Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63828

⸱

2 czerwca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje techniki izolowania pierwotnych mysich hepatocytów z wątroby i elektroportowania CRISPR-Cas9 jako rybonukleoprotein i mRNA w celu zakłócenia terapeutycznego genu docelowego związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną wątroby. Opisane metody skutkują wysoką żywotnością i wysokim poziomem modyfikacji genów po elektroporacji.

Streszczenie

Ten protokół opisuje szybką i skuteczną metodę izolacji pierwotnych hepatocytów myszy, a następnie za pośrednictwem elektroporacji dostarczania CRISPR-Cas9 w postaci rybonukleoprotein (RNP) i mRNA. Pierwotne hepatocyty myszy wyizolowano przy użyciu trzystopniowej metody perfuzji wstecznej, co dało wysoką wydajność do 50 × 106 komórek na wątrobę i żywotność komórek na poziomie >85%. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące posiewu, barwienia i hodowli hepatocytów. Wyniki wskazują, że elektroporacja zapewnia wysoką skuteczność transfekcji wynoszącą 89%, mierzoną procentem komórek dodatnich pod względem zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) i skromną żywotnością komórek wynoszącą >35% w hepatocytach myszy.

Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, CRISPR-Cas9 ukierunkowany na gen dioksygenazy hydroksyfenylopirogronianowej został elektroporowany do pierwotnych hepatocytów myszy jako dowód słuszności edycji genów w celu zakłócenia terapeutycznego genu związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną (IMD) wątroby. W przypadku RNP zaobserwowano wyższą edycję on-target wynoszącą 78% w porównaniu z 47% wydajnością edycji z mRNA. Funkcjonalność hepatocytów oceniono in vitro przy użyciu testu albuminowego, który wykazał, że dostarczanie CRISPR-Cas9 w postaci RNP i mRNA skutkuje porównywalną żywotnością komórek w pierwotnych hepatocytach myszy. Obiecującym zastosowaniem tego protokołu jest generowanie mysich modeli chorób genetycznych człowieka wpływających na wątrobę.

Wprowadzenie

1,2. Jedyną opcją leczenia dla pacjentów z IMD wątroby jest ortotopowe przeszczepienie wątroby, które jest ograniczone ze względu na niską dostępność narządów dawcy i powikłania związane z leczeniem immunosupresyjnym po zabiegu3,4. Zgodnie z ostatnimi danymi zebranymi przez Sieć Pozyskiwania i Transplantacji Narządów, tylko 40%-46% dorosłych pacjentów znajdujących się na liście oczekujących na przeszczep wątroby otrzymuje narząd, podczas gdy 12,3% tych pacjentów umiera będąc na liście oczekujących5. Co więcej, tylko 5% wszystkich rzadkich chorób wątroby ma zatwierdzone przez FDA leczenie6. Oczywiste jest, że istnieje pilna potrzeba opracowania nowatorskich metod leczenia IMD wątroby. Potrzebne są jednak odpowiednie modele chorób do opracowania nowych opcji terapeutycznych.

Modelowanie chorób człowieka za pomocą systemów in vitro i in vivo pozostaje przeszkodą w opracowywaniu skutecznych terapii i badaniu patologii IMD wątroby. Hepatocyty od pacjentów z rzadkimi chorobami wątroby są trudne do uzyskania7. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patologii choroby i testowania strategii terapeutycznych. Jednak jedną z przeszkód jest generowanie modeli z embrionów niosących śmiertelne mutacje. Na przykład próby stworzenia mysich modeli zespołu Alagille'a (ALGS) z zarodkami zawierającymi homozygotyczne delecje sekwencji 5 kb w pobliżu końca 5′ genu Jag1 doprowadziły do wczesnej śmierci zarodków8. Ponadto generowanie modeli myszy poprzez edycję genów w embrionalnych komórkach macierzystych może być czasochłonne i zasobożerne9. Wreszcie, mutacje pojawią się poza tkanką docelową, prowadząc do zmiennych zakłócających, które mogą utrudnić badanie choroby9. Edycja genów somatycznych pozwoliłaby na łatwiejszą edycję w tkance wątroby i ominęłaby wyzwania związane z generowaniem modeli z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych.

Elektroporacja umożliwia dostarczanie CRISPR-Cas9 bezpośrednio do jądra poprzez zastosowanie prądów o wysokim napięciu do przenikania przez błonę komórkową i jest kompatybilna z wieloma typami komórek, w tym z tymi, które są nieprzejednane wobec technik transfekcji, takich jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste, pluripotencjalne komórki macierzyste i neurony10,11,12. Jednak niska żywotność jest potencjalną wadą elektroporacji; Optymalizacja procedury może zapewnić wysoki poziom dostarczania przy jednoczesnym ograniczeniu toksyczności13. Niedawne badanie wykazało wykonalność elektroportowania składników CRISPR-Cas9 do pierwotnych hepatocytów myszy i ludzi jako wysoce wydajnego podejścia14. Elektroporacja ex vivo w hepatocytach może zostać zastosowana do generowania nowych mysich modeli ludzkich IMD wątroby.

Ten protokół zawiera szczegółową procedurę krok po kroku do izolowania mysich hepatocytów z wątroby, a następnie elektroportowania CRISPR-Cas9 jako kompleksów RNP, składających się z białka Cas9 i syntetycznego jednoprowadnicowego RNA (sgRNA), lub mRNA Cas9 połączonego z sgRNA w celu uzyskania wysokiego poziomu edycji genów na miejscu. Ponadto protokół zapewnia metody ilościowego określania wydajności, żywotności i funkcjonalności edycji genów po elektroporacji CRISPR-Cas9 do świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt oraz zatwierdzonymi protokołami na Uniwersytecie Clemson. Procedury chirurgiczne wykonano u znieczulonych myszy szczepu C57BL/6J typu dzikiego w wieku od 8 do 10 tygodni.

1. Operacja chirurgiczna zwierząt

  1. Przygotowanie roztworów i instrumentów
    UWAGA: Składy roztworów perfuzyjnych i koktajlu anestetycznego znajdują się w Tabeli materiałów.
    1. Przygotować Roztwór perfuzyjny 1 (HEPES, EGTA i EBSS), Roztwór perfuzyjny 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl2 i MgSO4) oraz Roztwór perfuzyjny 3 (Roztwór 2 i Liberaza). Należy upewnić się, że roztwory są dobrze wymieszane.
    2. Ustawić kąpiel wodną na 42 °C i podgrzać Roztwory perfuzyjne 1, 2 i 3 przez minimum 30 min przed rozpoczęciem procedury, a następnie pozostawić je w kąpieli wodnej.
      UWAGA: Roztwory perfuzyjne 1 i 2 chelatują wapń i wypłukują krew z wątroby. Roztwór perfuzyjny 3 zawiera enzym trawienny liberazę w celu dysocjacji macierzy zewnątrzkomórkowej.
    3. Nalać 150 mL DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do probówek stożkowych i przechowywać je w lodzie.
      UWAGA: Pożywka ta zostanie użyta do uwalniania komórek z torebki wątroby oraz do przemywania wyizolowanych hepatocytów odpowiednio w krokach 2.1 i 2.2.
    4. Ustawić wirówkę na 4 °C.
    5. Zsterylizować dren pompy, umieszczając oba końce drenu w kolbie wypełnionej 70% etanolem i przepompowując etanol trzy razy.
    6. Przepłukać dren wodą destylowaną i opróżnić go.
    7. Wypełnić dren podgrzanymi 30 mL Roztworu perfuzyjnego 1, a następnie 8 mL Roztworu perfuzyjnego 2. Jeśli w drenie pozostało miejsce na więcej płynów, wypełnić resztę Roztworem perfuzyjnym 3. Należy zatrzymać pompę podczas zmiany roztworu perfuzyjnego, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do drenu.
    8. Umieścić nadmiar drenu w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, aby utrzymać ciepłotę roztworów perfuzyjnych.
    9. Umieścić koniec drenu pompy w probówce stożkowej zawierającej Roztwór perfuzyjny 3, utrzymując go w kąpieli wodnej.
      UWAGA: Krok ten jest niezbędny, aby pompa mogła być stale napełniana Roztworem perfuzyjnym 3 podczas perfuzji.
  2. Przygotowanie zwierzęcia
    1. Zanestetyzować mysz poprzez domięśniowy wstrzyknięcie koktajlu anestetycznego w dawce 10-11,7 µL/g masy ciała. Koktajl anestetyczny ma stężenie końcowe 7,5 mg/mL ketaminy, 0,25 mg/mL acepromazyny i 1,5 mg/mL ksylazyny.
    2. Monitorować oddychanie myszy i sprawdzić, czy zwierzę nie reaguje na ból. Czekać, aż częstotliwość oddechów myszy wyniesie ~55-65 oddechów na min, mysz przestanie reagować na uszczypnięcie w palce u łap, a ogon stanie się wiotki. Dodatkowo sprawdzić odruch powiekowy, lekko dotykając skóry po stronie przyśrodkowej zamkniętego oka. Jeśli mysz mrugnie lub mięśnie oka drgną, zwiększyć dawkę całego koktajlu anestetycznego o 5-10 µL.
    3. Położyć mysz na plecach w pozycji supine i unieruchomić kończyny na powierzchni za pomocą pinezek lub taśmy (Rycina uzupełniająca S1).
    4. Spryskać brzuch 70% etanolem i osuszyć go za pomocą waty.
  3. Perfuzja wątroby
    1. Wyciąć nożyczkami boczny nacięcie w kształcie litery U w skórze brzucha i rozszerzyć otwór po bokach.
    2. Kontynuować rozcinanie skóry aż do klatki piersiowej.
    3. Za pomocą nożyczek przeciąć otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną aż do klatki piersiowej, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z narządów. Przesunąć jelita na prawą stronę za pomocą grzbietu pęsety lub tępym końcem nożyczek. Zidentyfikować żyłę główną dolną oraz żyłę wrotną (Rycina uzupełniająca S1).
    4. Uruchomić pompę, aby przepłukać cewnik podgrzanym roztworem perfuzyjnym.
    5. Zatrzymać pompę i usunąć cewnik po przepłukaniu całego powietrza z systemu. Wprowadzić końcówkę igły połączonej z cewnikiem do żyły głównej dolnej pod kątem 10°-20° względem żyły. Wyjąć igłę z cewnika i delikatnie wsunąć cewnik do żyły ruchem równoległym do niej.
      ​UWAGA: Użytkownik powinien zaobserwować cofanie się krwi do cewnika, co potwierdza prawidłowe kaniulowanie żyły.
    6. Podłączyć dren do cewnika, nie przesuwając go dalej do wnętrza żyły.
    7. Uruchomić pompę z przepływem 2 mL/min. Natychmiastowe zbladnięcie wątroby jest sygnałem, że perfuzja przebiega pomyślnie.
    8. Przeciąć żyłę wrotną za pomocą nożyczek.
    9. Stopniowo zwiększyć przepływ do 5 mL/min.
    10. Okresowo uciskać żyłę wrotną w przybliżonym miejscu cięcia przez 3 s za pomocą pęsety lub patyczka z watą, aby zablokować drenaż i ułatwić skuteczną perfuzję.
    11. Gdy zacznie płynąć Roztwór perfuzyjny 3, uważnie monitorować elastyczność wątroby. Aby ocenić, czy wątroba zmiękła, delikatnie nacisnąć ją patyczkiem z watą lub pęsetą i sprawdzić, czy na wątrobie powstają wgłębienia. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej perfuzji, co mogłoby spowodować utratę żywotności komórek.
    12. Po zmięknięciu wątroby (co następuje po przepłynięciu 30-50 mL Roztworu perfuzyjnego 3), zatrzymać pompę, usunąć cewnik i ostrożnie wypreparować wątrobę. Umieścić wątrobę w szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej lodowatą pożywkę DMEM + 10% FBS. Wyciąć pęcherzyk żółciowy, uważając, aby nie wylać jego zawartości. Zakręcić szalką Petriego, aby delikatnie usunąć ewentualne skrzepy krwi.
    13. Przenieść wątrobę do nowej szalki Petriego zawierającej lodowatą pożywkę DMEM + 10% FBS.

2. Izolacja hepatocytów

  1. Uwolnienie komórek z torebki wątroby.
    1. Umieść szalkę Petriego na lodzie i za pomocą dwóch par sterylnych pęset delikatnie rozdarj torebkę wątroby we wszystkich płatach. Delikatnie zamieszaj wątrobą w medium, używając scrapra do komórek lub pęsety, aby uwolnić hepatocyty. Kontynuuj ten ruch, aż wątroba stanie się bardzo mała, a zawiesina brązowa i nieprzezroczysta.
    2. Usuń pozostałości tkanki wątroby z płytki i za pomocą pipety serologicznej 25 mL ustawionej na niską prędkość ostrożnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 50 mL (schłodzonej wcześniej na lodzie) wyposażonej w sitko komórkowe 100 μm.
    3. Dodaj do szalki Petriego świeże, lodowate medium DMEM + 10% FBS, aby wypłukać i zebrać pozostałe komórki z powierzchni, a następnie przenieś je do probówki stożkowej 50 mL. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie komórki zostaną zebrane.
  2. Przemywanie i oczyszczanie hepatocytów z komórek nieparenchymalnych.
    1. Wirowarkuj komórki zebrane w probówce stożkowej 50 mL przy 50 × g w temperaturze 4 °C przez 5 min przy niskim hamowaniu lub bez użycia hamulca.
    2. Odlej nadsącz zawierający zanieczyszczenia i komórki nieparenchymalne, a osad resuspenduj w pozostałym nadsączu, delikatnie obracając probówkę. Po resuspensji osadu dodaj 30 mL świeżego, lodowatego medium DMEM + 10% FBS.
    3. Powtórz wirowanie (krok 2.2.1) i przemywanie (krok 2.2.3) trzy razy.
    4. Resuspenduj końcowy osad komórkowy w 10 mL lodowatego medium DMEM + 10% FBS.
      UWAGA: Objętość medium użytego do resuspensji osadu zależy od wielkości osadu. Jeśli osad jest znacznie mniejszy niż 15 mm, użyj 1-5 mL lodowatego medium DMEM + 10% FBS.
  3. Ilościowe oznaczanie żywotności komórek
    1. Do probówki do mikrowirowarki dodaj 50 µL 0,4% roztworu błękitu trypanu do 350 µL medium do wysiewu hepatocytów (PM). Następnie dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:5, i kilkukrotnie pipetuj w górę i w dół w celu wymieszania.
    2. Oznacz gęstość i żywotność komórek za pomocą komory hemocytometrycznej. Podczas liczenia trzymaj zawiesinę hepatocytów na lodzie, a naczynie z lodem umieść na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30 rpm, aby zapobiec sedymentacji hepatocytów.
    3. Jeśli żywotność komórek wynosi <70%, wykonaj poniższe kroki obróbki Percollem i wirowania.
      1. Rozcieńcz Percoll w 10-krotnym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w stosunku 9:1.
      2. Wymieszaj zawiesinę hepatocytów z rozcieńczonym Percollem w stosunku 1:1.
      3. Wiruj przy 200 × g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
      4. Odlej nadsącz zawierający martwe komórki. Resuspenduj osad w lodowatym medium DMEM + 10% FBS.
      5. Policz komórki ponownie.
  4. Testowanie zdolności hepatocytów do przylegania
    1. Wysiej część komórek na płytki 6-dołkowe pokryte kolagenem I z gęstością 0,5 × 106 komórek na mL, używając 1,5 mL podgrzanego medium PM.
    2. Przechowuj pozostałe komórki na lodzie na wytrząsarce orbitalnej do czasu rozpoczęcia elektroporacji.
    3. Umieść płytkę z komórkami w inkubatorze CO2 z płaszczem wodnym w temperaturze 37 C. Poruszaj płytką delikatnie w poziomie i pionie, wykonując ruchy z północy na południe i ze wschodu na zachód, aby zapewnić homogeniczny wysiew. Powtórz ten ruch jeszcze dwa razy co 1,5 h.
    4. Zweryfikuj przyleganie komórek 3 h po wysiewie.
      UWAGA: Przynajmniej 60% komórek powinno przylgnąć do płytki, co jest wskaźnikiem wysokiej jakości hepatocytów.
    5. Wymień medium na podgrzane medium do hodowli hepatocytów (MM) 24 h po wysiewie, aby utrzymać komórki w kulturze.
  5. Barwienie glikogenu
    1. Po przylgnięciu komórek do płytek 6-dołkowych pokrytych kolagenem I usuń zużyte medium z hodowlanych komórek.
    2. Utrwal komórki przez 10-15 min w lodowatym etanolu.
    3. Przemyj dokładnie sterylną wodą.
    4. Inkubuj w 1% wodnym roztworze kwasu okresowego przez 5 min, a następnie przemyj sterylną wodą.
    5. Inkubuj w 100% odczynniku Schiffa przez 30 min.
      UWAGA: Odczynnik Schiffa nie może być rozcieńczany przed dodaniem do komórek.
    6. Przemywaj wodą trzy razy w ciągu 10 min.
    7. Zamontuj w medium montażowym.
    8. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu w ustawieniu pola jasnego.

3. Projektowanie sgRNA do edycji genów CRISPR-Cas9

UWAGA: Niniejsza sekcja opisuje projekt sgRNA celującego w mysi gen hydroksyfenylopirogronianowej dioksygenazy (Hpd) jako dowód koncepcji edycji genów w celu znokautowania genu celu terapeutycznego związanego z IMD wątroby.

  1. Zaprojektuj sekwencję naprowadzającą celującą w Hpd, korzystając z referowanego oprogramowania15.
  2. Zweryfikuj sekwencję Hpd w przeglądarce genomu Ensembl Genome Browser.
  3. Do projektowania gRNA zastosuj następujące parametry: długość pojedynczego przewodnika wynosząca 20 nukleotydów oraz sekwencję motywu PAM (protospacer-adjacent motif) NGG (gdzie N może być dowolnym nukleotydem).
  4. Wybierz region docelowy z eksonu 3 w genie Hpd.
  5. Wygeneruj listę sekwencji naprowadzających z regionu docelowego wraz z wynikami On-Target i Off-Target Score.
    UWAGA: Wynik On-Target Score wskazuje przewidywaną wydajność edycji w miejscu docelowym dla danego projektu: wyższy wynik koreluje z wyższą wydajnością edycji. Wynik Off-Target Score koreluje ze specyficznością sekwencji naprowadzającej: wyższy wynik wskazuje na niższe prawdopodobieństwo edycji poza celem. Idealnie oba wyniki powinny być wysokie: On-Target Score >60 oraz Off-Target Score >50.
  6. Wybierz sekwencję naprowadzającą z najwyższymi wynikami On-Target i Off-Target Score. Zleć chemiczną syntezę sgRNA zawierającego wybraną sekwencję naprowadzającą.

4. Elektroporacja i hodowla komórek

  1. Przygotowanie substratów CRISPR-Cas9, pożywek, komórek oraz urządzenia do elektroporacji
    1. Dodać cały dołączony suplement do PM i ogrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 10 min.
    2. Włączyć urządzenie do elektroporacji, naciskając przycisk power, a następnie ustawić program elektroporacji, naciskając przycisk x, a potem przycisk strzałki w dół, aż na ekranie pojawi się program T-028.
    3. Przygotować docelowe studzienki dla elektroporowanych hepatocytów, dodając 1,5 mL PM do sześciostudzienkowych płytek pokrytych kolagenem I. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
    4. Dodać cały dołączony suplement do buforu do elektroporacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      UWAGA: Należy zapisać datę ważności buforu do elektroporacji na fiolce (3 miesiące od daty dodania suplementu).
    5. Wyjąć naczynia do elektroporacji z opakowania i opisać je dla każdej próbki.
    6. W probówkach PCR w paskach przygotować kompleksy RNP Cas9, łącząc 30 µg sgRNA z 300 pmol białka Cas9, a następnie inkubować kompleksy w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przygotować mRNA Cas9, łącząc 30 µg sgRNA z 4 µL mRNA Cas9 (1 µg/µL). Mieszaninę mRNA-sgRNA przechowywać na lodzie do czasu elektroporacji. Oddzielnie przygotować probówkę zawierającą 1,0 µg mRNA eGFP w celu weryfikacji pomyślnej elektroporacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    7. Wirować 1,2 × 106 komórek na reakcję elektroporacji przy 100 × g przez 2 min w temperaturze 4 °C.
    8. Usunąć nadosad z osadu komórkowego i dodać 100 µL roztworu do elektroporacji na reakcję, wlewając go wzdłuż ścianki probówki. Resuspendować hepatocyty w roztworze do elektroporacji, delikatnie obracając probówkę ręką.
  2. Elektroporacja RNP CRISPR-Cas9 i mRNA do hepatocytów
    1. Gdy hepatocyty będą równomiernie rozproszone w roztworze do elektroporacji, przenieść 100 µL zawiesiny hepatocytów do probówek w paskach zawierających kompleksy Cas9.
      UWAGA: Podczas przenoszenia hepatocytów należy używać końcówek do pipet o szerokim otworze, aby zachować żywotność komórek.
    2. Przenieść zawartość studzienki paska do naczynia do elektroporacji.
    3. Umieścić naczynie typu nucleovette w gnieździe urządzenia do elektroporacji. Przeprowadzić elektroporację hepatocytów, naciskając przycisk x. Po elektroporacji poczekać, aż na ekranie urządzenia pojawi się komunikat OK. Ponownie nacisnąć przycisk x i wyjąć naczynie.
    4. Inkubować naczynie po elektroporacji na lodzie przez 15 min.
    5. Dodać 500 µL uprzednio ogrzanego PM do naczynia do elektroporacji.
    6. Przenieść 300 µL reakcji elektroporacji do każdej docelowej studzienki na ogrzanej płytce.
      UWAGA: Na każdą reakcję elektroporacji powinny przypadać dwie docelowe studzienki. Jedna studzienka zostanie wykorzystana do ilościowego określenia wydajności edycji genów, a druga do testów MTT i oznaczania albumin.
    7. Aby zapobiec gromadzeniu się hepatocytów w centrum studzienki, rozproszyć komórki, delikatnie poruszając płytkami w płaszczyźnie poziomej i pionowej (z północy na południe i ze wschodu na zachód). Należy upewnić się, że płytka utrzymuje kontakt z półką inkubatora podczas poruszania. Powtórzyć ten ruch w 15, 30, 45, 60 i 90 min po wysianiu elektroporowanych hepatocytów.
    8. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
    9. Usunąć pożywkę ze studzienek przeznaczonych do analizy edycji genów 24 h po wysianiu komórek i zastąpić ją warstwą matrycy błony podstawnej o stężeniu 0,25 mg/mL.
      UWAGA: Jeśli matryca była przechowywana w zamrażarce, przenieść ją do temperatury 4 °C i pozwolić jej odmarznąć. Ponieważ matryca błony podstawnej jest ciałem stałym powyżej 10 °C, kluczowe jest, aby pozostawała ona na lodzie lub w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

5. Oblicz objętość macierzy membranowej, którą należy zmieszać z MM, aby uzyskać stężenie końcowe 0,25 mg/mL

UWAGA: W przypadku płytki 6-dołkowej wymagane jest 2 mL warstwy pokrywczej na dołek.

6. Dodaj obliczoną objętość matrycy błonowej do schłodzonego na lodzie MM i wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy

  1. Powoli nanieś pipetą mieszaninę nakładki na komórki, a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  2. Wymieniaj pożywkę na świeżą pożywkę utrzymującą co 24 h.
  3. Po 24 h od wysiania komórek przenieś pożywkę warunkującą z dołka przeznaczonego do testów MTT i albumin. Przechowuj pożywkę warunkującą w probówce do mikrowirówki do czasu przeprowadzenia analizy albumin. Przejdź do kroku 7.1 w celu wykonania testu MTT.
    UWAGA: Pożywkę warunkującą przechowuj w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania (mniej niż jeden dzień). W przypadku dłuższego przechowywania przechowuj pożywkę w temperaturze -80 °C.

7. Analiza wydajności dostarczania, żywotności oraz edycji docelowej w elektroporowanych hepatocytach myszy

  1. Pomiar żywotności za pomocą testu MTT
    1. Przygotować roztwór zapasowy MTT o stężeniu 12 mM, dodając 1 mL PBS do jednej fiolki MTT zawierającej 5 mg substancji.
    2. Do dołków dodać 150 µL roztworu zapasowego MTT i inkubować przez 24 h.
    3. Po inkubacji do każdego dołka dodać 1,5 mL roztworu dodecylosiarczanu sodu i chlorowodoru (SDS-HCl), a następnie wymieszać za pomocą pipety.
    4. Inkubować płytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C; zmiana koloru medium z bezbarwnego na fioletowy wskazuje na obecność żywych komórek.
    5. Każdą próbkę ponownie wymieszać pipetą i odczytać absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
    6. Obliczyć znormalizowaną żywotność dla próbek traktowanych Cas9 zgodnie z równaniem (1):
      Wzór na stosunek absorbancji dla żywotności komórek przedstawiony na schemacie wyników eksperymentu. (1)
  2. Test albuminy w celu oceny funkcjonalności hepatocytów
    1. Przenieść 50 µL medium kondycjonowanego do dołków w płytce dostarczonej w zestawie do oznaczania albuminy. Przykryć dołki i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyć dołki 5 razy, używając 200 µL buforu do mycia.
    3. Odwrócić płytkę, aby opróżnić każdy dołek na papier ręcznikowy, i kilkakrotnie stuknąć.
    4. Po przemyciu do każdego dołka dodać 50 µL biotynilowanego przeciwciała z zestawu do oznaczania albuminy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    5. Powtórzyć kroki 5.2.2-5.2.3 w celu przemycia dołków.
    6. Do każdego dołka dodać 50 µL streptawidyny-peroksydazy z zestawu do oznaczania albuminy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    7. Powtórzyć krok 5.2.2.
    8. Do każdego dołka dodać 50 µL substratu chromogennego z zestawu do oznaczania albuminy i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Delikatnie stuknąć płytką, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Usunąć pęcherzyki powietrza końcówką pipety.
    9. Na koniec do każdego dołka dodać 50 µL roztworu stopującego; zmiana koloru z żółtego na niebieski wskazuje na funkcjonalność komórek.
    10. Niezwłocznie odczytać absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  3. Oszacowanie wydajności dostarczania w dołkach elektroporowanych mRNA eGFP.
    1. Wykonać obrazy hepatocytów w kontraście fazowym i fluorescencji zielonej 24 h po elektroporacji. Wykonać trzy zdjęcia w różnych miejscach w obrębie dołka.
    2. Przesłać obrazy komórek do programu ImageJ. W zakładce Image wybrać Type | 16-bit, aby przekonwertować obraz na skalę szarości.
    3. Aby wyróżnić struktury komórkowe na obrazie, w zakładce Image wybrać Adjust | Threshold. Dostosować suwak, aby wyeksponować komórki.
    4. W zakładce Process wybrać Subtract Background, aby usunąć szum tła.
    5. Policzyć komórki, klikając zakładkę Analyze , a następnie wybierając Analyze particles. Kliknąć Ok , aby wygenerować listę policzonych cząstek.
    6. Obliczyć procent komórek GFP-dodatnich, dzieląc liczbę policzonych cząstek na obrazach fluorescencji zielonej przez liczbę policzonych cząstek na odpowiadającym im obrazie w kontraście fazowym.
  4. Analiza aktywności on-target Cas9
    1. Wyizolować DNA genomiczne z elektroporowanych komórek.
      1. Usunąć medium z płytki 3 dni po elektroporacji i dodać 500 μL 0,25% trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. Po inkubacji kilkakrotnie pipetować, aby upewnić się, że hepatocyty oddzieliły się od płytki.
      2. Przenieść zawiesinę komórek potraktowanych trypsyną do probótek do mikrocentryfugi i wirować w wirówce stołowej przy 800 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu sprawdzić obecność osadu w probówkach.
      3. Usunąć nadsącz zawierający trypsynę za pomocą pipety, dbając o to, aby nie naruszyć osadu. Resuspender osad w 80 µL roztworu do ekstrakcji DNA. Jeśli osad jest słabo widoczny, resuspender zawartość probówki w 50 µL roztworu do ekstrakcji DNA.
      4. Wymieszać na wirówce typu vortex przez 30 s, aby zapewnić całkowitą resuspensję osadu. Przenieść zawiesinę do pasków probówek do PCR i umieścić je w termocyklerze. Inkubować przez 15 min w 95 °C oraz 8 min w 68 °C.
    2. Przeprowadzić amplifikację PCR locus on-target.
    3. W celu amplifikacji regionu on-target genu Hpd przy użyciu polimerazy DNA postępować zgodnie z poniższą procedurą.
      1. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą 0,5 µL 10 mM dNTP, 0,5 µL 10 µM startera Forward, 0,5 µL 10 µM startera Reverse, 0,125 µL polimerazy Taq, 5 µL DNA genomicznego wyizolowanego z hepatocytów oraz 18,375 µL wody wolnej od nukleaz. Sekwencje starterów znajdują się w Supplemental Table S1.
      2. Krótko wymieszać na vortexie i szybko odwirować mieszaninę PCR, aby roztwór znalazł się na dnie probówki.
      3. Umieścić mieszaninę PCR w termocyklerze i amplifikować w następujących warunkach: 94 °C przez 30 s (denaturacja), 30 cykli: 94 °C przez 30 s, 57 °C przez 45 s (przyłączanie), 68 °C przez 1 min, oraz końcowa elongacja w 68 °C przez 5 min.
        UWAGA: Temperatura przyłączania w reakcji PCR będzie się różnić w zależności od składu starterów. Przed wykonaniem PCR zaleca się skorzystanie z kalkulatora temperatury topnienia.
      4. Aby potwierdzić prawidłowy rozmiar produktu, zmieszać 3 µL produktów PCR z 2 µL wody i 1 µL barwnika 6x. Rozdzielić w 1,5% żelu agarozowym i potwierdzić prawidłowy rozmiar produktu.
    4. Oczyścić DNA za pomocą kulek magnetycznych.
      UWAGA: Do oczyszczania produktów PCR można również użyć kolumienek wirowych. Poniżej przedstawiono procedurę oczyszczania produktów PCR z użyciem kulek magnetycznych.
      1. Wyjąć kulki magnetyczne z temperatury 4 °C i pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową.
      2. Krótko wymieszać na vortexie i szybko odwirować mieszaninę PCR.
      3. Dodać objętość kulek równą 1,8× objętości mieszaniny PCR. Pipetować mieszaninę PCR z kulkami 10 razy, aby zapewnić jednorodne wymieszanie roztworu.
      4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      5. Przenieść mieszaninę PCR z kulkami do płytki PCR i umieścić ją na płytce magnetycznej.
      6. Inkubować płytkę na magnesie przez 5 min. Po 5 minutach sprawdzić, czy roztwór jest klarowny, a kulki są przyciągnięte do magnesu przed przejściem do kolejnego kroku.
      7. Usunąć nadsącz.
      8. Do dołka dodać 200 µL 70% etanolu i inkubować przez 30 s.
        UWAGA: 70% etanol należy przygotować tuż przed oczyszczaniem, aby zapobiec utracie DNA.
      9. Usunąć nadsącz i powtórzyć krok 7.4.4.8.
      10. Usunąć nadsącz i pozostawić do wyschnięcia przez 3 min w temperaturze pokojowej w celu usunięcia śladów etanolu.
      11. Zdjąć płytkę z magnesu i dodać 22 µL wody do próbki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać wodę z kulkami.
      12. Inkubować próbki przez 3 min w temperaturze pokojowej.
      13. Przenieść płytkę z powrotem na magnes i inkubować przez 3 min lub do momentu, aż roztwór stanie się klarowny.
      14. Przenieść 20 µL próbki do probówki PCR. Należy uważać, aby nie przenieść kulek.
    5. Przeprowadzić sekwencjonowanie oczyszczonego amplikonu DNA metodą Sangera.
    6. Przesłać pliki sekwencji .ab1 dla próbek traktowanych i kontrolnych (nietraktowanych) do programu Tracking of indels by Decomposition (TIDE)16 w celu ilościowego oznaczenia indeli w miejscu docelowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja pierwotnych hepatocytów z wątroby do hodowli na płytkach
Cały proces perfuzji wątroby i izolacji hepatocytów przedstawiono na Rysunku 1. W tym doświadczeniu wykorzystano myszy szczepu C57BL6/6J typu dzikiego w wieku 8-10 tygodni. Przewiduje się, że procedura pozwoli na uzyskanie 20-50 × 106 komórek na mysz, przy żywotności od 85% do 95%. Jeśli żywotność wynosi <70%, należy przeprowadzić zabieg z użyciem Percoll w celu usunięcia martwych komórek. Św...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki opisane w protokole izolacji hepatocytów są trudne i wymagają praktyki, aby osiągnąć biegłość. Istnieje kilka kluczowych etapów udanej izolacji hepatocytów z wątroby. Po pierwsze, prawidłowa kaniulacja żyły głównej dolnej jest niezbędna do całkowitej perfuzji wątroby. Brak blanszowania w wątrobie po perfuzji wskazuje na przemieszczenie cewnika (Tabela 1). Żyła główna dolna (perfuzja wsteczna) została kaniulowana w procedurze, ponieważ jest prostsza i bardziej dostępna niż żyła wrotna (perfuzja wste...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

RNC otrzymało finansowanie z pilotażowego grantu Centrum Bioinżynierii Południowej Karoliny wspieranego przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) of the National Institutes of Health, American Association for the Study of Liver Diseases Foundation oraz American Society of Gene & Cell Therapy pod numerami grantów P30 GM131959, 2021000920, i 2022000099. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Amerykańskiego Towarzystwa Terapii Genowej i Komórkowej (American Society of Gene & Cell Therapy) lub Fundacji Amerykańskiego Towarzystwa Badań nad Chorobami Wątroby. Schemat do rysunku 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
0,2 mL 8-tubowy pasek FLEX-FREE do PCR, dołączone przezroczyste płaskie nakrętki, naturalneUSA Scientific1402-4700
6-dołkowe płytki kolagenoweAdvanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
Wielofunkcyjny mikroskop fluorescencyjnyKeyenceBZ-X810
Analogowy mieszalnik wirowyVWR97043-562
ART Końcówki z filtrem o szerokim otworze 1,000 &mikro; LThermoFisher Scientific2079GPK
Automatyczny licznik komórekBio-Rad LaboratoriesTC20
Niebieska taca do wywarstwianiawosku Braintree Scientific Inc.DTW19" x 6,5" x 1/2"+F21
Skrobak/podnośnik do komórekArgos TechnologiesUX-04396-53Niepirogenne, sterylne
Probówki stożkowe (15 ml)Fisher Scientific339650
Probówki stożkowe (50 ml)Fisher Scientific14-432-22
Aplikatory bawełnianeFisher Scientific22-363-170
Zakrzywione nożyczkiCooper Surgical62131
Jednorazowe szalki PetriegoFalcon351029100mm, sterylne
jednorazowe szalki PetriegoVWR25373-10035mm, sterylny
spektrofotometr mikropłytkowy EpochInstrumenty BioTek250082
Filtr siatkowy Falcon Cell (70 µ m)Fisher Scientific08-771-2
KleszczeCooper Surgical61864Euro-Med Adson Kleszcze do tkanek
Cewniki IV dożylnej BD38261224 G x 0,75 cala
Baxter2C6401
MyFuge 12 Mini wirówkaBenchmark Scientific1220P38
IgłyFisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b UrządzenieLonzaAAB-1001Program T-028 został użyty do elektroporacji w hepatocytach myszy
Pompa perystaltycznaMasterflex  HV-77120-42Od 10 do 60 obr./min; 90 do 260 VAC
Rurki pompy precyzyjnejMasterflexHV-96410-1425 ft, silikonowe
Płytki hodowlane PrimariaCorning Life Sciences353846Płytki do hodowli tkankowych zawierające azot
Pipety serologiczne (25 ml)Fisher Scientific12-567-604
StrzykawkiBD3294641 mL, sterylne
T100 Thermal CyclerBio-Rad Laboratories1861096
Łaźnia wodnaALT27577Thermo Scientific Precyzyjny mikroprocesor sterowany serią 280, 2,5 l
odczynniki
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mLFisher ScientificNC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap  EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel MatrixCorning Life Sciences356234
DMEMThermoFisher Scientific11885076Niski poziom glukozy, pirogronian
Etanol 70%VWR71001-652
Surowica bydlęcapłodu Thermoscientific26140-079
Utrzymanie hepatocytów Medium (MM)LonzaMM250
Pożywka do powlekania hepatocytów (PM)LonzaMP100
Zestaw ELISA do albuminy myszyFisher Scientific NC0010653
Zestaw nukleofektorów hepatocytów myszy/szczura LonzaVPL-1004
Polimeraza DNA OneTaq HotStartNew England BiolabsM0481L
PBS 10x pH 7,4 Thermoscientific70011-044Bez chlorku wapnia lub magnezu
Percoll (roztwór PVP)Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
Kwas okresowySigma-AldrichP7875-25G
Podłoże montażowe PermountVWR100496-550
Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtractLucigen CorporationQE05090
Schiff' s odczynnik siarczynowo-fuksynowySigma-AldrichS5133
Trypsyna-EDTA (0,25%)ThermoFisher Scientific25200056w czerwieni fenolowej
VybrantThermoFisher ScientificV13154
Roztwór perfuzyjny 1 (pH 7,4, sterylizowany filtrem)  stabilny przy 4 stopniach; C przez 2 miesiące
EBSSFisher Scientific 14155063Complete do 200 mL
EGTA (0,5 M)Bioworld40520008-1200 &mikro; L
HEPES (pH 7,3, 1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
Roztwór perfuzyjny 2 (pH 7,4, sterylizowany filtrem)  stabilny przy 4 stopniach; C przez 2 miesiące
CaCl2· 2H20 (1,8 mM)SigmaC7902-500G360 µ L z 1 M zapasów 
EBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej)Fisher Scientific14-155-063Kompletny do 200 ml
HEPES (1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
MgSO4 i kropka środkowa; 7H20 (0,8 mM)Sigma30391-25G160 &mikro; L z 1 M zapasu
Roztwór perfuzyjny 3  Przygotowany świeżo przed użyciem
Roztwór 250 ml
LiberaseRoche54011270010,094 jednostek Wunsch / ml
Koktajl znieczulający dla myszy 
Acepromzine0,25 mg/ml stężenie końcowe
Ketamina7,5 mg/ml stężenie końcowe
Ksylazyna1,5 mg/ml stężenie końcowe
SoftwareURL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Śledzenie indeli przez dekompozycjęhttps://tide.nki.nl/
Zestaw do infuzji Test żywotności komórek MTT

Bibliografia

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117(2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584(2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja hepatocytówdostarczanie drogą elektroporacjiedycja CRISPR-Cas9transfekcja mRNAperfuzja wstecznawyciszanie genówoznaczenie albuminyfluorescencja GFP
Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.