Zwiększona odtwarzalność i precyzja wysokoprzepustowej kwantyfikacji danych dotyczących wzrostu bakterii przy użyciu czytnika mikropłytek

Leili Abkar; Florentin M. Wilfart; Marta Piercey; Graham A. Gagnon

doi:10.3791/63849

Method Article

Zwiększona odtwarzalność i precyzja wysokoprzepustowej kwantyfikacji danych dotyczących wzrostu bakterii przy użyciu czytnika mikropłytek

DOI:

10.3791/63849

⸱

July 27th, 2022

Leili Abkar¹ , Florentin M. Wilfart² , Marta Piercey³ , Graham A. Gagnon⁴

¹Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, ²Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, ³Food Science and Technology, Dalhousie University, ⁴Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentowany jest protokół o wysokiej przepustowości do pomiaru danych o wzroście, w tym krzywych wzrostu, szybkości wzrostu i maksymalnej stopy wzrostu. Protokół został zweryfikowany i zwalidowany przy użyciu dwóch bakterii wytwarzających biofilm. Wyniki i podejście zastosowane w tym badaniu można rozszerzyć na inne protokoły o wysokiej przepustowości wykorzystujące czytniki mikropłytek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie miało na celu opracowanie powtarzalnego, niezawodnego, wysokoprzepustowego protokołu do monitorowania wzrostu bakterii na 96-dołkowych płytkach i analizy maksymalnego tempa wzrostu. Wyznaczono krzywe wzrostu i maksymalne tempo wzrostu dwóch gatunków bakterii. Zbadano takie kwestie, jak (i) kondensacja pokrywy, (ii) korekta długości ścieżki, (iii) wielkość inokulacji, (iv) odstęp czasu pobierania próbek oraz (v) odchylenie przestrzenne. Powtarzalność protokołu oceniono za pomocą trzech niezależnych replikacji technicznych, z odchyleniem standardowym wynoszącym 0,03 między seriami. Maksymalne tempo wzrostu Bacillus mycoides i Paenibacillus tundrae określono odpowiednio (średnia ± SD) 0,99 h⁻¹ ± 0,03 h⁻¹ i 0,85 h⁻¹ ± 0,025 h⁻¹. Bakterie te są trudniejsze do optycznego monitorowania ze względu na ich powinowactwo do zlepiania się. Badanie to pokazuje krytyczne znaczenie wielkości inokulacji, korekcji długości ścieżki, ogrzewania pokrywy, odstępów czasu pobierania próbek i odchylenia przestrzennego płytki studziennej w celu uzyskania wiarygodnych, dokładnych i odtwarzalnych danych na czytnikach mikropłytek. Opracowany protokół i jego etapy weryfikacji można rozszerzyć na inne metody wykorzystujące czytniki mikropłytek i protokoły o wysokiej przepustowości, zmniejszając wrodzone błędy badaczy i koszty materiałów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwijanie zainteresowania manipulacją multiomiczną, w tym badaniami mechanizmów i metabolizmu bakterii, podkreśla znaczenie wysokoprzepustowych i zautomatyzowanych metod, takich jak rejestrowanie danych o wzroście¹^,². Dane dotyczące wzrostu obejmujące parametry kinetyczne, takie jak maksymalne tempo wzrostu, mogą pomóc w scharakteryzowaniu reakcji bakterii na różne warunki fizyczne, chemiczne i przeciwbakteryjne. Dane dotyczące szybkości wzrostu są standardową zmienną odpowiedzi wykorzystywaną do odkrywania potencjalnych powiązań genotyp-fenotypy¹ lub wskazują bez....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie kroki w tym protokole muszą być wykonywane w sterylnych warunkach (np. między dwoma płomieniami lub komorą bezpieczeństwa biologicznego). Wszystkie materiały i narzędzia są sterylizowane w autoklawie przez 20 minut. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole. Ręce w rękawiczkach są dezynfekowane, utrzymywane w stanie zwilżonym środkiem do dezynfekcji rąk lub 70% roztworem alkoholu przez co najmniej 1 minutę, a następnie nie wyjmowane z szafy bezpieczeństwa. W przeciwnym razie procedurę dezynfekcji należy powtórzyć przed ponownym ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

współczynnik walidacji odczytu OD i korekcji długości ścieżki
Rozszczepione próbki kultury B. mycoides pobrano w różnych punktach czasowych i zmierzono za pomocą czytnika mikropłytek i spektrofotometru (Rysunek 1A). Ten krok został wykonany w celu zweryfikowania wyników na różnych urządzeniach. Dane OD₆₀₀ były skorelowane, ale nie pasowały (Rysunek 1B). Korelacja była liniowa z nachyleniem 0,55 (95% przedział ufności [CI]: 0,53-0,58, R^2.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czytniki mikropłytek pozwalają na uzyskanie stałych i powtarzalnych temp wzrostu. Technologia ta minimalizuje błędy ludzkie i umożliwia próbkowanie o wysokiej przepustowości. Niewielka ilość kultury wymagana na próbkę sprawia, że podejście to jest atrakcyjną i tanią alternatywą dla liczenia komórek przy użyciu kolb lub probówek. Czytniki mikropłytek pozwalają na dużą wielkość próby, zwiększając moc statystyczną, a następnie ułatwiając wiarygodne obliczenia szybkości wzrostu przy jednoczesnym utrzymaniu kosztów i pracy na.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Radę Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) / Halifax Water Industrial Research Chair in Water Quality and Treatment (Grant No. IRCPJ 349838-16). Zespół autorów pragnie również podziękować za pomoc Anity Taylor w zrecenzowaniu tego artykułu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Wirówka	Eppendorf	5810 R
Probówki wirówkowe - 15 mL	ThermoFisher- Naukowy	339650	Sterylne
probówki wirówkowe - 50 mL	ThermoFisher- Naukowy	339652	Sterylna
jednorazowa pętla zaszczepiająca, 10 i mikro; L	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Sterylne
kolby Erlenmeyera - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Szkło
Izopropanol	ThermoFisher- Naukowy	396982500	≥ 99.0
Bufor fosforanowy Solanka	Sigma-Aldrich	P4417
Końcówki do pipet 1 000 &mikro; L	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-76
Końcówki do pipet 10 ml	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-83
Końcówki do pipet 200 i mikro; L	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-85
Końcówki do pipet 5 ml	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-80
Piper 1,000 &mikro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Piper 10 ml	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Piper 200 & mikro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Piper 5 ml	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Rosół sojowy tryptyczny	Millipore	22091	Nadaje się do mikrobiologii

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
Sparkes, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Zwiększona odtwarzalność i precyzja wysokoprzepustowej kwantyfikacji danych dotyczących wzrostu bakterii przy użyciu czytnika mikropłytek

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles