Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zwiększona odtwarzalność i precyzja wysokoprzepustowej kwantyfikacji danych dotyczących wzrostu bakterii przy użyciu czytnika mikropłytek

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63849

⸱

27 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, 2Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, 3Food Science and Technology, Dalhousie University, 4Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentowany jest protokół o wysokiej przepustowości do pomiaru danych o wzroście, w tym krzywych wzrostu, szybkości wzrostu i maksymalnej stopy wzrostu. Protokół został zweryfikowany i zwalidowany przy użyciu dwóch bakterii wytwarzających biofilm. Wyniki i podejście zastosowane w tym badaniu można rozszerzyć na inne protokoły o wysokiej przepustowości wykorzystujące czytniki mikropłytek.

Streszczenie

To badanie miało na celu opracowanie powtarzalnego, niezawodnego, wysokoprzepustowego protokołu do monitorowania wzrostu bakterii na 96-dołkowych płytkach i analizy maksymalnego tempa wzrostu. Wyznaczono krzywe wzrostu i maksymalne tempo wzrostu dwóch gatunków bakterii. Zbadano takie kwestie, jak (i) kondensacja pokrywy, (ii) korekta długości ścieżki, (iii) wielkość inokulacji, (iv) odstęp czasu pobierania próbek oraz (v) odchylenie przestrzenne. Powtarzalność protokołu oceniono za pomocą trzech niezależnych replikacji technicznych, z odchyleniem standardowym wynoszącym 0,03 między seriami. Maksymalne tempo wzrostu Bacillus mycoides i Paenibacillus tundrae określono odpowiednio (średnia ± SD) 0,99 h−1 ± 0,03 h−1 i 0,85 h−1 ± 0,025 h−1. Bakterie te są trudniejsze do optycznego monitorowania ze względu na ich powinowactwo do zlepiania się. Badanie to pokazuje krytyczne znaczenie wielkości inokulacji, korekcji długości ścieżki, ogrzewania pokrywy, odstępów czasu pobierania próbek i odchylenia przestrzennego płytki studziennej w celu uzyskania wiarygodnych, dokładnych i odtwarzalnych danych na czytnikach mikropłytek. Opracowany protokół i jego etapy weryfikacji można rozszerzyć na inne metody wykorzystujące czytniki mikropłytek i protokoły o wysokiej przepustowości, zmniejszając wrodzone błędy badaczy i koszty materiałów.

Wprowadzenie

Rozwijanie zainteresowania manipulacją multiomiczną, w tym badaniami mechanizmów i metabolizmu bakterii, podkreśla znaczenie wysokoprzepustowych i zautomatyzowanych metod, takich jak rejestrowanie danych o wzroście1,2. Dane dotyczące wzrostu obejmujące parametry kinetyczne, takie jak maksymalne tempo wzrostu, mogą pomóc w scharakteryzowaniu reakcji bakterii na różne warunki fizyczne, chemiczne i przeciwbakteryjne. Dane dotyczące szybkości wzrostu są standardową zmienną odpowiedzi wykorzystywaną do odkrywania potencjalnych powiązań genotyp-fenotypy1 lub wskazują bezpieczeństwo mikrobiologiczne i okres przydatności do spożycia produktów spożywczych3,4. Techniki takie jak adaptacyjna ewolucja laboratoryjna5,6,7, badania przesiewowe całego genomu, niektóre testy chemiczne8 i różne przesiewowe badania genetyczne9 opierają się na wskaźnikach wzrostu w celu oceny wyników.

Pomiary gęstości optycznej (OD) kultur bakteryjnych są standardową mikrobiologiczną metodą monitorowania wzrostu bakterii. Pomiary OD są często rejestrowane na długości fali 600 nm, opierając się na rozpraszaniu światła i gęstości komórek10,11. Prawo Beera-Lamberta wyjaśnia zależność wartości OD od stężenia (tj. gęstości komórek, liczby komórek), długości ścieżki i współczynnika absorpcji. Geometria i układ optyczny spektrofotometru wpływają na odczyty OD11. Klasyczne metody pomiarów średnicy zewnętrznej mogą być bardzo czasochłonne i pracochłonne, a dane mogą zawierać różne błędy ludzkie. W tym protokole czytnik mikropłytek jest używany do zmniejszenia czasu analityka12,13 i ryzyka skażenia biologicznego. Wysokoprzepustowa analiza przy użyciu czytników mikropłytek jest szeroko stosowana w różnych obszarach mikrobiologii, takich jak badania przesiewowe bakterii wytwarzających biofilm14,15, hamowanie wzrostu bakterii16, wzrost komórek drożdży17, oznaczanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze18 oraz badanie przesiewowe toksyczności nanomateriałów19.

Kilku badaczy opublikowało protokoły tempa wzrostu bakterii za pomocą czytnika mikropłytek12,20,21. Jednak dokładny protokół, który bada wiarygodność zebranych danych, nie został w pełni ustalony. Poinformowano, że czynniki takie jak typ gatunku22,23,24 i taśmy uszczelniające wpływają na powtarzalność ze względu na nieodpowiedni transfer tlenu w 96-dołkowej płytce25,26. Delaney i wsp. donieśli o dużych skupiskach Methylorubrum extorquens (szczep typu dzikiego) w pożywce wzrostowej podczas korzystania z czytnika mikropłytek, co spowodowało bardzo głośne dane o wzroście24. Problem został rozwiązany przez usunięcie genów związanych z produkcją biofilmu24. Ze względu na wydzielanie zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych bakterie wytwarzające biofilm mają większe powinowactwo do łączenia się i tworzenia klastrów komórkowych. W związku z tym trudniej jest monitorować ich wzrost za pomocą technik rozpraszania światła (np. spektrofotometrów i czytników mikropłytek).

Ten protokół ma na celu ustanowienie kroków do uzyskania powtarzalnych danych w sposób wysokoprzepustowy za pomocą czytnika mikropłytek. Wykorzystano Bacillus mycoides i Paenibacillus tundrae ze względu na ich szybki wzrost i zdolność do wytwarzania biofilmu, które tradycyjnie stanowią wyzwanie w przypadku metod ręcznych i automatycznych. Zbadano takie czynniki, jak (i) korekta długości ścieżki, (ii) kondensacja na pokrywie, (iii) rozmiar inokulum, (iv) przedział czasowy próbkowania oraz (v) odchylenie przestrzenne w celu oceny wiarygodności i odtwarzalności danych. W protokole tym przedstawiono kroki dokładnego monitorowania wzrostu bakterii i pomiaru określonych wskaźników wzrostu za pomocą czytnika mikropłytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie etapy niniejszego protokołu muszą być wykonywane w warunkach sterylnych (np. w obszarze między dwoma płomieniami lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza). Wszystkie materiały i narzędzia należy autoklawować przez 20 min. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Dłonie w rękawiczkach należy zdezynfekować i utrzymać w stanie wilgotnym przy użyciu środka do dezynfekcji rąk lub 70% roztworu alkoholu przez co najmniej 1 min, a następnie nie wyjmować ich z komory bezpieczeństwa. W przeciwnym razie procedurę dezynfekcji należy powtórzyć przed ponownym wprowadzeniem dłoni do komory bezpieczeństwa. OSTREŻENIE: Przed użyciem otwartego płomienia należy upewnić się, że środek dezynfekujący całkowicie odparował.

UWAGA: Dwie bakterie wyizolowano z biofiltracji wody pitnej, zgodnie z wcześniej opisaną metodą27, ze względu na ich zdolność do tworzenia biofilmu. Zostały one zidentyfikowane poprzez pełne sekwencjonowanie 16S rRNA i zgłoszone do NCBI jako Bacillus mycoides (SAMN10518261) oraz Paenibacillus tundrae (SAMN10452279).

1. Przygotowanie banku bakterii w glicerolu

  1. Odważ 3 g proszku Tryptic soy broth (TSB) i rozpuść go w 100 mL wody destylowanej. Autoklawuj bulion przez 20 min i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Odmierz 50 mL TSB do kolby o pojemności 50 mL.
  2. Przenieś bakterie na płytki agarowe27,28. Za pomocą pętli pobierz kolonię bakterii z płytki agarowej. Przenieś zawartość pętli do kolby, delikatnie nią mieszając. Inkubuj kolbę przez noc w temperaturze 30 °C ± 1 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 150 rpm.
    UWAGA: Temperaturę i prędkość wytrząsania należy dostosować do rodzaju szczepu.
  3. Przygotuj kolejną kolbę 50 mL zawierającą 47,5 mL TSB. Przenieś 2,5 mL kultury nocnej do kolby. Inkubuj przez 5-6 h do uzyskania OD600 = 0,6 ± 0,05 (aby osiągnąć średnią fazę wykładniczą).
  4. Przenieś kulturę do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 50 mL. Wirować kulturę przy 2 200 × g przez 10 min. Ostrożnie odlej bulion, aby uniknąć utraty komórek zebranych na dnie probówki.
  5. Dodaj 5 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do tej samej probówki i wirować przy 2 200 × g przez 10 min. Powtórz ten krok 3 razy.
  6. Dostosuj OD600 komórek do wartości 0,6 ± 0,05, używając pipety do miareczkowania odpowiedniej ilości roztworu PBS. Dokładnie zapisz dodaną ilość PBS do późniejszego wykorzystania.
  7. Dodaj glicerol do zawiesiny, aż osiągnie stężenie 20% v/v. Zakręć probówkę i mieszaj w wortexie przez 15 s.
  8. Przenieś 1,5 mL zawiesiny do krioprobówek o pojemności 2 mL. Umieść krioprobówki w odpowiednim pudełku i przechowuj w zamrażarce w temperaturze −80 °C.

2. Przygotowanie kultury nocnej.

  1. Pozostawić krio probówki z zapasem bakterii do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez 30 min lub do momentu upłynnienia zawartości.
    UWAGA: Zaleca się, aby nie przyspieszać procesu rozmrażania.
  2. Przygotować sterylną probówkę zawierającą 10 mL TSB. Przenieść 50 µL zawiesiny zapasowej do probówki. Inkubować probówkę przez noc (16-18 h) w temperaturze 30 °C ± 1 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 150 rpm.

3. Przygotowanie inokulum.

  1. Przygotować probówkę z 10 mL sterylnego TSB. Przenieść 500 µL kultury nocnej do probówki. Inkubować przez 6-8 h do osiągnięcia OD600 = 0,6 ± 0,05 (lub do osiągnięcia środkowej fazy wykładniczej).
  2. Przenieść kulturę do 15 mL probówki wirówkowej. Wirować z prędkością 2 200 × g przez 10 min. Ostrożnie odlać bulion.
  3. Dodać 5 mL PBS i wirować z prędkością 2 200 × g przez 10 min. Powtórzyć ten krok 3 razy.
  4. Dostosować OD600 komórek do poziomu 0,6 ± 0,05 poprzez miareczkowanie roztworem PBS za pomocą pipety. Dokładnie zapisać dodaną ilość PBS do późniejszego wykorzystania.

4. Przenoszenie pożywki do czytnika mikropłytek

  1. Wybierz przezroczystą, sterylną płytkę wielodołkową z płaskim dnem i pokrywką (np. płytkę 96-dołkową, 6-dołkową lub 12-dołkową).
  2. Przed rozpoczęciem protokołu zmierz korekcję długości drogi optycznej dla mikropłytki, używając wody DI, zgodnie z opisem w kroku 1.10.
  3. Na podstawie wybranej płytki przygotuj tabelę referencyjną, aby określić położenie próbek przed ich naniesieniem. Na przykład w przypadku płytki 96-dołkowej narysuj tabelę 8 x 12.
    UWAGA: Tabela referencyjna pozwala uniknąć pomyłek podczas etapów inkubacji i zbierania wyników.
  4. Umieść w komorze z laminarnym przepływem powietrza następujące elementy: mikropłytkę z pokrywką, pipety 1 000 µL i 200 µL, końcówki do pipet 1 000 µL i 200 µL, kilka probówek kriogenicznych, zlewkę 25 mL, pożywkę wzrostową oraz inokulum.
    UWAGA: Wymienione elementy należy przenieść do komory aseptycznie.
  5. Do zlewki dodaj 10 mL pożywki wzrostowej. Przenieś obliczoną ilość inokulum do zlewki z pożywką wzrostową.
    UWAGA: Stosunki inokulum w tym protokole wynoszą 1% i 5%. Na przykład, aby uzyskać stosunek inokulum 5% i 1%, należy dodać odpowiednio 500 µL i 100 µL inokulum do 9,5 mL i 9,9 mL pożywki wzrostowej.
  6. Po dodaniu inokulum delikatnie potrząśnij zlewką, aby uzyskać jednorodne rozmieszczenie. Rozdaj 200 µL zaszczepionej pożywki do wyznaczonych dołków, korzystając z tabeli referencyjnej. Wybierz co najmniej trzy dołki jako kontrole, dodając do nich 200 µL samej pożywki wzrostowej (bez inokulum).
    UWAGA: Upewnij się, że dołki kontrolne są wyraźnie zaznaczone w tabeli referencyjnej. Jeśli w tych dołkach zaobserwowany zostanie jakikolwiek wzrost (kontaminacja), eksperyment należy powtórzyć.
  7. Do dołków brzegowych, w których tempo parowania jest wyższe, wlej 200 µL wody DI. Przed wyjęciem płytki 96-dołkowej z komory ostrożnie załóż pokrywkę. Ostrożnie umieść płytkę 96-dołkową w czytniku płytek, unikając gwałtownych ruchów.

5. Ustawienia czytnika mikropłytek

  1. Włącz czytnik mikropłytek, a następnie za pomocą wbudowanego oprogramowania utwórz spersonalizowany protokół. W Menedżerze zadań (Task Manager) otwórz protokół (protocol) i wybierz Utwórz nowy | Standardowy protokół (Create New | Standard Protocol). Otwórz Procedurę (Procedure) i dostosuj ustawienia w następujący sposób:
    1. Ustaw temperaturę na 30 °C (lub wartości docelowe) za pomocą opcji Ustaw temperaturę (Set Temperature).
    2. Kliknij Inkubator włączony (Incubator On), a następnie ustaw Gradient (Gradient) na 1 °C.
      UWAGA: Aby uniknąć nierzetelnych danych spowodowanych kondensacją pary wodnej na pokrywie, upewnij się, że Gradient (Gradient) jest ustawiony na 1 °C.
    3. Wybierz opcję Podgrzewanie wstępne (Preheat), aby zapewnić równomierny rozkład ciepła w całej płytce z dołkami.
    4. Otwórz Start kinetyki (Start Kinetic) i wybierz pożądany czas inkubacji za pomocą Czasu trwania (Run time) (np. 12:00:00 lub 24:00:00 itd.) oraz Odstęp (Interval) między odczytami na 00:30:00 (oznacza 30 min) lub 01:00:00 (oznacza 1 h).
      UWAGA: Odczyt każdej płytki 96-dołkowej trwa około 1 min.
    5. Skonfiguruj ustawienia Wstrząsania (Shaking) w następujący sposób: otwórz Wstrząsaj (Shake); ustaw Tryb wstrząsania (Shake Mode) na Liniowy (Linear); kliknij Wstrząsanie ciągłe (Continuous Shake); i dostosuj Częstotliwość (Frequency) do 567 cpm (lub dowolnej innej pożądanej wartości).
    6. Skonfiguruj ustawienia odczytu OD w następujący sposób: kliknij Odczytaj | Absorbancja (Read | Absorbance); wybierz Punkt końcowy/Kinetyka (Endpoint/Kinetic) oraz Monochromatory (Monochromators); ustaw Długość fali (Wavelength) na 600 nm; i kliknij Zatwierdź | Zapisz (Validate | Save), aby zapisać ustawienia jako nowy protokół z odpowiednią nazwą i datą.

6. Rejestrowanie danych dotyczących wzrostu

  1. Otwórz Menedżer zadań | Czytaj teraz.
  2. Wybierz zapisany protokół, a następnie kliknij OK, aby rozpocząć protokół.
  3. Zapisz odczyty do analizy danych.

7. Analiza danych

  1. Przenieś wyniki OD600 (dane o wzroście) do formatu arkusza kalkulacyjnego. W sekcji results kliknij opcję image dla każdego dołka, aby obejrzeć końcowe krzywe wzrostu.
  2. Otwórz plik arkusza i uporządkuj zapisane dane zgodnie z tabelą referencyjną. Od pozostałych odczytów odejmij średnią wartość odczytów tła.
    UWAGA: Tło to odczyty OD w czasie zero. W tym protokole do obliczeń przyjmuje się wartości OD600. Jeśli dostępna jest krzywa kalibracyjna OD600 w stosunku do liczby komórek, można zastosować gęstość komórek.

8. Wyznaczanie szybkości wzrostu

  1. Wykorzystaj przeniesione dane w arkuszu kalkulacyjnym utworzonym w kroku 1.6. Aby ocenić szybkość wzrostu, zastosuj opisaną poniżej metodę oraz równanie (1).
    wzór na szybkość wzrostu bakterii, obliczanie μ, równanie zmian gęstości optycznej w czasie (1)
    gdzie µ to szybkość wzrostu, ODi to OD600 w każdym punkcie czasowym, ODi-1 to początkowa wartość OD600 w poprzednim punkcie czasowym, a ti oraz ti-1 to różnice czasu między dwoma wspomnianymi punktami (np. 0,5 dla odstępów czasowych 30 min, 1 dla odstępów czasowych 1 h).
  2. Oblicz średnią i odchylenie standardowe z pięciu kolejnych szybkości wzrostu za pomocą wybranego oprogramowania do analizy danych. Należy pamiętać, że największa średnia z najniższym odchyleniem standardowym stanowi maksymalną szybkość wzrostu (μm) 12.

9. Określanie stronniczości przestrzennej

​UWAGA: Czytniki mikropłytek oraz same płytki wprowadzają błędy systematyczne do wyników. Aby zapewnić wiarygodność i powtarzalność wyników, kluczowe jest ocenienie błędów przestrzennych płytek stosowanych w konkretnym czytniku mikropłytek. W tym celu należy wykonać następujące kroki:

  1. Powtórzyć kroki 1.2-1.6.
  2. Zarejestrować dane i przeanalizować je zgodnie z krokiem 1.7 i krokiem 1.8, aby obliczyć tempo wzrostu dla każdej studzienki.
  3. Utworzyć mapę ciepła (heatmap), aby zwizualizować zmiany tempa wzrostu na płytce 96-dołkowej.
  4. Przeprowadzić analizę statystyczną (patrz: Tabele uzupełniające), upewniając się, że pomiędzy studzienkami nie występują istotne różnice.
    UWAGA: Niezbędne jest użycie tego samego szczepu bakterii oraz tej samej wielkości inokulum we wszystkich studzienkach.

10. Walidacja odczytu OD i współczynnik korekcji długości drogi optycznej

UWAGA: Wyznaczenie współczynnika korekcji długości drogi optycznej jest kluczowe dla walidacji danych oraz zapewnienia ich rzetelności i poprawności na różnych urządzeniach.

  1. Należy przeprowadzić kroki 1.2 i 1.3, aby przygotować nocną kulturę startową B. mycoides.
  2. Przygotować trzy wysterylizowane kolby o pojemności 50 mL i do każdej z nich wlać 49,5 mL świeżej pożywki TSB. W komorze bezpieczeństwa biologicznego aseptycznie dodać 500 µL kultury startowej do każdej kolby. Do wysterylizowanej kolby wlać 50 mL niezaszczepionej pożywki TSB, która będzie służyć jako kontrola.
  3. Inkubować kolby w temperaturze 30 °C przy 150 rpm. Co 30 min aseptycznie pobierać próbki z każdej kolby, a następnie odczytać i zapisać wartość OD600 za pomocą spektrofotometru.
  4. Do zlewki o pojemności 25 mL wlać 9,9 mL pożywki TSB. Dodać 100 µL kultury startowej do zlewki i delikatnie wymieszać.
  5. Przenieść 200 µL mieszaniny ze zlewki do sześciu dołków w wybranej kolumnie płytki 96-dołkowej. Do trzech dołków dodać 200 µL niezaszczepionej pożywki TSB jako kontrolę. Dołki brzegowe wypełnić 200 µL wody DI.
  6. Nałożyć pokrywkę i ostrożnie przenieść płytkę 96-dołkową do czytnika mikropłytek. Postępować zgodnie z krokami 1.5 i 1.6, aby zarejestrować dane dotyczące wzrostu.
  7. Wykreślić zależność OD600 z czytnika mikropłytek względem OD600 ze spektrofotometru. Należy zauważyć, że nachylenie prostej stanowi różnicę między dwoma zestawami odczytów, nazywaną współczynnikiem korekcji długości drogi optycznej.
    UWAGA: Inkubacja w inkubatorze oraz w czytniku mikropłytek powinna odbywać się równocześnie tego samego dnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja odczytu OD i współczynnik korekcji długości drogi optycznej
Podziel próbki na B. mycoides próbki hodowli pobierano w różnych punktach czasowych i mierzono przy użyciu czytnika mikropłytek oraz spektrofotometru (Rycina 1A). Krok ten podjęto w celu walidacji wyników na różnych urządzeniach. OD600 dane skorelowane, lecz niezgodne (Rysunek 1B). Korelacja była liniowa z nachyleniem wynoszącym 0,55 (95% przedział ufno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Czytniki mikropłytek pozwalają na uzyskanie stałych i powtarzalnych temp wzrostu. Technologia ta minimalizuje błędy ludzkie i umożliwia próbkowanie o wysokiej przepustowości. Niewielka ilość kultury wymagana na próbkę sprawia, że podejście to jest atrakcyjną i tanią alternatywą dla liczenia komórek przy użyciu kolb lub probówek. Czytniki mikropłytek pozwalają na dużą wielkość próby, zwiększając moc statystyczną, a następnie ułatwiając wiarygodne obliczenia szybkości wzrostu przy jednoczesnym utrzymaniu kosztów i pracy na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Radę Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) / Halifax Water Industrial Research Chair in Water Quality and Treatment (Grant No. IRCPJ 349838-16). Zespół autorów pragnie również podziękować za pomoc Anity Taylor w zrecenzowaniu tego artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wirówka Eppendorf5810 R
Probówki wirówkowe - 15 mL ThermoFisher- Naukowy 339650Sterylne
probówki wirówkowe - 50 mL ThermoFisher- Naukowy 339652Sterylna
jednorazowa pętla zaszczepiająca, 10 i mikro; LCole-Parmer UZ-06231-08Sterylne
kolby Erlenmeyera - 250 mL Cole-Parmer   UZ-34502-59Szkło 
Izopropanol ThermoFisher- Naukowy 396982500≥ 99.0
Bufor fosforanowy Solanka Sigma-AldrichP4417
Końcówki do pipet 1 000 &mikro; LThermoFisher- Naukowy   UZ-25001-76
Końcówki do pipet 10 ml ThermoFisher- Naukowy UZ-25001-83
Końcówki do pipet 200 i mikro; LThermoFisher- Naukowy UZ-25001-85
Końcówki do pipet 5 ml ThermoFisher- Naukowy   UZ-25001-80
Piper 1,000 &mikro; LCole-Parmer UZ-07909-11
Piper 10 mlCole-Parmer UZ-07909-15
Piper 200 & mikro; LCole-Parmer   UZ-07909-09
Piper 5 ml Cole-Parmer UZ-07859-30
Rosół sojowy tryptyczny Millipore22091Nadaje się do mikrobiologii

Bibliografia

  1. Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
  2. Sparkes, A., et al. Towards Robot Scientists for autonomous scientific discovery. Automated Experimentation. 2 (1), (2010).
  3. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).
  4. Pla, M., Oltra, S., Esteban, M., Andreu, S., Palop, A. Comparison of primary models to predict microbial growth by the plate count and absorbance methods. BioMed Research International. 2015 (6), 1-14 (2015).
  5. Choe, D., et al. Adaptive laboratory evolution of a genome-reduced Escherichia coli. Nature Communications. 10 (1), 935(2019).
  6. Dykhuizen, D. E., Dean, A. M. Enzyme activity and fitness: Evolution in solution. Trends in Ecology and Evolution. 5 (8), 257-262 (1990).
  7. McDonald, M. J. Microbial experimental evolution - A proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Reports. 20 (8), 1-14 (2019).
  8. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116 (1), 121-137 (2004).
  9. Cagnon, C., et al. Development of a forward genetic screen to isolate oil mutants in the green microalga Chlamydomonas reinhardtii. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 178(2013).
  10. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828(2016).
  11. Matlock, B. C., Beringer, R. W., Ash, D. L., Page, A. F., Allen, M. W. Differences in Bacterial Optical Density Measurements between Spectrophotometers. Technical Note. ThermoScientific. , at http://www.thermoscientific.de/eThermo/CMA/PDFs/Product/productPDF_58468.pdf (2011).
  12. Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Molecular Biology and Evolution. 31 (1), 232-238 (2014).
  13. Rolfe, M. D., et al. Lag phase is a distinct growth phase that prepares bacteria for exponential growth and involves transient metal accumulation. Journal of Bacteriology. 194 (3), 686-701 (2012).
  14. Djordjevic, D., Wiedmann, M., Mclandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology. 68 (6), 2950-2958 (2002).
  15. O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437(2011).
  16. Campbell, J. High-throughput assessment of bacterial growth inhibition by optical density measurements. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (3), 1-20 (2012).
  17. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: A bench protocol for testing genotoxic agents. Nature Protocols. 1 (4), 1922-1928 (2006).
  18. Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. -M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).
  19. Qiu, T. A., et al. Growth-based bacterial viability assay for interference-free and high-throughput toxicity screening of nanomaterials. Analytical Chemistry. 89 (3), 2057-2064 (2017).
  20. Kurokawa, M., Precise Ying, B. -W. Precise, high-throughput analysis of bacterial growth. Journal of Visualized Experiments. (127), e56197(2017).
  21. Bredit, F., Romick, T. L., Fleming, H. P. A rapid method for determination of bacterial growth kinetics. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology. 3, 59-68 (1994).
  22. Delaney, N. F., et al. Development of an optimized medium, strain and high-throughput culturing methods for Methylobacterium extorquens. PLOS ONE. 8 (4), 62957(2013).
  23. Haire, T. C., et al. Robust microplate-based methods for culturing and in vivo phenotypic screening of Chlamydomonas reinhardtii. Frontiers in Plant Science. 9, 235(2018).
  24. McBirney, S. E., Trinh, K., Wong-Beringer, A., Armani, A. M. Wavelength-normalized spectroscopic analysis of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa growth rates. Biomedical Optics Express. 7 (10), 4034(2016).
  25. Sieben, M., Giese, H., Grosch, J. H., Kauffmann, K., Büchs, J. Permeability of currently available microtiter plate sealing tapes fail to fulfil the requirements for aerobic microbial cultivation. Biotechnology Journal. 11 (12), 1525-1538 (2016).
  26. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid evaluation of oxygen and water permeation through microplate sealing tapes. Biotechnology Progress. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  27. Abkar, L., Gagnon, G. A. Biological responses to P-limitation in indigenous bacteria isolated from drinking water. AWWA Water Science. 3 (5), 1248(2021).
  28. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  29. Hart, S. F. M., Skelding, D., Waite, A. J., Burton, J. C., Shou, W. High-throughput quantification of microbial birth and death dynamics using fluorescence microscopy. Quantitative Biology. 7 (1), 69-81 (2019).
  30. Periago, P. M., Abee, T., Wouters, J. A. Analysis of the heat-adaptive response of psychrotrophic Bacillus weihenstephanensis. International Journal of Food Microbiology. 79 (1-2), 17-26 (2002).
  31. Mira, P., Barlow, M., Meza, J. C., Hall, B. G. Statistical package for growth rates made easy. Molecular Biology and Evolution. 34 (12), 3303-3309 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza tempa wzrostup ytki 96 do kowekorekcja d ugo ci drogi optycznejwielko inokuluminterwa pr bkowaniab d przestrzennypowt rzenia techniczne
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.