Artykuł metodologiczny

Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

DOI:

10.3791/63841

⸱

12 lipca 2022

 ,  , 
1The Heart Institute, Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak analizować interesujące regiony genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek za pomocą PhyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu UCSC. Ponadto zaleca się stosowanie kilku narzędzi i zasobów w celu dalszego zbadania charakterystyki sekwencji zidentyfikowanych mikrobiałek w celu uzyskania wglądu w ich przypuszczalne funkcje.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) popchnęło dziedzinę genomiki do przodu i stworzyło sekwencje całego genomu dla wielu gatunków zwierząt i organizmów modelowych. Jednak pomimo tego bogactwa informacji o sekwencjach, kompleksowe wysiłki w zakresie adnotacji genów okazały się wyzwaniem, zwłaszcza w przypadku małych białek. Warto zauważyć, że konwencjonalne metody adnotacji białek zostały zaprojektowane tak, aby celowo wykluczyć domniemane białka kodowane przez krótkie otwarte ramki odczytu (sORF) o długości mniejszej niż 300 nukleotydów, aby odfiltrować wykładniczo większą liczbę fałszywych niekodujących sORF w całym genomie. W rezultacie, setki funkcjonalnych małych białek zwanych mikroproteinami (o długości <100 aminokwasów) zostały błędnie sklasyfikowane jako niekodujące RNA lub całkowicie pominięte.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół wykorzystania darmowych, publicznie dostępnych narzędzi bioinformatycznych do przeszukiwania regionów genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek w oparciu o ewolucyjną ochronę. W szczególności udostępniamy instrukcje krok po kroku, jak badać potencjał zachowania i kodowania sekwencji przy użyciu częstotliwości substytucji kodonów filogenetycznych (PhyloCSF) w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu Uniwersytetu Kalifornijskiego Santa Cruz (UCSC). Ponadto szczegółowo opisujemy kroki w celu efektywnego generowania wielu gatunków dopasowań zidentyfikowanych sekwencji mikroprotein w celu wizualizacji zachowania sekwencji aminokwasów i zalecamy zasoby do analizy cech mikroprotein, w tym przewidywanych struktur domenowych. Te potężne narzędzia mogą być wykorzystane do identyfikacji przypuszczalnych sekwencji kodujących mikrobiałka w niekanonicznych regionach genomu lub do wykluczenia obecności konserwatywnej sekwencji kodującej o potencjale translacyjnym w niekodującym transkryptach będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja kompletnego zestawu elementów kodujących w genomie była głównym celem od momentu rozpoczęcia Projektu Poznania Ludzkiego Genomu i pozostaje głównym celem w kierunku zrozumienia systemów biologicznych i etiologii chorób genetycznych1,2,3,4. Postępy w technikach NGS doprowadziły do wytworzenia całych sekwencji genomu dla dużej liczby organizmów, w tym kręgowców, bezkręgowców, drożdży i roślin5. Ponadto wysokoprzepustowe metody sekwencjonowania transkrypcji jeszcze bardziej ujawniły złożoność transkryptomu ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany poniżej szczegółowo opisuje kroki ładowania i nawigacji po ścieżkach przeglądarki PhyloCSF w przeglądarce UCSC Genome Browser (wygenerowanej przez Mudge et al.49). W przypadku ogólnych pytań dotyczących przeglądarki UCSC Genome Browser, obszerny podręcznik użytkownika przeglądarki genomu można znaleźć tutaj: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.

1. Wczytywanie koncentratora śledzenia PhyloCSF do przeglądarki genomu UCSC

  1. Otwórz okno przeglądarki internetowej i przejdź do przeglądar....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj użyjemy zweryfikowanej mikrobiałkowej mitoreguliny (Mtln) jako przykładu, aby pokazać, jak konserwatywny sORF wygeneruje dodatni wynik PhyloCSF, który może być łatwo zwizualizowany i przeanalizowany w przeglądarce genomu UCSC. Mitoregulina była wcześniej opisywana jako niekodujący RNA (dawniej ludzki identyfikator genu LINC00116 i mysi gen ID 1500011K16Rik). Genomika porównawcza i metody analizy konserwacji sekwencji odegrały kluczową rolę w jego początkowym odkryciu40.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak badać interesujące regiony genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek za pomocą PhyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce UCSC Genome Browser 48,49,50,51. Jak opisano powyżej, PhyloCSF jest potężnym algorytmem genomiki porównawczej, który integruje modele filogenetyczne i częstotliwości substytucji kodonów w celu i.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (HL-141630 i HL-160569) oraz Cincinnati Children's Research Foundation (Trustee Award).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Website<strong>Website AddressRequirements
Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Toolhttps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/Web browserProgram do wyrównywania wielu sekwencji do efektywnego dopasowywania sekwencji FASTA (tj. do międzygatunkowego porównywania zidentyfikowanych mikrobiałek)
COXPRESSdbhttps://coxpresdb.jpPrzeglądarka internetowaZapewnia współregulowane relacje genów w celu oszacowania funkcji genów
Narzędzia bioinformatyczne EMBL-EBI FAQshttps://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQCzęstozadawane pytania (FAQ) dotyczące narzędzi EMBL-EBI w przeglądarce internetowej. Zawiera klucz kodowania kolorami do dopasowania sekwencji białek
Europejski Instytut Bioinformatyki (EMBL-EBI),
Narzędzia i zasoby danych		https://www.ebi.ac.uk/services/allPrzeglądarka internetowaPełna lista ogólnodostępnych stron internetowych, narzędzi i zasobów danych
Expasy - Szwajcarski PortalZasobów Bioinformatycznychhttps://www.expasy.orgPrzeglądarka internetowaZestaw narzędzi i zasobów bioinformatycznych do analizy sekwencji białek, który jest utrzymywany przez Szwajcarski Instytut Bioinformatyki (SIB)
Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI)
Conserved Domain Search		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgiPrzeglądarkainternetowaNarzędzie do identyfikacji konserwatywnych domen w obrębie sekwencji białkowych lub kodujących nukleotydy
Pfam 35http://pfam.xfam.orgPrzeglądarkainternetowaBaza danych rodziny białek (Pfam), zapewnia wyrównanie i klasyfikację rodziny i domeny białek
PhyloCSF Track Hub Opis https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q
edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10
&c=chr2&g=hub_109801_
PhyloCSF_smooth		Przeglądarka internetowaSzczegółowy opis wygładzonych ścieżek PhyloCSF i PhyloCSF Track Hub
   
   
   
   
   
SignalP 6.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0Przeglądarka internetowaPrzewiduje obecność peptydów sygnałowych i lokalizację miejsc ich rozszczepienia
TMHMM - 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0Przeglądarka internetowaPrzewidywanie helis transbłonowych w białkach
UCSC Genome Browser BLAT Searchhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatPrzeglądarka internetowaNarzędzie służące do znajdowania regionów genomu na podstawie informacji o sekwencji DNA lub białka
UCSC Genome Browser Gatewayhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayPrzeglądarka internetowaBezpośredni link do UCSC Genome Browser Gateway
UCSC Genome Browser Homehttps://genome.ucsc.edu/Web browserStrona główna przeglądarki UCSC
Genome Browser UCSC Genome Browser Track Data Hubshttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubsPrzeglądarka internetowaBezpośredni link do bazy danych Track Data Hubs/Public Hubs w celu wyszukania i załadowania PhyloCSF Tracks
UCSC Genome Browser User Guidehttps://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.htmlWeb browserObszerny podręcznik użytkownika opisujący sposób poruszania się po UCSC Genome Browser
WoLF PSORTa href="https://wolfpsort.hgc.jp">https://wolfpsort.hgc.jpWeb browserNarzędzie do przewidywania lokalizacji subkomórkowej białek
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collins, F. S., Morgan, M., Patrinos, A. The human genome project: lessons from large-scale biology. Science. 300 (5617), 286-290 (2003).
  2. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  3. Sachidanandam, R., <....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microprotein IdentificationSequence AnalysisShort Open Reading FramesPhyloCSF AnalysisUCSC Genome BrowserMultiple Sequence AlignmentAmino Acid ConservationNoncoding RNA AnnotationDomain Structure PredictionComparative Genomics

Powiązane artykuły