Artykuł metodologiczny

Indukowanie ratowania polipów w koloniach koralowców w celu uzyskania zindywidualizowanych mikropropagatów do laboratoryjnego użytku eksperymentalnego

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63840

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  , 
1Red Sea Research Center (RSRC), Division of Biological and Environmental Science and Engineering (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

W tym artykule

Podsumowanie

Ratowanie polipów to proces wywołany ostrym stresem, w którym polipy koralowców trawią tkankę łączącą je z ich kolonią i odłączają się od niej, aby żyć jako jednostki. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób indukować mikrorozmnażanie koralowców poprzez ratowanie za pomocą hipersoli fizjologicznej lub bezwapniowej wody morskiej.

Streszczenie

Koralowce to zwierzęta kolonialne utworzone przez modułowe jednostki zwane polipami. Polipy koralowców są fizjologicznie połączone i połączone tkanką. Zjawisko ratowania polipów jest procesem wywołanym ostrym stresem, w którym polipy koralowców trawią tkankę łączącą je z resztą kolonii i ostatecznie odłączają się od szkieletu, aby kontynuować życie jako odrębne osobniki. Biolodzy koralowców od lat uznają proces ratowania polipów, ale dopiero niedawno mikrorozmnażanie generowane przez ten proces zostało uznane za system modelowy dla badań biologii koralowców. Zastosowanie ratowania polipów może spowodować powstanie dużej liczby jednostek klonalnych z pojedynczego fragmentu koralowca. Kolejną korzyścią jest to, że pojedyncze polipy lub plamy polipów można łatwo uwidocznić pod mikroskopem i utrzymać w wysoce znormalizowanych, tanich środowiskach, takich jak szalki Petriego, kolby i chipy mikroprzepływowe. Niniejszy protokół demonstruje powtarzalne metody zdolne do indukowania mikrorozmnażania koralowców i różne podejścia do utrzymania pojedynczych polipów przy życiu w dłuższej perspektywie. Metodologia ta była w stanie z powodzeniem hodować polipy gatunku koralowców Pocillopora verrucosa przez okres do 8 tygodni po uratowaniu, wykazując praktyczność wykorzystania poszczególnych polipów koralowców do badań nad koralowcami.

Wprowadzenie

Koralowce skleraktynowe lub budujące rafy to parzydełkowce zdolne do tworzenia szkieletów węglanowych, tworzenia raf i strukturalnie złożonych ekosystemów, które można znaleźć od głębokich do płytkich środowisk wodnych1. Tropikalne rafy koralowe charakteryzują się wysoką różnorodnością biologiczną i zapewniają podstawowe usługi ekosystemowe, takie jak ochrona wybrzeży i utrzymanie rybołówstwa2. Większość płytkowodnych koralowców budujących rafy opiera się na wzajemnym związku z glonami z rodziny Symbiodiniaceae, które dostarczają energii potrzebnej koralowcom do budowy ich szkieletów. Symbioza między koralowcem a glonami może zostać przerwana przez stres środowiskowy, powodując blaknięcie koralowców3,4,5,6. Niedawne anomalie temperaturowe spowodowały poważne zdarzenia blaknięcia koralowców na całym świecie, prowadząc do masowej śmiertelności koralowców i trwałej degradacji raf7,8,9,10,11. Ponieważ zjawisko to opiera się na wydalaniu symbiontów przez mechanizmy komórkowe związane ze stresem cieplnym, takie jak apoptoza, autofagia i egzocytoza, bielenie koralowców można opisać jako proces komórkowy, który ma konsekwencje w skali ekosystemu5,6,12, co oznacza, że posiadanie in vitro hodowli komórek lub tkanek koralowców byłoby przydatne do dokładnego zbadania tego zjawiska.

Ze względu na znaczenie raf koralowych i główne zagrożenia, z którymi musiały się zmierzyć, szczególnie w ciągu ostatnich dwóch dekad2, koralowce stały się przedmiotem badań w celach ochrony i odbudowy na całym świecie13. Jednak rozwój podejść i systemów eksperymentalnych, które są niezawodne, powtarzalne i oferują minimalny wpływ na środowisko w celu badania koralowców, jest poważnym wyzwaniem w tej dziedzinie.

Mikropropagacja jest definiowana jako proliferacja in vitro genotypu organizmu poprzez hodowlę jego materiału biologicznego w kontrolowanych naczyniach14,15. Hodowla komórek, tkanek i narządów miała kluczowe znaczenie dla biologii roślin i zwierząt w ostatnich dziesięcioleciach. Pozwala na masową reprodukcję organizmów w laboratoriach, szybką ocenę różnych metod leczenia (takich jak leki i farmaceutyki) oraz bezpośrednie badanie funkcji komórek14,15,16,17. Ogólnie rzecz biorąc, modele in vitro okazały się przydatne do uzupełnienia i pogłębienia badań nad różnymi organizmami w lepiej kontrolowanych warunkach fizycznych i chemicznych. Ze względu na zalety technik hodowli in vitro, różne technologie hodowli komórek zwierzęcych i tkanek zostały opracowane, zoptymalizowane i wykorzystane jako ważne narzędzia w wielu dziedzinach badawczych, w których wiele linii komórkowych zostało zbadanych i skomercjalizowanych do wielu zastosowań16,17,18.

Od czasu pierwszej hodowli tkanek zwierzęcych w 1882 roku dokonano wielu postępów w wiedzy na temat hodowli komórek i tkanek17, takich jak użycie naturalnych i syntetycznych mediów, wynalezienie ustalonych linii komórkowych i rozwój nośników 3D do hodowli wielu typów komórek w lepszy sposób16,17, 18,19. Jednak dziedzina biologii komórki skupia się głównie na wybranej grupie organizmów modelowych, podczas gdy wiele taksonów nadal nie ma dobrze ugruntowanych kultur in vitro komórek, tkanek lub narządów20. Na przykład w badaniach nad koralowcami żadne unieśmiertelnione linie komórkowe nie były szeroko wykorzystywane do badań, co ogranicza badania nad komórkami koralowców do wykorzystania pierwotnych kultur komórkowych. Żywotność tych kultur jest ograniczona do kilku tygodni21, przy czym do początku 2021 roku nie przeprowadzono żadnych badań rejestrujących przeżywalność pojedynczych komórek ze wszystkich tkanek koralowców przez więcej niż 13 dni22. Pierwszy raport na temat zrównoważonych linii komórkowych koralowców, który został opublikowany, dotyczył komórek Acropora tenuis, które żyły do 6 miesięcy, a użyteczność tych komórek dla przyszłych badań pozostaje do zbadania23.

Aby przezwyciężyć ograniczenia w hodowli komórek koralowców i utrzymać hodowlę laboratoryjną, która zachowuje ogólną organizację tkanek koralowców, ostatnio zaproponowano użycie izolowanych polipów jako modelu do badań nad biologią koralowców24,25. Polipy są jednostkami anatomicznymi koralowców, a każdy z nich ma ujście umieszczone w środku dysku ustnego i jest połączony z innymi polipami przez coenosarc w swoim obszarze aboralnym26. Separacja żywych polipów zachodzi naturalnie w procesie ratowania polipów, w którym ostry stres powoduje trawienie koenosarku między polipami, który może następnie oderwać się od szkieletu kolonii25,27,28. Zjawisko to występuje u różnych taksonów, w tym ośmiokoralowców29,30,31, black corals32 i koralowce skleraktynowe25,27,28,32,33i jest powiązany z wieloma stresorami środowiskowymi, takimi jak brak wapnia w wodzie24,34, zwiększona kwasowość35, warunki hiperosmotyczne25,27,32,36, wysokie temperatury36,37, głód33, air exposure25,30, and insecticide contamination28,38. Na przykład przypadki ratowania polipów zostały zgłoszone w koralowcach pocilloporid19, które są szeroko rozpowszechnione na całym świecie i są powszechnie używane jako modele w badaniach nad koralowcami. Gatunki należące do tej grupy, takie jak Pocillopora damicornis i Styllophora pistillata, wygenerowały około 30-40 mikrorozmnażania z 5 mm fragmentu25. Liczba ta podkreśla zaletę stosowania ratowania polipów jako metody mikrorozmnażania koralowców, ponieważ stwarza możliwość generowania wielu genetycznie identycznych osobników z małego kawałka koralowca. Zastosowanie izolowanych polipów do badań ma również te same zalety, co hodowle komórkowe, jeśli chodzi o możliwość hodowli w kontrolowanych środowiskach laboratoryjnych, takich jak kolby i szalki Petriego. Ponadto platformy mikroprzepływowe do utrzymywania żywych polipów wykazały, że te mikropropagaty mogą być przechowywane w stosunkowo tanich i łatwych do odtworzenia środowiskach, z kontrolowanym przepływem wody, powierzchnią i temperaturą24,25. Te platformy mikroprzepływowe mogą być również używane do bezpośredniej wizualizacji żywych struktur koralowców pod mikroskopem24,25.

W tym artykule podsumowujemy i demonstrujemy techniki, które zostały opracowane w celu izolowania pojedynczych polipów koralowców od ich kolonii, pokazując, jak utrzymać je w warunkach laboratoryjnych do długoterminowej hodowli. Omówione metody obejmują ratowanie polipów przez warunki hiperosmotyczne poprzez parowanie i pompowanie wody morskiej o wysokim zasoleniu oraz inkubację w wodzie morskiej wolnej od wapnia.

Protokół

Na potrzeby niniejszego badania, kolonia należąca do gatunku koralowca Pocillopora verrucosa została zebrana z rafy Al Fahal (22.305118 N; 38.964568 E) przez SCA, nurkując przy użyciu młotka i dłuta. Rodzaj kolonii został zidentyfikowany morfologicznie, a jego gatunek został sklasyfikowany jako P. verrucosa na podstawie wcześniej opublikowanych prac, w tym Pocillopora z Morza Czerwonego, co wskazuje, że z genetycznego punktu widzenia gatunek występujący na tym obszarze to P. verrucosa39,40. Rafa koralowa Al Fahal nie jest częścią chronionego obszaru ekologicznego, a do zbierania koralowców nie były potrzebne żadne specjalne pozwolenia. Kolonia była trzymana w akwarium o pojemności 300 litrów przez miesiąc, zanim została rozdrobniona i jej polipy zostały "uratowane". Akwarium było utrzymywane w temperaturze 26 °C z dwoma grzałkami akwariowymi, trzema pompami i dwoma źródłami światła (patrz Tabela Materiałów), utrzymując 12-godzinny cykl świetlny. Temperatura akwarium była utrzymywana poprzez podłączenie każdej z dwóch grzałek do regulatora temperatury. Emisja światła została zaprogramowana tak, aby rozpoczynała się o 6 rano i kończyła o 6 rano, tworząc krzywą natężenia promieniowania, która osiągnęła szczyt o godzinie 12 z 230 μmolami fotonów m−2s−1.

1. Ratowanie polipów przez wysokie zasolenie po odparowaniu wody

UWAGA: Ta metoda została zaadaptowana z Shapiro et al.25. W przypadku stosowania innych gatunków niż Pocillopora verrucosa, przed określeniem wielkości fragmentu, który ma zostać wycięty, należy wziąć pod uwagę wielkość polipów.

  1. Wytnij małe fragmenty (o długości mniejszej niż 1 cm) z kolonii koralowców za pomocą szczypiec do cięcia bocznego (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Dostosuj narzędzia tnące do używanych gatunków koralowców. Szczypce ukośne są przydatne do cięcia koralowców o smukłych gałęziach. W obecnym badaniu wycięto jeden fragment dla każdego zabiegu, ale liczba i rozmiar fragmentów może się różnić w zależności od pożądanej liczby polipów. Wielkość pociętych fragmentów nie może przekraczać głębokości wody po odparowaniu, aby koralowce po zakończeniu procesu pozostały całkowicie w wodzie.
  2. Umieść pokrojone fragmenty na małych szalkach Petriego wypełnionych 12 ml wody morskiej, do której przyzwyczajono kolonię koralowców. Może to być sztuczna woda morska (patrz tabela materiałów) lub przefiltrowana woda morska o tym samym zasoleniu, do której kolonia koralowców została wprowadzona przed fragmentacją.
    UWAGA: Ważne jest, aby całkowicie pokryć fragment wodą. Jeśli 12 ml na szalce Petriego nie wystarcza do pokrycia wyciętego fragmentu, należy odpowiednio zoptymalizować pojemnik i objętość. W niniejszym badaniu wykorzystano wodę pobraną z Morza Czerwonego, a jej zasolenie wynosiło 40 PSU, mierzone miernikiem wieloparametrowym (patrz Tabela Materiałów).
  3. Pozostaw płytkę otwartą na ~24 h w temperaturze otoczenia, aby woda mogła odparować, a jej zasolenie mogło stopniowo wzrosnąć. Gdy między polipami można zaobserwować trawienie tkankowe, przejdź do kroku 1.4.
    UWAGA: Po upływie czasu inkubacji zasolenie wody musi być o około 40% wyższe niż na początku, a polipy muszą być gotowe do oderwania od szkieletu.
  4. Za pomocą pipety transferowej o pojemności 1 ml wytworzyć delikatny przepływ w pobliżu tkanki koralowca. Przepływ powoli pomoże w całkowitym oderwaniu polipów, które już strawiły otaczającą je tkankę od szkieletu.
    UWAGA: Gdy przepływ wody jest tworzony za pomocą pipety, oddzielne polipy lub grupy polipów muszą zejść ze szkieletu w postaci płatków. Jeśli zamiast tego odpadnie mętna substancja, oznacza to śmierć lub rozpad tkanek, co oznacza, że koralowce były inkubowane zbyt długo lub w zbyt stresującym stanie (w tym przypadku o wysokim zasoleniu). Bardzo ważne jest, aby wykonać delikatny przepływ wody, aby oderwać polipy, ponieważ silniejszy przepływ może spowodować ich fizyczne uszkodzenie.
  5. Powoli wymieniać wodę na szalce Petriego na wodę izosmotyczną (użyć tej samej wody, co w kroku 1.2) za pomocą pipety. Wystarczy 50% wymiana wody w ciągu 10 minut, aby polipy powróciły do bezstresowego stanu zasolenia.
    UWAGA: Ponieważ wykorzystano kolonie koralowców z gatunku Pocillopora verrucosa z Morza Czerwonego, przeprowadzono testy w celu określenia, w jakich szczególnych warunkach koralowce z tego unikalnego środowiska zostaną uratowane. Ważne jest, aby podkreślić wysokie zasolenie Morza Czerwonego w porównaniu z większością innych środowisk rafowych.

2. Ratowanie polipów przez zaopatrzenie w wodę morską o wysokim zasoleniu

UWAGA: Ta metoda została zaadaptowana z Chuang et al.27.

  1. Przygotuj 3 l wody morskiej o wysokim zasoleniu, dodając NaCl do wody morskiej, aż zasolenie wzrośnie o 85%, mierzone za pomocą sondy zasolenia.
    UWAGA: W obecnym badaniu wodę morską o wysokim zasoleniu o mocy 74 PSU przygotowano z wody morskiej o wysokim zasoleniu 40 PSU z Morza Czerwonego.
  2. Wytnij małe fragmenty koralowca zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  3. Umieść pocięte fragmenty w 10-litrowym pojemniku wypełnionym 3 litrami izosmotycznej wody morskiej (w tym przypadku wody morskiej o niestresującym zasoleniu dla koralowców, takiej samej, jak użyta w kroku 1.2) podłączonej do pompy perystaltycznej (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Aby lepiej utrzymać zdrowie koralowców, można dodać regulatory temperatury, pompy powietrza i światła, aby symulować te same warunki akwariowe, na które kolonia była wcześniej narażona. Podczas inkubacji w niniejszej pracy fragmenty koralowców przechowywano w pojemnikach w temperaturze 26 °C, w 12-godzinnym dziennym cyklu świetlnym. Ruch wody i homogenizacja temperatury były utrzymywane przez pompy powietrza.
  4. Napełnij pojemnik zawierający fragmenty koralowców wodą morską o wysokim zasoleniu przygotowaną w kroku 2.1 za pomocą pompy perystaltycznej przez 24 godziny z szybkością 126 ml/h. Dodać łącznie 3 l wody o rosnącym zasoleniu około 40%.
    UWAGA: Wodę o wysokim zasoleniu można wytwarzać po prostu dodając NaCl do wody morskiej, aż do osiągnięcia zamierzonego zasolenia.
  5. Stwórz delikatny przepływ wody za pomocą pipety, aby uwolnić polipy ze szkieletu (krok 1.4.).
  6. Powoli wymień wodę, w której znajdują się polipy, na wodę izosmotyczną (krok 1.5.). Następnie przejdź do kroku 4 lub kroku 5.

3. Ratowanie polipów przez inkubację wody morskiej bez wapnia

UWAGA: Ta metoda została zaadaptowana z Pang et al.24.

  1. Przygotuj bezwapniowy roztwór sztucznej wody morskiej (CaFSW), dodając 26,29 g NaCl, 0,872 g KCl, 2,16 gMgSO4, 11,94 g MgCl2, 3,42 g Na2SO4 i 0,286 gNaHCO3 (patrz tabela materiałów) do 1 l wody dejonizowanej.
    UWAGA: To rozwiązanie zostało dostosowane w stosunku do poprzednich protokołów, aby lepiej pasowało do koralowców przystosowanych do zasolenia 40 PSU. W przypadku koralowców przystosowanych do innych warunków zasolenia należy użyć tej samej proporcji soli, ale dostosować całkowitą masę substancji rozpuszczonych, aby uzyskać zasolenie, które jest lepiej dostosowane do używanych koralowców.
  2. Wytnij małe fragmenty koralowców zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  3. Zanurz fragmenty koralowców na szalkach Petriego wypełnionych CaFSW przygotowanym wcześniej (Krok 3.1.) i inkubuj je w inkubatorach orbitalnych z prędkością obrotową 80 obr./min przez 3 godziny
    UWAGA: Ponownie ważne jest, aby całkowicie pokryć fragment wodą. Jeśli szalka Petriego nie wystarcza do przykrycia fragmentu, zoptymalizuj pojemnik i objętość zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi.
  4. Przenieść fragmenty na szalki Petriego lub 6-dołkowe płytki wypełnione 20% zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco i 100 mg/ml roztworu ampicyliny (patrz tabela materiałów) przygotowanego ze sztucznej wody morskiej o stężeniu 40 PSU. Inkubować fragmenty w temperaturze 26 °C i prędkości 80 obr./min, wymieniając pożywkę codziennie, aż do momentu, gdy między polipami będzie można zaobserwować trawienie tkankowe, a poszczególne polipy zaczną odłączać się od szkieletu.
    UWAGA: W większości przypadków trawienie tkanek jest zakończone w ciągu 20 godzin od inkubacji w tej pożywce i nie jest wymagana wymiana.
  5. Przenieś polipy do wysterylizowanej wody morskiej w celu wstępnego odzyskania za pomocą pipety. Po 1 godzinie inkubacji przejdź do Kroku 4 lub Kroku 5.

4. Utrzymanie polipów na szalkach Petriego

  1. Gdy polipy zostaną zwrócone do przefiltrowanej wody morskiej o niestresującym zasoleniu, wybierz żywotne polipy, obserwując integralność tkanek i ruch spowodowany przepływem rzęsek pod mikroskopem stereoskopowym.
  2. Umieść wybrane polipy na szklanej lub plastikowej szalce Petriego i przykryj szalkę Petriego siatką planktonową (rozmiar oczek 200 μm, patrz Tabela materiałów) tak, aby polipy nie odpływały od szalki.
    UWAGA: Rozmiar siatki może się różnić w zależności od wielkości polipów. Ważne jest, aby pamiętać, że siatki muszą mieć pory, które są mniejsze niż polipy i umożliwiają wymianę wody i przenikanie światła.
  3. Umieść szalkę Petriego w akwarium o odpowiednich warunkach dla użytych gatunków koralowców.
    UWAGA: W niniejszym badaniu warunki były następujące: 40 PSU przefiltrowana woda morska o temperaturze 26 °C i 12-godzinnym cyklu świetlnym.
  4. Otwieraj szalki Petriego co najmniej raz w tygodniu, aby odnowić wodę i umyć naczynia. Ten krok jest ważny, aby wyeliminować przerost glonów, które mogą konkurować z polipami koralowców lub je uszkadzać, lokalnie uwalniając toksyczne związki.

5. Utrzymanie polipów w inkubatorach

  1. Wybierz żywotne polipy zgodnie z opisem w kroku 4.1.
  2. Umieścić polipy w kolbach komórkowych opowierzchni 75 cm i 2 wypełnionych 50 ml izosmotycznej wody morskiej za pomocą pipet transferowych.
    UWAGA: W obecnych pracach do konserwacji polipów wykorzystano przefiltrowaną wodę morską pobraną z Morza Czerwonego. Można użyć wody o takich samych właściwościach, jak ta użyta w kroku 1.2.
  3. Zamknąć kolby i przenieść je do inkubatorów. Ustaw inkubatory na 12 godzin cykli świetlnych w temperaturze 26 °C i 40 obr./min. Wymieniaj 50% objętości wody co 4 dni i przenieś zawartość do czystych kolb, gdy / jeśli wypełnią się glonami lub biofilmem na ściankach.
    UWAGA: Obrazy zostały wykonane za pomocą w pełni apochromatycznego systemu zoomu wyposażonego w kamerę HD (patrz tabela materiałów) w celu uzyskania reprezentatywnych wyników.

Wyniki

Wypchnięcie polipów (bail-out) wywołano w fragmentach koralowca pochodzących z jednej kolonii gatunku P. verrucosa, stosując trzy różne metody (Rycina 1). Bail-out wywołany wysokim zasoleniem w wyniku odparowania wody nastąpił po 24 h inkubacji fragmentów koralowca w czarkach Petri w temperaturze otoczenia, wypełnionych wodą o początkowym zasoleniu 40 PSU, które po zakończeniu procesu osiągnęło wartość końcową 59 PSU (Rycina 2A-C,I). Bail-out poprzez dopływ słonej wody został również osiągnięty po 24 h inkubacji w wodzie o początkowym zasoleniu 40 PSU, które wzrosło do 52 PSU po 12 h i do 59 PSU na koniec procesu, czyli po 24 h (Rycina 2D-F,I). W obu eksperymentach to wzrost zasolenia był odpowiedzialny za indukcję trawienia tkanek przez polipy. Po 12 h wysokie zasolenie spowodowało skurczenie się polipów wraz z stopniowym cieńczeniem coenosarku, co ostatecznie doprowadziło do całkowitego oddzielenia się polipów po 24 h. Indukcja bail-out poprzez inkubację w wodzie morskiej pozbawionej wapnia została zakończona po 3 h inkubacji w CaFSW, a następnie 20 h inkubacji w medium DMEM 20% (Rycina 2G-H). W każdej z trzech metod tkanka została oddzielona od szkieletu poprzez odpychanie jej pipetą, aż do momentu uzyskania pojedynczych polipów koralowca (Rycina 3A-C) oraz „kulek tkankowych”.

Po odłączeniu polipy uzyskane wszystkimi trzema metodami zebrano i pozostawiono do regeneracji w wodzie morskiej, a następnie przeniesiono do naczyń Petri przykrytych siatkami lub do kolb hodowlanych. Polipy uzyskane metodą odparowania oraz metodą dopływu wody utrzymywano w naczyniach Petri wewnątrz akwariów; przeżyły one odpowiednio 6 tygodni i 8 tygodni (Rysunek 3D i Rysunek 3F). Mikrorozmnożone osobniki zachowały typową anatomię polipów, wykazując obecność czułków, tarczek przyssawnych i otworu gębowego1. Polipy uzyskane poprzez inkubację w wodzie morskiej pozbawionej wapnia miały krótki czas przeżycia, trwając do 1 doby, po czym ich tkanka uległa dysocjacji. Polipy uzyskane metodą odparowania wody morskiej i przechowywane w kolbach do hodowli komórkowej w inkubatorach przeżyły do 3 tygodni bez dysocjacji tkanek (Rysunek 3F). We wszystkich przypadkach, mimo że polipy nie mogły przytwierdzić się do podłoża, wyglądały na zdrowe i zachowały zabarwienie, a w ich tkankach nadal widoczne były komórki zooksantelli1.

Schemat procesu fragmentacji koralowców z wykorzystaniem odparowania i hipersolonej wody morskiej, wyniki inkubacji.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie trzech różnych badanych metod indukcji ucieczki polipów (bail-out) (po lewej), a następnie ilustracja dwóch metod utrzymania pozyskanych polipów w warunkach laboratoryjnych (po prawej). (A) Przedstawienie metody indukcji ucieczki polipów poprzez odparowanie wody. (B) Przedstawienie metody indukcji ucieczki polipów poprzez podaż wody morskiej o wysokim zasoleniu. (C) Przedstawienie metody indukcji ucieczki polipów poprzez inkubację w wodzie morskiej pozbawionej wapnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment nad reakcją koralowców na stres; obrazy progresji A-H; wykres zasolenia I; badanie ekologii rafy.
Rysunek 2: Obrazy procesu „bail-out” polipów wywołanego trzema różnymi metodologiami z wykorzystaniem fragmentów koralowca z gatunku P. verrucosa. (A-C) Fragment koralowca odpowiednio w 0 h, 12 h i 24 h po inkubacji w szalce Petri z zastosowaniem metody odparowywania wody. (D-F) Fragment koralowca odpowiednio w 0 h, 12 h i 24 h po inkubacji z zastosowaniem metody doprowadzania wody morskiej o wysokim zasoleniu. (G,H) Fragmenty koralowców odpowiednio przed i po zastosowaniu metody inkubacji w wodzie morskiej pozbawionej wapnia. Inkubacje w sztucznej wodzie morskiej bez wapnia trwały 3 h, a w 20% DMEM 21 h. (I) Graficzna reprezentacja wartości zasolenia w PSU wody morskiej w czasie podczas stosowania metod indukcji „bail-out” poprzez odparowywanie wody oraz doprowadzanie wody morskiej o wysokim zasoleniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe morskiego planktonu; morfologia organizmów; badanie planktonu na potrzeby badań środowiskowych.
Rycina 3: Obrazy polipów P. verrucosa uzyskane za pomocą trzech zaprezentowanych procedur indukcji odrywania (bail-out). (A-C) Obrazy polipów uzyskane odpowiednio metodami odparowania, dostarczania słonej wody oraz wody morskiej pozbawionej wapnia, wykonane bezpośrednio po ich odłączeniu od szkieletu. (D) Obraz polipa koralowca uzyskanego metodą odparowania po 6 tygodniach przeżycia w szalce Petriego. (E) Obraz polipa koralowca uzyskanego metodą dostarczania słonej wody po 8 tygodniach przeżycia w szalce Petriego. (F) Obraz polipa koralowca uzyskanego metodą odparowania po 3 tygodniach przeżycia w kolbie do hodowli komórkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wskaźnik przeżywalności polipów po poddaniu ich procesom ratunkowym i czas potrzebny do zakończenia procesu różnią się w zależności od wcześniej zgłoszonych badań 25,33,41, co można wyjaśnić różnymi podejściami eksperymentalnymi zastosowanymi w każdym badaniu. Na przykład różne gatunki koralowców, a nawet koralowce tego samego gatunku, ale zaaklimatyzowane do różnych warunków środowiskowych (np. koralowce z Morza Czerwonego), mają różne progi poziomu zasolenia. Wybrana metoda ratowania oraz warunki laboratoryjne/akwariowe również odgrywają ważną rolę w wynikach. W niektórych przypadkach utrzymanie mikrorozmnażania koralowców w warunkach laboratoryjnych przekroczyło czas przeżycia kultur komórek koralowców, osiągając miesiące przeżycia w koralowcach azooksanthellate3 3,41 i zooksanthellate25. Czas zakończenia procesu ratowania polipów był również różny w różnych badaniach, od kilku godzin2, 5,2, 7,30 do tygodni3, 5 inkubacji narażonej na stresor odpowiedzialny za spowodowanie ratunku. Inną zmienną, którą należy wziąć pod uwagę podczas badania ratowania polipów, jest powrót polipów do zdrowia po ekspozycji na ostry stres, który spowodował ich uwolnienie. Nadal można się zastanawiać, czy polipy po dofinansowaniu są w wystarczająco dobrym stanie, aby można je było wykorzystać jako modele do badania biologii koralowców. Odzyskanie ich tkanek po degradacji cenozarku jest kwestią niepokoju przy stosowaniu tych mikropropagacji. Jednak polipy w wielu badaniach, w tym w obecnym, były w stanie przedstawić komórki zooksantelli wewnątrz swoich tkanek i zewnętrznych morfologii z nienaruszoną polaryzacją ustno-aboral i mackami kilka tygodni po wykupieniu 25,27,32,36. Wcześniejsze badania wykazały również, że po uwolnieniu od ostrego stresu, uwolnione polipy koralowców wystawione na działanie silnie zasolonej lub podgrzanej wody morskiej były w stanie odzyskać ekspresję genów związanych z procesami takimi jak apoptoza, proteoliza i podział komórek do poziomów podobnych do tych, które stwierdzono przed bail-outem32,36, a nawet zwiększyć ekspresję genów związanych z gojeniem się tkanek36.

Jeśli chodzi o różnice w przeżywalności między metodami, ważne jest, aby podkreślić, że czas ten może się różnić w zależności od różnych eksperymentów, nawet jeśli stosowane są te same techniki, i może być związany ze zdrowiem użytych fragmentów i właściwym utrzymaniem polipów po procesie ratowania. W przypadku ratowania poprzez inkubację wody morskiej bez wapnia, przeżywalność polipów była ograniczona do 1 dnia. W związku z tym można stwierdzić, że metoda ta nie jest dobrze dostosowana do długoterminowego przetrwania badanych gatunków lub należy dokonać lepszej adaptacji techniki dla koralowców P. verrucosa z Morza Czerwonego. Przedstawione wyniki wykazały, że dłuższy czas przeżycia uzyskano przy zastosowaniu metod opartych na stopniowym wzroście zasolenia, gdy polipy poddano kapaniu wody o wysokim zasoleniu. Metoda ta może zapewnić bardziej kontrolowany wzrost zasolenia niż metoda parowania, a jednocześnie nie jest odpowiedzialna za wzrost stężenia innych substancji znajdujących się w wodzie morskiej, w tym odpadów metabolicznych koralowców, które są potencjalnie toksyczne dla organizmu. Z tych wszystkich powodów metoda ta została zasugerowana jako bezpieczniejsza alternatywa dla utrzymania zdrowych polipów27. Chociaż postawiono hipotezę, że metoda ta jest bezpieczniejsza dla zdrowia polipów i zdolna do wytwarzania polipów, które żyją dłużej, fakt ten został potwierdzony w tej obecnej publikacji, potrzebne są dodatkowe badania, aby to potwierdzić. Oba eksperymenty ratunkowe wywołane wysokim zasoleniem wykazały całkowite oderwanie polipów po osiągnięciu zasolenia 59 PSU w ciągu 24 godzin. Jeśli zasolenie wzrośnie powyżej poziomu, przy którym ratunek zostanie zakończony, polipy będą poddawane dalszemu stresowi, zmniejszając ich szanse na przeżycie i powrót do zdrowia po leczeniu ostrego stresu. Dlatego nie zaleca się dłuższego utrzymywania polipów przy takim poziomie zasolenia. Wykonując metodę indukcji ratunkowej poprzez ekspozycję na wodę morską bez wapnia, uzyskano całkowite oderwanie od 3-godzinnej inkubacji w sztucznej wodzie morskiej bez wapnia, co oznacza, że dalsza ekspozycja na to podłoże również nie jest zalecana.

Aby zająć się metodami, które były bardziej odpowiednie do badania polipów koralowych w badaniach laboratoryjnych/in vitro , badanie to skupiło się tylko na trzech procedurach, które trwały blisko 24 godziny, aby proces ratowania został zakończony i zostały wykorzystane w badaniach, które obejmowały długoterminowe utrzymanie polipów koralowych z koralowców skleraktynowych. Inne metody, o których mówiono, że trwają znacznie dłużej niż ten czas, nie zostały zastosowane. W tym badaniu, które koncentrowało się na wytwarzaniu polipów, nie podjęto próby osadzenia polipów na podłożu, które można było przenieść do różnych środowisk lub łatwo pobrać do analiz za pomocą jednorazowych pipet. Wyniki pokazują, że polipy koralowca z gatunku P. verrucosa były utrzymywane przy życiu, z powiązanymi komórkami zooksantelli, zdrowym stanem wizualnym i zachowaną grubą zewnętrzną strukturą anatomiczną, przez okres do 8 tygodni, nawet bez przyczepiania się do podłoża. Wyniki te wskazują, że można wygenerować więcej powtórzeń biologicznych z pojedynczych fragmentów koralowców przy użyciu niektórych technik zademonstrowanych w tym badaniu. Takie kontrpróby biologiczne mogą być przechowywane w kontrolowanych środowiskach (takich jak szalki Petriego i kolby komórkowe) i utrzymywane w warunkach laboratoryjnych przez miesięczne eksperymenty i wykorzystywane do różnych celów.

Od czasu pierwszych przypadkowych opisów ratowania polipów 42,43 ustanowiono nowe protokoły w celu znalezienia bardziej znormalizowanych metod wywoływania uwalniania polipów i utrzymywania takich polipów przy życiu, które można wykorzystać w przyszłych zastosowaniach badawczych. Obejmują one badanie różnych aspektów związanych z fizjologią holobiontów koralowców44 i interakcjami gospodarz-mikrobiom45, mechanizmami molekularnymi zaangażowanymi w blaknięcie koralowców 5,25 oraz zdrowiem, odpornością i ochroną holobiontu koralowca 12,13,46,47. Co więcej, uwolnione polipy koralowców mogą być wykorzystywane do zastosowań poza sferą badań i sugeruje się, że są przydatne do tworzenia propagul, które mogą przyczepiać się do podłoża i rosnąć, potencjalnie tworząc wiele osobników koralowców, które można wykorzystać do celów odbudowy, gdy upowszechnią się standardowe protokoły ratowania28. Ogólnie rzecz biorąc, chociaż w celu standaryzacji metodologii należy przeprowadzić bardziej dogłębne eksperymenty z wykorzystaniem polipów z wykorzystaniem polipów, wykazano, że ratowanie polipów jest powtarzalnym podejściem, które można zastosować jako narzędzie w badaniach koralowców do kilku celów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Adamowi Barno i Francisce Garcii za ich wsparcie w eksperymentach i monitorowaniu polipów koralowców. Dziękujemy również KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab za pomoc w zakresie utrzymania i infrastruktury akwarium. Badania zostały sfinansowane z grantu KAUST nr BAS/1/1095-01-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5560 Sonda przewodności/temperaturyYSI5560Sonda przewodności używana z miernikiem wieloparametrowym ProQuatro
Ace 5 cali. Szczypce ukośne ze stali stopowejAce Hardware2004083Służy do cięcia fragmentów koralowców
Sól sodowa ampicylinySigma-AldrichA9518Używany w podłożu DMEM.
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41965-039Służy do inkubacji fragmentów koralowców w metodzie ratowania polipów bezwapniowych
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterylne, PolistyrenThermo Fisher ScientificFB0875713Aszalka Petriego używana do ratowania przez odparowanie i do utrzymywania polipów w akwarium.
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 WattSchego548Grzałki stosowane w akwarium
Leica Application Suite wersja 4.2Leica MicrosystemsNAOprogramowanie używane do przechwytywania obrazów w demonstracyjnych wynikach
Leica IC80 HDLeica Microsystems12730216Aparat używany do robienia demonstracyjnych zdjęć
wyników Leica MDG33Leica Microsystems10 450 123Statyw stereoskopowy używany do robienia demonstracyjnych zdjęć wyników
Leica Z6 APOLeica MicrosystemsNAMakroskop używany do robienia demonstracyjnych zdjęć wyników
Chlorek magnezuThermo Fisher Scientific7487-88-9Służy do przygotowania sztucznej wody morskiej bez wapnia.
Siarczan magnezubezwodny Sigma-Aldrich7791-18-6Służy do przygotowania sztucznej wody morskiej bez wapnia.
Głowica pompy Masterflex I/P Easy-Load do przewodów precyzyjnych, biała obudowa PPS, wirnik SSGłowica pompy perystaltycznejMasterflexHV-77602-10
Precyzyjne napędy modułowe Masterflex L/S ze sterownikiem stacjonarnymMasterflexEW-07557-00Napęd pompy perystaltycznej stosowany do pompowania wody morskiej o wysokim zasoleniu. Może być zastąpiony dowolną pompą perystaltyczną zdolną do utrzymywania przepływu wody zgodnie z opisem w protokole.
Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, silikon utwardzany platyną, L/S 16; 25 stópMasterflexHV-96410-16Rurka do pompy perystaltycznej.
Millex 33 mm PVDF 0,22 &mikro; m Sterylny RUOSigma-AldrichSLGVR33RSSłuży do filtrowania sztucznej wody morskiej.
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific156499Kolba zwykle używana do hodowli komórkowych używanych do hodowli polipów.
Wytrząsarka orbitalna, Advanced 5000, VWRVWR444-2916Wytrząsarka używana wewnątrz inkubatora.
Inkubator Percival - I-22VLInkubator PercivalNAsłuży do hodowli koralowców trzymanych w kolbach komórkowych.
Siatka planktonowa 200 &mikro; m rozmiar oczekKC DaniaNASłuży do pokrywania szalek Petriego zawierających polipy koralowe.
Chlorek potasuVWR Chemicals7447-40-7Służy do przygotowania sztucznej wody morskiej bez wapnia.
Miernik wieloparametrowy ProQuatroYSI606950Służy do pomiaru zasolenia za pomocą protokołu
RADION XR15 G5 PROEcotechNAŚwiatła stosowane w akwarium
Sól z Morza Czerwonego
Klasa premium, umiarkowana zasadowość		Morze CzerwoneNASłuży do przygotowania 40 PSU sztucznej wody morskiej.
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich144-55-8Służy do przygotowania sztucznej wody morskiej bez wapnia.
Chlorek soduSigma-AldrichS3014Służy do przygotowania sztucznej wody morskiej bez wapnia.
Siarczan sodu bezwodnyVWR Chemicals7757-82-6Służy do przygotowania sztucznej wody morskiej bez wapnia.
Termostat TRD 112SchegoNATermostat stosowany w akwarium
Turbelle Nanostream 6025Tunze6025 000Pompy stosowane w akwarium
.

Bibliografia

  1. Goffredo, S., Dubinsky, Z. The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , Springer. (2016).
  2. Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56(2021).
  3. Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
  4. Douglas, A. Coral bleaching--how and why. Marine Pollution Bulletin. 46 (4), 385-392 (2003).
  5. Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
  6. Oakley, C. A., Davy, S. K. Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , Springer. 189-211 (2018).
  7. Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
  8. Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
  9. Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
  10. Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807(2012).
  11. Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179(2020).
  12. Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
  13. Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
  14. Debergh, P. C., Read, P. E. Micropropagation. 1, Kluwer Academic Publishers. 1-13 (1991).
  15. Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
  16. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  17. Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
  18. Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1(2006).
  19. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  20. Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
  21. Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
  22. Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
  23. Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
  24. Pang, A. -P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  25. Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  26. Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
  27. Chuang, P. -S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
  28. Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
  29. Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
  30. Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
  31. Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
  32. Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280(2021).
  33. Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
  34. Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
  35. Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
  36. Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
  37. Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687(2017).
  38. Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
  39. Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
  40. Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
  41. Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165(2014).
  42. Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
  43. Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
  44. Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
  45. Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249(2020).
  46. Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. dA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341(2017).
  47. Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikropropagacja koralowcówpolipy koralowcówblaknięcie koralowcówfizjologia koralowcówstres zasoleniawoda morska wolna od wapniahodowla na szalkach Petriegotworzenie szkieletu koralowca
Indukowanie ratowania polipów w koloniach koralowców w celu uzyskania zindywidualizowanych mikropropagatów do laboratoryjnego użytku eksperymentalnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.