Artykuł metodologiczny

Wizualizacja organelli drożdży za pomocą fluorescencyjnych markerów białkowych

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63846

⸱

20 kwietnia 2022

 ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Metabolism & Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy użycie zestawu markerów organelli opartych na białkach fluorescencyjnych w obrazowaniu żywych komórek pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

Pączkujące drożdże, Saccharomyces cerevisiae, to klasyczny system modelowy do badania funkcji i dynamiki organelli. W naszych poprzednich pracach skonstruowaliśmy markery oparte na białkach fluorescencyjnych dla głównych organelli i struktur endobłonowych, w tym jądra, retikulum endoplazmatycznego (ER), aparatu Golgiego, endosomów, wakuoli, mitochondriów, peroksysomów, kropelek lipidów i autofagosomów. Przedstawiony tutaj protokół opisuje procedury stosowania tych markerów u drożdży, w tym przygotowanie DNA do transformacji drożdży, dobór i ocenę transformantów, fluorescencyjną obserwację mikroskopową oraz oczekiwane wyniki. Tekst jest skierowany do badaczy, którzy wkraczają w dziedzinę badania organelli drożdży z innych środowisk. Omówiono podstawowe kroki, a także uwagi techniczne dotyczące kwestii związanych ze sprzętem mikroskopu i kilka typowych pułapek. Stanowi punkt wyjścia dla ludzi do obserwacji subkomórkowych jednostek drożdży za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Te narzędzia i metody mogą być wykorzystane do identyfikacji lokalizacji subkomórkowej białek i śledzenia organelli będących przedmiotem zainteresowania w obrazowaniu poklatkowym.

Wprowadzenie

Subkomórkowy podział na organelle związane z błoną jest powszechną zasadą w organizacji komórek eukariotycznych. Każda organella spełnia określone funkcje. Podobnie jak w wielu innych aspektach biologii eukariotycznej, pączkujące drożdże, Saccharomyces cerevisiae, są klasycznym systemem modelowym w wyjaśnianiu podstawowych zasad organizacji i dynamiki organelli. Przykłady obejmują przełomowe odkrycia w szlaku wydzielania białek, szlaku importu białek peroksysomalnych oraz szlaku autofagii1,2,3.

W typowych warunkach bogatych w składniki odżywcze, szybko rosnące komórki drożdży zawierają retikulum endoplazmatyczne (ER), wczesne Golgiego, późne Golgiego/wczesne endosomy, późne endosomy, wakuole i mitochondria. Niektóre peroksysomy, kropelki lipidów i autofagosomy (nawet mniej niż pierwsze dwa, głównie typu pęcherzykowego Cvt, które są obecne w warunkach bogatych w składniki odżywcze4) są również obecne, ale nie tak widoczne, jak byłyby w określonych warunkach hodowli (pożywki bogate w lipidy, pożywki głodowe itp.). W porównaniu z innymi popularnymi modelami eukariotycznymi, komórki drożdży są dość małe; Średnica typowej komórki drożdży wynosi około 5 μm, w porównaniu do kilkudziesięciu mikrometrów dla większości komórek zwierzęcych i roślinnych. W rezultacie, w tym samym polu obrazowania, które normalnie zawiera pojedynczą przylegającą komórkę zwierzęcą, zwykle widzi się dziesiątki komórek drożdży na różnych etapach cyklu komórkowego. Oprócz różnicy w wielkości, morfologia organelli drożdży ma również pewne szczególne cechy. Na poziomie ultrastrukturalnym drożdże ER składają się z arkuszy i kanalików, podobnie jak w innych systemach. Pod mikroskopią fluorescencyjną drożdżowy ER objawia się jako dwa pierścienie z pewnymi łączącymi się strukturami pomiędzy nimi. Wewnętrzny pierścień to jądrowy ER, który jest ciągły z otoczką jądrową, a zewnętrzny pierścień to obwodowy ER, który jest siecią rurkową leżącą pod błoną plazmatyczną5. Podobny do komórek roślinnych, ale różniący się od komórek zwierzęcych, organella hybrydowa, późny endosom Golgiego/wczesny, znajduje się na przecięciu szlaku wydzielniczego i szlaku endocytarnego6,7. Morfologicznie drożdżowe aparaty Golgiego są rozproszone w cytoplazmie. Wakuole są funkcjonalnie analogiczne do lizosomów w komórkach zwierzęcych. Często zajmują duże części cytoplazmy i ulegają częstemu rozszczepieniu i fuzji. Oprócz zastosowania fluorescencyjnych markerów kolokalizacji, błonę wakuolarną można odróżnić od jądrowego ER na podstawie co najmniej dwóch kryteriów: błona wakuolarna jest na ogół bardziej zaokrąglona niż jądrowa ER, a zapadający się wygląd wakuoli w DIC jest również bardziej wyraźny niż w jądrze.

Rutynowo, używamy zestawu markerów opartych na białkach fluorescencyjnych do wizualizacji wyżej wymienionych organelli w żywych komórkach drożdży (Tabela 1). Wierność i funkcjonalność tych markerów organelli została eksperymentalnie zweryfikowana7,8. Te konstrukty markerów mają na celu wprowadzenie kaset chimery białek fluorescencyjnych do genomu drożdży. Jak opisano poniżej, w ramach przygotowań do transformacji drożdży, liniowe fragmenty DNA są generowane przez trawienie enzymatyczne lub amplifikację PCR7,8. Liniowe fragmenty DNA integrują się z genomem poprzez rekombinację homologiczną. W przypadku plazmidów opisanych w tym protokole stosuje się trzy typy konstrukcji. W pierwszym typie, obejmującym większość plazmidów, często możliwe jest otrzymanie transformantów przenoszących wiele kopii konstruktu. Jest to zwykle niepożądane, ponieważ wprowadza ekspresyjne i możliwie funkcjonalne różnice między transformantami. Transformanty jednokopijne muszą być identyfikowane za pomocą obrazowania opisanego w niniejszym protokole, immunoblottingu lub starannie zaprojektowanych testów PCR. W drugim typie, obejmującym GFP-Sed5, GFP-Pep12 i GFP-Atg8, w haploidalnych komórkach drożdży wytwarzana jest tylko integracja pojedynczej kopii. Zarówno pierwszy, jak i drugi typ utrzymują endogenną kopię genu markerowego w stanie nienaruszonym w genomie. Trzeci typ konstrukcji plazmidu, obejmujący Sec7-2GFP i Vph1-2GFP, ma na celu wprowadzenie C-końcowych knock-inów, prowadzących do tego, że chimery są jedyną kopią odpowiedniego genu markerowego.

Tutaj opisujemy procedurę wykorzystania tych markerów organelli, dostarczamy przykładowe obrazy mikroskopowe i omawiamy środki ostrożności skierowane do badaczy nowych w obrazowaniu organelli drożdżowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Budowa szczepu drożdży

  1. Uzyskać plazmidy markerowe i odpowiedni szczep drożdży.
    UWAGA: Plazmidy są dostępne w firmie Addgene. Protokół ten wykorzystuje TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) i DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) jako przykłady. Jednym z ważnych czynników przy wyborze szczepu, poza naturą pytania naukowego, jest kompatybilność markerów selekcyjnych. Opisane tutaj plazmidy markerów organelli wykorzystują URA3 i TRP1 jako markery selekcyjne. W związku z tym genotyp szczepu biorcy musi być ura3 i trp1. W przeciwnym razie należy zmodyfikować szczep lub plazmidy.
  2. Przygotuj pożywkę drożdżową według następujących przepisów.
    UWAGA: SMD (syntetyczna minimalna dekstroza; 2% glukozy, 0,67% drożdżowa zasada azotowa (YNB) bez aminokwasów, 30 mg/L adenina, 30 mg/L lizyna, 30 mg/L metionina, 20 mg/L histydyna, 20 mg/L uracyl, 50 mg/L tryptofan, 50 mg/L leucyna). SMD+CA (SMD z dodatkiem 0,5% casaminokwasów). YPD (Ekstrakt drożdżowy dekstroza peptonowa; 1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 2% glukoza). SD-N (dekstroza syntetyczna bez azotu; 0,17% YNB bez aminokwasów i siarczanu amonu, 2% glukozy). Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby zapoznać się z rozważaniami na temat wyboru medium.
  3. Przed etapem transformacji należy wygenerować zlinearyzowane fragmenty DNA poprzez trawienie enzymatyczne lub amplifikację PCR plazmidu markera organelli.
    UWAGA: W tabeli 1 wymieniono miejsca enzymów restrykcyjnych i startery PCR do generowania liniowych fragmentów z plazmidów markerów organelli.
  4. Hoduj komórki drożdży w płynnej pożywce YPD i przekształcaj drożdże z liniowym fragmentem DNA.
    UWAGA: Transformację drożdży można przeprowadzić przy użyciu konwencjonalnej metody opartej na LiAc9 lub innych wybranych metod. Wskazane jest włączenie odpowiednich kontroli transformacji, w szczególności kontroli ujemnej bez plazmidu lub DNA pochodzącego z plazmidu.
  5. Inkubować na odpowiedniej płytce selekcyjnej (np. do selekcji URA3 użyć pożywki SMD-Ura) w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
    UWAGA: Pojawienie się pojedynczych kolonii zajmuje około 2 dni.
  6. Aby zweryfikować ekspresję chimery fluorescencyjnej i liczbę kopii całkowania, należy wybrać osiem kolonii z płytki selekcyjnej, ponownie nałożyć na świeże płytki selekcyjne i inkubować w temperaturze 30 °C.

2. Mikroskopia fluorescencyjna: ogólne procedury i obrazowanie pojedynczego punktu czasowego

  1. Hodować komórki drożdży przez noc w płynnym podłożu SMD w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
  2. Następnego ranka zmierz gęstość optyczną kultury drożdży przy długości fali 600 nm (zwanej dalej OD600) w spektrofotometrze lub czytniku płytek.
    UWAGA: Przy pewnej praktyce w zaszczepianiu drożdży, zwykle można upewnić się, że OD600 wszystkich próbek jest na tym etapie niższy niż 2. Jeśli okaże się, że jest wyższy, zaleca się większe rozcieńczenie w następnym kroku i danie komórkom drożdży więcej czasu na regenerację.
  3. Rozcieńczyć kulturę drożdży do około 0,2 OD600 przy użyciu świeżej pożywki.
  4. Kontynuuj hodowlę, aż OD600 osiągnie około 0,8-1,0,
    UWAGA: Czas podwojenia drożdży wynosi około 1,5-2 h.
  5. Połóż szklankę nakrywkową na bibułce na płaskiej powierzchni, rozprowadź 5 μl 1 mg/ml konkanawaliny A na górnej stronie szkła nakrywkowego i poczekaj 5 minut (Rysunek 1A)10.
    UWAGA: Ten etap przygotowania można wykonać z wyprzedzeniem.
  6. Przenieś 100 μl kultury drożdży na górną stronę szkła nakrywkowego i odczekaj 5 minut.
  7. Połączyć szkło nakrywkowe ze szkiełkiem nośnym, z komórkami drożdży umieszczonymi pomiędzy nimi; docisnąć z odpowiednią siłą, aby zabezpieczyć mocowanie.
    UWAGA: Potrzeba trochę praktyki, aby znaleźć odpowiednie ciśnienie, tak aby komórki drożdży tworzyły nieruchomą pojedynczą warstwę, ale nie były miażdżone (Rysunek 1B). Na tym etapie płynne podłoże zostanie wypchnięte i wchłonięte przez leżącą pod spodem bibułkę.
  8. Zamontuj szkiełko podstawowe na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj i skup się na skrawku komórek drożdży za pomocą kontrastu różnicowego (DIC) lub oświetlenia kontrastem fazowym (PC).
    UWAGA: Nie używaj fluorescencji do lokalizowania komórek; W przeciwnym razie sygnał może zostać wybielony przed zebraniem danych.
  9. Ręcznie skonfiguruj trzy zestawy parametrów do zbierania stosów z-obrazów : przekrój z, kanały obrazowania i parametry ekspozycji.
    UWAGA: Rysunek 1 zawiera ilustracje uzupełniające przedstawiające przykłady ustawień parametrów w graficznym interfejsie użytkownika w jednym komercyjnym oprogramowaniu. Dokładny wygląd różni się w zależności od platformy oprogramowania, ale opcje są mniej więcej takie same.
    1. Podział na sekcje Z: Zbieraj plastry w odstępach co 0,5 μm na 15 plasterków (pokrywając głębokość 7 μm, zwykle wystarczającą dla normalnych haploidalnych komórek drożdży).
    2. Kanały obrazowania: Wybierz DIC lub PC dla konturów komórek i odpowiednich kanałów fluorescencyjnych w razie potrzeby.
    3. Natężenie światła wzbudzenia i czas ekspozycji: Ustaw natężenie światła wzbudzenia i czas ekspozycji odpowiednio dla próbki.
      UWAGA: Jako punkt wyjścia użyj 100% dla natężenia światła wzbudzenia i 100 ms dla czasu ekspozycji; zmniejszyć natężenie światła, jeśli fotowybielanie staje się oczywiste wraz z postępem zbierania Z-Stack lub jeśli sygnał przekracza zdolność nagrywania kamery (tj. nasycenie sygnału); Zwiększ natężenie światła, jeśli stosunek sygnału do szumu jest niski.
  10. Zapisz ustawienia obrazowania i użyj tych samych ustawień dla wszystkich próbek, które mają być porównane.
    UWAGA: Nie używaj ustawienia "auto" do zbierania danych i wizualizacji obrazu. Ważne jest, aby zapisać ustawienia w notatce laboratoryjnej, aby dokładnie te same parametry można było ponownie zastosować w przyszłych powtórzeniach eksperymentalnych. Niektóre aplikacje do sterowania mikroskopem mają możliwość zapisywania i ponownego stosowania ustawień; Mimo to zaleca się niezależne rejestrowanie ustawień, ponieważ profile oprogramowania mogą zostać przypadkowo usunięte lub zmodyfikowane przez współpracowników.
  11. Zapisz dane w 16-bitowym formacie stosu wielokanałowego.
    UWAGA: Nie zapisuj obrazów jako 8-bitowych RGB (lub 24-bitowych, jeśli liczysz wszystkie trzy kolory). Zapoznaj się z sekcją dotyczącą wizualizacji obrazu (sekcja 4), aby zapoznać się z ograniczeniami formatu 8-bitowego.
  12. Przenieś się do zupełnie innego obszaru, aby wyświetlić następną kolekcję stosu obrazów.
    UWAGA: Sąsiednie obszary mogły doświadczyć fotowybielania i fototoksyczności. W rezultacie stos obrazów zebrany z tych obszarów może być mylący.

3. Obrazowanie poklatkowe

UWAGA: Procedura obrazowania poklatkowego różni się od tej dla obrazowania pojedynczego punktu czasowego w dwóch obszarach: przygotowaniu próbki i parametrach obrazowania.

  1. Przygotowanie próbki
    1. Posmaruj naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm roztworem 1 mg/ml konkanawaliny A i odczekaj 5 minut lub dłużej.
    2. Dodaj 1,5 ml płynnej kultury drożdży do naczynia i odczekaj 5 minut, aby komórki drożdży osiadły na powierzchni szkła.
    3. Za pomocą pipety odessać płynne podłoże od krawędzi naczynia, a następnie delikatnie spłukać plamę osadu drożdżowego około 1 ml świeżej pożywki, aby usunąć niepewnie przyczepione komórki.
    4. Powtórz płukanie 2-3 razy. Odessać pipetą, a następnie delikatnie dodać 2 ml świeżej pożywki hodowlanej.
  2. Parametry obrazowania
    1. Cięcie w kształcie litery Z: Zbieraj plastry w odstępach co 0,5 μm przez 15 plasterków.
    2. Kanały obrazowania: Wybierz zgodnie z potrzebami.
    3. Natężenie światła wzbudzającego i czas ekspozycji: Użyj minimum niezbędnego do rozpoznania badanej struktury subkomórkowej.
      UWAGA: W przypadku obrazowania poklatkowego fotowybielanie i fototoksyczność z powtarzającego się oświetlenia ograniczają całkowitą liczbę punktów czasowych, które można zebrać. W związku z tym intensywność wzbudzenia i czas ekspozycji są zazwyczaj ustawiane na niskie wartości, aby można było zobrazować więcej punktów czasowych.
    4. Interwał obrazowania: Ustaw przedziały czasowe odpowiednie dla badanego procesu biologicznego.
      UWAGA: Na przykład tworzenie autofagosomu w warunkach głodu trwa około 5-10 minut; Preferowany jest interwał 1 minuty lub krótszy, aby śledzić jego dynamikę. W warunkach bogatych w składniki odżywcze cykl komórkowy drożdży zachodzi w skali godzinowej; Można wykorzystać dłuższy interwał, taki jak 10-20 minut.
  3. Jeśli dostępny jest odpowiedni sprzęt, utrzymuj temperaturę naczynia na poziomie 30 °C.
    UWAGA: Większość procesów biologicznych w komórkach drożdży można również obrazować w temperaturze pokojowej (RT), z wyjątkiem ogólnie wolniejszego tempa.

4. Wizualizacja stosów obrazów i ocena liczby kopii integracji

  1. Zainstaluj oprogramowanie Fiji lub ImageJ do wizualizacji i analizy obrazów11,12.
    UWAGA: Fidżi to kolekcja narzędzi oparta na ImageJ, odpowiednia do wizualizacji i przetwarzania danych obrazów biologicznych ogólnego przeznaczenia. Do przetwarzania obrazu wymienionego w tym protokole wystarczy ImageJ bez dodatkowych wtyczek.
  2. Wybierz odpowiednie parametry do wyświetlania i porównywania obrazu.
    1. Na Fidżi otwórz kilka obrazów z-stack
      2. .
    2. Przeciągnij pozycję Z w każdym stosie do środkowej sekcji (lub innych pozycji, jeśli badana struktura jest tam lepiej wizualizowana).
    3. Przejdź do Obraz > Dostosuj jasność/kontrast > i kliknij Resetuj.
    4. W oknie Jasność/Kontrast (B&C) użyj pasków przewijania, aby zmienić dwa parametry, wartości minimalne i maksymalne, aby wyraźnie rozpoznać badaną strukturę.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wartość minimalna jest ustawiona tak, aby była bliska wartości średniej w pustych obszarach, a wartość maksymalna jest ustawiona na wartość bliską maksimum na obrazie. Wartości te można wywnioskować z wyświetlonego histogramu (Rysunek 2A). Jeśli stacja robocza przetwarzania obrazu jest skalibrowana kolorystycznie, wartość minimalną można ustawić nieco wyższą, aby ukryć więcej sygnałów tła.
    5. W oknie Jasność/Kontrast (B&C) kliknij Ustaw i zaznacz pole wyboru Propaguj do wszystkich innych otwartych obrazów w wyskakującym oknie Ustaw zakres wyświetlania.
      UWAGA: Ta operacja stosuje te same ustawienia jasności/kontrastu (w tym wartości minimalne i maksymalne) do wszystkich otwartych obrazów, aby można było porównać obrazy.
    6. Przeglądaj różne obrazy i przewijaj stos z w każdym z nich. Jeśli obrazy wyglądają dobrze z odpowiednim ciemnym tłem i niewielkimi przesadzonymi nasyceniami, zapisz ustawienia Minimum i Maksimum.
  3. W przypadku obrazów wielokanałowych wybierz ustawienia wyświetlania obrazu dla każdego kanału:
    1. Przejdź do narzędzia Obraz > Kolor > kanały, wybierz tryb Skala szarości w wyskakującym oknie Kanały.
    2. Przejrzyj każdy kanał, wybierz odpowiednią jasność/kontrast dla tego kanału i zapisz ustawienia.
    3. Po dostosowaniu jasności/kontrastu wróć do okna Kanały i przejdź do trybu kompozytowego, aby jednocześnie wyświetlać wiele kanałów.
      UWAGA: Pseudo kolor dla każdego kanału można ręcznie zmienić w Kanałach, aby dopasować go do osobistych preferencji. Pola wyboru służą do pokazywania/ukrywania poszczególnych kanałów.
  4. W razie potrzeby użyj pól wyboru w oknie Kanały, aby pokazać lub ukryć określone kanały.
  5. W razie potrzeby wygeneruj projekcje stosu, przechodząc do Image > Stacks > Z Project.
    UWAGA: Dostępnych jest kilka trybów projekcji. Maksymalna intensywność to dobry wybór do szybkiej oceny. Należy wziąć pod uwagę charakter badań w celu określenia, czy do oceny ilościowej należy użyć określonego trybu projekcji, czy też pojedynczych wycinków. Projekcja może być również ograniczona do wybranych plasterków Z, aby zmniejszyć interferencję nieostrego światła.
  6. Ekran dla transformantów całkujących z pojedynczą kopią.
    1. Po zastosowaniu tych samych ustawień jasności/kontrastu do wszystkich otwartych obrazów, porównaj intensywność obrazu w próbkach, aby wywnioskować liczbę integracji plazmidu.
      UWAGA: Obrazy należy uzyskiwać, postępując zgodnie z ogólną procedurą obrazowania pojedynczego punktu czasowego, zaczynając od nocnego posiewu w płynnym podłożu. Integracje z wieloma kopiami (patrz kolonia 2 i 3 w Rysunek 2B dla przykładów) wyglądają znacznie jaśniej niż integracje z pojedynczą kopią (kolonia 1 w Rysunek 2B). Natomiast te z pojedynczą kopią wyglądają podobnie do siebie (Rysunek 2B).
    2. Analizuj obrazy z ośmiu transformantów dla każdego szczepu, upewniając się, że używasz tych samych ustawień jasności/kontrastu.
    3. Ponownie zarysuj i zachowaj trzy lub więcej transformantów z pojedynczą kopią do późniejszego badania.
  7. Eksportuj obrazy do prezentacji.
    1. Przejdź do Obraz > Duplikuj, aby utworzyć kopię interesującego Cię obrazu i nadać mu wybraną nazwę.
    2. Przejdź do Image > Type > 8-bit, aby przekonwertować zduplikowaną kopię z 16-bitowej na 8-bitową i zapisać ją zgodnie z potrzebami.
      UWAGA: Należy pamiętać, że po zastosowaniu, jeśli ustawienia >jasności/kontrastu nie zostały wcześniej zapisane, nie ma łatwego sposobu na odzyskanie tych informacji, a tym samym nie ma łatwego sposobu na ponowne zastosowanie tego samego ustawienia w kolejnych wizualizacjach obrazów. Jest to również powód, dla którego zalecana jest poprzednia operacja duplikacji.
    3. Aby podzielić stos z na kolekcję pojedynczych obrazów, przejdź do Stosy obrazów > > Stosuj do obrazów i zapisz zgodnie z potrzebami.
      UWAGA: Obrazy można również przycinać do mniejszego obszaru na Fidżi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Morfologia i dynamika organelli ulegają zmianom w odpowiedzi komórek drożdży na sygnały zewnętrzne i wewnętrzne. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne obrazy organelli drożdży w środkowej fazie logarytmicznej (Rycina 3A,B). Jak wspomniano wcześniej, kilka organelli posiada charakterystyczne cechy morfologiczne, dzięki czemu są one łatwe do rozpoznania bez konieczności szerokiego porównywania z innymi markerami organelli. Dotyczy to ER, mitochondriów i wakuoli. Należy zauważyć,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół zapewnia prosty początek dla osób rozpoczynających naukę z innych dziedzin badawczych w celu zbadania organelli drożdży. Zanim przejdziemy do konkretnych tematów, chcielibyśmy jeszcze raz podkreślić, że należy powstrzymać się od nadmiernego korzystania z funkcji automatycznych w oprogramowaniu do obrazowania. Obrazy mikroskopowe to nie tylko ładne obrazki, to dane naukowe, dlatego ich pozyskiwanie i interpretacja powinny być odpowiednio traktowane. Szczególnie ważne jest, aby sumiennie dobierać par...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Xie za hojną pomoc w przygotowaniu manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant 91957104), Miejską Komisję Edukacji w Szanghaju (grant 2017-01-07-00-02-E00035) oraz Miejską Komisję Nauki i Technologii w Szanghaju (grant 22ZR1433800).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdenineSangon BiotechA600013
CasaminoacidSangon Biotech A603060
Concanavalin A z canavalia ensiformis (fasola jacka)Sigma AldrichL7647
D-GlucoseSangon BiotechA501991
Fidżihttps://fiji.sc/
szalka Petriegoze szklanym dnemNEST706001Φ 35 mm
ImajeJhttps://imagej.net/
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX83 wyposażony w obiektyw zanurzeniowy UPLXAPO 100X, źródło światła Lumencor Spectra X i kamerę Hamamatsu Orca Flash4.0 LT.
L-histydynaSangon BiotechA604351
L-leucynaSangon BiotechA100811
L-lizynaSangon BiotechA602759
L-metioninaSangon BiotechA100801
L-tryptofanSangon BiotechA601911
Szkło osłonowemikroskopu CITOTEST10222222C22 mm x 22 mm, 0,16 cala kreski; Szkiełka mikroskopowe 0,19 mm
CITOTEST1A510125 mm x 75 mm, 1– 1,2 mm
PeptonSangon BiotechA505247
UracilSangon BiotechA610564
VisiviewVisitron System GmbHhttps://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Ekstrakt drożdżowySangon BiotechA100850
Drożdże na bazie azotu bez aminokwasówSangon BiotechA610507
YNB bez aminokwasów i siarczanu amonuSangon Biotech A600505

Bibliografia

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Autophagy wins the 2016 Nobel prize in physiology or medicine: Breakthroughs in baker's yeast fuel advances in biomedical research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 201-205 (2017).
  2. Spang, A. Anniversary of the discovery of sec mutants by Novick and Schekman. Molecular Biology of the Cell. 26 (10), 1783-1785 (2015).
  3. Walter, T., Erdmann, R. Current advances in protein import into peroxisomes. The Protein Journal. 38 (3), 351-362 (2019).
  4. Farre, J. C., Subramani, S. Mechanistic insights into selective autophagy pathways: lessons from yeast. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (9), 537-552 (2016).
  5. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Zhu, J., et al. A validated set of fluorescent-protein-based markers for major organelles in yeast (Saccharomyces cerevisiae). mBio. 10 (5), 19(2019).
  8. Li, D., et al. A fluorescent tool set for yeast Atg proteins. Autophagy. 11 (6), 954-960 (2015).
  9. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods in Molecular Biology. 313, Clifton, N.J. 107-120 (2006).
  10. Caloca, B., et al. Comparison of concanavalin A and poly-l-lysine as cell adhesives for routine yeast microscopy applications. Yeast. , (2021).
  11. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Banfield, D. K., Lewis, M. J., Pelham, H. R. B. A SNARE-like protein required for traffic through the Golgi complex. Nature (London). 375 (6534), 806-809 (1995).
  14. Curran, B. P., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1163, Clifton, N.J. 1-14 (2014).
  15. Zhao, W., et al. Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. , (2021).
  16. He, C. W., et al. Membrane recruitment of Atg8 by Hfl1 facilitates turnover of vacuolar membrane proteins in yeast cells approaching stationary phase. BMC Biology. 19 (1), 117(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Saccharomyces cerevisiaedynamika organellimikroskopia ywych kom rektransformacja dro d ylokalizacja wewn trzkom rkowaobrazowanie poklatkoweledzenie organellimikroskopia fluorescencyjna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły