Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Summary

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Abstract

Dzięki swoim małym rozmiarom, krótkiej żywotności i łatwej genetyce, Caenorhabditis elegans oferuje wygodną platformę do badania wpływu izolatów mikrobiologicznych na fizjologię gospodarza. Fluoryzuje również na niebiesko podczas umierania, zapewniając wygodny sposób na określenie śmierci. Właściwość ta została wykorzystana do opracowania wysokoprzepustowych, bezznakowych testów przeżycia C. elegans (LFASS). Polegają one na poklatkowym zapisie fluorescencyjnym populacji robaków umieszczonych na płytkach wielodołkowych, na podstawie których można wyznaczyć medianę czasu zgonu populacji. W niniejszym badaniu przyjęto podejście LFASS do badania przesiewowego wielu izolatów drobnoustrojów jednocześnie pod kątem wpływu na podatność C. elegans na silne ciepło i stresy oksydacyjne. Przedstawiono tutaj takie badania przesiewowe mikrobiologiczne, które można w szczególności wykorzystać do wstępnego badania przesiewowego probiotyków, wykorzystując silną odporność na stres jako wskaźnik zastępczy dla zdrowia gospodarza. W protokole opisano, w jaki sposób hodować zarówno kolekcje izolatów mikrobioty jelitowej C. elegans, jak i synchroniczne populacje robaków w układach wielodołkowych przed połączeniem ich do testów. Podany przykład obejmuje testowanie 47 izolatów bakteryjnych i jednego szczepu kontrolnego na dwóch szczepach robaków, w dwóch równoległych testach stresu. Linia podejścia jest jednak łatwo skalowalna i ma zastosowanie do monitorowania wielu innych modalności. W ten sposób zapewnia wszechstronną konfigurację do szybkiego badania wieloparametrycznego krajobrazu warunków biologicznych i biochemicznych, które wpływają na zdrowie C. elegans.

Introduction

Ciało ludzkie zawiera około 10-100 bilionów żywych komórek mikrobiologicznych (bakterie, archeony grzyby), które znajdują się głównie w jelitach, skórze i błonach śluzowych¹. W zdrowym stanie zapewniają one gospodarzowi korzyści, w tym produkcję witamin, dojrzewanie układu odpornościowego, stymulację wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych na patogeny, regulację metabolizmu tłuszczów, modulację reakcji na stres i wiele innych, co ma wpływ na wzrost i rozwój, początek choroby i starzenie się^2,3,4,5. Mikrobiota jelitowa również znacznie ewoluuje w ciągu życia. Najbardziej drastyczna ewolucja zachodzi w okresie niemowlęctwa i wczesnego dzieciństwa⁶, ale znaczące zmiany zachodzą również z wiekiem, w tym spadek liczebności Bifidobacterium i wzrost liczby gatunków Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae i Enterococcus⁷. Styl życia może dodatkowo zmienić skład mikrobiologiczny jelit, prowadząc do dysbiozy (utraty pożytecznych bakterii, przerostu bakterii oportunistycznych), powodując różne patologie, takie jak nieswoiste zapalenie jelit, cukrzyca i otyłość⁵, ale także przyczyniając się do chorób Alzheimera i Parkinsona^8,9,10,11.

To uświadomienie znacząco przyczyniło się do udoskonalenia koncepcji osi jelito-mózg (GBA), gdzie interakcje między fizjologią jelit (teraz obejmującą mikroby) a układem nerwowym są uważane za główny regulator metabolizmu i funkcji fizjologicznych zwierząt¹². Jednak dokładna rola mikrobioty w sygnalizacji jelitowo-mózgowej i związane z tym mechanizmy działania są dalekie od pełnego zrozumienia¹³. Ponieważ mikrobiota jelitowa jest kluczowym czynnikiem wpływającym na zdrowe starzenie się, sposób, w jaki bakterie modulują proces starzenia, stał się przedmiotem intensywnych badań i kontrowersji^6,14,15.

Z demonstracją, że glista Caenorhabditis elegans posiada prawdziwą mikrobiotę jelitową zdominowaną - podobnie jak u innych gatunków - przez Bacteroidetes, Firmicutes i Actinobacteria^{16,17,18,19,20}, jego szybki rozwój jako eksperymentalnej platformy do badania jelit gospodarza. Interakcje komensalne^{21,22,23,24,25,26} znacznie rozszerzyło nasz arsenał dochodzeniowy^26,27,28,29. W szczególności wysokoprzepustowe podejścia eksperymentalne dostępne dla C. elegans do badania interakcji gen-dieta, gen-lek, gen-patogen itp., mogą być dostosowane do szybkiego zbadania, w jaki sposób izolaty i koktajle bakteryjne wpływają na zdrowie i starzenie się C. elegans.

Obecny protokół opisuje eksperymentalny proces jednoczesnego badania matryc izolatów bakteryjnych lub mieszanin umieszczonych na płytkach wielodołkowych pod kątem wpływu na odporność na stres C. elegans jako wskaźnik zdrowia, który może być wykorzystany do identyfikacji probiotyków. Szczegółowo opisuje, jak hodować duże populacje robaków i obsługiwać macierze bakteryjne w formatach płytek 96- i 384-dołkowych przed przetworzeniem robaków do automatycznej analizy odporności na stres przy użyciu czytnika płytek fluorescencyjnych (Rysunek 1). Podejście to opiera się na bezznacznikowych automatycznych testach przeżycia (LFASS)³⁰, które wykorzystują zjawisko fluorescencji śmierci³¹, w wyniku których umierające robaki wytwarzają wybuch niebieskiej fluorescencji, który można wykorzystać do określenia czasu śmierci. Niebieska fluorescencja jest emitowana przez estry glukozylowe kwasu antranilowego przechowywane w granulkach jelitowych C. elegans (rodzaj organelli związanych z lizosomami), które pękają, gdy po śmierci w jelicie robaka wyzwalana jest martwicza kaskada³¹.

Rysunek 1: Eksperymentalny proces przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych izolatów bakteryjnych z wpływem na odporność C. elegans na stres. (A) Harmonogram konserwacji robaków i bakterii oraz konfiguracji testów. (B) Konfiguracja i obsługa 96-dołkowej bakteryjnej macierzy płytkowej. (C) Zestaw 384-dołkowej płytki ślimakowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

Dwa szczepy C. elegans użyte równolegle w niniejszym badaniu to Bristol N2 wild type i HT1890: daf-16(mgDf50), które rosną w podobnym tempie. Jednak protokół można powielić z dowolną kombinacją dwóch szczepów, które mają podobne tempo wzrostu. Należy zauważyć, że podczas równoległego testowania innych szczepów (na przykład dzikich i wolno rosnących mutantów daf-2) należy wziąć pod uwagę różne tempo wzrostu, a zatem protokół należy dostosować. Skale czasowe i ilości robaków i bakterii w poniższym protokole są zoptymalizowane pod kątem równoległego testowania 48 izolatów bakteryjnych na dwóch szczepach robaków w dwóch testach LFASS w tetraplikatach. Dostosowania będą konieczne, jeśli równolegle ma być testowanych więcej warunków. Escherichia coli (Escherichia coli) Szczep bakterii OP50 został uzyskany z Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minnesota. 48 izolatów bakteryjnych uzyskano z laboratorium Schulenburga i utrzymywano na agarze LB.

1. Hodowla C. elegans na OP50 (dni 1 - 8)

UWAGA: Obecne podejście ma na celu hodowlę hermafrodytów C. elegans na stałym podłożu na wszystkich etapach i unikanie niepotrzebnych zmian w diecie (np. używanie alternatywnych, szybciej rosnących szczepów E. coli, takich jak NA22 lub bogatszych pożywek wzrostowych, takich jak płytki jaj), aby pozostać jak najbardziej zbliżonym do standardowych warunków wzrostu^32,33 które są nadal szeroko stosowane. Temperatura wzrostu robaków (tutaj ustawiona na 15 °C) zależy od użytego szczepu (szczepów) C. elegans i może wymagać dostosowania (na przykład w celu uniknięcia lub wywołania ekspresji wrażliwego na temperaturę fenotypu lub biomarkera). Więcej informacji na temat hodowli robaków można znaleźć na stronie reference³³.

1. Przygotuj osiem płytek NGM o średnicy 6 cm (10 ml agaru z podłożem do hodowli nicieni, NGM, plik uzupełniający 1)^32,33 na szczep robaka i pozostaw je do wyschnięcia na 1 dzień w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować nasyconą płynną kulturę bakterii E. coli OP50, wysiewając pojedynczy klon bakteryjny ze świeżo wyhodowanego agaru Lysogeny Bulion (agar LB, plik uzupełniający 1) w 25 ml pożywki OP50 (plik uzupełniający 1) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Hodować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką.
3. Zaszczepić osiem 6 cm płytek NGM na szczep 100 μl nasyconej płynnej kultury E. coli OP50 na płytkę i utrzymywać płytki w temperaturze 20 °C przez 2 dni przed użyciem.
4. Za pomocą skalpela pokrój i przenieś kwadratowy kawałek agaru o wielkości 0,5 cm z robakami z niedawno zagłodzonej płytki NGM na każdą z ośmiu zaszczepionych 6 cm płytek NGM i inkubuj te płytki w temperaturze 20 °C przez 3 dni (lub do momentu, gdy robaki skończą jeść).
5. Przygotuj pięć 15 cm płytek NGM na szczep robaka (30 ml pożywki NGM na płytkę) i zaszczep 3 ml OP50. Pozostawić płytki do wyschnięcia przed inkubacją w temperaturze 37 °C przez noc. Przechowywać płytki w temperaturze 20 °C do czasu użycia w późniejszych etapach.
6. Za pomocą pipety P-1000 dodać do 3 ml sterylnego buforu M9 (plik uzupełniający 1) do 6 cm płytek NGM (krok 1.1.) w celu ponownego zawieszenia robaków i zebrać roztwór robaka ze wszystkich ośmiu płytek na szczep w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
   1. Wirować przy 142 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety P-5000 lub pompy wodnej wyposażonej w sterylną pipetę lub końcówkę Pasteura. Dodać 10 ml sterylnego buforu M9, aby umyć osad robaka. Powtórz 2 razy.
   2. Usunąć supernatant (tak bardzo, jak to możliwe) i przenieść robaki na 15-centymetrową płytkę zaszczepioną OP50 NGM (krok 1.5.) za pomocą pipety. Dodać 0,5 ml skoncentrowanej kultury OP50.
   3. Aby uzyskać skoncentrowany OP50, należy zaszczepić każdą z czterech 1-litrowych butelek LB 2 ml kultury starterowej OP50 (przygotowanej w kroku 1.2) i hodować w inkubatorze z wytrząsaniem przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 160 x g. Osadzać bakterie w temperaturze 3057 x g i temperaturze 20 °C przez 15 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulki bakteryjne z 6 ml pożywki OP50 i zebrać w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Bakterie można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
7. Hoduj każdy szczep robaka na płytce NGM o średnicy 15 cm przez 3-4 dni w temperaturze 15 °C, ponownie karmiąc robaki 0,5 ml skoncentrowanego OP50 dziennie.
   1. Gdy robaki prawie skończą jeść, zbierz i umyj w buforze M9 (krok 1.6.1.), przenieś każdą kulturę szczepu robaka na dwie 15-centymetrowe płytki NGM (krok 1.5.) i rozmnażaj robaki w temperaturze 20 °C, aż ~95% populacji będzie grawitymi dorosłymi (zajmie to około 24 godzin dla dzikiego typu Bristol N2).
      UWAGA: Dorosłe osobniki charakteryzują się obecnością jaj w robaku, a idealna płyta powinna również zawierać obfitość niewyklutych jaj złożonych na talerzu bez zbyt wielu larw³³.

2. Utrzymanie kolekcji izolatów mikrobioty jelitowej (Dzień 9)

1. Umieść 48 izolatów bakteryjnych na pojedynczych płytkach agarowych LB o średnicy 6 cm i hoduj przez 48 godzin w temperaturze 20 °C.
   UWAGA: Bakterie mogą być hodowane w temperaturze 25 °C przez 24-36 godzin, jeśli zajdzie taka potrzeba wcześniej, ale dłuższy wzrost w temperaturze 20 °C pozwala na wykrycie potencjalnych zanieczyszczeń.
2. Zsynchronizuj dużą liczbę C. elegans.
   1. Dorosłe robaki należy wybielić, postępując zgodnie ze standardową metodą przygotowania jaj³³ i przenieść jaja na dwie nieobsiane płytki NGM o średnicy 15 cm na 24 godziny w temperaturze 15 °C, aby umożliwić wszystkim larwom L1 wyklucie się i synchroniczny wzrost w kolejnych etapach.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z roztworami wybielacza.

3. Uprawa dużych kultur C. elegans (Dzień 10)

1. Po wykluciu należy zebrać larwy L1 (z kroku 2.2.1.) w 3-4 ml M9 w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odpipetować cztery krople roztworu ślimakowego o pojemności 10 μl na szkiełko lub płytkę i policzyć liczbę robaków w każdej kropli pod mikroskopem stereoskopowym przy 16-krotnym powiększeniu. Określić stężenie robaków w roztworze, uśredniając liczbę larw ze wszystkich kropli roztworu robaka. Pomnóż tę wartość przez pozostałą objętość i oszacuj całkowitą liczbę robaków dla każdego szczepu.
   UWAGA: Na tym etapie potrzeba 46 000-50 000 larw L1 na szczep, aby później wypełnić 384-dołkową płytkę lub dwie półpłytki.
   1. Dla każdego szczepu przenieś wszystkie larwy L1 na dwie 15 cm płytki NGM (23 000-25 000 L1 na płytkę) uprzednio zaszczepione 3 ml OP50 (krok 1.5.) i ponownie obsiane 0,5 ml skoncentrowanego OP50.
2. Inkubować w temperaturze 15 °C, uzupełniając 0,5 ml stężonego OP50 dziennie, w zależności od potrzeb, aż robaki osiągną stadium L4.
   UWAGA: Etap L4 charakteryzuje się nieco ciemniejszym jelitem i białą plamą w kształcie półdysku lub półksiężyca, w której ostatecznie utworzy się srom^32,33.
3. Przygotuj 96-dołkowe płytki NGM-agarozowe, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Przygotować osiem 96-dołkowych płytek agarozy NGM, wypełniając każdą studzienkę 125 μl agarozy NGM (cztery płytki na test).
      UWAGA: Zaleca się pokrycie dodatkowych płytek, jeśli niektóre z nich zostaną zanieczyszczone w kolejnych krokach. Do równoległego wykonywania testów wymagane będą dwa czytniki płytek, ale mogą one być również uruchamiane sukcesywnie, począwszy od testu stresu cieplnego, ponieważ może on trwać zaledwie 6 godzin. W przypadku tych płytek agar z popiołu o s<4% zastępuje się agarozą (patrz Tabela materiałów), co umożliwia wolniejsze i bardziej równomierne suszenie w korkach NGM i zmniejsza zakopywanie się robaków w celu lepszego odzysku.
   2. Upewnij się, że studzienki są wypełnione równomiernie i bez pęcherzyków powietrza. Użyć bloku grzewczego ustawionego na 70 °C (przy powolnym przenoszeniu ciepła przez tworzywo sztuczne płytki wielodołkowej, agaroza NGM może nagrzać się tylko do około 55-60 °C), aby zapobiec zestaleniu się mieszaniny podczas procesu. Aby usunąć pęcherzyki w studzienkach, użyj sterylnej igły podgrzanej płomieniem.
   3. Pozwól 96-dołkowym płytkom zastygnąć w temperaturze pokojowej w sterylnym środowisku przed odwróceniem (pokrywką w dół, aby zapobiec kondensacji) i przechowywać w temperaturze 4 °C w czystym pudełku, aż będą potrzebne.
4. W dniu 11 sprawdź, czy robaki są w kroku 3.2, upewniając się, że nie pojawiły się żadne zanieczyszczenia i że robaki są nadal pełne.
5. W dniu 12 sprawdź, czy robaki są w kroku 3.1, upewniając się, że nie pojawiły się żadne zanieczyszczenia i że robaki są nadal pełne. Sprawdź również etap rozwoju robaków.
   UWAGA: Płeć/szczep i stadium rozwojowe robaka, takie jak używane robaki L4 lub L4 + 24 h, zależą od zabiegów, którym poddawane są robaki. Tutaj hermafrodyty typu dzikiego wystawiono na działanie izolatów bakteryjnych z L4 przez 36 godzin.

4. Przygotowanie kolekcji izolatów mikrobioty jelitowej do ponownego karmienia robaków

1. Monitorować wzrost bakterii na płytkach agarowych LB od kroku 2.1 i kontynuować inkubację w temperaturze 20 °C.
   UWAGA: Chociaż nie jest to idealne rozwiązanie, w przypadku, gdy niektóre klony nie rosną lub nie ujawniają zanieczyszczeń, bakterie można ponownie przerzucić z czystych zapasów na płytki o średnicy 6 cm LB i hodować w temperaturze 25-28 °C przez 24 godziny, aby być gotowym do eksperymentu.
2. Zdefiniuj 96-dołkowy układ macierzy dla testowanej kolekcji bakterii, ułatwiając systematyczny siew płytek i analizę danych w kolejnych krokach (Tabela uzupełniająca 1).
3. Zebrać masę bakteryjną z każdej płytki bakteryjnej o średnicy 6 cm (krok 4.1) i przenieść ją do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml buforu M9. Zrób to za pomocą jednorazowej sterylnej plastikowej pętli o średnicy 2 mm lub metalowej pętli o średnicy 5 mm. Wysterylizuj metalową pętlę między szczepami bakterii, zanurzając w 100% etanolu, paląc i schładzając przez 5 sekund.
4. Wiruj probówki mikrowirówkowe, aż granulki bakteryjne zostaną całkowicie ponownie zawieszone (w zależności od szczepu bakteryjnego może to zająć ~1-10 s).
5. Wirować w temperaturze 9 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, usunąć 700 μl supernatantu i ponownie zawiesić osad bakteryjny przez wirowanie.
6. Przenieść 200 μl każdej zawiesiny bakteryjnej do pojedynczego dołka pustej sterylnej płytki 96-dołkowej zgodnie z układem określonym w kroku 4.2.
7. Z tej płytki zaszczepić osiem 96-dołkowych płytek NGM-agarozowych (przygotowanych w kroku 3.3.) 10 μl roztworu bakteryjnego za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować pod pokrywką w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Nie uszczelniaj płytek, aby umożliwić wysuszenie płytek i rozwój bakterii tlenowych oraz uniknąć nadmiernej kondensacji.
8. Uszczelnić 96-dołkową płytkę zawiesinową przygotowaną w kroku 4.6 czystą samoprzylepną folią uszczelniającą (patrz tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze 15 °C przez okres do 5 dni. Zostanie to wykorzystane do ponownego karmienia robaków w razie potrzeby.

5. Szok termiczny LFASS i test oksydacyjny (dni 13 - 14)

1. Patrząc na płytki z kroku 3.5., oceń stadium rozwojowe robaków. Gdy >90% robaków osiągnie L4³⁴, zbierz robaki w ilości do 10 ml sterylnego roztworu M9 w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
2. Dokładnie umyj robaki (co najmniej 4 razy), obracając w dół z prędkością 142 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, usuwając supernatant i dodając 10 ml świeżego sterylnego M9 między każdym myciem, aby pozbyć się bakterii OP50. Zawiesić osad robaka w 10 ml M9.
3. Przenieść 50 μl roztworu robaka do probówki wiążącej o niskiej powierzchni (patrz tabela materiałów) zawierającej 950 μl M9. Po delikatnym wymieszaniu zawartości probówki w celu uniknięcia sedymentacji robaków, szybko użyj zwilżonej końcówki pipety o niskim stopniu wiązania, aby przenieść 3-4 oddzielne krople o pojemności 10 μl na szkiełko podstawowe lub płytkę NGM i policz liczbę robaków pod mikroskopem stereoskopowym (patrz tabela materiałów) przy 16-krotnym powiększeniu. Uśrednić liczbę z 3-4 kropli i określić liczbę robaków na mikrolitr w roztworze robaka (patrz krok 3.1.).
4. Dostosuj stężenie robaków w probówce 10 ml, aby osiągnąć ~120 robaków w 8 μl. Jeśli roztwór przygotowany w kroku 5.2. nie jest wystarczająco skoncentrowany, odkręć robaki i odpowiednio usuń M9, aby osiągnąć 120 robaków na 8 μl.
5. Przenieś 8 μl roztworu robaka (~120 robaków) do każdej z studzienek z ośmiu 96-dołkowych płytek agarozy NGM z kroku 4.7., używając pipety wielokanałowej lub pipety powtarzalnej. Upewnij się, że używasz końcówek o niskiej retencji, aby ograniczyć utratę robaków. Może być również konieczne przecięcie końcówek, aby umożliwić dużym dorosłym robakom ograniczenie naprężeń mechanicznych u dorosłych robaków.
   UWAGA: Test wymaga co najmniej 30 żywych, zdrowych robaków, aby działał niezawodnie, ale najlepiej działa z około 100 robakami na studzienkę.
6. Inkubować 96-dołkowe płytki agarozowe NGM z nasionami robaków i bakterii w temperaturze 25 °C przez 36 godzin.
7. Sprawdź talerze między 12-24 godzinami, upewniając się, że robaki pozostają pełne przez cały czas. Jeśli wymagane jest ponowne karmienie, ponownie zawiesić bakterie znajdujące się w 96-dołkowej płytce macierzy bakteryjnej przechowywanej w temperaturze 15 °C w kroku 4.8 i dodać do 10 μl odpowiedniego roztworu bakteryjnego do 96-dołkowych płytek NGM-agarozy, w których robaki są zagrożone głodem przed końcem 36-godzinnego okresu inkubacji (wygłodzone robaki dadzą bardzo różne wyniki, Więc to jest bardzo ważne).
   UWAGA: Następujące kroki należy wykonać w dniu 15. Przed rozpoczęciem testu może być konieczna optymalizacja wysokości odczytu. Optymalny odczyt zostanie osiągnięty 20-50 μm nad dnem studni. Będzie to zależało od modelu czytnika płytek. Niektóre oferują możliwość skanowania Z, podczas gdy inne umożliwiają ręczne wprowadzanie wysokości. Ustaw optymalną wysokość na poziomie, na którym wykryty zostanie najwyższy sygnał niebieskiej fluorescencji (365 nm/430 nm). Niektóre czytniki płytek mogą pracować na stałej wysokości zoptymalizowanej pod kątem testów z komórkami przylegającymi i mogą nie być idealne do testów LFASS.
8. Po 36 godzinach napełnij 30 μl M9 do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
   UWAGA: W przypadku testów naprężeń termicznych czytnik płytek musi osiągnąć wymaganą temperaturę do przeprowadzenia testu i może być konieczne jego wcześniejsze włączenie. Obecny protokół wykorzystuje 42 °C, aby zmaksymalizować prędkość zabijania, ale podejście to ma zastosowanie do innych temperatur powyżej 30 °C.
9. Przenieś robaki (około 20 μl) na płytkę 384-dołkową zgodnie z ustalonym układem, używając końcówek o niskiej retencji (rozważ odcięcie końca końcówek, aby umożliwić dużym robakom zmniejszenie naprężeń mechanicznych u dorosłych robaków).
   UWAGA: W niniejszym badaniu dla dwóch opisanych tutaj testów (naprężenie termiczne i stres oksydacyjny) stosuje się dwa różne ustawienia czytnika płytek, a zatem próbki przeznaczone do tych dwóch testów nie mogą być siane na tej samej płytce 384-dołkowej.
10. Upewnij się, że czytniki płytek są prawidłowo ustawione (Tabela 1).
11. Uzupełnij płytki 384-dołkowe większą ilością M9, dążąc do uzyskania końcowej objętości 60 μl na studzienkę. Do testu naprężeń termicznych dodać 40 μl M9, a do stresu oksydacyjnego wywołanego t-BHP dodać 34 μl M9 do 6 μl t-BHP (patrz tabela materiałów).
    1. Rozpocznij test w ciągu 2 minut od dodania t-BHP (idealnie, wszystkie robaki muszą być jednocześnie wystawione na działanie t-BHP, przy czym rozdzielczość czasu testu wynosi 2 minuty). Jeśli nie jest to możliwe, należy użyć timera, aby oszacować czas spędzony na pipetowaniu t-BHP przed rozpoczęciem testu, aby umożliwić późniejsze dostosowanie mediany czasu zgonu.
12. Zamknij płytki przezroczystą pokrywką. Uszczelnić krawędzie płytek 384-dołkowych taśmą maskującą (przyklejającą taśmę na płytce i pokrywce), upewniając się, że taśma nie przechodzi przez pokrywkę lub pod płytkę. Naciąć taśmę między pokrywką a płytką w odstępach za pomocą skalpela, aby umożliwić wymianę powietrza, jednocześnie minimalizując parowanie podczas testu.
13. Włóż płytkę do czytnika płytek (patrz Tabela materiałów) i rozpocznij bieg. Dążyć do wzbudzenia przy długości fali 365 nm i wykrywania emisji przy długości fali 435 nm co 2 minuty przez 6-12 godzin (Tabela 1).
    UWAGA: Zazwyczaj 6 godzin wystarcza na testy stresu cieplnego w temperaturze 42 °C i 8 godzin na testy stresu oksydacyjnego 7% t-BHP.

6. Obsługa danych czytnika tabliczek

1. Zapisz surowe dane fluorescencyjne z czytnika płytek w formatach .txt, .csv lub .xls /.xlsx oddzielonych przecinkami lub tabulatorami, a następnie przekonwertuj je na format xls /.xlsx. W zależności od formatu danych należy je zreorganizować, aby dopasować je do układu arkusza Excela potrzebnego do analizy LFASS. Postępuj zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami podanymi w reference³⁰.
   UWAGA: Podczas gdy dane mogą być analizowane ręcznie, normalizując każdy szereg czasowy i szukając czasu, w którym fluorescencja śmierci osiąga połowę maksimum, automatyczną analizę można przeprowadzić w Matlabie uruchamiając procedurę LFASS ³⁰.
2. Pobierz i zainstaluj Matlab (wersja 2014a lub nowsza) oraz pakiet oprogramowania LFASS z https://github.com/ABA80/LFASS. Postępuj zgodnie ze wskazówkami i adnotacjami w nim zawartymi.
   UWAGA: Rysunek 1C przedstawia krótki opis podejścia. Matlab jest wymagany do uruchomienia procedury LFASS. Alternatywnie, kod Matlaba może być przetłumaczony na Oracle, z wyjątkiem funkcji dopasowania, która jest zastrzeżona. Nowe funkcje wygładzania i sigmoidalne można przepisać, aby umożliwić korzystanie z nich na platformie w pełni open-source.
3. Pomiędzy analizami LFASS należy przenieść dane i wyniki do nowej lokalizacji, ponieważ analiza LFASS przetworzy wszystkie pliki w folderze danych i zastąpi pliki w folderze Wyniki.

7. Inspekcja danych

1. Otwórz plik Excela i oznacz wiersze zgodnie z pozycją studzienki na płytce 384-dołkowej. Plik uzupełniający 2 przedstawia przykład pliku Excel z surowymi danymi fluorescencyjnymi wygenerowanymi dla testu szoku cieplnego. Użyj pozycji studzienki na płytce 384-dołkowej, aby oznaczyć szczepy robaków i bakterii.
2. Przed analizą Matlab sprawdź wizualnie dane w programie Excel, wykreślając intensywność fluorescencji w czasie dla reprezentatywnej studni. W zależności od używanego czytnika płytek, dane mogą być zaszumione, ale powinny wyświetlać wyraźny szczyt. Nowy rok:
   1. Określ wartość fluorescencji, poniżej której pik nie różniłby się istotnie od szumu (ustawienie takiego progu w LFASS przyspieszy analizę poprzez wykluczenie pustych studzienek).
   2. Zwróć uwagę na najwcześniejszy punkt czasowy, w którym fluktuacje fluorescencji słabną przed wzrostem (zwierzęta mogą energicznie młócić się przez okres do 30 minut, co prowadzi do szybkich wahań odczytów niebieskiej fluorescencji).
      UWAGA: Dopasowanie szczytowe można poprawić, wykluczając te wczesne punkty czasowe z okna dopasowania krzywej.
   3. Zwróć uwagę na punkty czasowe, między którymi spodziewane są minimalne i maksymalne wartości fluorescencji (spójrz na kilka studzienek, aby zidentyfikować te zakresy), ponieważ będą one używane do dopasowania krzywej.
   4. Sprawdź, czy amplitudy pików fluorescencji różnią się znacząco między studzienkami, znormalizuj dane przed dalszą analizą, korzystając z następującego wzoru:
      Studnia fluorescencji znormalizowanej_n (t) = (Studnia fluorescencji_n [t] - studzienka minimalnej fluorescencji [Dt]) / (studzienka maksymalna fluorescencji [Dt] - studzienka minimalnej fluorescencji [Dt])
      gdzie "n" to aktualna liczba studzienki, "t" to punkt czasowy, a "Dt" to seria punktów czasowych dla testu.

8. Przetwarzanie danych LFASS

UWAGA: Szczegóły znajdują się na https://github.com/ABA80/LFASS oraz w materiałach uzupełniających Reference³⁰.

1. W folderze LFASS należy utworzyć dwa podfoldery, jeden dla danych do analizy, a drugi dla wyników, na przykład "moje dane" i "wyniki".
2. Po sprawdzeniu danych skopiuj plik danych testu Excel do podfolderu LFASS "moje dane".
3. Uruchom program MATLAB, przejdź do folderu LFASS, wpisz i uruchom fitfolder w oknie poleceń (plik uzupełniający 3). Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
4. Po wpisaniu w "fitfolder" system prosi o podanie nazwy folderu, w którym znajduje się plik excel, na przykład 'moje dane'. Wpisz nazwę folderu danych (w tym przykładzie "moje dane").
5. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, podając różne żądane parametry.
   1. Wprowadź "2" dla odstępu czasu między kolejnymi pomiarami w bieżącym protokole (określenie, że pozwala to na wyrażenie wyników w minutach, a nie w jednostkach punktu czasu).
      UWAGA: Przedział czasowy może być modyfikowany w celu częstszego lub rzadszego wykonywania pomiarów fluorescencji (w celu zmniejszenia lub zwiększenia rozdzielczości czasowej), a także w zależności od możliwości czytnika płytek (tj. może być konieczne wydłużenie przedziału czasu w przypadku czytników płytek, które nie są w stanie wykonywać wystarczająco szybkich pomiarów). Należy upewnić się, że przedział czasu eksperymentu jest zawsze dopasowany do procedury LFASS.
   2. Przypisz górny próg tolerancji, wpisując "0,95" (można go zmienić w razie potrzeby, aby poprawić dopasowanie), a dolny próg tolerancji, wpisując "0,05" (można go zmienić w razie potrzeby, aby poprawić dopasowanie), aby ograniczyć dopasowanie esicy.
      UWAGA: Inne parametry czasowe są oparte na notatkach użytkownika z inspekcji danych (krok 7.2.).
6. Wybierz, czy krzywe dopasowane i wygładzone mają być wyświetlane, czy nie, wpisując "y" dla TAK lub "n" dla NIE, gdy zostaniesz o to poproszony. Aby wizualnie sprawdzić zbieżne pasowania, wybierz były.
   UWAGA: Ten ostatni jest przydatny do wizualizacji wszystkich wygładzonych danych, ale zwykle nie jest wybierany, ponieważ generuje zbyt wiele wyskakujących wykresów. Następnie Matlab wykona procedurę LFASS, która może zająć 1-10 minut, jeśli wiele plików Excela jest przetwarzanych za jednym razem. Wyskakujące okienka z krzywymi pojawią się zgodnie z wyborem w kroku 8.6. Plik uzupełniający 4A przedstawia przykład dopasowanej krzywej.
7. Wybierz, czy chcesz (1) analizować krzywe zidentyfikowane jako szum, czy (2) ponownie dopasować źle dopasowane krzywe za pomocą opcji [t/n]. Wpisz y, aby zatwierdzić i n, aby odrzucić.
   UWAGA: Zaleca się zatwierdzenie ponownego montażu, zwłaszcza jeśli występuje wiele źle dopasowanych lub niedopasowanych krzywych. Umożliwi to użytkownikowi podanie dostosowanych parametrów dopasowania krzywej dla każdej krzywej w postaci, w jakiej pojawiają się one na ekranie i zapytanie tylko o wcześniejsze i późniejsze granice dopasowania esicy. Można próbować tyle razy, ile jest to wymagane.
8. Po przeanalizowaniu danych zamknij Matlab i otwórz folder LFASS.
9. Kliknij podfolder LFASS Moje wyniki, ponieważ pliki wyników są automatycznie zapisywane w folderze Wyniki jako .txt.
   UWAGA: Matlab generuje trzy pliki .txt: "Batch-fitted.txt", "Batch and noise-fitted.txt" oraz "Refitted.txt". Dwa pierwsze są zapisywane jako środek ostrożności w przypadku awarii komputera lub błędu użytkownika podczas ponownego montażu. Plikiem zawierającym najdokładniejszą kompletną analizę jest "Refitted.txt".
10. Otwórz plik Refitted.txt za pomocą programu Microsoft Excel i zapisz jako .xls do dalszego przetwarzania. Plik uzupełniający 4B pokazuje przykład takiego pliku wynikowego.
    UWAGA: Dla każdego dołka (zorganizowanego w wiersze) w kolumnach podano trzy wartości, które podają szacunki mediany czasu śmierci populacji robaków: "Surowy": informuje o czasie przecinającym się w połowie maksimum piku danych eksperymentalnych; »Partia dopasowana«: podaje czas przecięcia w połowie maksimum krzywej dopasowanej do partii; »Zamontowany«: informuje o czasie do przecięcia w połowie maksimum ponownie zamontowanej krzywej.
11. Zapisz plik w .xls formacie jako kopię w bezpiecznym miejscu. Niewykonanie tej czynności grozi nadpisaniem plików podczas następnego uruchomienia procedury LFASS.
    UWAGA: Wyniki mogą być następnie dalej przetwarzane w celu sporządzenia wykresu lub analizy statystycznej.

Results

Testy LFASS zapewniają solidne, wysokoprzepustowe i szybkie badanie przesiewowe wielu warunków testowych jednocześnie, takich jak badanie przesiewowe wielu parametrów genetycznych i mikrobioty, które przyczyniają się do odporności na stres i starzenia. Wystarczy 2-3 tygodnie, aby eksperyment uzyskał obszerny zestaw danych dotyczących wielu warunków testowych. L4 + 36 h dorosłe populacje robaków typu dzikiego były narażone na stres termiczny w temperaturze 42 °C i 7% stres oksydacyjny wywołany t-BHP po 36-godzinn...

Discussion

C. elegans oferuje wiele zalet w zakresie szybkiego badania przesiewowego wielu parametrów eksperymentalnych jednocześnie, ze względu na niewielkie rozmiary, przezroczystość, szybki rozwój, krótką żywotność, nieopłacalność i łatwość obsługi. Jego znacznie prostszy genom, plan ciała, układ nerwowy, jelita i mikrobiom, a jednocześnie wystarczająco złożony i podobny do ludzkiego, sprawia, że jest to potężny model przedkliniczny, w którym można uzyskać mechanistyczny wgląd podczas testowania skuteczności bioaktywnej...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytki o średnicy 10 cm (bez wentylacji)	Fisher Scientific 10720052		Wentylacja nie jest konieczna w przypadku kultur bakteryjnych
Płytki o średnicy 15 cm (wentylowane)	Fisher Scientific	168381
384-dołkowe czarne, przezroczyste płytki z płaskim dnem	Corning	3712 lub 3762	Nie muszą być sterylne do szybkich testów naprężeń
Płytki o średnicy 6 cm (wentylowane)	Fisher Scientific	150288	W przypadku kultur robaków konieczne jest odpowietrzenie, aby uniknąć niedotlenienia
96-dołkowe przezroczyste płytki (Biolite)	Thermo	130188
Agar (< 4% popiołu)	Sigma-Aldrich	102218041	Dobrej jakości agar jest ważny dla integralności strukturalnej pożywki hodowlanej, aby uniknąć zakopywania się robaków
Agaroza	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Wirówka J-26 XP	Redlica
Wybielacz	Honeywell	425044
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5080
Wirówka 5415 R	Eppendorf
Wirówka 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB bulion	Invitrogen	12795084
Końcówki LoBind	VWR	732-1488	Lo-bind zmniejszają straty robaków podczas przenoszenia
Probówki LoBind	Eppendorf	22431081
Siarczan magnezu	Fisher Scientific	M/1100/53
Czytnik płytek - nieskończony M nano +	Tecan		Konfiguracja monochromatora umożliwia strojenie fluorescencji, ale można zastosować odpowiednie konfiguracje oparte na filtrach
Czytnik płytek - Spark	Tecan
Fosforan potasu jednozasadowy	Honeywell	P0662
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Zestaw mikroskopu stereoskopowego z podstawą transiluminacyjną	Leica	MZ6 lub M80	Konieczne jest powiększenie od 0,6-0,8x do 40-60x, podobnie jak dobrej jakości podstawa transiluminacyjna z odkształcalnym, tytuowalnym lub przesuwanym lustrem do regulacji kontrastu
t-BHP (tert-nadtlenek butylu)	Sigma-Aldrich	458139
Przezroczyste uszczelki samoprzylepne Nunc	Fisher Scientific	101706871	Ważne jest, aby był przezroczysty i tolerował temperatury występujące w testach.
Tryptofan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	BP1422