Ten protokół opisuje techniki izolowania pierwotnych mysich hepatocytów z wątroby i elektroportowania CRISPR-Cas9 jako rybonukleoprotein i mRNA w celu zakłócenia terapeutycznego genu docelowego związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną wątroby. Opisane metody skutkują wysoką żywotnością i wysokim poziomem modyfikacji genów po elektroporacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje szybką i skuteczną metodę izolacji pierwotnych hepatocytów myszy, a następnie za pośrednictwem elektroporacji dostarczania CRISPR-Cas9 w postaci rybonukleoprotein (RNP) i mRNA. Pierwotne hepatocyty myszy wyizolowano przy użyciu trzystopniowej metody perfuzji wstecznej, co dało wysoką wydajność do 50 × 106 komórek na wątrobę i żywotność komórek na poziomie >85%. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące posiewu, barwienia i hodowli hepatocytów. Wyniki wskazują, że elektroporacja zapewnia wysoką skuteczność transfekcji wynoszącą 89%, mierzoną procentem komórek dodatnich pod względem zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) i skromną żywotnością komórek wynoszącą >35% w hepatocytach myszy.
Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, CRISPR-Cas9 ukierunkowany na gen dioksygenazy hydroksyfenylopirogronianowej został elektroporowany do pierwotnych hepatocytów myszy jako dowód słuszności edycji genów w celu zakłócenia terapeutycznego genu związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną (IMD) wątroby. W przypadku RNP zaobserwowano wyższą edycję on-target wynoszącą 78% w porównaniu z 47% wydajnością edycji z mRNA. Funkcjonalność hepatocytów oceniono in vitro przy użyciu testu albuminowego, który wykazał, że dostarczanie CRISPR-Cas9 w postaci RNP i mRNA skutkuje porównywalną żywotnością komórek w pierwotnych hepatocytach myszy. Obiecującym zastosowaniem tego protokołu jest generowanie mysich modeli chorób genetycznych człowieka wpływających na wątrobę.
Wprowadzenie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt oraz zatwierdzonymi protokołami na Uniwersytecie Clemson. Procedury chirurgiczne wykonano u znieczulonych myszy szczepu C57BL/6J typu dzikiego w wieku od 8 do 10 tygodni.
1. Operacja chirurgiczna zwierząt
- Przygotowanie roztworów i instrumentów
UWAGA: Składy roztworów perfuzyjnych i koktajlu anestetycznego znajdują się w Tabeli materiałów.- Przygotować Roztwór perfuzyjny 1 (HEPES, EGTA i EBSS), Roztwór perfuzyjny 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaC....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Izolacja pierwotnych hepatocytów z wątroby do hodowli na płytkach
Cały proces perfuzji wątroby i izolacji hepatocytów przedstawiono na Rysunku 1. W tym doświadczeniu wykorzystano myszy szczepu C57BL6/6J typu dzikiego w wieku 8-10 tygodni. Przewiduje się, że procedura pozwoli na uzyskanie 20-50 × 106 komórek na mysz, przy żywotności od 85% do 95%. Jeśli żywotność wynosi <70%, należy przeprowadzić zabieg z użyciem Percoll w celu usunięcia martwych komórek. Św.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kroki opisane w protokole izolacji hepatocytów są trudne i wymagają praktyki, aby osiągnąć biegłość. Istnieje kilka kluczowych etapów udanej izolacji hepatocytów z wątroby. Po pierwsze, prawidłowa kaniulacja żyły głównej dolnej jest niezbędna do całkowitej perfuzji wątroby. Brak blanszowania w wątrobie po perfuzji wskazuje na przemieszczenie cewnika (Tabela 1). Żyła główna dolna (perfuzja wsteczna) została kaniulowana w procedurze, ponieważ jest prostsza i bardziej dostępna niż żyła wrotna (perfuzja wste.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
RNC otrzymało finansowanie z pilotażowego grantu Centrum Bioinżynierii Południowej Karoliny wspieranego przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) of the National Institutes of Health, American Association for the Study of Liver Diseases Foundation oraz American Society of Gene & Cell Therapy pod numerami grantów P30 GM131959, 2021000920, i 2022000099. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Amerykańskiego Towarzystwa Terapii Genowej i Komórkowej (American Society of Gene & Cell Therapy) lub Fundacji Amerykańskiego Towarzystwa Badań nad Chorobami Wątroby. Schemat do rysunku 1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt | |||
| 0,2 mL 8-tubowy pasek FLEX-FREE do PCR, dołączone przezroczyste płaskie nakrętki, naturalne | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-dołkowe płytki kolagenowe | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Wielofunkcyjny mikroskop fluorescencyjny | Keyence | BZ-X810 | |
| Analogowy mieszalnik wirowy | VWR | 97043-562 | |
| ART Końcówki z filtrem o szerokim otworze 1,000 &mikro; L | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automatyczny licznik komórek | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Niebieska taca do wywarstwiania | wosku Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6,5" x 1/2"+F21 |
| Skrobak/podnośnik do komórek | Argos Technologies | UX-04396-53 | Niepirogenne, sterylne |
| Probówki stożkowe (15 ml) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Probówki stożkowe (50 ml) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aplikatory bawełniane | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Zakrzywione nożyczki | Cooper Surgical | 62131 | |
| Jednorazowe szalki Petriego | Falcon | 351029 | 100mm, sterylne |
| jednorazowe szalki Petriego | VWR | 25373-100 | 35mm, sterylny |
| spektrofotometr mikropłytkowy Epoch | Instrumenty BioTek | 250082 | |
| Filtr siatkowy Falcon Cell (70 µ m) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Kleszcze | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Kleszcze do tkanek |
| Cewniki IV | dożylnej BD | 382612 | 24 G x 0,75 cala |
| Baxter | 2C6401 | ||
| MyFuge 12 Mini wirówka | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Igły | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Urządzenie | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 został użyty do elektroporacji w hepatocytach myszy |
| Pompa perystaltyczna | Masterflex | HV-77120-42 | Od 10 do 60 obr./min; 90 do 260 VAC |
| Rurki pompy precyzyjnej | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silikonowe |
| Płytki hodowlane Primaria | Corning Life Sciences | 353846 | Płytki do hodowli tkankowych zawierające azot |
| Pipety serologiczne (25 ml) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Strzykawki | BD | 329464 | 1 mL, sterylne |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Łaźnia wodna | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precyzyjny mikroprocesor sterowany serią 280, 2,5 l |
| odczynniki | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Niski poziom glukozy, pirogronian |
| Etanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Surowica bydlęca | płodu Thermoscientific | 26140-079 | |
| Utrzymanie hepatocytów Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Pożywka do powlekania hepatocytów (PM) | Lonza | MP100 | |
| Zestaw ELISA do albuminy myszy | Fisher Scientific NC0010653 | ||
| Zestaw nukleofektorów hepatocytów myszy/szczura Lonza | VPL-1004 | ||
| Polimeraza DNA OneTaq HotStart | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7,4 | Thermoscientific | 70011-044 | Bez chlorku wapnia lub magnezu |
| Percoll (roztwór PVP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Kwas okresowy | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Podłoże montażowe Permount | VWR | 100496-550 | |
| Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff' s odczynnik siarczynowo-fuksynowy | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsyna-EDTA (0,25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | w czerwieni fenolowej |
| Vybrant | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Roztwór perfuzyjny 1 (pH 7,4, sterylizowany filtrem) | stabilny przy 4 stopniach; C przez 2 miesiące | ||
| EBSS | Fisher Scientific 14155063 | Complete do 200 mL | |
| EGTA (0,5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 &mikro; L |
| HEPES (pH 7,3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Roztwór perfuzyjny 2 (pH 7,4, sterylizowany filtrem) | stabilny przy 4 stopniach; C przez 2 miesiące | ||
| CaCl2· 2H20 (1,8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µ L z 1 M zapasów |
| EBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Kompletny do 200 ml |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4 i kropka środkowa; 7H20 (0,8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 &mikro; L z 1 M zapasu |
| Roztwór perfuzyjny 3 | Przygotowany świeżo przed użyciem | ||
| Roztwór 2 | 50 ml | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0,094 jednostek Wunsch / ml |
| Koktajl znieczulający dla myszy | |||
| Acepromzine | 0,25 mg/ml stężenie końcowe | ||
| Ketamina | 7,5 mg/ml stężenie końcowe | ||
| Ksylazyna | 1,5 mg/ml stężenie końcowe | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Śledzenie indeli przez dekompozycję | https://tide.nki.nl/ |
Bibliografia
- Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
- Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
