Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania, odkryto wiele nowych sekwencji wirusopodobnych u stawonogów, w tym u komarów. Dwie główne kategorie tych nowych wirusów związanych z komarami to "wirusy przenoszone przez komary (MBV)" i "wirusy specyficzne dla komarów (MSV)". Te nowe wirusy mogą być chorobotwórcze zarówno dla kręgowców, jak i komarów, lub mogą po prostu być w symbiozie z komarami. Wirusy bytowe są niezbędne do potwierdzenia cech biologicznych tych wirusów. W związku z tym opisano tutaj szczegółowy protokół izolacji i amplifikacji wirusa od komarów zebranych w terenie. W pierwszej kolejności próbki komarów przygotowano jako supernatanty homogenatów komarów. Po dwukrotnym odwirowaniu supernatanty zostały następnie zaszczepione do linii komórkowej komarów C6/36 lub linii komórkowej kręgowców BHK-21 w celu amplifikacji wirusa. Po 7 dniach supernatanty zebrano jako supernatanty P1 i przechowywano w temperaturze -80 °C. Następnie supernatanty P1 pasażowano jeszcze dwukrotnie w komórkach C6/36 lub BHK-21, podczas gdy stan komórek był sprawdzany codziennie. Kiedy odkryto efekt cytopatogenny (CPE) na komórki, te supernatanty zostały zebrane i wykorzystane do identyfikacji wirusów. Protokół ten służy jako podstawa dla przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym MBV i MSV.
Wprowadzenie
Komary to grupa ważnych patogennych wektorów stawonogów. W rodzinie Culicidae występuje około 3 500 gatunków komarów1,2. Rozwój technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości doprowadził do odkrycia wielu nowych, wirusopodobnych sekwencji u komarów z różnych części świata3. Ogólnie rzecz biorąc, te wirusy związane z komarami można podzielić na dwie główne grupy: MBV i MSV.
MBV to grupa różnorodnych wirusów, które są czynnikami wywołującymi wiele chorób ludzkich lub zwierzęcych, takich jak wirus żółtej febry (YFV), wirus dengi (DENV), wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV), wirus Zachodniego Nilu (WNV) i wirus gorączki doliny Rift (RVFV)4. Poważnie zagrażają zdrowiu publicznemu, powodując poważną zachorowalność i śmiertelność zarówno ludzi, jak i zwierząt na całym świecie. MBV w naturalny sposób podtrzymują cykl życiowy między różnymi gospodarzami poprzez przenoszenie z zakażonego komara na żywiciela naiwnego, a także z żywiciela zainfekowanego wirusem i na żerującego komara5. W związku z tym wirusy te mogą infekować zarówno linie komórkowe komarów, jak i linie komórkowe kręgowców w lab1.
MSV, które obejmują wirusa Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) i wirusa Chaoyang (CHAOV), są podgrupą wirusów specyficznych dla owadów1,6,7. W ostatnich latach nastąpił wzrost liczby odkrywanych nowych MSV, a niektóre z tych MSV mają wpływ na przenoszenie MBV. Na przykład CxFV, który może być uporczywą infekcją Culex pipiens, może hamować replikację WNV na wczesnym etapie8. Stwierdzono, że inny specyficzny dla owadów flawiwirus, wirus czynnika łączącego komórki (CFAV), hamuje rozprzestrzenianie się wirusa DENV i Zika (ZIKV) u komarów Aedes aegypti9. W związku z tym protokół ten jest użytecznym podejściem do izolowania wirusów związanych z komarami i może pomóc w dalszych badaniach nad dystrybucją patogenów związanych z komarami i zwalczaniem chorób przenoszonych przez komary.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pobieranie próbek i sortowanie komarów
- Złap dorosłe komary przez pułapki świetlne MXA-02 lub pułapki na komary na dwutlenek węgla w terenie.
- Zabij zebrane komary, zanurzając je w ciekłym azocie10,11. Przetransportuj je do laboratorium za pomocą systemu logistycznego łańcucha chłodniczego12.
UWAGA: Suchy lód był używany przede wszystkim w systemie logistycznym łańcucha chłodniczego. - (Opcjonalnie) Jeśli miejsca pobierania próbek znajdowały się w pobliżu laboratorium, wyślij bezpośrednio żywe komary w pułapkach sieciowych do laboratorium i poddaj je eutanazji poprzez zamrożenie w temperaturze ≤-20 °C przez 30 min4.
- Dokonaj identyfikacji morfologicznej zebranych komarów za pomocą podręcznika13 do klasyfikacji i identyfikacji komarów.
UWAGA: W razie potrzeby do klasyfikacji i identyfikacji komarów można użyć kodów kreskowych DNA14,15. - Na podstawie dat i miejsc pobierania próbek przypisz je do różnych pul, a następnie przechowuj je w probówkach o pojemności 2-5 ml.
- Narysuj tabelę, w której zapisz każdą probówkę z gatunkami komarów, liczbą, kodem pobierania próbek, datą i miejscami.
- Wydrukuj etykiety z kodami pobierania próbek i przymocuj je do probówek.
- Probówki z próbkami komarów należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
2. Zgrzytanie komarów
- Umieść 20-50 komarów w każdej sterylnej probówce o pojemności 2 ml z kulkami ceramicznymi o średnicy 3 mm z 1,5 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) zawierającej 2% roztworu penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B.
UWAGA: Trzymaj rurki na lodzie lub na ładnej tacy. - Homogenizuj komary za pomocą niskotemperaturowego homogenizatora tkankowego, mieląc przez 30 s przy 70 Hz w 4 °C przez trzy cykle16.
- Odwirować mieszaniny w temperaturze 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowych probówek.
- Ponownie odwirować supernatanty w temperaturze 15 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki komarów12,17.
UWAGA: W razie potrzeby supernatanty można przefiltrować za pomocą filtrów 0,22 μm. - Porcjować supernatanty (P0) do probówek z zakrętką o pojemności 2 ml (200 μl na probówkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Przygotowanie komórek i pożywka do konserwacji hodowli komórkowych
UWAGA: Linia komórkowa komara C6/36 (Aedes albopictus z niedoborem RNAi) i linia komórkowa kręgowców BHK-21 (nerka chomika) zostały użyte do amplifikacji i izolacji wirusa.
- Zaszczepić 1 × 106 komórek C6/36 w kolbie o średnicy 75cm2 z 10 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S) w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .
- Zaszczepić 1 × 106 komórek BHK-21 w kolbie o średnicy 75cm2 z 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5%CO2.
UWAGA: Komórki były przepuszczane dwa lub trzy razy w tygodniu17,18. - Wysiewać komórki hodowane w kolbie o średnicy 75cm2 (komórki C6/36 lub BHK-21) na płytki 24-dołkowe (C6/36 na basenik: 1,4 × 105; BHK-21 na studzienkę: 0,8 × 105).
- Umieścić 24-dołkowe płytki w temperaturze 28 °C lub 37 °C na noc.
- Obserwuj komórki pod mikroskopem i potwierdź, czy zbieganie komórek w każdym dołku wynosi 80%-90%.
- Przygotować pożywkę do konserwacji hodowli komórkowych (500 ml).
UWAGA: W przypadku C6/36 pożywką była pożywka RPMI uzupełniona 2% FBS i 2% roztworem penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B. W przypadku BHK-21 pożywką była pożywka DMEM uzupełniona 2% FBS i 2% roztworem penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B.
4. Izolacja wirusa
UWAGA: Wszystkie kroki zostały przeprowadzone w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Wymagania dotyczące poziomu bezpieczeństwa laboratorium bezpieczeństwa biologicznego zostały określone na podstawie oceny ryzyka bezpieczeństwa biologicznego w oparciu o przepisy różnych krajów i regionów. Proces musi być przeprowadzony w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z 24-dołkowych płytek i dodać 100 μl pożywki do utrzymania hodowli komórkowej i 100 μl supernatantu homogenatu komarów (P0) do każdej studzienki.
- Inkubować płytki w temperaturze 28 °C lub 37 °C przez 60 minut i delikatnie wstrząsać nimi co 15 minut, aby zapobiec wysuszeniu komórek.
- Usunąć supernatant i delikatnie przepłukać każdą studzienkę 600 μl pożywki do konserwacji kultur komórkowych, aby całkowicie usunąć zanieczyszczenia.
- Dodać 800 μl pożywki do utrzymania hodowli komórkowych do każdej studzienki i przechowywać płytki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 28 °C lub 37 °C przez 7 dni.
- Monitoruj stan komórek każdej studzienki pod mikroskopem daily15.
- Zebrać supernatanty komórek (supernatanty P1) 7dnia i przechowywać supernatanty w temperaturze -80 °C.
- Powtórz kroki 4.1-4.6 2x, aby uzyskać supernatanty P2 i P3.
UWAGA: W kroku 4.3 delikatne płukanie każdej studzienki 600 μl pożywki do konserwacji hodowli komórkowych było opcjonalne dla P2 i P3. - W zależności od tego, która studzienka wykazuje efekt cytopatogenny (CPE) - komórki umierają, piknoza i odrywają się od powierzchni; fuzja z sąsiednimi komórkami w celu utworzenia syncytii; lub pojawienie się jądrowych lub cytoplazmatycznych ciał inkluzyjnych - dodaj 300-400 μl supernatantu tego CPE do każdej studzienki nowych 6-dołkowych płytek zawierających komórki (zbieganie komórek wynosiło 80%-90%), aby znacznie wzmocnić wirusy.
- Zebrać supernatanty i rozdzielić je na probówki do przechowywania z zakrętką o pojemności 2 ml (500 μl na probówkę). Przechowywać je w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Po trzech pokoleniach kolejnych pasażów w komórkach, próbki, które nie indukowały CPE, zostały odrzucone. W razie potrzeby można zwiększyć generacje kolejnych pasaży w komórkach.
5. Wykrywanie sekwencji wirusowych za pomocą RT-PCR
- Ekstrakcja całkowitego RNA z 200 μl supernatantu wirusa za pomocą mini zestawu wirusowego RNA16.
UWAGA: W tym przypadku zastosowano zautomatyzowany system ekstrakcji kwasów nukleinowych do ekstrakcji całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia. - Przekształć RNA w cDNA zgodnie z instrukcjami zestawu RT-PCR za pomocą przyrządu do PCR.
- Dodać 15 μl RNA zmieszanego z 1 μl losowych starterów do probówki PCR. Umieścić probówkę w temperaturze 70 °C na 5 minut, a następnie umieścić ją na lodzie na 5 minut.
- Dodać 5 μl 5x buforu i 25 μl mieszaniny (10 mM dNTP, 40 U/μL inhibitora RNazy i 200 U/μL M-MLV) do probówki i umieścić probówkę w temperaturze 42 °C na 60 min i 95 °C na 10 min.
- Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C.
- Użyj zestawu do PCR i uniwersalnych starterów (Tabela 1), aby wykryć wirusy metodą PCR.
- W przypadku arbowirusów należy skonfigurować system reakcji PCR (łącznie 30 μL) z następującymi składnikami: 3 μL 10x buforu Taq, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL startera przedniego (10 μm), 1 μL startera odwrotnego (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U/μL), 19,7 μl ddH, 2O i 2 μl cDNA.
- W celu wykrycia flawiwirusów należy ustawić proces reakcji jako: etap 1: 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; etap 2: 72 °C przez 10 minut.
- W celu wykrycia alfawirusów należy skonfigurować proces reakcji jako: etap 1: 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 50 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; etap 2: 72 °C przez 10 minut.
- W celu wykrycia bunyawirusów należy skonfigurować proces reakcji jako: etap 1: 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 50 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; etap 2: 72 °C przez 10 minut.
- Wykryj produkty amplifikacji PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym i wyślij je do analizy sekwencjonowania.
UWAGA: Jeśli warunki na to pozwolą, supernatanty mogą zostać poddane analizie sekwencjonowania nowej generacji w celu identyfikacji nowych wirusów i uzyskania sekwencji całego genomu wirusa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po inokulacji supernatantami homogenatów komarów (P0), w komórkach C6/36 zaobserwowano szerokie przestrzenie międzykomórkowe oraz złuszczanie komórek w 120 h (Rycina 1A) w porównaniu z nieinokulowanymi komórkami (kontrolnymi) w tym samym czasie (Rycina 1B). Po inkubacji komórek BHK-21 z supernatantami P3, w komórkach BHK-21 w 48 h zaobserwowano widoczny efekt cytopatyczny (CPE) (Rycina 1C) w przeciwieństwie do komórek kontrolnych (<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tej metody było zaoferowanie praktycznego sposobu izolowania wirusów związanych z komarami przy użyciu różnych linii komórkowych. Bardzo ważne jest, aby dodać antybiotyk-antybiotyk (penicylina-streptomycyna-amfoterycyna) do supernatantów homogenatów komarów, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami lub grzybami. Komary i supernatanty wirusowe uzyskane w terenie muszą być przechowywane w lodówce w temperaturze -80 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
Kolejnym ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Projekt Planu Nauki i Technologii z Wuhan (2018201261638501).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mikro; m Filtr membranowy | Millipore | SLGP033RB | Folie polimerowe o określonych wskaźnikach porów. Do usuwania resztek komórkowych i bakterii. |
| Płytki 24-dołkowe | CORNING | 3524 | Pojemniki na komórkę |
| Kolby 75 cm2 | CORNING | 430641 | Pojemniki na |
| komórkę sterylna probówka 2 ml z kulkami | |||
| Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy | Gibco | 15240-062 | Antybiotyk w pożywce zapobiegający zanieczyszczeniu bakteriami i grzybami |
| Zautomatyzowany kwas nukleinowy system ekstrakcji | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 komórki | Narodowe Centrum Zasobów Wirusowych, Instytut Wirusologii | ||
| Komórki C6 / 36 | Narodowe Centrum Zasobów Wirusów, Instytut Wirusologii | ||
| Maszyna odśrodkowa | Himac | CF16RN | Przyrząd do wirowania próbek komarów |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s minimalna pożywka niezbędna (DMEM) | Pożywka Gibco | C11995500BT | dla linii komórkowych kręgowców |
| Izolacja wirusa | Cu20-XJ | ||
| Surowica bydlęca fety (FBS) | Gibco | 10099141C | Zapewnij odżywianie komórek |
| wysokoobrotowego niskotemperaturowego homogenizatora tkankowegobio | KZ-III-F | Przyrząd do mielenia | |
| inkubator (28 & C) | Instrument | Panasonic MCO-18AC | do |
| inkubatora kultur komórkowych (37 & deg; C) | Panasonic | MCO-18AC | Przyrząd do hodowli komórek |
| w probówce | |||
| penicylina-streptomycyna | Gibco | 15410-122 | Antybiotyk w pożywce zapobiegającej zanieczyszczeniu bakteriami |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B | Gibco | 15240096 | |
| Lodówka (-80 ° C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | podłoże do linii komórkowych mosiquto |
| Probówki do przechowywania z nakrętką (2 ml) | biofil | ||
| sterylne tłuczki | Tiangen | OSE-Y004 | Materiały eksploatacyjne do mielenia |
| TGrinder OSE-Y30 elektryczna maszynka do mielenia tkanek | Tiangen | OSE-Y30 | Przyrząd do mielenia |
| Mikroskop preparacyjny | ZEISS | stemi508 | |
| pułapki świetlne MXA-02 | Maxttrac | ||
| Maszyna | pochłaniająca komaryNingbo Bangning | ||
| Końcówki do pipet | Axygen | TF | |
| Mini zestaw QIAamp wirusowego RNA | QIAGEN | 52906 | |
| Pęseta | Dumont | 0203-5-PO |
Bibliografia
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342(2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265(2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873(2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30(2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555(2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640(2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298(2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
