Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63834

⸱

1 kwietnia 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia metodę izolowania lizatów białkowych całych komórek z wypreparowanych procesów twarzy zarodków myszy lub hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy zarodkowej i przeprowadzania następnie western blot w celu oceny poziomu fosforylowanego białka.

Streszczenie

Rozwój twarzoczaszki u ssaków to złożony proces morfologiczny, podczas którego wiele populacji komórek koordynuje swoje działania, aby wytworzyć szkielet czołowo-nosowy. Te zmiany morfologiczne są inicjowane i utrzymywane przez różne interakcje sygnalizacyjne, które często obejmują fosforylację białek przez kinazy. W tym miejscu przedstawiono dwa przykłady fizjologicznie istotnych kontekstów, w których można badać fosforylację białek podczas rozwoju twarzoczaszki u ssaków: procesy twarzy myszy, w szczególności wyrostki szczękowe E11.5, oraz hodowane embrionalne komórki mezenchymy podniebienia myszy pochodzące z wtórnych półek podniebiennych E13.5. Aby pokonać powszechną barierę defosforylacji podczas izolacji białek, omówiono adaptacje i modyfikacje standardowych metod laboratoryjnych, które pozwalają na izolację fosfoprotein. Ponadto przedstawiono najlepsze praktyki w zakresie prawidłowej analizy i kwantyfikacji fosfoprotein po zachodnim blotowaniu lizatów białek całych komórek. Techniki te, szczególnie w połączeniu z inhibitorami farmakologicznymi i/lub mysimi modelami genetycznymi, mogą być wykorzystane do uzyskania lepszego wglądu w dynamikę i role różnych fosfoprotein aktywnych podczas rozwoju twarzoczaszki.

Wprowadzenie

Rozwój twarzoczaszki u ssaków to złożony proces morfologiczny, podczas którego wiele populacji komórek koordynuje swoje działania, aby wytworzyć szkielet czołowo-nosowy. U myszy proces ten rozpoczyna się w dniu embrionalnym (E) 9,5 dnia od utworzenia wypukłości czołowo-nosowej i par wyrostków szczękowych i żuchwowych, z których każdy zawiera postmigracyjne komórki grzebienia nerwowego czaszki. Boczne i przyśrodkowe wyrostki nosowe powstają z wypukłości czołowo-nosowej wraz z pojawieniem się dołów nosowych i ostatecznie łączą się, tworząc nozdrza. Ponadto przyśrodkowe wyrostki nosowe i wyrostki szczękowe łączą się, tworząc górną wargę. Jednocześnie palatogeneza rozpoczyna się od powstania wyraźnych wyrostków - drugorzędowych półek podniebiennych - od strony ustnej wyrostków szczękowych w E11.5. Z biegiem czasu półki podniebienne rosną w dół po obu stronach języka, unoszą się do przeciwnej pozycji nad językiem i ostatecznie łączą się w linii środkowej, tworząc ciągłe podniebienie, które oddziela jamę nosową i ustną przez E16.51.

Te zmiany morfologiczne w całym rozwoju twarzoczaszki są inicjowane i podtrzymywane przez różnorodne interakcje sygnalizacyjne, które często obejmują fosforylację białek przez kinazy. Na przykład receptory błony komórkowej, takie jak podrodziny receptorów β transformującego czynnika wzrostu (TGF), w tym receptory białek morfogenetycznych kości (BMPR) i różne rodziny receptorowych kinaz tyrozynowych (RTK), ulegają autofosforylacji po wiązaniu i aktywacji ligandów w komórkach grzebienia nerwowego czaszki2,3,4. Dodatkowo, wygładzony receptor transbłonowy sprzężony z białkiem G ulega fosforylacji w komórkach grzebienia nerwowego czaszki i ektodermie twarzoczaszki za ligandem Sonic hedgehog (SHH) wiążącym się z receptorem Patched1, co powoduje wygładzoną akumulację na błonie rzęskowej i aktywację szlaku SHH5. Takie interakcje ligand-receptor mogą zachodzić poprzez sygnalizację autokrynną, parakrynną i / lub jukstakrynową w kontekstach twarzoczaszki. Na przykład wiadomo, że BMP6 sygnalizuje w sposób autokrynny podczas różnicowania chondrocytów6, podczas gdy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) 8 ulega ekspresji w ektodermie łuku gardłowego i wiąże się z członkami rodziny FGF RTK wyrażonymi w mezenchymie łuku gardłowego w sposób parakrynny, aby zainicjować wzorzec i wzrost łuków gardłowych7, 8,9,10. Co więcej, sygnalizacja Notch jest aktywowana zarówno w chondrocytach, jak i osteoblastach podczas rozwoju szkieletu twarzoczaszki poprzez sygnalizację jukstarynową, gdy transbłonowe ligandy Delta i/lub Jagged wiążą się z transbłonowymi receptorami Notch na sąsiednich komórkach, które są następnie rozszczepiane i fosforylowane11. Istnieją jednak inne pary ligandów i receptorów ważne dla rozwoju twarzoczaszki, które mają elastyczność w funkcjonowaniu zarówno w sygnalizacji autokrynnej, jak i parakrynnej. Na przykład, podczas morfogenezy zębów myszy, wykazano, że ligand płytkowego czynnika wzrostu (PDGF)-AA sygnalizuje w sposób autokrynny, aby aktywować RTK PDGFRα w nabłonku narządu szkliwa 12. Natomiast w mysich procesach twarzowych w połowie ciąży transkrypty kodujące ligandy PDGF-AA i PDGF-CC ulegają ekspresji w ektodermie twarzoczaszki, podczas gdy receptor PDGFRα ulega ekspresji w mezenchymie pochodzącej z grzebienia nerwowego czaszki, co powoduje sygnalizację parakrynną13,14,15,16,17. Niezależnie od mechanizmu sygnalizacji, te zdarzenia fosforylacji receptorów często skutkują rekrutacją białek adaptorowych i/lub cząsteczek sygnałowych, które często same ulegają fosforylacji, aby zainicjować wewnątrzkomórkowe kaskady kinaz, takie jak szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)18,19.

Końcowe wewnątrzkomórkowe efektory tych kaskad mogą następnie fosforylować szereg substratów, takich jak czynniki transkrypcyjne, białka wiążące RNA, cytoszkielet i macierz zewnątrzkomórkowa. Runx220, Hand121, Dlx3/522,23,24, Gli1-325, oraz Sox926 należą do czynników transkrypcyjnych fosforylowanych w kontekście rozwoju twarzoczaszki. Ta modyfikacja potranslacyjna (PTM) może bezpośrednio wpływać między innymi na podatność na alternatywne PTM, dimeryzację, stabilność, rozszczepienie i/lub powinowactwo do wiązania DNA20,21,25,26. Dodatkowo, białko wiążące RNA Srsf3 ulega fosforylacji w kontekście rozwoju twarzoczaszki, co prowadzi do jego translokacji jądrowej27. Ogólnie wykazano, że fosforylacja białek wiążących RNA wpływa na ich subkomórkową lokalizację, interakcje białko-białko, wiązanie RNA i/lub specyficzność sekwencji28. Co więcej, fosforylacja aktomiozyny może prowadzić do przegrupowań cytoszkieletu podczas całego rozwoju twarzoczaszki29,30, a fosforylacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak małe glikoproteiny związane z integryną wiążącą integrynę, przyczynia się do biomineralizacji podczas rozwoju szkieletu31. Z powyższych i wielu innych przykładów jasno wynika, że istnieją szerokie implikacje dla fosforylacji białek podczas rozwoju twarzoczaszki. Dodając dodatkowy poziom regulacji, fosforylacja białek jest dodatkowo modulowana przez fosfatazy, które przeciwdziałają kinazom poprzez usuwanie grup fosforanowych.

Te zdarzenia fosforylacji zarówno na poziomie receptora, jak i cząsteczki efektorowej są kluczowe dla propagacji szlaków sygnałowych i ostatecznie skutkują zmianami w ekspresji genów w jądrze, napędzając określone działania komórki, takie jak migracja, proliferacja, przeżycie i różnicowanie, które skutkują prawidłowym kształtowaniem twarzy ssaka. Biorąc pod uwagę specyficzność kontekstową interakcji białek z kinazami i fosfatazami, wynikające z nich zmiany w PTM i ich wpływ na aktywność komórki, niezwykle ważne jest, aby parametry te były badane w fizjologicznie istotnych warunkach, aby uzyskać pełne zrozumienie udziału zdarzeń fosforylacji w rozwoju twarzoczaszki. W tym miejscu przedstawiono przykłady dwóch kontekstów, w których można badać fosforylację białek, a tym samym aktywację szlaków sygnałowych podczas rozwoju twarzoczaszki u ssaków: procesy twarzowe myszy, w szczególności wyrostki szczękowe E11.5, oraz hodowane embrionalne komórki mezenchymy podniebiennej myszy pochodzące z wtórnych półek podniebiennych E13.5 - oba primary32 i immortalized33. W E11.5 wyrostki szczękowe są w trakcie łączenia się z bocznymi i przyśrodkowymi wyrostkami nosowymi1, reprezentując tym samym krytyczny punkt czasowy podczas rozwoju twarzoczaszki myszy. Co więcej, wybrano tutaj wyrostki szczękowe i komórki pochodzące z półek podniebiennych, ponieważ te ostatnie struktury są pochodnymi pierwszej, dając tym samym naukowcom możliwość zbadania fosforylacji białek in vivo i in vitro w powiązanych kontekstach. Jednak protokół ten ma również zastosowanie do alternatywnych procesów twarzy i rozwojowych punktów czasowych.

Krytycznym problemem w badaniu fosforylowanych białek jest to, że są one łatwo defosforylowane podczas izolacji białek przez obfite fosfatazy środowiskowe. Aby pokonać tę barierę, omówiono adaptacje i modyfikacje standardowych metod laboratoryjnych, które pozwalają na izolację fosforylowanych białek. Ponadto przedstawiono najlepsze praktyki w zakresie prawidłowej analizy i kwantyfikacji fosforylowanych białek. Techniki te, szczególnie w połączeniu z inhibitorami farmakologicznymi i/lub mysimi modelami genetycznymi, mogą być wykorzystane do uzyskania lepszego wglądu w dynamikę i role różnych szlaków sygnałowych aktywnych podczas rozwoju twarzoczaszki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kampusu Medycznego Anschutz Uniwersytetu Kolorado i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi. Samice myszy 129S4 w wieku 1,5-6 miesięcy i trzymane w temperaturze sub-termoneutralnej 21-23 °C wykorzystano do pobierania zarodków. Schematyczny przebieg pracy protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu, oprogramowania, odczynników i zwierząt użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie embrionów myszy E11.5

  1. Eutanazja ciężarnej samicy myszy 11,5 dnia po wykryciu czopa pochwowego podczas krycia w czasie krycia w komorze CO2 przy użyciu zatwierdzonego przez IACUC natężenia przepływu CO2 wymaganego dla około 50% przemieszczenia (2,95 l / min w komorze 360 cali < sup = "xref" >3 komory) i czasu ekspozycji (patrz tabela materiałów). Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną metodę eutanazji. Natychmiast przystąp do sekcji.
  2. Połóż ciało myszy na desce sekcyjnej brzuszną stroną skierowaną do góry. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem.
  3. Otwórz jamę brzuszną, ściskając i unosząc skórę przed otworem pochwy za pomocą prostych kleszczy Semken i przecinając uniesioną skórę i leżące pod nią warstwy nożyczkami chirurgicznymi z prostym ostrzem pod kątem 45° po obu stronach, aby uzyskać kształt litery "V", który rozciąga się na każdą powierzchnię boczną mniej więcej w połowie odległości między kończynami przednimi i tylnymi.
  4. Za pomocą kleszczy Semken chwyć jeden z rogów macicy i przetnij nożyczkami chirurgicznymi poniżej jajowodu i powyżej szyjki macicy. Odetnij mezometrium, aby umożliwić całkowite usunięcie rogu macicy.
  5. Przenieś wypreparowany róg macicy do 10 ml histologicznego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monozasadowy, 10,14 mM Na2HPO4 dwuzasadowy, pH 7,4] na 10 cm szalce Petriego.
  6. Usuń drugi róg macicy po przeciwnej stronie jamy brzusznej, stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 1.4-1.5.
  7. Umieścić 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą oba rogi macicy na lodzie, jeśli nie przystąpi się natychmiast do sekcji poszczególnych zarodków (tj. jeśli zostanie poddana sekcji drugiej samicy myszy).
  8. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy za pomocą cienkich kleszczy Dumont #5. Powoli odciągnij mięśniówkę macicy, decidua i kosmówkę. Rozerwij i usuń stosunkowo przezroczystą owodnię otaczającą zarodek i przeciąć pępowinę łączącą zarodek z łożyskiem.
  9. Przenieść każdy wypreparowany zarodek do 2,5 ml PBS histologicznego w indywidualnym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na lodzie za pomocą wyciętej plastikowej pipety transferowej lub łyżki do zarodków.
    UWAGA: W przypadku pracy z miotem, który może zawierać zarodki o więcej niż jednym genotypie, zachowaj owodnię otaczającą każdy zarodek do genotypowania, umieszczając każdy z nich we własnej, wstępnie oznakowanej probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml na lodzie.

2. Analiza wyrostków szczękowych z zarodków myszy E11.5

  1. Przygotować trzy 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające 10 ml histologicznego PBS i przechowywać je na lodzie do stosowania na przemian między zarodkami.
  2. Przenieść jeden zarodek z pojedynczego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na jedną z 10-centymetrowych szalek Petriego za pomocą histologicznej PBS na lodzie za pomocą wyciętej plastikowej pipety transferowej lub łyżki do zarodków.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym oddziel każdy wyrostek szczękowy od twarzy za pomocą cienkich kleszczy. Najpierw przetnij przednią stronę jednego wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego boczny wyrostek nosowy i wyrostek szczękowy (Rysunek 2A).
  4. Po drugie, przeciąć tylną stronę wyrostka szczękowego wzdłuż naturalnego wgłębienia oddzielającego wyrostek szczękowy i wyrostek żuchwowy (Rysunek 2A).
  5. Po trzecie, aby całkowicie oddzielić wyrostek szczękowy, wykonaj pionowe cięcie od przedniej do tylnej strony wyrostka szczękowego po stronie oka wyrostka szczękowego, gdzie kończą się naturalne wgłębienia, o których mowa powyżej (Rysunek 2A-C).
  6. Powtórz te trzy cięcia dla wyrostka szczękowego po przeciwnej stronie twarzy.
  7. Używając 9-calowej pipety Pasteura z małą bańką lateksową o pojemności 2 ml, przenieś wypreparowaną parę wyrostków szczękowych i małą kropelkę około 30 μl histologicznego PBS na znakowaną szalkę Petriego o średnicy 35 mm na lodzie (Rysunek 2D).
  8. Wykonaj kroki 2.3-2.7 dla każdego zarodka, obracając trzy 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające histologiczną PBS na lodzie między zarodkami. Umieść pojedyncze pary wypreparowanych wyrostków szczękowych na oddzielnych szalkach Petriego o średnicy 35 mm na lodzie.
    UWAGA: Rozdzielenie ektodermy wyrostka szczękowego i mezenchymy (kroki 2.9-2.17) można przeprowadzić po wypreparowaniu wyrostków szczękowych wszystkich zarodków w miocie. Jeśli pożądane są nienaruszone wyrostki szczękowe zawierające zarówno ektodermę, jak i mezenchymę, przejdź do kroku 2.18 poniżej.
  9. Przygotować 250 μl świeżej 2% trypsyny w kulturze tkankowej PBS i 250 μl 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w kulturze tkankowej PBS i przechowywać na lodzie.
  10. Umieścić drugą, małą kropelkę około 30 μl 2% trypsyny na szalce Petriego o średnicy 35 mm, oddzielnie od pierwszej, małej kropli histologicznego PBS zawierającej wyrostki szczękowe. Przenieś parę wyrostków szczękowych do małej kropelki 2% trypsyny za pomocą pipety Pasteura (Rysunek 2D).
  11. Inkubuj naczynie na lodzie przez 15 minut.
  12. Wyjąć szalkę Petriego o średnicy 35 mm z lodu i umieścić pod mikroskopem preparacyjnym
    13. .
  13. Za pomocą cienkich kleszczyków powoli i ostrożnie zdejmij warstwę ektodermy z każdego wyrostka szczękowego (Rysunek 2E).
    UWAGA: Jeśli ektoderma nie oddziela się od mezenchymy w nienaruszonym arkuszu, inkubuj w 2% trypsyny w temperaturze pokojowej (RT) przez maksymalnie 5 dodatkowych minut przed kontynuowaniem separacji. Jeśli tkanka zacznie się rozpadać w 2% trypszynie, przenieś wyrostki szczękowe do 10% FBS, jak opisano poniżej, aby zneutralizować trypsynę i zakończyć oddzielanie ektodermy i mezenchymy.
  14. Po oddzieleniu ektodermy wyrostka szczękowego i mezenchymimy (Ryc. 2F), przenieś pożądane tkanki z pary wyrostków szczękowych do trzeciej, małej kropelki o objętości około 30 μl 10% FBS - oddzielonej od dwóch poprzednich małych kropelek - za pomocą pipety Pasteura (Ryc. 2D).
  15. Umieść szalkę Petriego o średnicy 35 mm na lodzie, aby zatrzymać trypsynizację.
  16. Inkubować tkanki wyrostka szczękowego na lodzie w 10% FBS przez 1-2 minuty, a następnie przenieść tkanki z obu wyrostków szczękowych do czwartej, małej kropelki około 30 μl wstępnie schłodzonego PBS histologicznego na lodzie - oddzielnie od trzech poprzednich małych kropelek - za pomocą pipety Pasteura (Rysunek 2D).
  17. Inkubować tkanki wyrostka szczękowego w histologii PBS przez 1 minutę, delikatnie obracając histologiczną PBS wokół tkanek wyrostka szczękowego końcówką pipety Pasteura, aby upewnić się, że cały FBS został wypłukany z tkanki.
  18. Przenieść parę tkanek wyrostka czasowego szczęki do znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie za pomocą pipety Pasteura, minimalizując przenoszenie histologicznego PBS. Usunąć nadmiar histologicznego PBS z probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety Pasteura.
  19. Postępuj zgodnie z powyższymi krokami, aby wypreparować wyrostki szczękowe z każdego zarodka w miocie.
  20. Próbki należy natychmiast przetworzyć w celu wyizolowania lizatów białkowych całych komórek (poniżej) lub przechowywać je przez długi czas w temperaturze -80 °C. Przed długotrwałym przechowywaniem należy zamrozić probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w kąpieli 100% EtOH na suchym lodzie przez 5 minut.

3. Izolowanie lizatów białkowych całych komórek z procesów szczękowych myszy

  1. Jeśli wyrostki szczękowe zostały wcześniej zamrożone w temperaturze -80 °C, rozmrozić je na lodzie.
  2. Dodać 0,1 ml lodowatego buforu do lizy NP-40 (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glicerolu, 1% nonidetu P-40, 2 mM EDTA; przechowywane w temperaturze 4 °C) z inhibitorami proteazy i fosfatazy (1x kompletny koktajl inhibitorów mini proteazy [rozpuszczony w wodzie; przechowywany w temperaturze -20 °C], 1 mM PMSF [rozpuszczony w izopropanolu; przechowywany w temperaturze 4 °C], 10 mM NaF [przechowywany w temperaturze -20 °C; unikać zamrażania/rozmrażania], 1 mM Na3VO4 [przechowywany w temperaturze -20 °C], 25 mM β-glicerofosforan [przechowywany w temperaturze 4 °C]) dodawany bezpośrednio przed użyciem na lodzie.
    UWAGA: Frakcjonowanie komórek można alternatywnie przeprowadzić w celu wyizolowania cytoplazmatycznych, jądrowych, błonowych lub mitochondrialnych frakcji białkowych.
  3. Pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą pipetara o pojemności 200 μl.
  4. Wirować przez 10 s, a następnie pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą pipetara o pojemności 200 μl. Unikaj generowania bąbelków.
  5. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, obracając się od końca do końca, używając łopatki o pojemności 1,5 ml/2 ml z rewolwerem z rurką.
  6. Odwirować próbki o masie 13 500 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zebrać supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie za pomocą pipetara o pojemności 200 ml.
  8. Określić ilościowo stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek, używając 10 μl lizatu białkowego + 10 μl buforu do lizy NP-40 dla próbek doświadczalnych i 3-5 rozcieńczeń albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V) (BSA) w buforze do lizy NP-40 w zakresie 0,25-2,0 mg/ml jako wzorce białka.
  9. Kontynuuj elektroforezę w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) (krok 5) lub szybko zamroź pozostałe lizaty na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C przez długi czas.

4. Izolowanie lizatów białkowych całych komórek z pierwotnych i/lub unieśmiertelnionych mysich embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej (MEPM)

UWAGA: Izolacja i hodowla pierwotnych komórek MEPM z zarodków myszy E13.5 i unieśmiertelnionych komórek MEPM zostały wcześniej opisane32,33,34. Stymulacja komórek czynnikiem wzrostu (kroki 4.1-4.7) może być przeprowadzona przed lizą komórek. Jeśli pożądane są komórki niestymulowane, przejdź do kroku 4.8 poniżej.

  1. Odessać pożywkę wzrostową [zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 10% FBS] z komórek MEPM przy ~70% zbiegu w 6-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych za pomocą pipety Pasteura 5,75" podłączonej do systemu próżniowego.
  2. Przemyć komórki 1 ml PBS do hodowli tkankowej.
  3. Dodać 3 ml pożywki do głodzenia surowicy [DMEM z 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 0,1% FBS] wstępnie podgrzanej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 23 godziny.
  5. Zastąp pożywkę do głodzenia surowicy 3 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do głodzenia surowicy.
  6. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
  7. Stymuluj komórki wybranym czynnikiem wzrostu w empirycznie określonym stężeniu przez pożądany okres czasu.
  8. Zassać pożywkę z komórek MEPM przy zbiegu 80%-100% za pomocą pipety Pasteura 5.75" podłączonej do systemu próżniowego.
  9. Przemyć komórki dwukrotnie lodowatym PBS do hodowli tkankowej (1 ml na 6 cm naczynie do hodowli komórkowych); przechylić płytkę na bok podczas ostatniego płukania, aby upewnić się, że cała PBS kultury tkankowej została odessana.
  10. Poddać komórki lizie, dodając lodowaty bufor do lizy NP-40 z inhibitorami proteazy i fosfatazy dodanymi bezpośrednio przed użyciem (0,1 ml na 6 cm naczynie do hodowli komórkowych) na lodzie.
  11. Inkubować płytkę na lodzie przez 5 minut, obracając ją mniej więcej co minutę, aby zapewnić całkowite pokrycie płytki.
  12. Zeskrobać komórki z płytki za pomocą wstępnie schłodzonego podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
  13. Inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C przez 30 minut, obracając się od końca do końca, używając łopatki o pojemności 1,5 ml/2 ml z rewolwerem z rurką.
  14. Wykonaj kroki 3.6-3.9 opisane powyżej.

5. Western blot lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i/lub komórek MEPM pod kątem fosfoprotein

  1. Przygotuj próbki lizatu białek całych komórek do SDS-PAGE.
    1. Określ ilość białka do obciążenia, w zależności od obfitości białka w tkance/komórce; 12,5 μg jest zwykle wystarczające dla białek o silnej ekspresji w lizatach białkowych całej komórki.
    2. Dodać równą objętość 2x buforu Laemmli [20% glicerolu, 4% SDS, 0,004% błękitu bromofenolowego, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] z 10% β-merkaptoetanolem dodanym bezpośrednio przed użyciem.
      UWAGA: β-merkaptoetanol działa żrąco na skórę lub oczy, jest toksyczny, niebezpieczny w przypadku połknięcia i działa toksycznie na organizmy wodne. Trzymaj się w rękawicach, fartuchu laboratoryjnym, osłonie twarzy i okularach ochronnych w osłonie przeciwchemicznej. Utylizować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa.
    3. Wymieszaj przez wirowanie.
    4. Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut w mini suchej kąpieli.
    5. Wymieszać przez wirowanie i umieścić próbki na lodzie.
    6. Wirować przy 9 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Umieść próbki na krótko na lodzie przed załadowaniem do żelu SDS-PAGE lub przechowuj przez długi czas w temperaturze -20 °C.
  2. Wykonaj SDS-PAGE przy użyciu ogniwa do elektroforezy z 4%-15% prefabrykowanym żelem białkowym i buforem do elektroforezy35.
  3. Elektrotransferuj białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą buforu transferowego z 0%-20% metanolem (0%-10% dla białek większych niż 100 kDa; 20% dla białek mniejszych niż 100 kDa) dodanym bezpośrednio przed użyciem35.
  4. Zablokuj błonę i sondę pod kątem fosfoproteiny będącej przedmiotem zainteresowania.
    1. Po przeniesieniu przemyć membranę w 1x soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] przez 5 minut w pudełku western blot.
    2. Inkubować membranę w 5 ml buforu blokującego [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% w/v BSA; dobrze wymieszać i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 25 mm z porami 0,2 μm za pomocą strzykawki 10 ml z końcówką typu luer] przez 1 godzinę w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.
      UWAGA: Nie używaj mleka jako środka blokującego podczas charakteryzowania fosfoprotein, ponieważ zawiera ono fosfoproteinę kazeinę, która może powodować silny, niespecyficzny sygnał tła.
    3. Umyj membranę trzy razy przez 5 minut każdy w TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.
    4. Inkubować błonę w 5 ml pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w buforze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc w stożkowej probówce o pojemności 50 ml za pomocą łopatki o pojemności 50 ml z rewolwerem do probówek.
      UWAGA: Zapoznaj się z arkuszem danych przeciwciał, aby uzyskać informacje na temat odpowiedniego stężenia dla western blot.
    5. Umyć membranę trzy razy w temperaturze pokojowej przez 5 minut w TBS-T w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.
    6. Inkubować błonę w 5 ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczonego w buforze blokującym przez 1 godzinę w pudełku Western Blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.
    7. Umyć membranę trzy razy przez 5 minut każdy w TBS-T w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.
    8. Inkubować błonę w podłożu western blotting o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) [mieszając równe objętości z butelek 1 i 2; po 0,5 ml każdej z nich dla dużych membran (8,6 cm x 6,7 cm)] przez 1 minutę, upewniając się, że cała membrana jest stale wystawiona na działanie substratu do western blottingu ECL.
    9. Opróżnij błonę z nadmiaru substratu ECL western blot i natychmiast rozwiń za pomocą obrazowania chemiluminescencyjnego.
  5. Usuń błonę i ponownie zbadaj w celu uzyskania całkowitego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    1. Umieść membranę PVDF w przezroczystej torebce z wyściółką polietylenową zawierającą 5 ml buforu do oddzielania [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] z 8 μl/ml β-merkaptoetanolu dodanym bezpośrednio przed użyciem.
    2. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut z kołysaniem w piecu do hybrydyzacji z prędkością 11 obrotów na minutę.
    3. Umyć membranę trzy razy w temperaturze pokojowej przez 5 minut w TBS-T w pudełku western blot z mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej.
    4. Wykonaj kroki 5.4.2-5.4.9 opisane powyżej.
  6. Określ ilościowo gęstość pasma Western blot za pomocą oprogramowania ImageJ, normalizując poziomy baczącego nas fosforylowanego białka do poziomów całkowitego białka będącego przedmiotem zainteresowania36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas próby charakterystyki fosforylacji białek wyizolowanych z wyrostków twarzowych myszy i/lub hodowlanych komórek mezenchymy podniebienia, reprezentatywne wyniki powinny w idealnym przypadku wykazać wyraźny, powtarzalny prążek po przeprowadzeniu western blossomingu z użyciem przeciwciała przeciwko fosfoproteinie, znajdujący się na tej samej wysokości lub blisko wysokości odpowiadającego prążka całkowitego białka (Rycina 3). Jednakże, jeśli białko uległo intensywnej fosforylacji, może wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół pozwala naukowcom badać krytyczne zdarzenia sygnalizacyjne zależne od fosforylacji podczas rozwoju twarzoczaszki w solidny i powtarzalny sposób. W tym protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, które zapewniają prawidłowe gromadzenie danych i analizę wyników. Niezależnie od tego, czy izoluje się fosfoproteiny z procesów twarzy myszy i/lub hodowanych komórek mezenchymy podniebienia, konieczne jest szybkie i wydajne poruszanie się, jednocześnie utrzymując wszystkie odczynniki i materiały na lod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

129S4 myszy były prezentem od dr Philippe'a Soriano, Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 i K02 DE028572 do K.A.F., F31 DE029976 do M.A.R. i F31 DE029364 do B.J.C.D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Block do mini suchej kąpieliResearch Products International Corp400783
System obrazowania ChemiDoc XRS+ z oprogramowaniem Image LabInkubator chemiluminescencyjnyBio-Rad
1708265 Inkubator CO2, płaszcz powietrznyVWR10810-902
Preparacja płyta, 11 x 13 caliFisher Scientific09 002 12
Komórka do elektroforezy, 4-żelowa, do mini żeli prefabrykowanych z modułem mini trans-blotBio-Rad
FisherScientificUVP95003001
Mikrowirówka 5415 D z wirnikiem F45-24-11 (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini sucha kąpielProdukty badawcze International Corp400780
Wytrząsarka orbitalnaVWR89032-092
pH-metrVWR89231-662
Zasilacz do SDS-PAGEBio-Rad1645050
Prostokątna miska na lód, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Mikroskop stereoskopowy Stemi 508 ze stojakiem K LAB, lampa pierścieniowa LEDZeiss4350649020000000mikroskop preparacyjny
TimerVWR62344-641
Rewolwer rurowyFisher Scientific11 676 341
Mikser wirowyFisher Scientific02 215 414
Kąpiel wodnaVWR89501-472
Pudełko Western blotFisher ScientificNC9358182
Materiały
Szalki do hodowli komórkowych, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Płytki do hodowli komórkowych, 12-dołkoweFisher Scientific07-200-82
Podnośniki komórkoweFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Rurki stożkowe, polipropylenowe, 50 mlFisher Scientific05-539-13
Kleszcze drobnoziarniste Dumont #5Fine Science Tools11254-20
Łyżka do zarodkówFine Science Tools10370-17
Probówki do mikrowirówek, 0,5 mlVWR89000-010
Probówki do mikrowirówek, 1,5 mlVWR20170-038
Pipeta Pasteura, 5,75"Fisher Scientific13-678-6A
Pipeta Pasteura, 9"VWR14672-380
szalki Petriego, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
szalki Petriego, 35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
Woreczki, przezroczyste, wyściółka polietylenowaFisher Scientific01-812-25B
Membrana PVDFFisher NaukoweIPVH00010
Kleszcze SemkenFine Science Tools11008-13
Mała bańka lateksowa, 2 mlVWR82024-554
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14002-12
Filtr strzykawkowy, 25 mm, 0,2 μ m wielkość porówFisher Scientific09-740-108
Strzykawka z końcówką typu luer, 10 mlVWRBD309604
Pipeta transferowaFisher Scientific13-711-22
Dźwignia otwierania kasety Western blotBio-Rad4560000
Bibuła chromatograficzna Whatmann 3MM chrFisher Scientific05-714-5
Odczynniki
4-15% Prefabrykowane żele białkowe, 10-dołkowe, 30 i mikro; LBio-Rad4561083
β-glicerofosforan sól disodowa hydrat SigmaAldrichG5422-25Gstężenie fabryczne 1 M
β-merkaptoetanolSigma AldrichM3148-100ML
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, testowana na szok termicznyFisher ScientificBP1600-100
Błękit bromofenolowyFisher Scientific
Kompletny mini koktajl inhibitorów proteazySigma Aldrich11836153001stężenie standardowe 25x
zestaw do oznaczania białek DC IIBio-Rad500-0112
DMEM, wysoka glukozaGibco11965092
E7, mysie monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe beta tubuliny, koncentrat 0,1 mlBadania rozwojowe Hybridoma BankE71:1,000
Podłoże do blottingu ECLFisher ScientificPI32106zakres niskich pikogramów
Podłoże do blottingu zachodniego ECLGenesee Scientific20-302Bniski zakres femtogramów
Bufor do elektroforezy, 5 LBio-Rad1610772stężenie zapasowe 10x
etanol, 200 proof, 1 galonDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, Di Na sól dihydrat. (krystaliczny powd./elektrofor)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Płodowa surowica bydlęca, scharakteryzowana, pochodzenie amerykańskie, 500 mlHyCloneSH30071.03
Glicerol (certyfikowany ACS)Fisher ScientificG33-4
Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP, kozie przeciwciało anty-mysie IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20 000
Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP, koza anty-królicze IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20 000
Roztwór kwasu solnego, 6N (certyfikowany)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 niejonowy detergentFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Izopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-glutaminaGibco25030081stężenie zapasowe 200 mM
MetanolFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2)Technologia sygnalizacji komórkowej9102S1:1,000; rekombinowany ligand anty-Erk1/2
PDGF-BB, szczurFisher Scientific520BB050
Receptor PDGF i beta; pierwotne przeciwciałoTechnologia sygnalizacji komórkowej3169S1:1,000
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122stężenie podstawowe 100 U/mL, 100 &mikro; g / ml
Fluorek fenylometanosulfonylu, 99%Fisher ScientificAC215740100PMSF; stężenie podstawowe 100 mM
Phospho-p44/42 Przeciwciało pierwotne MAPK (Erk1/2)Technologia sygnalizacji komórkowej9101S1:1,000, anty-fosfo-Erk1/2
Receptor fosfo-PDGF &alfa; /PDGF Receptor β pierwotne przeciwciałoTechnologia sygnalizacji komórkowej3170S1:1,000
Chlorek potasu (białe kryształy)Fisher ScientificBP366-500KCl
Fosforan potasu jednozasadowy (białe kryształy)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
roztwór SDS, 10%Bio-Rad161-0416
Chlorek sodu (krystaliczny / biologiczny, certyfikowany)Fisher ScientificS671-3NaCl
Fluorek sodu (proszek/certyfikowany ACS)Fisher ScientificS299-100NaF; podwielokrotność do jednorazowego użytku; stężenie podstawowe 1 M
Ortowanadan sodu, 99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; stężenie 100 mM
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (granulowany lub proszkowy/certyfikowany ACS)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Kultura tkankowa PBSFisher Scientific21-031-CV
Bufor transferowy, 5 LBio-Rad1610771stężenie podstawowe 10x
Baza Tris (białe kryształy lub krystaliczny proszek/biologia molekularna)Fisher ScientificBP152-1
TrypsynaBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Marker masy cząsteczkowej Western blotBio-Rad1610374
Software
ImageJNational Institutes of Health
Animals
Female 129S4 myszydar dr Philippe'a Soriano, Icahn School of Medicine na Górze Synaj
Piec do hybrydyzacji 1658030 AC403140050 przeciwciało pierwotne

Bibliografia

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271(2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709(2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja lizatu bia kowegorozw j kraniofacjalnyfosforylacja bia ekWestern blotinhibitory fosfatazbufor do lizy kom rektransdukcja sygna u
Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.