Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania, odkryto wiele nowych sekwencji wirusopodobnych u stawonogów, w tym u komarów. Dwie główne kategorie tych nowych wirusów związanych z komarami to "wirusy przenoszone przez komary (MBV)" i "wirusy specyficzne dla komarów (MSV)". Te nowe wirusy mogą być chorobotwórcze zarówno dla kręgowców, jak i komarów, lub mogą po prostu być w symbiozie z komarami. Wirusy bytowe są niezbędne do potwierdzenia cech biologicznych tych wirusów. W związku z tym opisano tutaj szczegółowy protokół izolacji i amplifikacji wirusa od komarów zebranych w terenie. W pierwszej kolejności próbki komarów przygotowano jako supernatanty homogenatów komarów. Po dwukrotnym odwirowaniu supernatanty zostały następnie zaszczepione do linii komórkowej komarów C6/36 lub linii komórkowej kręgowców BHK-21 w celu amplifikacji wirusa. Po 7 dniach supernatanty zebrano jako supernatanty P1 i przechowywano w temperaturze -80 °C. Następnie supernatanty P1 pasażowano jeszcze dwukrotnie w komórkach C6/36 lub BHK-21, podczas gdy stan komórek był sprawdzany codziennie. Kiedy odkryto efekt cytopatogenny (CPE) na komórki, te supernatanty zostały zebrane i wykorzystane do identyfikacji wirusów. Protokół ten służy jako podstawa dla przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym MBV i MSV.
Wprowadzenie
Komary to grupa ważnych patogennych wektorów stawonogów. W rodzinie Culicidae występuje około 3 500 gatunków komarów1,2. Rozwój technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości doprowadził do odkrycia wielu nowych, wirusopodobnych sekwencji u komarów z różnych części świata3. Ogólnie rzecz biorąc, te wirusy związane z komarami można podzielić na dwie główne grupy: MBV i MSV.
MBV to grupa różnorodnych wirusów, które są czynnikami wywołującymi wiele chorób ludzkich lub zwierzęcych, takich jak wirus żółtej febry (YFV), wirus dengi (DENV), wirus japońskiego....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pobieranie próbek i sortowanie komarów
- Złap dorosłe komary przez pułapki świetlne MXA-02 lub pułapki na komary na dwutlenek węgla w terenie.
- Zabij zebrane komary, zanurzając je w ciekłym azocie10,11. Przetransportuj je do laboratorium za pomocą systemu logistycznego łańcucha chłodniczego12.
UWAGA: Suchy lód był używany przede wszystkim w systemie logistycznym łańcucha chłodniczego. - (Opcjonalnie) Jeśli miejsca pobierania próbek znajdowały się w pobliżu laboratorium, wyślij bezpośrednio żywe komary w pułapkach sieciowych do labora....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po inokulacji supernatantami homogenatów komarów (P0), w komórkach C6/36 zaobserwowano szerokie przestrzenie międzykomórkowe oraz złuszczanie komórek w 120 h (Rycina 1A) w porównaniu z nieinokulowanymi komórkami (kontrolnymi) w tym samym czasie (Rycina 1B). Po inkubacji komórek BHK-21 z supernatantami P3, w komórkach BHK-21 w 48 h zaobserwowano widoczny efekt cytopatyczny (CPE) (Rycina 1C) w przeciwieństwie do komórek kontrolnych (<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tej metody było zaoferowanie praktycznego sposobu izolowania wirusów związanych z komarami przy użyciu różnych linii komórkowych. Bardzo ważne jest, aby dodać antybiotyk-antybiotyk (penicylina-streptomycyna-amfoterycyna) do supernatantów homogenatów komarów, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami lub grzybami. Komary i supernatanty wirusowe uzyskane w terenie muszą być przechowywane w lodówce w temperaturze -80 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
Kolejnym .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Projekt Planu Nauki i Technologii z Wuhan (2018201261638501).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mikro; m Filtr membranowy | Millipore | SLGP033RB | Folie polimerowe o określonych wskaźnikach porów. Do usuwania resztek komórkowych i bakterii. |
| Płytki 24-dołkowe | CORNING | 3524 | Pojemniki na komórkę |
| Kolby 75 cm2 | CORNING | 430641 | Pojemniki na |
| komórkę sterylna probówka 2 ml z kulkami | |||
| Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy | Gibco | 15240-062 | Antybiotyk w pożywce zapobiegający zanieczyszczeniu bakteriami i grzybami |
| Zautomatyzowany kwas nukleinowy system ekstrakcji | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 komórki | Narodowe Centrum Zasobów Wirusowych, Instytut Wirusologii | ||
| Komórki C6 / 36 | Narodowe Centrum Zasobów Wirusów, Instytut Wirusologii | ||
| Maszyna odśrodkowa | Himac | CF16RN | Przyrząd do wirowania próbek komarów |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s minimalna pożywka niezbędna (DMEM) | Pożywka Gibco | C11995500BT | dla linii komórkowych kręgowców |
| Izolacja wirusa | Cu20-XJ | ||
| Surowica bydlęca fety (FBS) | Gibco | 10099141C | Zapewnij odżywianie komórek |
| wysokoobrotowego niskotemperaturowego homogenizatora tkankowegobio | KZ-III-F | Przyrząd do mielenia | |
| inkubator (28 & C) | Instrument | Panasonic MCO-18AC | do |
| inkubatora kultur komórkowych (37 & deg; C) | Panasonic | MCO-18AC | Przyrząd do hodowli komórek |
| w probówce | |||
| penicylina-streptomycyna | Gibco | 15410-122 | Antybiotyk w pożywce zapobiegającej zanieczyszczeniu bakteriami |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B | Gibco | 15240096 | |
| Lodówka (-80 ° C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | podłoże do linii komórkowych mosiquto |
| Probówki do przechowywania z nakrętką (2 ml) | biofil | ||
| sterylne tłuczki | Tiangen | OSE-Y004 | Materiały eksploatacyjne do mielenia |
| TGrinder OSE-Y30 elektryczna maszynka do mielenia tkanek | Tiangen | OSE-Y30 | Przyrząd do mielenia |
| Mikroskop preparacyjny | ZEISS | stemi508 | |
| pułapki świetlne MXA-02 | Maxttrac | ||
| Maszyna | pochłaniająca komaryNingbo Bangning | ||
| Końcówki do pipet | Axygen | TF | |
| Mini zestaw QIAamp wirusowego RNA | QIAGEN | 52906 | |
| Pęseta | Dumont | 0203-5-PO |
Bibliografia
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
