Zwiększona odtwarzalność i precyzja wysokoprzepustowej kwantyfikacji danych dotyczących wzrostu bakterii przy użyciu czytnika mikropłytek

Summary

Tutaj prezentowany jest protokół o wysokiej przepustowości do pomiaru danych o wzroście, w tym krzywych wzrostu, szybkości wzrostu i maksymalnej stopy wzrostu. Protokół został zweryfikowany i zwalidowany przy użyciu dwóch bakterii wytwarzających biofilm. Wyniki i podejście zastosowane w tym badaniu można rozszerzyć na inne protokoły o wysokiej przepustowości wykorzystujące czytniki mikropłytek.

Abstract

To badanie miało na celu opracowanie powtarzalnego, niezawodnego, wysokoprzepustowego protokołu do monitorowania wzrostu bakterii na 96-dołkowych płytkach i analizy maksymalnego tempa wzrostu. Wyznaczono krzywe wzrostu i maksymalne tempo wzrostu dwóch gatunków bakterii. Zbadano takie kwestie, jak (i) kondensacja pokrywy, (ii) korekta długości ścieżki, (iii) wielkość inokulacji, (iv) odstęp czasu pobierania próbek oraz (v) odchylenie przestrzenne. Powtarzalność protokołu oceniono za pomocą trzech niezależnych replikacji technicznych, z odchyleniem standardowym wynoszącym 0,03 między seriami. Maksymalne tempo wzrostu Bacillus mycoides i Paenibacillus tundrae określono odpowiednio (średnia ± SD) 0,99 h⁻¹ ± 0,03 h⁻¹ i 0,85 h⁻¹ ± 0,025 h⁻¹. Bakterie te są trudniejsze do optycznego monitorowania ze względu na ich powinowactwo do zlepiania się. Badanie to pokazuje krytyczne znaczenie wielkości inokulacji, korekcji długości ścieżki, ogrzewania pokrywy, odstępów czasu pobierania próbek i odchylenia przestrzennego płytki studziennej w celu uzyskania wiarygodnych, dokładnych i odtwarzalnych danych na czytnikach mikropłytek. Opracowany protokół i jego etapy weryfikacji można rozszerzyć na inne metody wykorzystujące czytniki mikropłytek i protokoły o wysokiej przepustowości, zmniejszając wrodzone błędy badaczy i koszty materiałów.

Introduction

Rozwijanie zainteresowania manipulacją multiomiczną, w tym badaniami mechanizmów i metabolizmu bakterii, podkreśla znaczenie wysokoprzepustowych i zautomatyzowanych metod, takich jak rejestrowanie danych o wzroście^1,2. Dane dotyczące wzrostu obejmujące parametry kinetyczne, takie jak maksymalne tempo wzrostu, mogą pomóc w scharakteryzowaniu reakcji bakterii na różne warunki fizyczne, chemiczne i przeciwbakteryjne. Dane dotyczące szybkości wzrostu są standardową zmienną odpowiedzi wykorzystywaną do odkrywania potencjalnych powiązań genotyp-fenotypy¹ lub wskazują bezpieczeństwo mikrobiologiczne i okres przydatności do spożycia produktów spożywczych^3,4. Techniki takie jak adaptacyjna ewolucja laboratoryjna^5,6,7, badania przesiewowe całego genomu, niektóre testy chemiczne⁸ i różne przesiewowe badania genetyczne⁹ opierają się na wskaźnikach wzrostu w celu oceny wyników.

Pomiary gęstości optycznej (OD) kultur bakteryjnych są standardową mikrobiologiczną metodą monitorowania wzrostu bakterii. Pomiary OD są często rejestrowane na długości fali 600 nm, opierając się na rozpraszaniu światła i gęstości komórek^10,11. Prawo Beera-Lamberta wyjaśnia zależność wartości OD od stężenia (tj. gęstości komórek, liczby komórek), długości ścieżki i współczynnika absorpcji. Geometria i układ optyczny spektrofotometru wpływają na odczyty OD¹¹. Klasyczne metody pomiarów średnicy zewnętrznej mogą być bardzo czasochłonne i pracochłonne, a dane mogą zawierać różne błędy ludzkie. W tym protokole czytnik mikropłytek jest używany do zmniejszenia czasu analityka^12,13 i ryzyka skażenia biologicznego. Wysokoprzepustowa analiza przy użyciu czytników mikropłytek jest szeroko stosowana w różnych obszarach mikrobiologii, takich jak badania przesiewowe bakterii wytwarzających biofilm^14,15, hamowanie wzrostu bakterii¹⁶, wzrost komórek drożdży¹⁷, oznaczanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze¹⁸ oraz badanie przesiewowe toksyczności nanomateriałów¹⁹.

Kilku badaczy opublikowało protokoły tempa wzrostu bakterii za pomocą czytnika mikropłytek^12,20,21. Jednak dokładny protokół, który bada wiarygodność zebranych danych, nie został w pełni ustalony. Poinformowano, że czynniki takie jak typ gatunku^22,23,24 i taśmy uszczelniające wpływają na powtarzalność ze względu na nieodpowiedni transfer tlenu w 96-dołkowej płytce^25,26. Delaney i wsp. donieśli o dużych skupiskach Methylorubrum extorquens (szczep typu dzikiego) w pożywce wzrostowej podczas korzystania z czytnika mikropłytek, co spowodowało bardzo głośne dane o wzroście²⁴. Problem został rozwiązany przez usunięcie genów związanych z produkcją biofilmu²⁴. Ze względu na wydzielanie zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych bakterie wytwarzające biofilm mają większe powinowactwo do łączenia się i tworzenia klastrów komórkowych. W związku z tym trudniej jest monitorować ich wzrost za pomocą technik rozpraszania światła (np. spektrofotometrów i czytników mikropłytek).

Ten protokół ma na celu ustanowienie kroków do uzyskania powtarzalnych danych w sposób wysokoprzepustowy za pomocą czytnika mikropłytek. Wykorzystano Bacillus mycoides i Paenibacillus tundrae ze względu na ich szybki wzrost i zdolność do wytwarzania biofilmu, które tradycyjnie stanowią wyzwanie w przypadku metod ręcznych i automatycznych. Zbadano takie czynniki, jak (i) korekta długości ścieżki, (ii) kondensacja na pokrywie, (iii) rozmiar inokulum, (iv) przedział czasowy próbkowania oraz (v) odchylenie przestrzenne w celu oceny wiarygodności i odtwarzalności danych. W protokole tym przedstawiono kroki dokładnego monitorowania wzrostu bakterii i pomiaru określonych wskaźników wzrostu za pomocą czytnika mikropłytek.

Protocol

UWAGA: Wszystkie kroki w tym protokole muszą być wykonywane w sterylnych warunkach (np. między dwoma płomieniami lub komorą bezpieczeństwa biologicznego). Wszystkie materiały i narzędzia są sterylizowane w autoklawie przez 20 minut. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole. Ręce w rękawiczkach są dezynfekowane, utrzymywane w stanie zwilżonym środkiem do dezynfekcji rąk lub 70% roztworem alkoholu przez co najmniej 1 minutę, a następnie nie wyjmowane z szafy bezpieczeństwa. W przeciwnym razie procedurę dezynfekcji należy powtórzyć przed ponownym włożeniem rąk do szafy bezpieczeństwa. UWAGA: Upewnij się, że środek dezynfekujący został całkowicie odparowany przed użyciem otwartego ognia.

UWAGA: Dwie bakterie zostały wyizolowane z biofiltracji wody pitnej, jak wyjaśniono wcześniej²⁷ ze względu na ich zdolność do wytwarzania biofilmu. Zostały one zidentyfikowane przez pełne sekwencjonowanie 16S rRNA i przesłane do NCBI jako Bacillus mycoides (SAMN10518261) i Paenibacillus tundrae (SAMN10452279).

1. Przygotowanie wywaru bakteryjnego w glicerolu

1. Odważ 3 g bulionu sojowego tryptycznego (TSB) w proszku i rozpuść go w 100 ml wody destylowanej. Autoklaw bulion przez 20 minut i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 50 ml TSB do kolby o pojemności 50 ml.
2. Przenieś bakterie na płytki agarowe^27,28. Za pomocą pętli wybierz kolonię bakterii z płytki agarowej. Dodaj zawartość pętli do kolby, delikatnie obracając pętlę. Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 30 °C ± 1 °C z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr./min.
   UWAGA: Temperaturę i wstrząsy należy dostosować do typu szczepu.
3. Przygotuj kolejną kolbę o pojemności 50 ml z 47,5 ml TSB. Przenieść 2,5 ml nocnej kultury do kolby. Inkubuj go przez 5-6 godzin, aby osiągnąć OD₆₀₀ = 0,6 0,05 (aby przejść do środkowej fazy wykładniczej).
4. Przenieś kulturę do wysterylizowanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwirować kulturę o masie 2 200 × g przez 10 minut. Delikatnie zdekantować bulion, aby uniknąć utraty komórek zebranych na dnie tuby.
5. Dodać 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do tej samej probówki i odwirować przy 2 200 × g przez 10 minut. Powtórz ten krok 3 razy.
6. Dostosuj OD₆₀₀ komórek do 0,6 0,05 za pomocą pipety do miareczkowania odpowiedniej ilości roztworu PBS. Dokładnie rejestruj dodaną ilość PBS do wykorzystania w przyszłości.
7. Miareczkować glicerol do zawiesiny, aż do osiągnięcia 20% v/v. Zakryj probówkę i wiruj przez 15 sekund.
8. Przenieść 1,5 ml zawiesiny do 2 ml kriowialiów. Umieść kriowiale w odpowiednim pudełku i przechowuj je w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

2. Przygotuj kulturę na noc.

1. Pozostaw kriowiale z wywarem bakteryjnym do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu, gdy zawartość stanie się płynna.
   UWAGA: Zaleca się, aby nie przyspieszać procesu rozmrażania.
2. Przygotuj wysterylizowaną probówkę z 10 ml TSB. Przenieść 50 μl zawiesiny do probówki. Inkubować probówkę przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 30 °C ± 1 °C z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr./min.

3. Przygotuj Inokulum.

1. Przygotuj probówkę z 10 ml wysterylizowanego TSB. Przenieść 500 μl nocnej kultury do probówki. Inkubuj go przez 6-8 godzin, aby osiągnąć OD₆₀₀ = 0,6 0,05 (lub przejść do środkowej fazy wykładniczej).
2. Przenieść kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 2 200 × g przez 10 minut. Delikatnie zdekantować bulion.
3. Dodać 5 ml PBS i odwirować w stężeniu 2 200 × g przez 10 minut. Powtórzyć ten krok 3 razy.
4. Dostosować OD₆₀₀ komórek do 0,6 0,05, miareczkując roztwór PBS za pomocą pipety. Dokładnie rejestruj dodaną ilość PBS do wykorzystania w przyszłości.

4. Przenoszenie pożywki wzrostowej do czytnika mikropłytek

1. Wybierz przezroczystą, sterylną płytkę z płaskim dnem i pokrywką (tj. płytka 96-dołkowa, płytka 6-dołkowa, płytka 12-dołkowa).
2. Zmierz korekcję długości ścieżki dla mikropłytki za pomocą wody DI przed uruchomieniem protokołu, jak wyjaśniono w kroku 1.10.
3. Narysuj tabelę referencyjną na podstawie wybranej płytki studzienki, aby określić pozycje próbek przed załadowaniem. Na przykład narysuj tabelę 8 x 12 dla płytki 96-dołkowej.
   UWAGA: Tabela referencyjna pozwala uniknąć nieporozumień na etapie inkubacji i zbierania wyników.
4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieścić następujące elementy: mikropłytkę z pokrywką, pipetę o pojemności 1 000 μl i 200 μl, końcówki do pipet o pojemności 1 000 μl i 200 μl, kilka kriowialiów, zlewkę o pojemności 25 ml, pożywkę wzrostową i inokulum.
   UWAGA: Wymienione elementy należy przenosić do komory bezpieczeństwa biologicznego w sposób aseptyczny.
5. Dodać 10 ml pożywki wzrostowej do zlewki. Przenieść obliczoną ilość inokulum do zlewki z pożywką wzrostową.
   UWAGA: Proporcje inokulum w tym protokole wynoszą 1% i 5%. Na przykład, aby osiągnąć stosunek inokulum 5% i 1%, dodaj 500 μl i 100 μl inokulum do odpowiednio 9,5 ml i 9,9 ml pożywki wzrostowej.
6. Po dodaniu inokulum delikatnie potrząśnij zlewką, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Dozować 200 μl zaszczepionej pożywki do wyznaczonych studzienek, korzystając z tabeli referencyjnej. Wybierz co najmniej trzy studzienki, które będą działać jako kontrole, dodając 200 μl pożywki wzrostowej (bez inokulum).
   UWAGA: Upewnij się, że studzienki kontrolne są wyraźnie oznaczone w tabeli referencyjnej. Jeśli w tych studzienkach zaobserwuje się jakikolwiek wzrost (zanieczyszczenie), eksperyment należy powtórzyć.
7. Dozuj 200 μl wody DI do studzienek krawędziowych, w których szybkość parowania jest wyższa. Delikatnie nałożyć pokrywkę przed wyjęciem płytki 96-dołkowej z szafy bezpieczeństwa. Ostrożnie umieścić 96-dołkową płytkę w czytniku płytek, upewniając się, że nie wykonuje się gwałtownych ruchów.

5. Ustawienia czytnika mikropłytek

1. Włącz czytnik mikropłytek, a następnie użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć niestandardowy protokół. W Menedżerze zadań otwórz protokół i wybierz Utwórz nowy | Protokół standardowy. Otwórz Procedurę i dostosuj ustawienia w następujący sposób:
   1. Ustaw temperaturę na 30 °C (lub wartości docelowe) za pomocą opcji Ustaw temperaturę.
   2. Kliknij Inkubator włączony, a następnie ustaw gradient na 1 °C.
      UWAGA: Aby uniknąć niewiarygodnych danych spowodowanych kondensacją pary wodnej na pokrywie, upewnij się, że opcja Gradient jest ustawiona na 1 °C.
   3. Wybierz opcję Podgrzej, zapewniając równomierne rozprowadzanie ciepła wzdłuż płyty studzienki.
   4. Otwórz Start Kinetic i wybierz żądany czas trwania inkubacji, korzystając z czasu pracy (np. 12:00:00 lub 24:00:00 itd.) oraz interwału między odczytami dla 00:30:00 (reprezentuje 30 min) lub 01:00:00 (reprezentuje 1 h).
      UWAGA: Odczyt każdej płytki 96-dołkowej zajmuje około 1 minuty.
   5. Ustaw ustawienia potrząsania w następujący sposób: otwórz Shake (Potrząśnięcie), ustaw Shake Mode (Tryb potrząsania) na Linear (Liniowy), kliknij Continuous Shake (Ciągłe potrząsanie) i ustaw Frequency (Częstotliwość) na 567 cpm (lub dowolną żądaną wartość).
   6. Ustaw ustawienia odczytu OD w następujący sposób: kliknij Czytaj | Absorbancja; wybierz Punkt końcowy/Kinetyczne i Monochromatory; ustawić długość fali na 600 nm; i kliknij przycisk Zatwierdź | Zapisz, aby zapisać go jako nowy protokół o odpowiedniej nazwie i dacie.

6. Rejestrowanie danych o wzroście

1. Otwórz Menedżera zadań | Przeczytaj teraz.
2. Wybierz zapisany protokół, a następnie kliknij OK, aby rozpocząć protokół.
3. Zapisz odczyty do analizy danych.

7. Analiza danych

1. Przenieś wyniki OD₆₀₀ (dane o wzroście) do formatu arkusza kalkulacyjnego. W sekcji wyników kliknij opcję obrazu dla każdej studzienki, aby obserwować końcowe krzywe wzrostu.
2. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego i zmień kolejność zarejestrowanych danych na podstawie tabeli referencyjnej. Odejmij średnią wartość pustych odczytów od innych odczytów.
   UWAGA: Puste miejsca to odczyty OD w czasie zero. W tym protokole do obliczeń brane są wartości OD₆₀₀. Gęstość komórek może być użyta, jeśli dostępna jest krzywa kalibracyjna dla OD₆₀₀ w funkcji liczby komórek.

8. Wyznaczanie szybkości wzrostu

1. Użyj przesłanych danych w arkuszu kalkulacyjnym utworzonym w kroku 1.6. Użyj metody opisanej poniżej i równania (1), aby ocenić szybkość wzrostu.
   (1)
   gdzie μ jest szybkością wzrostu, OD_i jest OD₆₀₀ w każdym punkcie czasowym, OD_i-1 jest początkową wartością OD₆₀₀ w ostatnim punkcie czasowym, t_{i i t i-1} są różnicami czasu między dwoma wymienionymi punktami (np. 0,5 dla 30-minutowych przedziałów czasowych, 1 dla 1-godzinnych przedziałów czasowych).
2. Oblicz średnią i odchylenie standardowe pięciu kolejnych stóp wzrostu za pomocą żądanego oprogramowania do analizy danych. Należy zauważyć, że największą średnią z najmniejszym odchyleniem standardowym jest maksymalna szybkość wzrostu (μ_m) ¹².

9. Określanie stronniczości przestrzennej

UWAGA: Czytniki mikropłytek i płytki wprowadzają stronniczość w wynikach. Kluczowe znaczenie ma ocena odchyleń przestrzennych płytek używanych w konkretnym czytniku mikropłytek, aby zapewnić wiarygodność i odtwarzalność wyników. Aby to osiągnąć, wykonaj następujące kroki:

1. Powtórz kroki 1.2-1.6.
2. Zapisz dane i przeanalizuj je zgodnie z krokami 1.7 i 1.8, aby obliczyć tempo wzrostu dla każdego dołka.
3. Utwórz mapę cieplną, aby zobrazować zmiany tempa wzrostu w 96-dołkowej płytce.
4. Przeprowadzić analizę statystyczną (patrz tabele uzupełniające), upewniając się, że nie ma znaczących różnic między studzienkami.
   UWAGA: Konieczne jest użycie tego samego rodzaju bakterii i tej samej wielkości inokulum we wszystkich studzienkach.

10. Walidacja odczytu OD i współczynnik korekcji długości ścieżki

UWAGA: Określenie współczynnika korekcji długości ścieżki jest kluczowe dla walidacji danych oraz zapewnienia niezawodności i trafności na różnych urządzeniach.

1. Użyj kroku 1.2 i kroku 1.3, aby przygotować inokulum B. mycoides na noc.
2. Przygotować trzy wysterylizowane kolby o pojemności 50 ml i dodać 49,5 ml świeżego TSB do każdej kolby. Dodać 500 μl inokulum do każdej kolby w komorze bezpieczeństwa w sposób aseptyczny. Dodać 50 ml niezaszczepionego TSB do wysterylizowanej kolby, która posłuży jako kontrola.
3. Inkubować kolby w temperaturze 30 °C i prędkości 150 obr./min. Co 30 minut pobierać próbki z każdej kolby w sposób aseptyczny, a następnie odczytywać i zapisywać OD₆₀₀ w spektrofotometrze.
4. Dodaj 9,9 ml TSB do zlewki o pojemności 25 ml. Dodać 100 μl inokulum do zlewki i delikatnie wstrząsnąć.
5. Dodać 200 μl mieszaniny ze zlewki do sześciu dołków w wybranej kolumnie na płytce 96-dołkowej. Dodaj 200 μl niezaszczepionego TSB do trzech studzienek jako kontrolę. Napełnij studzienki krawędziowe 200 μl wody DI.
6. Założyć pokrywkę i delikatnie przenieść 96-dołkową płytkę do czytnika mikropłytek. Wykonaj kroki 1.5 i 1.6, aby zarejestrować dane dotyczące wzrostu.
7. Wykreślić OD₆₀₀ z czytnika mikropłytek z OD₆₀₀ ze spektrofotometru. Należy pamiętać, że nachylenie jest przesunięciem między dwoma zestawami odczytów, zwanym współczynnikiem korekcji długości ścieżki.
   UWAGA: Inkubator i czytnik mikropłytek należy wykonać jednocześnie tego samego dnia.

Results

współczynnik walidacji odczytu OD i korekcji długości ścieżki
Rozszczepione próbki kultury B. mycoides pobrano w różnych punktach czasowych i zmierzono za pomocą czytnika mikropłytek i spektrofotometru (Rysunek 1A). Ten krok został wykonany w celu zweryfikowania wyników na różnych urządzeniach. Dane OD₆₀₀ były skorelowane, ale nie pasowały (Rysunek 1B). Korelacja była liniowa z nachyleniem 0,55 (95% przedział ufności [CI]: 0,53-0,58, R^2...

Discussion

Czytniki mikropłytek pozwalają na uzyskanie stałych i powtarzalnych temp wzrostu. Technologia ta minimalizuje błędy ludzkie i umożliwia próbkowanie o wysokiej przepustowości. Niewielka ilość kultury wymagana na próbkę sprawia, że podejście to jest atrakcyjną i tanią alternatywą dla liczenia komórek przy użyciu kolb lub probówek. Czytniki mikropłytek pozwalają na dużą wielkość próby, zwiększając moc statystyczną, a następnie ułatwiając wiarygodne obliczenia szybkości wzrostu przy jednoczesnym utrzymaniu kosztów i pracy na...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wirówka	Eppendorf	5810 R
Probówki wirówkowe - 15 mL	ThermoFisher- Naukowy	339650	Sterylne
probówki wirówkowe - 50 mL	ThermoFisher- Naukowy	339652	Sterylna
jednorazowa pętla zaszczepiająca, 10 i mikro; L	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Sterylne
kolby Erlenmeyera - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Szkło
Izopropanol	ThermoFisher- Naukowy	396982500	≥ 99.0
Bufor fosforanowy Solanka	Sigma-Aldrich	P4417
Końcówki do pipet 1 000 &mikro; L	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-76
Końcówki do pipet 10 ml	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-83
Końcówki do pipet 200 i mikro; L	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-85
Końcówki do pipet 5 ml	ThermoFisher- Naukowy	UZ-25001-80
Piper 1,000 &mikro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Piper 10 ml	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Piper 200 & mikro; L	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Piper 5 ml	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Rosół sojowy tryptyczny	Millipore	22091	Nadaje się do mikrobiologii