Artykuł metodologiczny

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63856

⸱

20 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Podsumowanie

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Zainteresowanie mikroskopią ciekłych elektronów (liquid-EM) gwałtownie wzrosło w ostatnich latach, ponieważ naukowcy mogą teraz obserwować procesy w czasie rzeczywistym w nanoskali. Niezwykle pożądane jest łączenie informacji krioelektromagnetycznych o wysokiej rozdzielczości z dynamicznymi obserwacjami, ponieważ wiele zdarzeń zachodzi w szybkich skalach czasowych - w zakresie milisekund lub szybszym. Pogłębiona wiedza na temat elastycznych struktur może również pomóc w projektowaniu nowych odczynników do zwalczania nowo pojawiających się patogenów, takich jak SARS-CoV-2. Co ważniejsze, oglądanie materiałów biologicznych w płynnym środowisku daje unikalny wgląd w ich działanie w ludzkim ciele. Przedstawiono nowo opracowane metody badania nanoskalowych właściwości zespołów wirusów w ciekłym i szklistym lodzie. Aby osiągnąć ten cel, jako systemy modelowe wykorzystano dobrze zdefiniowane próbki. Przedstawiono równoległe porównania metod przygotowania próbek i reprezentatywnych informacji strukturalnych. Cechy subnanometrowe są pokazane dla struktur o rozdzielczości w zakresie ~3,5-Å-10 A. Inne niedawne wyniki, które wspierają tę komplementarną strukturę, obejmują dynamiczne spostrzeżenia dotyczące kandydatów na szczepionki i terapii opartych na przeciwciałach zobrazowanych w płynie. Ogólnie rzecz biorąc, te korelacyjne zastosowania zwiększają naszą zdolność do wizualizacji dynamiki molekularnej, zapewniając unikalny kontekst dla ich zastosowania w ludzkim zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Badania biomedyczne poprawiają nasze zrozumienie ludzkiego zdrowia i chorób poprzez rozwój nowych technologii. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zmienia nasze spojrzenie na nanoświat - pozwala nam badać komórki i cząsteczki w najdrobniejszych szczegółach1,2,3,4,5. Statyczne informacje o dynamicznych komponentach, takich jak miękkie polimery, zespoły białek lub ludzkie wirusy, ujawniają tylko ograniczony wycinek ich złożonej narracji. Aby lepiej zrozumieć, jak działają jednostki molekularne, należy wspólnie zbadać ich strukturę i funkcję.

Ostatnie postępy w produkcji materiałów takich jak atomowo cienki grafen czy mikroprocesory na bazie krzemu otwierają nowe możliwości analizy strukturalno-funkcyjnej w czasie rzeczywistym za pomocą transmisyjnych mikroskopów elektronowych (TEM). Materiały te mogą tworzyć hermetycznie zamknięte komory do obrazowania EM na żywo6,7,8,9,10,11. Nowa dziedzina cieczy-EM, temperatura pokojowa skorelowana z cryo-EM, zapewnia bezprecedensowy wgląd w twarde lub miękkie materiały w roztworze, umożliwiając naukowcom jednoczesne badanie struktury i dynamiki ich próbki. Zastosowania ciekłego EM obejmują zapisy w czasie rzeczywistym terapeutycznych nanocząstek oddziałujących z nowotworowymi komórkami macierzystymi, a także zmiany w zawiłościach molekularnych patogenów wirusowych12,13,14.

Tak jak postęp metodologiczny pobudził rewolucję rozdzielczości w dziedzinie krio-EM, potrzebne są nowe techniki i metody, aby rozszerzyć zastosowanie ciekłego EM jako narzędzia o wysokiej przepustowości dla społeczności naukowej. Ogólnym celem przedstawionych tutaj metod jest usprawnienie protokołów przygotowania próbek ciekłego EM. Uzasadnieniem opracowanych technik jest zastosowanie nowych konstrukcji mikroprocesorów i urządzeń do automatycznego ładowania, odpowiednich zarówno do zbierania danych cieczowych, jak i kriogenicznych (Rysunek 1)7,14,15,16,17. Zespoły są mechanicznie uszczelniane za pomocą standardowych klipsów siatkowych do automatycznych instrumentów, takich jak Krios, które mogą pomieścić wiele próbek na sesję lub F200C TEM (Rysunek 2). Metodologia ta rozszerza zastosowanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości poza standardowe zastosowania krio-EM, wykazując szersze cele analizy materiałów w czasie rzeczywistym.

W obecnym artykule wideo przedstawione są protokoły przygotowania zestawów wirusów w płynie z dostępnymi na rynku uchwytami na próbki i bez nich. Korzystając ze specjalistycznego uchwytu na próbki do cieczy EM, cienkie próbki cieczy mogą dostarczyć informacji strukturalnych porównywalnych z próbkami krio-EM, a także dynamicznych wglądów w próbki. Zademonstrowano również metody przygotowywania próbek cieczy przy użyciu narzędzi automatycznego podajnika do procedur o wysokiej przepustowości. Główną zaletą w porównaniu z innymi technikami jest to, że zautomatyzowana produkcja próbek pozwala użytkownikowi szybko ocenić próbki pod kątem optymalnej grubości i dawki elektronów przed zebraniem danych. Ta technika przesiewowa szybko identyfikuje idealne obszary do nagrań w czasie rzeczywistym w cieczy lub lodzie12,14,18,19. Dla celów wyznaczania struktury 3D, ciecz-EM może uzupełniać znane od dawna metody cryo-EM stosowane w cryo-EM. Czytelnicy korzystający z konwencjonalnych technologii TEM lub cryo-EM mogą rozważyć użycie przepływów pracy typu liquid-EM w celu zapewnienia nowych, dynamicznych obserwacji swoich próbek w sposób, który uzupełnia ich obecne strategie.

Próbki wirusa użyte w tym protokole zawierają oczyszczony wirus związany z adenowirusem podtyp 3 (AAV) otrzymany jako prezent i hodowany w standardowych warunkach12. Wykorzystano również niezakaźne podzespoły wirusa SARS CoV-2 pochodzące z surowicy pacjentów z COVID-1912 i uzyskane ze źródła komercyjnego. Na koniec, oczyszczone dwuwarstwowe cząstki (DLP) siego rotawirusa (szczep SA11) uzyskano z laboratorium dr Sarah M. McDonald Esstman na Uniwersytecie Wake Forest i wyhodowano przy użyciu standardowych warunków 6,17. Opisane tutaj pakiety oprogramowania są ogólnodostępne, a linki zostały zamieszczone w sekcji Tabela materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ładowanie uchwytu próbki na płyn-EM

  1. Oczyść mikroczipy z azotku krzemu (SiN), inkubując każdy chip w 150 ml acetonu przez 2 minuty, a następnie inkubując w 150 ml metanolu przez 2 minuty. Pozostaw wióry do wyschnięcia w laminarnym przepływie powietrza.
  2. Plazma czyści wysuszone wióry za pomocą przyrządu do jarzeniowego pracującego w standardowych warunkach 30 W, 15 mA przez 45 s przy użyciu argonu.
  3. Załaduj mikroczip z suchą podstawą do końcówki uchwytu na próbkę. Dodaj ~0,2 μL próbki (0,2-1 mg/ml zespołów wirusów w 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2) do chipa bazowego. Po 1-2 minutowym etapie inkubacji umieść górny wiór na mokrym chipsie podstawowym zawierającym próbkę.
  4. Zacisnąć zespół razem, tworząc hermetycznie zamkniętą obudowę, utrzymywaną mechanicznie za pomocą trzech mosiężnych. Po uszczelnieniu zespołu przepompuj końcówkę do 10-6 Torr za pomocą turbopompowanej przepompowni na sucho. Uchwyt jest teraz gotowy do włożenia do TEM.
    UWAGA: Uchwyt wyboru nie ma możliwości chłodzenia i nie jest używany do cryo-EM.

2. Produkcja zespołów warstwowych z mikroprocesorami

UWAGA: Różne mikroczipy SiN lub dwutlenku krzemu (SiO) mogą być używane bezpośrednio z dostarczonych pakietów żelowych. Złote kratki powlekane węglem mogą być również używane bezpośrednio w takiej postaci, w jakiej są dostarczane.

  1. Plazmowe czyszczenie mikroczipów i siatek węglowych za pomocą przyrządu do wyładowań jarzeniowych działającego w standardowych warunkach 30 W, 15 mA przez 45 s przy użyciu argonu.
  2. Dodać ~2 μL próbki zawartej w 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 do mikroczipa z rozżarzeniem umieszczonym na opakowaniu żelowym. Usuń nadmiar roztworu (~50%) za pomocą bibuły filtracyjnej lub pipety. Po 1-2 minutowym etapie inkubacji dodać rozżarzoną siatkę węglową do mokrego mikrochipa zawierającego próbkę.
  3. Zacisnąć zespół razem za pomocą uchwytu na próbki z pojedynczym przechyłem lub klipsów siatkowych automatycznego podajnika w temperaturze pokojowej, aby utworzyć hermetycznie zamkniętą obudowę. W przypadku zacisków automatycznej ładowarki umieść zespół warstwowy na dolnym zacisku C, umieść górny zacisk na górze zespołu i użyj standardowego narzędzia do zaciskania, aby uszczelnić zespół.
    UWAGA: Wykonywana tutaj procedura zaciskania wykorzystuje te same kroki, co w przypadku zaciskania siatki cryo-EM, ale w temperaturze pokojowej. Zaciśnięte próbki mogą być przechowywane przez 2 miesiące lub dłużej przed obrazowaniem, utrzymując płyn w obudowie. Nie stosuje się kontroli szczelności w przypadku uchwytu na próbki w temperaturze pokojowej lub automatycznego podajnika.
  4. Próbka jest teraz gotowa do włożenia do TEM. Zbadaj próbki umieszczone w automatycznych podajnikach w warunkach kriogenicznych lub w temperaturze pokojowej.

3. Obrazowanie próbek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego

  1. Obrazowanie ciekłego EM
    1. Załadować uchwyt próbki do TEM wyposażonego w pistolet do emisji polowej (FEG) i pracującego pod napięciem 200 kV.
    2. Włączyć pistolet i wyregulować eucentryczną wysokość stolika mikroskopu w stosunku do próbki za pomocą funkcji woblera, przechylając próbkę od -15° do +15° w kolumnie. Ta procedura dostosowuje stolik w kierunku Z, aby dostosować go do grubości próbki. Pomaga również zapewnić dokładne powiększenie podczas rejestrowania obrazu.
    3. Nagrywaj obrazy jako filmy z długimi klatkami za pomocą pakietu in situ zintegrowanego z detektorem bezpośrednim o odstępie między pikselami 6 μm (Wideo 1 i Wideo 2). Pojedyncze obrazy mogą być również rejestrowane za pomocą pakietu oprogramowania do szeregowego gromadzenia danych20, implementującego zautomatyzowane procedury obrazowania. Uzyskuj obrazy w warunkach niskiej dawki przy powiększeniach w zakresie od 28 000x do 92 000x i 40 klatkach na sekundę.
    4. Dostosuj czasy naświetlania (0,25-1 s), aby zminimalizować uszkodzenie próbki przez wiązkę. Użyj zakresu rozmycia -1-4 μm przy określonym powiększeniu. Jeśli napotkasz gęsty roztwór, użyj wyższych wartości rozmycia lub wybierz inny obszar zainteresowania.
    5. Upewnij się, że roztwór jest obecny w próbkach przez cały czas trwania sesji obrazowania, skupiając wiązkę elektronów na obszarze protektorowym nieużywanym do zbierania danych, aż do powstania pęcherzyków (rysunek uzupełniający 1).
  2. Obrazowanie krio-EM
    1. Załaduj przycięte siatki EM lub kanapki z mikroczipem do TEM wyposażonego w FEG i pracującego pod napięciem 300 kV. Włączyć pistolet i wyregulować eucentryczną wysokość stolika mikroskopu, stosując podobną procedurę opisaną dla ciekłego TEM powyżej (krok 3.1.2).
    2. Rejestruj indywidualne obrazy za pomocą systemu analizy pojedynczych cząstek zintegrowanego z systemem mikroskopu, jednocześnie wdrażając zautomatyzowane procedury obrazowania. Rejestruj obrazy w warunkach niskiej dawki za pomocą bezpośredniego detektora elektronów do analizy pojedynczych cząstek o odstępach między pikselami 14 μm przy powiększeniu 59 000x i 40 klatkach na sekundę.
    3. Użyj zakresu rozmycia 1-4 μm przy określonym powiększeniu. W przypadku napotkania grubych warstw lodu szklistego należy użyć wyższych wartości rozmycia lub wybrać inny region do zbierania danych.

4. Analiza danych i porównania struktur 3D

  1. Analiza wirusa związanego z adenowirusem (AAV) w ciekłym i szklistym lodzie
    1. Przetwarzaj filmy dla cząstek AAV w cieczy i lodzie za pomocą RELION-3.08 program21 lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazu22. Wykonaj korekcję ruchu za pomocą MotionCor2 v1.2.3.
    2. Po skorygowaniu wyodrębnij cząstki za pomocą narzędzia do automatycznego wybierania w pakiecie oprogramowania programu. Typowe rozmiary pudełek to 330 pikseli dla próbek płynnych i 350 pikseli dla próbek lodu.
    3. Obliczanie początkowych rekonstrukcji przy użyciu symetrii C1 przy użyciu procedury wstępnego modelu 3D programu i/lub opcji modelu ab-initio w pakiecie oprogramowania do przetwarzania danych. W programie użyj parametru regularyzacji T = 4 i rozmiaru piksela 1,01 A dla próbek płynnych i 1,13 A dla próbek lodu.
    4. Podczas wszystkich procedur uściślania należy używać wartości maski 300 A. Wykonaj protokoły udoskonalania w oprogramowaniu do przetwarzania danych przy użyciu symetrii I1, aby uzyskać wiele map EM. Oczekiwana rozdzielczość strukturalna może mieścić się w zakresie 4 A lub lepszym. Użyj równoważności cząstek implementującej symetrię dwudziestościenną na poziomie 16 800 dla cieczy i 15 240 dla lodu12,14.
      UWAGA: Oszacowania rozdzielczości są oparte na kryteriach złotego standardu korelacji powłoki Fouriera (FSC).
    5. Maskuj mapy EM na ~250 A i sprawdź wyniki za pomocą pakietu oprogramowania do analizy struktury molekularnej23,24. W Rysunek 3, wycinki są pokazane w przyrostach ~5 nm.
    6. Wyodrębnij podjednostki białka kapsydu (VP1) z map EM dla porównania. Określ ilościowo dynamiczne zmiany między strukturami EM na podstawie pomiarów średnicy cząstek (rysunek uzupełniający 2), a następnie zwizualizuj je za pomocą funkcji mapy morfów w oprogramowaniu.
  2. Analiza zespołów subwirusowych SARS-CoV-2 w płynie
    1. Obróbka filmów za pomocą programu RELION-3.08. Skorygowano dryf obrazu i ruch wywołany wiązką przy użyciu MotionCor2 v1.2.3. Poprawka dla funkcji transferu kontrastu (CTF) mikroskopu.
    2. Użyj narzędzia do automatycznego wybierania w programie, aby wybrać zestawy wirusowe o rozmiarze pudełka 800 pikseli. Aby uzyskać wydajność obliczeniową, wyodrębnione cząstki można przeskalować do 256 pikseli. Uzyskaj w programie model początkowy z wykorzystaniem symetrii C1 z parametrem regularyzacji T = 2 i rozmiarem piksela 1,66 A.
    3. Wykonaj udoskonalenie 3D w programie, aby uzyskać mapę EM, przykład jest pokazany przy ~8,25 A zgodnie ze standardowymi kryteriami FSC (Rysunek 4). Wizualizacja map EM za pomocą oprogramowania do analizy struktury molekularnej z warstwami zwiększanymi o 25 nm, jak pokazano na Rysunek 4.
  3. Analiza dwuwarstwowych cząstek rotawirusów (DLP) w lodzie szklistym
    1. Przetwarzaj filmy dla DLP rotawirusów za pomocą innego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Użyj MotionCor2 v1.2.3, aby skorygować dryf na obrazach. Użyj oszacowania Patch CTF, aby skorygować efekty obiektywu na obrazach.
    2. Wyodrębnij cząsteczki za pomocą narzędzia do automatycznego wybierania w oprogramowaniu o rozmiarze pudełka 950 pikseli. Zmniejsz rozmiar pudełka zgodnie z potrzebami do celów obliczeniowych.
    3. Obliczanie początkowych modeli przy użyciu opcji ab-initio i symetrii C1. Użyj parametrów zagęszczenia, takich jak rozmiar piksela 1,47 A i wartość maski 800 A.
    4. Wykonuj dodatkowe procedury udoskonalania, nakładając symetrię I1. Przykładowe wyniki obejmują mapę 10,15 A EM, zgodnie ze złotymi kryteriami FSC. Całkowita liczba użytych cząstek wyniosła 2050, co odpowiada 123 000 jednostek protomeru ze względu na operator symetrii dwudziestościennej (Rysunek 5).
    5. Zamaskuj końcowe mapy przy ~750 A i wizualizuj wyniki w pakiecie oprogramowania do analizy struktury molekularnej. Przykładowe przekroje mapy EM są pokazane w Rysunek 5 w krokach co ~10 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do wszystkich eksperymentów z obrazowaniem w ciekłej EM użyto urządzenia liquid-TEM pracującego przy 200 kV, natomiast do gromadzenia danych cryo-EM wykorzystano cryo-TEM pracujący przy 300 kV. Przedstawiono reprezentatywne obrazy i struktury wielu wirusów, aby zademonstrować użyteczność tych metod dla różnych obiektów badawczych. Obejmują one rekombinowany wirus towarzyszący adenowirusom podtypu 3 (AAV), subwirusem assemblies SARS-CoV-2 pochodzące z surowicy pacjenta oraz dwuwarstwowe cząstki (DLPs) małpiego rotawirusa,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pojawiają się nowe możliwości usprawnienia obecnych przepływów pracy z ciekłym EM dzięki zastosowaniu nowych zautomatyzowanych narzędzi i technologii zaadaptowanych z dziedziny cryo-EM. Zastosowania wykorzystujące nową technikę przekładkową mikroprocesorów są istotne w porównaniu z innymi metodami, ponieważ umożliwiają analizę obrazowania w wysokiej rozdzielczości w cieczy lub szklistym lodzie. Jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest wytwarzanie próbek o idealnej grubości cieczy, aby uwidocznić wyjątkowe s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Autorka, Madeline J. Dressel-Dukes, jest pracownikiem Protochips, Inc., a Michael Spilman jest pracownikiem DirectElectron.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Lukowi H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) za dostarczenie oczyszczonego AAV-3. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health i National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 do D.F.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonFisher Naukowy  A11-11-litrowe
narzędzie do przycinania automatycznego ładowaniaThermoFisher ScientificN/ARównież dostawca SubAngstrom
Klipsy siatkowe do automatycznego ładowaniaThermoFisher ScientificN/Agórne i dolne klipsy
Złote siatki EM powlekane węglemElectron Microcopy SciencesCF400-AU-50siatce 400 i grubości 5 nm
RayBiotechCoV-Pos-S-500500 mikrolitrów surowicy PCR+
MetanolFisher Scientific  A412-11 litr
mikroczipy Microwell-integradProtochips, Inc.EPB-42A1-10Matryce okienne 10x10 mm
TEMWindows microchipsSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 dużych okien, 10-nn grubości
TEMWindows microchipsSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 małych okien o grubości 5 nm
Top microchipsProtochips, Inc.EPT-50W 500mm x 100 mm okno
Whatman #1 bibuła filtracyjnaWhatman1001 090100 sztuk, 90 mm
Sprzęt 
DirectView bezpośredni detektor elektronówodstępypikselami
Falcon 3 EC Bezpośredni detektor elektronów ThermoFisherScientific14-mikronowy odstęp między pikselami
Gatan 655 Sucha stacja pompGatan, Inc.  Końcówka uchwytu pompy do zakresu 10-6 s
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientific Najnowocześniejszeurządzenie do przygotowywania próbek 
PELCO easiGlow, jednostka wyładowcza jarzeniowaTed Pella, Inc.  Tryb ujemnej polaryzacji
Poseidon Select uchwyt próbkiProtochips, Inc.  Kompatybilny z FEI; uchwyt na próbki
Talos F200C, TEM,ThermoFisher Scientific200 kV; Płynny TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Bezpłatnie dostępne oprogramowanie>Link do strony internetowejComments (opcjonalnie)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/inne oprogramowanie do przetwarzania obrazu
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4Program do wyszukiwania CTF
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
Pakiet oprogramowania do analizy struktury molekularnejSerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Surowica pacjenta COVID-19 o Bezpośrednie między . , https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

Bibliografia

  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936(2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80(2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221(2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p ynna mikroskopia elektronowakriomikroskopia elektronowadynamika molekularnametoda kanapki na mikroczipieobrazowanie SARS CoV 2przygotowanie pr bekanaliza strukturalnaprocesy dynamiczne