazowanie wolumetryczne w superrozdzielczości w próbkach biologicznych z rozdzielczością przestrzenną do 78 nm. Procedura jest ustalana poprzez osadzenie komórek i tkanek w hydrożelu, izotropowe rozszerzanie hybrydy próbki hydrożelu i wizualizację endogennych rozkładów białek za pomocą obrazowania wibracyjnego za pomocą stymulowanej mikroskopii rozpraszania Ramana. Metodę demonstruje się zarówno na komórkach, jak i tkankach mózgowych myszy. Zaobserwowano wysoce skorelowane obrazy VISTA i immunofluorescencyjne, potwierdzając białkowe pochodzenie specyficzności obrazowania. Wykorzystując tę korelację, przeszkolono algorytm segmentacji obrazów oparty na uczeniu maszynowym, aby uzyskać wieloskładnikowe przewidywanie jąder, naczyń krwionośnych, komórek nerwowych i dendrytów na podstawie obrazów mózgu myszy bez znaczników. Procedura została następnie dostosowana do badania patologicznych agregatów poliglutaminy (polyQ) w komórkach i blaszek beta-amyloidu (Aβ) w tkankach mózgowych o wysokiej przepustowości, co uzasadnia jej potencjał w przypadku dużych próbek klinicznych.
Rozwój metod obrazowania optycznego zrewolucjonizował zrozumienie współczesnej biologii, ponieważ dostarczają one bezprecedensowych informacji przestrzennych i czasowych o celach w różnych skalach, od białek subkomórkowych po całe narządy1. Wśród nich mikroskopia fluorescencyjna jest najbardziej ugruntowana, z dużą paletą barwników organicznych o wysokich współczynnikach ekstynkcji i wydajności kwantowej2, łatwe w użyciu genetycznie kodowane białka fluorescencyjne3 oraz metody superrozdzielcze, takie jak STED, PALM i STORM do obrazowania struktur w skali nanometrowej4,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Kalifornijski Instytut Technologii Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), a procedury protokołu były zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi.
1. Przygotowanie roztworów podstawowych do utrwalania i rozszerzania próbki
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Po ustaleniu zasady działania metody obrazowania i analizy przeprowadzono rejestrację obrazów w celu oceny stopnia ekspansji oraz upewnienia się, że podczas przetwarzania próbek zachodzi ekspansja izotropowa (Rycina 1A,B). Zarówno próbki niepoddane obróbce, jak i próbki VISTA obrazowano, celując w drgania wiązań przy 2940 cm−1, pochodzące z grup CH3 białek endogennych. W próbkach niepoddanych obróbce struktury bogate w białka, takie jak jądra komórkowe,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podsumowując, przedstawiamy protokół dla VISTA, który jest bezznacznikową modalnością obrazowania bogatych w białka struktur komórkowych i subkomórkowych komórek i tkanek. Poprzez celowanie w endogenny CH3 z białek w komórkach i tkankach zanurzonych w hydrożelu, metoda osiąga efektywną rozdzielczość obrazowania do 78 nm w próbkach biologicznych i rozwiązuje niewielkie wytłaczanie w agregatach huntingtyny i włókienkach w blaszkach Aβ. Technika ta jest pierwszym przypadkiem, w którym rozdzielczość poniżej 100 nm.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Dziękujemy Caltech Biological Imaging Facility za wsparcie w zakresie oprogramowania. L.W. dziękuje za wsparcie National Institutes of Health (NIH Director's New Innovator Award, DP2 GM140919-01), Amgen (Amgen Early Innovation Award) oraz funduszy start-upowych z California Institute of Technology.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,0 M Tris pH 8 | Sigma-Aldrich | 648314 | |
| 16% paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa nauka | 15710 | rozcieńczony do 4% w PBS |
| 25x obiektyw zanurzeniowy w wodzie | Olympus | XLPLN25XWMP2 | NA 1.05 |
| 5XFAD Myszy | z mutacjami Zasoby i Centra Badawcze oraz Jackson Laboratory | B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax | Mózg Alzheimera |
| 60-krotny obiektyw zanurzenia w wodzie | Olympus | UPLSAPO60XWIR | NA 1.2 |
| Akrylamid | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| nadsiarczan amonu | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| anty-MAP2 | Technologia sygnalizacji komórkowej | 8707 | |
| Technologia sygnalizacji komórkowej | anty-NeuN | 24307 | |
| Szkiełko nakrywkowe borokrzemianowe #1.5 | Fisher Scientific | 1254581 | |
| C57BL/6J Myszy | Jackson Laboratory (JAX) | 664 | Normalne myszy |
| D2O | Sigma-Aldrich | 151882 | do kalibracji SRS |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM | GIBCO | 10566-016 | |
| FBS | GIBCO | A4766 | |
| szkiełko szkiełkowe 3" x 1" x 1 mm | VWR | 16004-430 | |
| kozia anty-kurza IgY, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21449 | |
| kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21236 | |
| kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| kozia anty-szczurza IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11077 | |
| Izolatory silikonowe Press-To-Seal Grace Bio-Labs | Sigma-Aldrich | GBL664108 | dystans mikroskopu |
| Htt-97Q-GFP Plazmid | Prezent od prof. R. Kopito i prof. F.-U.Hartl. | ||
| Laserowy mikroskop skaningowy | Olympus | FV3000 | laserowy skaningowy mikroskop konfokalny |
| lipofektamina 3000 | Thermo Fisher | L3000001 | środek do transfekcji |
| Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight® 594 (lektyna) | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| Przekładka mikroskopowa | Grace Bio-Labs | 621502 | |
| N,N′-metylenobisakryloamid (BIS) | Sigma-Aldrich | M1533 | kupiony jako 2% roztwór w wodzie |
| Woda wolna od nukleaz | Thermo Fisher | 10977-015 | |
| Penicylina-Streptomycyna | GIBCO | 15140-122 | |
| Koraliki poliestrowe | Sigma-Aldrich | 43302 | do charakteryzacji rozdzielczości |
| Akrylan sodu | Sigma-Aldrich | 408220 | |
| dodecylosiarczan sodu | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| pędzel z miękkiej wełny #3 | TANIS | 000333 | |
| SRS Laser | A.P.E | picoSzmaragd | o szerokości |
| impulsu 2pstetrametyloetylenodiamina | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Kolba do hodowli tkankowych 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| pęseta | Fine Science Tool | 11295-51 | |
| Wibrotomium | Leica | VT1200S | wibratomie |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny