Artykuł metodologiczny

Hodowle neuronów hipokampa w celu wykrywania i badania nowych patogennych przeciwciał zaangażowanych w autoimmunologiczne zapalenie mózgu

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63829

⸱

2 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Hospital Clínic, Universitat de Barcelona

W tym artykule

Podsumowanie

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu to nowa kategoria chorób ośrodkowego układu nerwowego wywołanych przez przeciwciała. Neurony hipokampa mogą być wykorzystane do odkrycia i scharakteryzowania tych przeciwciał. W artykule przedstawiono protokół pierwotnej hodowli komórek i barwienia immunologicznego w celu określenia autoprzeciwciał w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów.

Streszczenie

W ciągu ostatnich 15 lat scharakteryzowano nową kategorię chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wywołanych przez przeciwciała, która jest obecnie definiowana jako "autoimmunologiczne zapalenie mózgu" (AE). Obecnie znanych jest 17 zespołów AE, a wszystkie są związane z przeciwciałami przeciwko powierzchni komórek neuronalnych lub białkom synaptycznym. Zespoły kliniczne są złożone i różnią się w zależności od rodzaju związanego przeciwciała. Najbardziej znaną z tych chorób jest zapalenie mózgu z receptorem anty-N-metylo-D-asparaginianowym (NMDAR), które jest wybitnym zaburzeniem neuropsychiatrycznym związanym z poważnymi zaburzeniami pamięci i zachowania. Powiązane przeciwciała reagują z podjednostką GluN1 NMDAR w domenie N-końcowej. Podejście najczęściej stosowane do odkrywania i charakteryzowania przeciwciał AE obejmuje hodowlę zdysocjowanych, płodowych neuronów hipokampa gryzoni. Podczas procesu charakteryzowania przeciwciał żywe neurony w hodowli są wystawiane na działanie surowicy lub płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta, a wykrycie reaktywności wskazuje, że próbki surowicy lub płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta zawierają przeciwciała przeciwko antygenom powierzchniowym neuronów. Posiewy hipokampa można również wykorzystać do określenia, czy przeciwciała u pacjentów są potencjalnie patogenne, poprzez zbadanie, czy powodują one zmiany strukturalne lub funkcjonalne neuronów. Poziom powodzenia tych badań zależy od jakości kultur i protokołów stosowanych do uzyskiwania i wykrywania reaktywności próbek pobranych od pacjentów. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół pierwotnej hodowli komórkowej płodowych neuronów hipokampa szczura w połączeniu z barwieniem immunologicznym w celu określenia obecności przeciwciał w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów. Przedstawiono również przykład badania potencjalnych skutków patogennych przeciwciał NMDAR za pomocą hodowanych neuronów i obrazowania wapnia.

Wprowadzenie

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu (AE) to niedawno odkryta kategoria chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w których pośredniczą przeciwciała atakujące powierzchnię neuronów lub białka synaptyczne1,2. Cechy kliniczne różnią się w zależności od przeciwciała, ale zwykle obejmują upośledzenie pamięci i funkcji poznawczych, zmienione zachowanie i objawy psychiatryczne, nieprawidłowe ruchy, dysfunkcję snu, obniżony poziom świadomości i drgawki. Zaburzenia te mogą dotyczyć osób w każdym wieku, przy czym niektóre rodzaje AE dotykają głównie dzieci i młodych dorosłych2.

W ciągu ostatnich 15 lat opisano 17 zespołów AE z przeciwciałami przeciwko specyficznym białkom powierzchniowym/synaptycznym na powierzchni neuronów (Tabela 1). Kilka przykładów celów neuronalnych obejmuje synaptyczne receptory pobudzające NMDAR3,4 i AMPAR5, synaptyczny receptor hamujący GABAbR6, białko wydzielane przez neurony LGI17 oraz cząsteczka adhezyjna komórek IgLON58. W przypadku większości tych zdarzeń niepożądanych badania wykazały, że przeciwciała zaburzają strukturę lub funkcję docelowego antygenu, silnie wspierając rolę patogenną. Na przykład w zapaleniu mózgu anty-NMDAR przeciwciała reagują z N-końcową domeną podjednostki GluN1 NMDAR, powodując selektywną i odwracalną internalizację tych receptorów, co skutkuje wyraźnymi zmianami neuropsychiatrycznymi4,9,10,11. W związku z tym identyfikacja któregokolwiek z 17 znanych przeciwciał w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym pacjenta może być również wykorzystana jako test diagnostyczny, który ustala diagnozę określonego zdarzenia niepożądanego.

Jedną z częściej używanych technik do identyfikacji i charakterystyki tych przeciwciał jest wykorzystanie kultur zdysocjowanych, płodowych, gryzoniowych neuronów hipokampa. Kultury te są przydatne z kilku powodów: mózg embrionalny jest łatwy do dysocjacji i zawiera niski poziom komórek glejowych, głównego źródła zanieczyszczenia w kulturach neuronalnych12; populacja komórek hipokampa jest stosunkowo jednorodna w porównaniu z większością innych regionów OUN, przy czym komórki piramidalne reprezentują zdecydowaną większość13,14; hodowle przygotowuje się z zarodków w późnym stadium rozwoju, gdy wytwarzanie neuronów piramidowych jest zakończone, ale komórki ziarniste jeszcze się nie rozwinęły, co dodatkowo zwiększa jednorodność hodowli; Hodowane neurony piramidowe wyrażają większość swoich głównych cech fenotypowych, są zdolne do tworzenia dobrze rozwiniętych dendrytów i tworzenia synaptycznie połączonych sieci, które można wykorzystać do badań strukturalnych i elektrofizjologicznych12,13; Ponieważ przeciwciała nie mogą przenikać do żywych neuronów, zastosowanie żywych kultur pozwala na identyfikację celów antygenowych, które znajdują się na powierzchni komórki; oraz immunoprecypitacja kompleksu przeciwciało-antygen z kultur neuronalnych pozwala na identyfikację docelowego antygenu5.

Sukces badań z wykorzystaniem kultur neuronalnych zależy w dużym stopniu od jakości kultur i protokołów stosowanych do oceny immunoreaktywności surowicy pacjenta lub płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Zmienne, które mogą wpływać na hodowle, obejmują procedury izolacji hipokampa przed rozwojem hodowli, dysocjację tkanki, gęstość posiewu, użytą powierzchnię wzrostu i skład podłoża13,15,16. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół pierwotnej hodowli komórkowej płodowych neuronów hipokampa szczura w połączeniu z fluorescencyjnym barwieniem immunologicznym, które można wykorzystać do określenia obecności przeciwciał przeciwko znanym antygenom AE i potencjalnie nowym celom powierzchniowym. Przedstawiono również przykład, w jaki sposób można badać patogenne działanie przeciwciał NMDAR za pomocą technik obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem hodowanych neuronów hipokampa wyrażających genetycznie kodowany wskaźnik wapnia (GECI) z rodziny GCaMP, GCaMP5G.

T ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
Białko doceloweFunkcja białkaKomora na komórkiGłówny zespół
NMDAR (Amerykański ZwiązekJon ChanelBiałko synaptyczneAnty-NMDAR zapalenie mózgu
AMPAR (Protokół AMPARJon ChanelBiałko synaptyczneLimbiczne zapalenie mózgu
GluK2Jon ChanelBiałko synaptyczneZapalenie mózgu
GABAaR (Język GABAaRJon ChanelBiałko synaptyczneZapalenie mózgu
GABAbRReceptor metabotropowyBiałko synaptyczneLimbiczne zapalenie mózgu
mGluR1Receptor metabotropowyBiałko synaptyczneZapalenie mózgu
mGluR2Receptor metabotropowyBiałko synaptyczneZapalenie mózgu
mGluR5Receptor metabotropowyBiałko synaptyczneZapalenie mózgu
D2R (Język w języku angielskim)Receptor metabotropowyBiałko synaptyczneZapalenie zwojów podstawy mózgu
Gniazdo LGI1Cząsteczka adhezyjnaBiałko powierzchniowe komórkiLimbiczne zapalenie mózgu
CASPR2Cząsteczka adhezyjnaBiałko powierzchniowe komórkiLimbiczne zapalenie mózgu
IgLON5Cząsteczka adhezyjnaBiałko powierzchniowe komórkiChoroba anty-IgLON5
Neurexin-3αCząsteczka adhezyjnaBiałko powierzchniowe komórkiZapalenie mózgu
DNER (Tr)Białko transbłonoweBiałko powierzchniowe komórkiZapalenie mózgu
Strefa SEZ6LBiałko transbłonoweBiałko powierzchniowe komórkiZapalenie mózgu
AmfifizynaCząsteczka strukturalnaBiałko powierzchniowe komórkiLimbiczne zapalenie mózgu
Filtr DPPXPeptydazaBiałko powierzchniowe komórkiZapalenie mózgu

Tabela 1: Przeciwciała przeciwko powierzchni komórek neuronalnych i białkom synaptycznym.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki Uniwersytetu w Barcelonie zgodnie z europejskimi (2010/63/UE) przepisami dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi. Uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentów, a badanie zostało zatwierdzone przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną do wykorzystania próbek ludzkich (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).

UWAGA: Obecny protokół składa się z trzech części. Pierwszy z nich służy do tworzenia kultur neuronalnych, drugi służy do wykrywania przeciwciał powierzchniowych za pomocą żywych kultur neuronów, a trzeci ma na celu określenie patogenności tych przeciwciał.

CZĘŚĆ 1: Tworzenie zdysocjowanych, płodowych, hipokampowych kultur neuronalnych gryzoni

1. Kroki przygotowawcze

  1. Powlekanie powierzchni galwanowych poli-L-lizyną (3 dni przed rozwarstwieniem)
    1. Przygotować bufor boranowy, dodając 2,38 g kwasu borowego i 1,27 g boraksu do 500 ml wody destylowanej i mieszając przez 15 minut aż do rozpuszczenia. Pod kapturem wysterylizuj roztwór buforowy, filtrując (wielkość porów 0,2 μm), oznacz etykietą i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: To rozwiązanie jest stabilne i może być używane przez 6 miesięcy.
      UWAGA: Podczas przygotowywania buforu boranowego należy stosować zalecane środki ochrony osobistej.
    2. Przygotować roztwór podstawowy poli-L-lizyny (PLL) (100 mg/ml), dodając 1 g PLL do 10 ml wody destylowanej i mieszając aż do rozpuszczenia. Przygotować 500 μl porcji roztworu podstawowego PLL. Aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/ml, dodać 500 μl podwielokrotności PLL do 50 ml buforu boranowego i wirować aż do rozpuszczenia, a następnie wysterylizować roztwór przez filtrowanie (wielkość porów 0,2 μm).
      UWAGA: To rozwiązanie jest stabilne i może być używane przez 6 miesięcy.
    3. Przygotuj powierzchnie do powlekania. Używaj szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm do procedur barwienia immunologicznego i naczyń ze szklanym dnem do badań, które będą obejmować obrazowanie żywych neuronów. Jeśli używasz szkiełek nakrywkowych, przeprowadź autoklaw w autoklawie, a następnie umieść pięć szkiełek nakrywkowych w każdym naczyniu (o średnicy 3,5 cm).
      UWAGA: Grubość szkiełka nakrywkowego wpływa na jakość i intensywność sygnału pozyskiwanych obrazów. Większość obiektywów mikroskopowych jest przeznaczona do szkiełek nakrywkowych #1.5. Wybierz odpowiednie szkiełka nakrywkowe zgodnie z konfiguracją i technikami obrazowania.
    4. Pod kapturem dodaj 1,5 ml roztworu PLL do każdego naczynia (naczynie ze szklanym dnem lub naczynie o średnicy 3,5 cm z pięcioma szkiełkami nakrywkowymi). Upewnij się, że wszystkie szkiełka nakrywkowe są zanurzone i przechowywane w RT przez 24 godziny.
    5. Na 2 dni przed sekcją odessać roztwór PLL i przemyć sterylną wodą wolną od endotoksyn, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe są zanurzone. Trzymaj wodę w naczyniach i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
    6. Na 1 dzień przed rozbioru odessać wodę i zastąpić ją pożywką hodowlaną NB + B27 (patrz poniżej) i umieścić szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.
  2. Przygotowanie pożywki hodowlanej i roztworu podstawowego (1 dzień przed preparacją)
    1. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g / l) bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej dodaj 50 ml surowicy końskiej, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 ml L-glutaminy (200 mM), 10 ml pirogronianu sodu (100 mM), 10 ml penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml). Przefiltrować (wielkość porów 0,2 μm) i przechowywać w porcjach o pojemności 5 ml w temperaturze 4 oC ze szczelnie zamkniętą nakrętką.
      UWAGA: To rozwiązanie jest stabilne i może być używane przez 1 miesiąc.
    2. Pożywka neuropodstawowa (NB) uzupełniona witaminą B27 (NB + B27): Do 50 ml pożywki NB bez czerwieni fenolowej dodać 1 ml suplementu witaminy B27.
    3. Pożywka Hibernate-E uzupełniona witaminą B27 (Hibernate + B27): Do 50 ml pożywki Hibernate-E dodaj 1 ml suplementu B27.
    4. Zewnątrzkomórkowy roztwór fizjologiczny (EPS): Do 1 l sterylnej wody dodać następujące składniki o określonych stężeniach końcowych: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glukoza (20 mM) i CaCl2 (2 mM). Mieszać aż do rozpuszczenia i dostosować pH do 7,4, dodając NaOH (0,5 M) lub HCl (0,5 M). Pod maską wysterylizować przez filtrację (wielkość porów 0,2 μm) i przechowywać w temperaturze 4 oC.
  3. Sprzęt i inne materiały laboratoryjne (dzień sekcji)
    1. Ustawić łaźnię wodną na temperaturę 37 °C. Podgrzać następujące porcje: 50 ml HBSS i 5 ml DMEM.
    2. Wysterylizuj następujące narzędzia, zanurzając je w zlewce zawierającej absolutny etanol (Rysunek 1B): kleszcze, kleszcze zakrzywione, nożyczki, kleszcze drobno zakrzywione, kleszcze drobno proste, nożyczki chirurgiczne, kleszcze drobnokątowe i precyzyjne nożyczki sprężynowe.
      UWAGA: Aby chronić narzędzia, umieść miękki materiał (np. chusteczki naukowe) na dnie zlewki.
    3. Napełnij dwie tace lodem i umieść następujące przedmioty.
      1. Tacka na lód 1 (Rysunek 1C): Umieść narzędzia chirurgiczne w zlewce z absolutnym etanolem, zlewce z HBSS do płukania narzędzi chirurgicznych, 10-centymetrowej misce z HBSS do umieszczenia zarodków, 6-centymetrowej misce z HBSS do umieszczenia głów zarodków i 6-centymetrowej misce z Hibernate + B27 na umieszczeniu mózgów zarodków.
      2. Tacka na lód 2: Umieść 1 ml porcji trypsyny 2,5% i 3,5 cm naczynie z Hibernate + B27 dla wypreparowanego hipokampa.
        UWAGA: Czas potrzebny na tę procedurę zależy od doświadczenia badacza i liczby zarodków do wypreparowania. Dlatego lód musi pozostać zamrożony przez wymagany czas. Do tego celu zalecane są tacki styropianowe.

2. Sekcja i siew (Rysunek 1)

  1. Izolacja hipokampa
    UWAGA: Ciężarne szczury z zarodkami w grupie E18 są poddawane eutanazji bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu zgodnie z lokalną komisją etyczną Uniwersytetu w Barcelonie, zgodnie z europejskimi przepisami (2010/63/UE) dotyczącymi wykorzystywania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi. W protokole tym jako metodę eutanazji zastosowano wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ).
    1. Wypreparuj szczura na poziomie otrzewnej brzusznej za pomocą kleszczy i nożyczek. Pobrać macicę z zarodkami E18 i umieścić ją w 10-centymetrowym naczyniu, które zostało schłodzone na lodzie.
      UWAGA: Ważne jest, aby uniknąć przyczepiania się włosów szczurów do zarodków. Zaleca się stosowanie dużych ilości 70% etanolu do sterylizacji jamy brzusznej. Począwszy od tego kroku, pracuj wewnątrz okapu na tacce na lód 1.
    2. Otwórz woreczki embrionalne i przenieś zarodki do 10-centymetrowej szalki z HBSS, upewniając się, że zarodki są całkowicie zanurzone.
    3. Usuń główkę zarodka nożyczkami i umieść ją w 6 cm naczyniu z HBSS. Powtórz ten proces ze wszystkimi zarodkami.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, wszystkie tkanki z wyjątkiem główek zarodków należy wyrzucić do pojemnika z zakrętką.
    4. Przytrzymaj głowę zarodka drobno zakrzywionymi kleszczami i przebij oczodoły parą drobno prostych kleszczy, wchodząc pod kątem 45°, a następnie zwolnij drobno zakrzywione kleszcze.
      UWAGA: Kleszcze nie mogą przechodzić przez mózg, dlatego ważne jest, aby zachować kąt podczas wchodzenia.
    5. Wypreparuj skórę i czaszkę nożyczkami chirurgicznymi, zaczynając od kości potylicznej do kości czołowej. Usuń mózg za pomocą pary drobno zakrzywionych kleszczy i umieść go w 6 cm naczyniu z Hibernate + B27. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie mózgi wyzdrowieją.
    6. Strzałkowo oddziel kresomózgowie za pomocą drobno prostych kleszczy.
      UWAGA: Od tego kroku sekcja hipokampa jest przeprowadzana pod mikroskopem stereoskopowym. Zaleca się stosowanie lamp przegubowych, tak aby światło oświetlało powierzchnię sekcji z boków. Zaleca się również użycie czarnego tła, ponieważ zapewnia to większy kontrast, co pozwala lepiej odróżnić hipokamp.
    7. Przygotuj naczynie o średnicy 10 cm, umieszczając krople Hibernate + B27 w odległości 1 cm (np. w kółku). Umieść jeden kresomózgowie na kroplę Hibernate + B27 i wizualizuj przez lunetę sekcyjną (zalecane jest powiększenie obiektywu 1,25x).
    8. Ostrożnie obierz opony mózgowe i usuń wzgórze, aby lepiej uwidocznić hipokamp.
    9. Rozetnij hipokamp precyzyjnymi nożyczkami sprężynowymi i umieść go w 3,5 cm naczyniu z Hibernate + B27 w tacce na lód 2. Powtarzaj dla każdego kresomózgowia, aż wszystkie hipokampy zostaną zebrane.
    10. Ostrożnie zbierz wszystkie hipokampy za pomocą pipety Pasteura i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Podczas zbierania hipokampów należy wziąć minimalną objętość Hibernate + B27, aby nie rozcieńczać trypsyny.
  2. Dysocjacja komórek
    1. Dysocjacja enzymatyczna hipokampa
      1. Do probówki o pojemności 50 ml zawierającej hipokamp dodaj 1 ml 2,5% trypsyny i doprowadź do objętości 5 ml za pomocą HBSS. Inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
      2. Aby rozcieńczyć trypsynę, dodać 10 ml wstępnie podgrzanego HBSS i inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
      3. Przenieś hipokampy, które teraz pojawiają się jako masa śluzowa, do probówki o pojemności 50 ml za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl, dodaj 6 ml wstępnie podgrzanego HBSS i inkubuj przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    2. Mechaniczna dysocjacja hipokampa
      1. Przenieś masę do probówki o pojemności 2 ml ze stożkowym dnem, biorąc minimalną objętość. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM. Homogenizować granulki za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl, delikatnie zasysając w górę iw dół.
        UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać generowania pęcherzyków podczas zasysania, ponieważ pęcherzyki mogą powodować lizę komórek.
      2. Powtórz zasysanie w górę iw dół za pomocą wstępnie wyciągniętej szklanej pipety (10x-20x), tak aby jej końcówka stykała się ze stożkowym dnem probówki. Unikaj generowania bąbelków. Pod koniec tego kroku mieszanina musi być półprzezroczysta.
      3. Po jednorodnym wymieszaniu w taki sposób, aby mieszanina stała się przezroczysta, przenieść mieszaninę do probówki zawierającej 4 ml pożywki DMEM w temperaturze 37 °C i homogenizować szklaną pipetą, pipetując w górę i w dół.
  3. Wysiewanie komórek
    1. Policz komórki. Liczbę neuronów w roztworze można policzyć zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi.
      UWAGA: W eksperymentach obrazowych do wykrywania przeciwciał i aktywności wapnia stężenie 50 000 komórek na 3,5 cm naczynia jest optymalne.
    2. Trzymając komórki w zawieszeniu, odjąć obliczoną objętość i umieścić na talerzu 3,5 cm naczynia zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte PLL lub w naczyniach ze szklanym dnem pokrytych PLL.
    3. Równomiernie rozprowadź komórki na szalkach, delikatnie potrząsając skrzyżowanymi ruchami (w przód iw tył, a następnie z boku na bok; powtórz w razie potrzeby) i umieść szalki w inkubatorze CO2 (5%).
      UWAGA: Ważne jest, aby używać skrzyżowanych ruchów, aby uniknąć osiadania komórek na obrzeżach naczynia.
    4. Co tydzień dodawaj około 1 ml NB + B27, aby kultura nie wyschła.
      UWAGA: Po 2 tygodniach (14 dni in vitro [div]) neurony są dojrzałe i wyrażają wszystkie czynniki, które można wykorzystać do eksperymentów. Całkowita średnia liczba neuronów uzyskanych przy użyciu tego protokołu wynosi około 2,5 x 106 neuronów pochodzących ze średnio 12 zarodków E18 na ciężarną szczur.



CZĘŚĆ 2: Wykorzystanie kultur neuronalnych hipokampa do wykrywania przeciwciał w białkach powierzchniowych komórek neuronalnych

UWAGA: Ta część protokołu pokazuje, jak hodowle hipokampa są używane do identyfikacji przeciwciał anty-NMDAR w surowicy i/lub płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z zapaleniem mózgu anty-NMDAR. Barwienie immunologiczne fluorescencyjne służy do wizualizacji reaktywności w żywych neuronach, ale można również zastosować inne metody wizualizacji. Odpowiednią kontrolą dla tego eksperymentu byłaby surowica lub płyn mózgowo-rdzeniowy od zdrowej osoby. W przypadku korzystania z próbek pobranych od ludzi należy pamiętać, że może być wymagana zgoda instytucjonalnej komisji etycznej.

3. Barwienie immunologiczne na żywo fluorescencyjne

  1. Użyj 14 komórek div, które zostały wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych (50 000 komórek na 3,5 cm naczynie zawierające pięć szkiełek nakrywkowych).
  2. Wewnątrz kaptura spłukać szkiełka nakrywkowe NB podgrzanym do temperatury 37 °C.
  3. Dodać próbkę, która w tym przypadku zawiera przeciwciała anty-NMDAR (stosowane jako przeciwciało pierwszorzędowe) rozcieńczoną w pożywce NB w stosunku 1:200 dla surowicy lub 1:2 dla płynu mózgowo-rdzeniowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (wewnątrz inkubatora CO2 (5 %).
  4. Dokładnie spłukać PBS 3x w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać roztwór utrwalający (4% formaldehydu w PBS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    UWAGA: W przypadku obchodzenia się z 4% formaldehydem należy pracować wewnątrz kaptura i nosić zalecane środki ochrony osobistej.
  6. Myć 3x PBS po 5 min.
  7. Dodać przeciwciało drugorzędowe Koza anty-ludzka AF488 w rozcieńczeniu 1:1000 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h,
    UWAGA: Podczas inkubacji chronić przed nasłonecznieniem poprzez przykrycie folią aluminiową.
  8. Myć 3x PBS po 5 min. Spłucz wodą destylowaną
  9. Umieścić szkiełka nakrywkowe za pomocą płynnego medium mocującego (np. płynu montażowego zapobiegającego blaknięciu z DAPI; około 7 μl), odessać pozostałą ciecz i spłukać wodą destylowaną. Neurony są teraz gotowe do obrazowania fluorescencyjnego.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z medium montażowym należy stosować zalecane środki ochrony osobistej.


   

CZĘŚĆ 3: Demonstracja patogennych efektów przeciwciał za pomocą obrazowania wapnia

UWAGA: Ta część protokołu pokazuje, jak określić, czy przeciwciała u pacjentów mają funkcjonalny wpływ na hodowle, co sugerowałoby chorobotwórczość . W celu zwiększenia istotności efektów wykorzystano pulę płynu mózgowo-rdzeniowego od ośmiu pacjentów. Aktywność wapnia w żywych kulturach rejestrowano po stymulacji chemicznej (NMDA + glicyna) przy użyciu fluorescencyjnego wskaźnika wapniowego GECI (GCaMP5G). Badania te wymagają odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z komorą komórkową, która może utrzymać wymagane warunki fizjologiczne neuronów.

4. Obrazowanie wapnia

  1. Użyj 14-18 komórek div, które zostały wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych (50 000 komórek na 3,5 cm szalkę z pięcioma szkiełkami nakrywkowymi)
  2. Na 1 tydzień przed obrazowaniem dodać wektor wirusowy pAAV2-CAG-GCaMP5G w dawce 2,5 x10 10 GC/ml do komórek i inkubować przez 5-7 dni.
    UWAGA: Ten komercyjnie dostępny, wstępnie zapakowany wektor serotypu 2 AAV wykazuje nadmierną ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia GCaMP5G pod promotorem CAG.
  3. Na 1 dzień przed obrazowaniem dodać próbkę pacjenta (w tym przykładzie pulę płynu mózgowo-rdzeniowego rozcieńczoną w stosunku 1:25 w NB + B27) i inkubować przez 24 godziny. Zawsze filtruj próbki ludzkie (wielkość porów 0,2 μm) przed użyciem, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    UWAGA: W przypadku tych badań kontrolna płyn mózgowo-rdzeniowy od zdrowych osób musi być prowadzona równolegle.
  4. W dniu obrazowania przygotuj zestaw do obrazowania i ustaw komorę komórki mikroskopu na 37 °C, napełnij tor wodą destylowaną i wlej 5% CO2 w celu utrzymania warunków fizjologicznych komórki.
  5. W kapturze umyj komórki z kroku 3 za pomocą 3 ml styropianu podgrzanego do temperatury 37 °C
  6. Przykryj komórki 2,45 ml EPS i przenieś je do komory na komórki mikroskopu. Dodaj NBQX (10 μM), aby zablokować receptory AMPA i KA, aby uwidocznić wyłącznie odpowiedź receptora NMDA.
  7. W odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w lampę rtęciową i kostkę filtrującą FITC uzyskaj 2-minutowy film z klatkami rejestrowanymi co 100 ms (aktywność spontaniczna).
    UWAGA: Użyto obiektywu powietrznego 20x NA 0,75, a zdjęcia (512 x 512 pikseli, 16-bitowa skala szarości) były wykonywane co 100 ms kamerą sCMOS.
  8. Zrób drugi film trwający 4 minuty z klatkami nagrywanymi co 100 ms. Krótko po rozpoczęciu akwizycji dodaj do naczynia roztwór stymulujący (NMDA [100 μM] + glicyna [1 μM]).
    UWAGA: Dodanie pożywki do naczynia spowoduje turbulencje, które mogą zakłócić warunki obrazowania (ostrość, intensywność fluorescencji i/lub niespecyficzny sygnał tła). Nie należy dodawać więcej niż 50 μl roztworu do napełnionego naczynia o pojemności 2,5 ml, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo takich zmian.
  9. Za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (użyto tutaj ImageJ), wyekstrahuj sygnał fluorescencyjny w czasie, uzyskany po stymulacji, z kultur inkubowanych z pacjentem i kontroluj próbki płynu mózgowo-rdzeniowego.
    UWAGA: Sondy GCaMP podczas wiązania się z wolnymi jonami wapnia ulegają zmianie konformacyjnej, powodując ich jaśniejsze działanie. Dlatego wzrost intensywności fluorescencji koreluje z napływem wapnia spowodowanym depolaryzacją neuronów.
  10. Określ obszary zainteresowania (ROI) do analizy. Ręcznie podziel soma neuronów i dodaj ROI do menedżera ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Zapisz ROI z menu Menedżer ROI (Więcej > Zapisz).
  11. Ustaw pomiary (Analizuj > Ustaw pomiary) i wybierz średnią wartość szarości. Wyodrębnij profil średniej intensywności fluorescencji z somy komórek, klikając pozycję Więcej > wielu miar, a następnie zapisz wygenerowaną tabelę jako .xls arkusz kalkulacyjny.
  12. Wykonaj analizy statystyczne w celu porównania fluorescencji między grupami (płyn mózgowo-rdzeniowy pacjentów vs. płyn mózgowo-rdzeniowy grupy kontrolnej).

Wyniki

Ustanowienie dysocjowanych kultur neuronów hipokampa płodów gryzoni
Przedstawiony tutaj protokół opiera się na wpływowych badaniach nad hodowlą komórek nerwowych przeprowadzonych przez Bankera i Goslina15. Protokół został udoskonalony w celu uzyskania kultur neuronalnych o optymalnej morfologii, gęstości i czystości do przeprowadzania badań wykrywania przeciwciał powierzchniowych neuronów. Protokół preparatyki i wysiewania jest podzielony na trzy części (Rycina 1A). Pierwsza część, izolacja hipokampa, polega na chirurgicznym wycięciu żywej tkanki (Rycina 1A, panel lewy). Jak wskazuje rycina, kluczowym materiałem wyjściowym dla sukcesu hodowli są ciężarne szczury Wistar z zarodkami w 18. dobie rozwoju (E18). Po wyjęciu mózgu z embrionów E18 przeprowadzana jest mikrochirurgia pod stereomikroskopem. Przy użyciu odpowiednich narzędzi (Rycina 1B) i precyzyjnej manipulacji możliwe jest oddzielenie hipokampa od pozostałej tkanki nerwowej. Rozmieszczenie tkanek w konkretnych mediach przedstawiono na Rycynie 1C. Druga część protokołu składa się z dysocjacji komórek hipokampa. Jest ona podzielona na dwa etapy (Rycina 1A, panel środkowy): dysocjację enzymatyczną i dysocjację mechaniczną hipokampa, w wyniku czego powstają nienaruszone, dysocjowane pojedyncze komórki. Stosując tę metodologię, możliwe jest uzyskanie kultur komórkowych bez agregatów komórkowych, co przedstawiono na Rycynie 2A-D. Trzecia część protokołu polega na wysiewaniu komórek (Rycina 1A, panel prawy). Ta część protokołu jest kluczowa dla dostosowania gęstości i homogeniczności kultury neuronalnej na płytce. Policzenie komórek i wysianie 50 000 neuronów na obszarze szalki o średnicy 3,5 cm zapewnia optymalną gęstość do przeprowadzenia nie tylko eksperymentów określających obecność przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym komórek neuronalnych (Rycina 3), ale także do analizy patogenności tych przeciwciał za pomocą obrazowania wapniowego (Rycina 4).

Schemat hodowli komórek hipokampa: etapy izolacji, dysocjacji enzymatycznej/mechanicznej oraz wysiewania komórek.
Rysunek 1: Protokół wizualny dla pierwotnych hodowli neuronów hipokampa.(A) Schemat blokowy przedstawiający trzy części protokołu przygotowania hodowli zdysocjowanych komórek neuronów hipokampa z embrionów szczura na etapie E18. Protokół podzielono na: 1. Izolację hipokampa, 2. Dysocjację komórek oraz 3. Wysiewanie komórek. (B) Wybór zalecanych narzędzi do izolacji hipokampa podzielony na trzy kategorie: (1- Pinceta, 2- Pinceta zakrzywiona, 3- Nożyczki) do pobierania embrionów, (4- Pinceta zakrzywiona precyzyjna, 5- Pinceta prosta precyzyjna, 6- Nożyczki chirurgiczne) do ekstrakcji mózgu oraz (7- Pinceta kątna precyzyjna, 8- Precyzyjne nożyczki sprężynowe) do izolacji hipokampa. (C) Schematyczny rysunek tacki z lodem nr 1 z płytkami i pożywkami niezbędnymi do izolacji hipokampa. Embriony i głowy umieszcza się w HBSS, natomiast mózgi w pożywce Hibernate + B27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kultury neuronów hipokampa w 18 div są dojrzałe, wzajemnie połączone i wykazują ekspresję białek strukturalnych oraz funkcjonalnych
W procesie wzrostu i dojrzewania kultur neuronalnych można wyróżnić dwie zróżnicowane fazy: fazę polaryzacji neuronu (Rysunek 2A,B) oraz fazę rozwoju dendrytów i budowy sieci synaptycznej (Rysunek 2C,D). Komórki w 1 div są równomiernie rozłożone i przylegają do płytki, tworząc wokół ciała komórki lamele, z których zaczynają wyrastać niewielkie neuryty (Rysunek 2A). Po kilku dniach hodowli neuryty wydłużają się na niewielkim dystansie. Komórki wykazują znaczną polaryzację, lecz przyrost netto jest niewielki (Rysunek 2B). Po tym etapie następuje intensywna synaptogeneza, a neurony zaczynają się wzajemnie łączyć. Sieć neuronalna stale rośnie i staje się bardziej złożona (Rysunek 2C). W 18 div neurony są dojrzałe i połączone; sieć neuronalna jest w pełni uformowana (Rysunek 2D). Po uformowaniu i połączeniu kolców synaptycznych neurony są w pełni spolaryzowane i wykazują ekspresję wszystkich białek funkcjonalnych i strukturalnych. Spośród wielu białek ekspresjonowanych przez dojrzałe neurony hodowlane, jako reprezentatywne markery wybrano tutaj receptor neuronalny NMDA (Rysunek 2E) oraz białko synaptyczne PSD95 (Rysunek 2F). Ponadto możliwe jest selektywne obrazowanie aksonów poprzez znakowanie neurofilamentów (NF) (Rysunek 2G) oraz obrazowanie dendrytów poprzez celowanie w białko MAP2 (Rysunek 2H).Etapy rozwoju neuronów, obrazy mikroskopowe z immunofluorescencją; DIV 1-18, NMDAR, PSD95, NF, MAP2.
Rysunek 2: Przebieg czasowy dojrzewania kultur rozproszonych komórek neuronów hipokampa. (A-D) Obrazy w kontraście fazowym neuronów hipokampa podczas pierwszych 18 dni hodowli. (A) Neurony w 1 div po przywiernięciu do podłoża powleczonego PLL. (B) Pojawienie się niewielkich neurytów w neuronach w 5 div. (C) Neurony w 11 div rozwinęły długie neuryty, które wydłużają się i nabierają cech aksonalnych. (D) Neurony w 18 div są dojrzałe i utworzyły sieć neuronalną. Pasek skali (A-D) = 40 µm. (E-H) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne wykonane za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej z użyciem selektywnych markerów obrazujących dojrzałe neurony w 18 div. Kultury neuronalne utrwalono i poddano immunostynowaniu przeciwciałami selektywnie barwiącymi (E) receptor neuronalny (NMDAR), (F) marker synaptyczny (PSD95), (G) marker aksonalny (neurofilament, NF) oraz (H) marker dendrytyczny (MAP2). Pasek skali (E-H) = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przeciwciała w próbkach pacjentów reagują z antygenami powierzchniowymi komórek neuronalnych
Próbki (surowica i CSF) pobrane od pacjentów z zapaleniem mózgu przeciwko NMDAR zawierają autoprzeciwciała, które rozpoznają NMDAR obecny na powierzchni neuronów. Inkubacja hodowli z próbkami pacjentów wywołuje intensywny sygnał fluorescencyjny na powierzchni komórek i dendrytach (Rysunek 3A,C). W przeciwieństwie do nich, próbki kontrolne nie wywołują sygnału fluorescencyjnego po podaniu do hodowli neuronalnych (Rysunek 3 B,D). Wyniki te pokazują, w jaki sposób hodowle mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania próbek pacjentów pod kątem obecności przeciwciał i mogą prowadzić do identyfikacji nowych przeciwciał celujących w powierzchnię komórek neuronalnych.

Próbka płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta obniża wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia w kulturach neuronów hipokampa indukowanych NMDA
W celu oceny wpływu przeciwciał pacjentów na aktywność neuronalną (po 24 h inkubacji), w czasie rzeczywistym optycznie monitorowano przejściowe zmiany stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w hodowlach neuronów po stymulacji za pośrednictwem NMDA. Aplikacja NMDA powoduje wzrost intensywności fluorescencji, co objawia się zmianą wewnątrzkomórkowej zielonej fluorescencji (Rycina 4A i Wideo uzupełniające 1). Neurony traktowane kontrolną próbką płynu mózgowo-rdzeniowego wykazały większą różnicę w intensywności fluorescencji (56%) po zastosowaniu stymulatora w porównaniu do komórek traktowanych próbką płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta. Zmierzono różnice w intensywności fluorescencji i porównano krzywe stymulacji indukowanej przez NMDA na podstawie danych wyekstrahowanych z somy komórek (Rycina 4B,C). Krzywe stymulacji wykazują, że w obu scenariuszach nastąpił wewnątrzkomórkowy napływ wapnia, jednak kultury traktowane płynem mózgowo-rdzeniowym pacjentów (linia szara) wykazały niższą odpowiedź niż kultury traktowane kontrolnie (linia czarna). Wyniki te dowodzą, że przeciwciała obecne w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów obniżają aktywność komórkową na skutek oddziaływania przeciwciał z NMDAR, wywołując tym samym efekt patogenny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna neuronów wykazująca surowicę i płyn mózgowo-rdzeniowy pacjenta w porównaniu z kontrolnymi, marker dendrytyczny.
Rysunek 3: Przeciwciała pacjenta reagują z powierzchnią hodowli neuronów. (A,E) Surowica i płyn mózgowo-rdzeniowy pacjentów z zapaleniem mózgu z przeciwciałami przeciwko NMDAR reagują z powierzchnią komórek żywych neuronów hipokampa szczura, (B,F) podczas gdy surowica i płyn mózgowo-rdzeniowy osób kontrolnych nie wykazują reaktywności. Pasek skali (A,B,E,F) = 20 µm. Obraz dendrytu przy większym powiększeniu (63x) wykazujący typowy wzorzec reaktywności powierzchniowej dla (C,G) surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta oraz (D,H) ujemny dla kontroli. Obrazy wykonano za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Fluorescencja stymulacji neuronalnej, porównanie PŁM; wyniki na wykresie, w mikroskopii i na wykresach pudełkowych.
Rysunek 4: Przeciwciała pacjentów redukują napływ wapnia w neuronach szczura wykazujących ekspresję GCaMP5G. (A) Podanie roztworu stymulującego (NMDA [100 μM] + glicyna [1 μM]) do kultur neuronów wywołało napływ wapnia, o czym świadczy wzrost wewnątrzkomórkowej zielonej fluorescencji (szczyt stymulacji) w porównaniu z obrazem wykonanym przed stymulacją (pre-stymulacja). Po 120 s intensywność fluorescencji spada i stabilizuje się (post-stymulacja). Kultury traktowane PŁM pacjentów wykazały istotną redukcję (56%) wzrostu poziomu wapnia indukowanego przez NMDA w porównaniu z PŁM kontrolnym. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pasek skali = 20 μm. (B) Wykres z jednego z trzech niezależnych eksperymentów przedstawiający intensywność fluorescencji w czasie (180 s) dla kultur traktowanych PŁM kontrolnym (linia czarna) i PŁM pacjentów (linia szara) po stymulacji NMDA (niebieska strzałka). n(PŁM kontrolny) = 20 komórek; n(PŁM pacjentów) = 28 komórek. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. (C) Wykresy pudełkowe pokazują medianę oraz 25. i 75. percentyl. Wąsy wskazują wartości minimalne i maksymalne. Ocenę istotności przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA; p < 0,0001) oraz testów U Manna-Whitneya (p < 0,0001). Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo uzupełniające 1: Film przedstawiający dwa obok siebie neurony hipokampa wykazujące ekspresję GCaMP5G: neuron traktowany płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF) grupy kontrolnej (po lewej) oraz neuron traktowany CSF pacjentów (po prawej). Podanie NMDAR (stymulacja) powoduje wzrost intensywności fluorescencji wewnątrzkomórkowej w obu przypadkach, jednak poziom ten jest znacznie wyższy w neuronie traktowanym CSF grupy kontrolnej niż w neuronie traktowanym CSF pacjentów. Obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i opracowane w programie ImageJ z zastosowaniem tablicy wyszukiwania (LUT) Fire. 1700 klatek (170 s); przyspieszenie 5-krotne. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Rozwijająca się dziedzina autoimmunizacji za pośrednictwem przeciwciał otworzyła okno możliwości identyfikacji autoprzeciwciał neuronalnych, które można wykorzystać do poprawy diagnostyki i leczenia pacjentów. Hodowle neuronów hipokampa są niezbędnym narzędziem do identyfikacji przeciwciał; Dlatego ważne jest, aby wykonać ustandaryzowany protokół, aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki. Najważniejsze kroki, które należy wziąć pod uwagę, ograniczenia i rozwiązywanie problemów są omówione tutaj.

Krytyczne etapy tego protokołu można podzielić na trzy kategorie w zależności od tego, czy wpływają na czystość, jednorodność czy żywotność neuronów hipokampa.

Czystość - Aby uzyskać optymalne pierwotne hodowle komórek, badacz musi być pewny siebie, przeszkolony i zdolny do szybkiej pracy, zwłaszcza w celu zminimalizowania czasu sekcji. Nawet jeśli neurony piramidowe są głównym typem komórek, hipokamp zawiera różne interneurony14. Aby wygenerować kultury z minimalną liczbą komórek glejowych, hipokamp musi zostać wyekstrahowany z minimalną otaczającą tkanką. Użycie czarnego tła podczas sekcji pomaga zidentyfikować granice hipokampa pod mikroskopem stereoskopowym. Ponadto należy wziąć pod uwagę, że mniejsze zagęszczenie komórek skutkuje mniejszym wsparciem parakrynnym i utrudnia utrzymanie kultury13. Dlatego ważne jest, aby pamiętać o tej równowadze. Jest to ważne w badaniach obrazowych, w których wykorzystuje się niewielką liczbę komórek (50 000 neuronów na 3,5 cm szalki). Aby mieć dodatkowy czas na ekstrakcję hipokampa, należy użyć pożywki hibernacyjnej, która zachowuje tkankę17. Niezbędna jest również praca z odpowiednimi narzędziami chirurgicznymi. Narzędzia o wysokiej precyzji są delikatne, dlatego powtarzalność techniki powinna być zapewniona poprzez ich staranne zabezpieczenie.

Jednorodność - Aby uzyskać hodowlę bez agregatów komórkowych, mechaniczna dysocjacja komórek została ulepszona poprzez połączenie użycia wstępnie wyciągniętych szklanych pipet ze standardową pipetą o pojemności 1 000 μl.

Żywotność - W tym protokole nie dodano antybiotyków, ponieważ wpływają one na pobudliwość neuronów i zmieniają właściwości elektrofizjologiczne hodowanych neuronów18. Dlatego zanieczyszczenie jest bardzo prawdopodobne, jeśli nie zostaną zachowane najwyższe standardy sterylności. Kluczowym czynnikiem jest również temperatura. Utrzymywanie zimnej tkanki podczas izolacji hipokampa spowalnia metabolizm i zmniejsza degradację komórek. Tkanka była zatem utrzymywana na lodzie do czasu procesu dysocjacji komórek. Co więcej, ważne jest, aby znaleźć właściwą równowagę podczas enzymatycznej dysocjacji komórek, która dezagreguje komórki bez wyraźnej lizy komórek. W tym protokole czasy inkubacji z trypsyną i kolejnych etapów płukania zostały zoptymalizowane w celu uzyskania pojedynczych komórek z wystarczającą ilością miejsca, aby umożliwić stworzenie odpowiedniej sieci neuronalnej.

Krytyczne etapy można również znaleźć we fluorescencyjnych żywych zapisach barwienia immunologicznego i aktywności wapnia z kultur neuronalnych. Aby przeprowadzić skuteczne barwienie immunologiczne na żywo w celu określenia obecności przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym komórki w próbkach pobranych od pacjentów, należy unikać przenikania komórek, które umożliwiłoby przeciwciałom dostęp do białek wewnątrzkomórkowych. Dodatkowo, w oparciu o miano przeciwciał, czas inkubacji i rozcieńczenie próbki muszą być odpowiednio dostosowane (np. przeciwciała o bardzo wysokim mianie mogą powodować zabarwienie tła, które utrudnia interpretację wyników). Przeprowadzając ocenę patogenności autoprzeciwciał za pomocą obrazowania wapnia, należy użyć pożywki, która jest optymalna do pomiarów aktywności komórkowej (np. supresja Mg2+ w pożywce hodowlanej jest ważna dla dobrej wydajności). Ponadto w przypadku obrazowania fluorescencyjnego należy unikać pożywek ze wskaźnikami pH, takimi jak czerwień fenolowa, ponieważ wprowadzają one niespecyficzny sygnał tła.

Istnieją dwa główne ograniczenia stosowania kultur neuronalnych hipokampa. Po pierwsze, w porównaniu ze stabilnymi liniami komórkowymi, hodowle pierwotne muszą być wytwarzane w sposób ciągły, a to oznacza regularne wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą zastąpić potrzebę stosowania modeli zwierzęcych, ale protokoły różnicowania iPSC nadal nie są optymalne. Po drugie, neurony pochodzące z iPSC nie wyrażają pełnych widm białek powierzchniowych, a zatem, jeśli są stosowane, brak reaktywności niekoniecznie oznacza ujemność próbki19.

Istnieją trzy metody badań przesiewowych na obecność autoprzeciwciał w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z podejrzeniem AE: test tkankowy (TBA) przy użyciu tkanki mózgowej szczura, test komórkowy (CBA) przy użyciu komórek HEK transfekowanych w celu ekspresji białek neuronalnych oraz aplikacja opisana tutaj przy użyciu żywych kultur neuronów hipokampa19. Znaczenie metody hodowli neuronów hipokampa polega na jej zdolności do różnicowania reaktywności z antygenami powierzchniowymi i wewnątrzkomórkowymi, których nie można łatwo odróżnić za pomocą TBA. Poza tym pierwotne hodowle neuronów, w przeciwieństwie do CBA w komórkach transfekowanych HEK, nie są ograniczone repertuarem transfekowanych białek. Ponadto wyhodowane neurony hipokampa można wykorzystać do identyfikacji nowych przeciwciał i ich docelowych antygenów w połączeniu z immunoprecypitacją i spektrometrią mas, a tym samym do poszerzenia spektrum możliwych do zidentyfikowania przeciwciał. Wreszcie, umożliwia ocenę patogennego działania autoprzeciwciał za pomocą metod obrazowania na żywo, które mogą monitorować zmiany w aktywności komórkowej. Podsumowując, identyfikacja nowych autoprzeciwciał ostatecznie umożliwia rozpoczęcie specyficznych immunoterapii w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Merche Rivas, Marii Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alinie Hirschmann i Angelowi Sandovalowi (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) oraz Mercedes Alba, Mariji Radosevic, Davidowi Soto, Xavierowi Gasullowi, Mar Guaspowi i Lidii Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, University of Barcelona) za wsparcie techniczne i dostarczenie odczynników, oraz Josepowi Dalmau i Myrnie R. Rosenfeld (IDIBAPS, Szpital Clínic, Uniwersytet w Barcelonie) za krytyczną recenzję manuskryptu i opiekę mentorską. Badanie zostało sfinansowane przez Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) i współfinansowane przez Unię Europejską, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Program Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa dla centrów doskonałości w dziedzinie badań i rozwoju (CEX2019-000910-S, P.L-A.); program CERCA i Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); oraz Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 cm Naczynie do hodowli komórkowychNunc12-565-020
12 mm okrągłe szkiełka nakrywkoweFisherNC9708845
20x NA 0,75 S Obiektyw fluorescencyjnyNikonCFI Super Fluor 20X
3,5 cm Naczynie do hodowli komórkowychNunc12-565-90
6 cm Naczynie do hodowli komórkowychNunc12-565-94
suplementB27Gibco17504-044
Zlewka 100 mlPirex-Borax
Sigma-AldrichB9876
Kwas borowySigma-AldrichB0252
CaCl2Sigma-AldrichC1016
Kleszczyki zakrzywioneFST11009-13
D-GlucoseSigma-AldrichD9434
DMEM Wysoka glukoza (4,5 g/L), bez L-glutaminy, bez fenolu CzerwonyKoziorożecDMEM-HXRXA
Samica szczura Wistar (18 dni ciąży)Janvier-Płodowa
surowica bydlęca (FBS)BiowestS181B-500
Kleszczyki drobnokątneFST11251-35
Kleszcze drobno zakrzywioneFST11272-30
Kleszcze drobno-prosteFST11251-23
Kostka filtra FITCKleszcze NikonStandard Series
FST11000-12
Koza anty-ludzka AF488InvitrogenA11013
HBSSKoziorożecHBSS-1A
HEPESSigma-AldrichH3375
Hibernate-E mediumGibcoA12476-01
Surowica konia (HS)Thermofisher26050088
Ludzkie przeciwciało anty-NMDAR (CSF)Próbkapacjenta-Ludzkie
przeciwciało anty-NMDAR (surowica)Próbkapacjenta-ImageJ
/FijiNIHv1.50i
Mikroskop fluorescencji odwróconej NikonEclipse TE2000-U
KClSigma-Aldrich44675
L-GlutaminaBiowestX0550-100
Lampa rtęciowaNikonC-HGFI
Komora komórkowa mikroskopuCustom-build-NaCl
Sigma-AldrichS9887
NBQXTocris373
Neurobaseal bez czerwieni fenolowejGibco12348-017
NMDASigma-AldrichM3262
pAAV2-CAG-GCaMP5GVectorBiolabs-Paraformaldehyd
4%Thermo scientificJ199943-K2
Penicylina-StreptomycynaBiowestL0022-100
Sól fizjologicznabuforowana fosforanamiGibco10010023
Poly-L-Lizyna (PLL)Peptyd międzynarodowyOKK-35056
Polistyrenowa tacka na lód-ponownie używana nasadka pudełka z poliastru
Precyzyjne nożyczki sprężynoweFST15000-08
ProLong Gold z DAPI (antifading mounting media)Sondy molekularneP36941
NożyczkiFST14068-12
Pirogronian soduBiowestL0642-100
Mikroskop stereoskopowyZeissStemi 2000
Nożyczki chirurgiczneFST14081-09
Trypsyna 2,5%Gibco15090046
Woda, sterylna bez endotoksynSigma-AldrichW3500

Bibliografia

  1. Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
  2. Dalmau, J., Graus, F. Antibody-mediated encephalitis. The New England Journal of Medicine. 378 (9), 840-851 (2018).
  3. Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
  4. Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
  5. Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
  6. Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
  7. Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
  8. Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
  9. Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
  10. Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
  11. Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
  12. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  13. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  14. Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
  15. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
  16. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895(2008).
  17. Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
  18. Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
  19. Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neuronalne antygeny powierzchnioweprzeciwcia a przeciwko NMDARobrazowanie wapniaprotok immunobarwieniapierwotna hodowla kom rkowaobrazowanie fluorescencyjnespektrometria mas

Powiązane artykuły