Method Article

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zainteresowanie mikroskopią ciekłych elektronów (liquid-EM) gwałtownie wzrosło w ostatnich latach, ponieważ naukowcy mogą teraz obserwować procesy w czasie rzeczywistym w nanoskali. Niezwykle pożądane jest łączenie informacji krioelektromagnetycznych o wysokiej rozdzielczości z dynamicznymi obserwacjami, ponieważ wiele zdarzeń zachodzi w szybkich skalach czasowych - w zakresie milisekund lub szybszym. Pogłębiona wiedza na temat elastycznych struktur może również pomóc w projektowaniu nowych odczynników do zwalczania nowo pojawiających się patogenów, takich jak SARS-CoV-2. Co ważniejsze, oglądanie materiałów biologicznych w płynnym środowisku daje unikalny wgląd w ich działanie w ludzkim ciele. Przedstawiono nowo opracowane metody badania nanoskalowych właściwości zespołów wirusów w ciekłym i szklistym lodzie. Aby osiągnąć ten cel, jako systemy modelowe wykorzystano dobrze zdefiniowane próbki. Przedstawiono równoległe porównania metod przygotowania próbek i reprezentatywnych informacji strukturalnych. Cechy subnanometrowe są pokazane dla struktur o rozdzielczości w zakresie ~3,5-Å-10 A. Inne niedawne wyniki, które wspierają tę komplementarną strukturę, obejmują dynamiczne spostrzeżenia dotyczące kandydatów na szczepionki i terapii opartych na przeciwciałach zobrazowanych w płynie. Ogólnie rzecz biorąc, te korelacyjne zastosowania zwiększają naszą zdolność do wizualizacji dynamiki molekularnej, zapewniając unikalny kontekst dla ich zastosowania w ludzkim zdrowiu i chorobie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania biomedyczne poprawiają nasze zrozumienie ludzkiego zdrowia i chorób poprzez rozwój nowych technologii. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zmienia nasze spojrzenie na nanoświat - pozwala nam badać komórki i cząsteczki w najdrobniejszych szczegółach1,2,3,4,5. Statyczne informacje o dynamicznych komponentach, takich jak miękkie polimery, zespoły białek lub ludzkie wirusy, ujawniają tylko ograniczony wycinek ich złożonej narracji. Aby lepiej zrozumieć, jak działają jednostki molekularne, należy wspól....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ładowanie uchwytu próbki na płyn-EM

  1. Oczyść mikroczipy z azotku krzemu (SiN), inkubując każdy chip w 150 ml acetonu przez 2 minuty, a następnie inkubując w 150 ml metanolu przez 2 minuty. Pozostaw wióry do wyschnięcia w laminarnym przepływie powietrza.
  2. Plazma czyści wysuszone wióry za pomocą przyrządu do jarzeniowego pracującego w standardowych warunkach 30 W, 15 mA przez 45 s przy użyciu argonu.
  3. Załaduj mikroczip z suchą podstawą do końcówki uchwytu na próbkę. Dodaj ~0,2 μL próbki (0,2-1 mg/ml zespołów wirusów w 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) do chipa bazowego. Po 1-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do wszystkich eksperymentów z obrazowaniem ciekłego EM użyto płynnego TEM-u działającego przy 200 kV, a do zbierania wszystkich danych krio-EM użyto krio-TEM działającego przy 300 kV. Przedstawiono reprezentatywne obrazy i struktury wielu wirusów, aby zademonstrować użyteczność metod w odniesieniu do różnych obiektów testowych. Należą do nich rekombinowany wirus związany z adenowirusem podtyp 3 (AAV), subwirusowe zespoły SARS-CoV-2 pochodzące z surowicy pacjenta oraz dwuwarstwowe cząstki rotawirusa małpiego (DLP), szczep.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawiają się nowe możliwości usprawnienia obecnych przepływów pracy z ciekłym EM dzięki zastosowaniu nowych zautomatyzowanych narzędzi i technologii zaadaptowanych z dziedziny cryo-EM. Zastosowania wykorzystujące nową technikę przekładkową mikroprocesorów są istotne w porównaniu z innymi metodami, ponieważ umożliwiają analizę obrazowania w wysokiej rozdzielczości w cieczy lub szklistym lodzie. Jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest wytwarzanie próbek o idealnej grubości cieczy, aby uwidocznić wyjątkowe s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Autorka, Madeline J. Dressel-Dukes, jest pracownikiem Protochips, Inc., a Michael Spilman jest pracownikiem DirectElectron.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Dr. Lukowi H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) za dostarczenie oczyszczonego AAV-3. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health i National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 do D.F.K.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonFisher Naukowy  A11-11-litrowe
narzędzie do przycinania automatycznego ładowaniaThermoFisher ScientificN/ARównież dostawca SubAngstrom
Klipsy siatkowe do automatycznego ładowaniaThermoFisher ScientificN/Agórne i dolne klipsy
Złote siatki EM powlekane węglemElectron Microcopy SciencesCF400-AU-50siatce 400 i grubości 5 nm
RayBiotechCoV-Pos-S-500500 mikrolitrów surowicy PCR+
MetanolFisher Scientific  A412-11 litr
mikroczipy Microwell-integradProtochips, Inc.EPB-42A1-10Matryce okienne 10x10 mm
TEMWindows microchipsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 dużych okien, 10-nn grubości
TEMWindows microchipsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 małych okien o grubości 5 nm
Top microchipsProtochips, Inc.EPT-50W 500mm x 100 mm okno
Whatman #1 bibuła filtracyjnaWhatman1001 090100 sztuk, 90 mm
Sprzęt 
DirectView bezpośredni detektor elektronówodstępypikselami
Falcon 3 EC Bezpośredni detektor elektronów ThermoFisherScientific14-mikronowy odstęp między pikselami
Gatan 655 Sucha stacja pompGatan, Inc.  Końcówka uchwytu pompy do zakresu 10-6 s
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientific Najnowocześniejszeurządzenie do przygotowywania próbek 
PELCO easiGlow, jednostka wyładowcza jarzeniowaTed Pella, Inc.  Tryb ujemnej polaryzacji
Poseidon Select uchwyt próbkiProtochips, Inc.  Kompatybilny z FEI; uchwyt na próbki
Talos F200C, TEM,ThermoFisher Scientific200 kV; Płynny TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Bezpłatnie dostępne oprogramowanie>Link do strony internetowejComments (opcjonalnie)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/inne oprogramowanie do przetwarzania obrazu
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4Program do wyszukiwania CTF
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
Pakiet oprogramowania do analizy struktury molekularnejSerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Surowica pacjenta COVID-19 o Bezpośrednie między . , https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes