Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63870

⸱

12 lipca 2022

 , 
1Department of Clinical Neurosciences, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, 2Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Streszczenie

Mitochondrialne (mt)DNA ssaków to mała, okrągła, dwuniciowa, wewnątrzmitochondrialna cząsteczka DNA, kodująca 13 podjednostek łańcucha transportu elektronów. W przeciwieństwie do diploidalnego genomu jądrowego, większość komórek zawiera znacznie więcej kopii mtDNA, od mniej niż 100 do ponad 200 000 kopii w zależności od typu komórki. Liczba kopii mtDNA jest coraz częściej wykorzystywana jako biomarker wielu stanów zwyrodnieniowych i chorób związanych z wiekiem, a zatem dokładny pomiar liczby kopii mtDNA staje się kluczowym narzędziem zarówno w badaniach, jak i diagnostyce. Mutacje w mtDNA, często występujące jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) lub delecje, mogą występować we wszystkich kopiach mtDNA w komórce (tzw. homoplazmia) lub jako mieszanina zmutowanych kopii mtDNA i WT (określanych jako heteroplazmia). Heteroplazmatyczne mutacje mtDNA są główną przyczyną klinicznej patologii mitochondriów, zarówno w rzadkich chorobach, jak i w rosnącej liczbie powszechnych chorób o późnym początku, takich jak choroba Parkinsona. Określenie poziomu heteroplazmii obecnej w komórkach jest kluczowym krokiem w diagnostyce rzadkich chorób mitochondrialnych oraz w badaniach mających na celu zrozumienie powszechnych zaburzeń o późnym początku, w których mitochondria mogą odgrywać rolę. Liczba kopii MtDNA i heteroplazmia są tradycyjnie mierzone za pomocą ilościowych testów opartych na (q)PCR lub głębokiego sekwencjonowania. Jednak niedawne wprowadzenie technologii ddPCR zapewniło alternatywną metodę pomiaru obu parametrów. Oferuje kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, w tym możliwość pomiaru bezwzględnej liczby kopii mtDNA i wystarczającą czułość, aby dokonywać dokładnych pomiarów z pojedynczych komórek nawet przy niskiej liczbie kopii. Przedstawiono szczegółowy protokół opisujący pomiar liczby kopii mtDNA w pojedynczych komórkach za pomocą ddPCR, zwany odtąd PCR z generacją kropelkową, z możliwością jednoczesnego pomiaru heteroplazmii w komórkach z delecjami mtDNA. Omówiono również możliwość rozszerzenia tej metody o pomiar heteroplazmii w komórkach z SNP mtDNA.

Wprowadzenie

Mitochondrialne (mt)DNA ssaków to mały (ok. 16,5 Kb), kolisty genom DNA znajdujący się w macierzy mitochondrialnej, który koduje 37 genów, w tym dwa rRNA, 22 tRNA i 13 genów kodujących białka1. W przeciwieństwie do genomu jądrowego, który zawiera jedną (haploidalną) lub dwie (diploidalne) kopie każdego genu na komórkę, mtDNA jest obecne w wielu kopiach w mitochondriach każdej komórki, od dziesiątek kopii (np. dojrzałych spermatocytów) do setek tysięcy kopii (np. oocytów)2,3. Konsekwencją tej wielokopijnej natury jest to, że mutacje w genomie mtDNA, które mogą istnieć jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP), delecje lub duplikacje, mogą być obecne na różnych poziomach w każdej komórce, stanowiąc od 0% do 100% całkowitej populacji mtDNA komórki. Istnienie dzikich i zmutowanych genomów mtDNA w tej samej komórce określa się mianem heteroplazmii, a patogenne heteroplazmatyczne mutacje mtDNA są główną przyczyną chorób mitochondrialnych, z kilkoma powszechnymi zespołami neurologicznymi związanymi z leżącymi u podstaw heteroplazmatycznymi mutacjami mtDNA4.

Dwa kluczowe parametry, które wpływają na prawdopodobieństwo wystąpienia heteroplazmatycznej mutacji mtDNA powodującej chorobę kliniczną, to poziom heteroplazmii i liczba kopii mtDNA. Wiele mutacji heteroplazmatycznych wykazuje efekt progowy, przy czym fenotypy biochemiczne i kliniczne stają się widoczne dopiero powyżej pewnego poziomu heteroplazmii, zwykle około 80%5, a następnie pogarszają się wraz z dalszym wzrostem heteroplazmii4. Jednak ważne jest również, aby wziąć pod uwagę liczbę kopii mtDNA obecnych w komórce, ponieważ wpłynie to na liczbę genomów mtDNA typu dzikiego (tj. "zdrowych"), które są obecne na danym poziomie heteroplazmii. Badania na pacjentach z chorobami mitochondrialnymi podkreśliły znaczenie tej interakcji między heteroplazmią a liczbą kopii5,6, a Filograna i wsp. niedawno zgłosili wzrost liczby kopii mtDNA łagodzący objawy pomimo niezmienionej heteroplazmii w mysim modelu choroby mitochondrialnej7.

Chociaż wiele zostało zrobione w ostatnich latach, aby poprawić zrozumienie patogenezy i przenoszenia chorób spowodowanych przez heteroplazmię mtDNA, większość tych prac została przeprowadzona na poziomie tkanek, a nie komórek, porównując średnie poziomy heteroplazmii tkanek i pomiary liczby kopii uzyskane z masowych biopsji tkanek i próbek krwi. Niektóre dobrze znane techniki, takie jak mikrodysekcja wychwytu laserowego, pozwalają na takie pomiary na poziomie komórkowym8,9; jednak niedawna eksplozja wysokoprzepustowych metod analizy pojedynczych komórek, czyli tak zwanej "omiki pojedynczej komórki"10, stworzyła zapotrzebowanie na metody, które mogą dokładnie mierzyć te kluczowe parametry mtDNA na poziomie pojedynczej komórki.

Metoda PCR generowania kropelek wykorzystuje najnowsze osiągnięcia w technologii mikroprzepływowej, aby ulepszyć istniejące metody ilościowego oznaczania nieznanych stężeń DNA poprzez amplifikację PCR specyficznych amplikonów docelowych w próbce DNA11. W przeciwieństwie do qPCR, gdzie próbka DNA jest amplifikowana w pojedynczej reakcji, przy czym względna szybkość akumulacji produktu PCR działa jako odczyt, ta metoda dzieli początkową próbkę na tysiące pojedynczych kropel, dzieląc w ten sposób cząsteczki DNA próbki na przestrzennie oddzielne reakcje12. Następująca po sobie reakcja PCR przebiega w każdej pojedynczej kropelce, przy czym produkt PCR gromadzi się tylko w kropelkach zawierających docelowe DNA. Wynikiem tej reakcji jest cyfrowy sygnał wyjściowy w postaci puli kropel, które albo zawierają kopię docelowego DNA i amplifikowanego produktu PCR, albo nie zawierają docelowego DNA. Za pomocą fluorescencyjnych sond DNA lub dwuniciowego barwnika wiążącego DNA (ds)DNA, kropelki zawierające amplifikowany produkt można policzyć, a stosunek kropel "dodatnich" do "ujemnych" można wykorzystać do obliczenia bezwzględnej liczby kopii DNA, które były obecne w próbce początkowej. Ten bezwzględny pomiar, w przeciwieństwie do względnego pomiaru uzyskanego z reakcji qPCR, jest kluczowym czynnikiem, który pozwala na zastosowanie tej metodologii do dokładnego pomiaru liczby kopii mtDNA i heteroplazmii w pojedynczych komórkach11, a kilka ostatnich badań wykorzystało już w tym celu technologię PCR do generowania kropel13,14. W artykule przedstawiono metodę pomiaru liczby kopii mtDNA i heteroplazmii delecji w pojedynczych komórkach zarówno z tkanki ludzkiej, jak i mysjej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Dobrostanu Zwierząt (AWERB) Uniwersytetu w Cambridge.

UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania próbek przed generowaniem kropel muszą być przeprowadzane w czystym obszarze roboczym przed-PCR, najlepiej w komorze sterylizowanej promieniami UV, jeśli jest to możliwe. Opisany tutaj protokół wykorzystuje specjalistyczny sprzęt do PCR z generowaniem kropel (patrz Tabela materiałów); choć ogólna metoda powinna być możliwa do zastosowania w innych systemach, zaleca się zapoznanie z wytycznymi producenta dotyczącymi stężeń starterów/sond, warunków cyklowania PCR itp., ponieważ mogą one różnić się od opisanych tutaj. Linie komórkowe/komórki pierwotne użyte w tym badaniu były następujące: ludzkie komórki HeLa (pozyskiwane komercyjnie), ludzkie komórki HEK 293T (pozyskiwane komercyjnie), pierwotne ludzkie fibroblasty skóry (pozyskane z Newcastle Biobank), ludzkie cybrydy (WT & delecja ΔH2.115, pozyskane od C. Moraes, University of Miami), zarodkowe fibroblasty mysie (unieśmiertelnione, z myszy C57Bl/6, pozyskane od J. Stewart, Newcastle University), mysie pierwotne komórki rozrodcze (pozyskane z embrionów myszy C57Bl/6) oraz mysie oocyty w stadium MII (pozyskane od dorosłych samic myszy C57Bl/6). Wszystkie hodowane komórki utrzymywano w DMEM z wysoką zawartością glukozy (4,5g/L) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Pierwotne komórki mysie użyte w tym badaniu zostały wyizolowane z zwierząt utrzymywanych zgodnie z ustawą Animal (Scientific Procedures) Act 1986 na podstawie licencji projektu Home Office P6C97520A.

1. Projektowanie i synteza zestawów starterów i sond nakierowanych na sekwencje DNA budzące zainteresowanie

UWAGA: PCR z generowaniem kropel można również przeprowadzić, stosując barwnik wiążący się z dsDNA zamiast sond specyficznych dla amplikonu.

  1. Zaprojektuj sekwencje starterów i sond zgodnie z wytycznymi producenta systemu. Zwalidowane sekwencje starterów i sond odpowiednie do pomiaru liczby kopii mtDNA/heteroplazmii delecji w pojedynczych komórkach ludzkich16,17 oraz mysich18 przedstawiono w Tabeli 1. Przy wyborze alternatywnych sekwencji docelowych należy wziąć pod uwagę następujące kwestie.
    1. Zastosuj multipleksowanie dwóch zestawów starterów/sond w jednym badaniu PCR, upewniając się jednak, że oba testy wykorzystują jedną sondę znakowaną FAM i jedną sondę znakowaną HEX, aby amplikony docelowe mogły zostać rozróżnione przez czytnik kropelkowy. Niniejszy protokół opisuje badanie z użyciem podwójnej sondy. Przy starannym planowaniu eksperymentu liczbę multipleksowanych celów można zwiększyć do czterech, a alternatywne platformy pozwalają na osiągnięcie jeszcze wyższego stopnia multipleksowania.
    2. Podczas multipleksowania zestawów starterów/sond celujących w oddzielne sekwencje mtDNA, należy upewnić się, że amplikony generowane przez oba zestawy starterów nie nakładają się na siebie.
    3. Przy pomiarze heteroplazmii w próbkach zawierających delecje mtDNA, upewnij się, że jeden amplikon docelowy znajduje się w obrębie przewidywanego regionu delecji, a drugi poza tym regionem.
      UWAGA: Optymalne warunki cyklizacji PCR dla alternatywnych testów mogą różnić się od tych podanych w Kroku 5.1; szczegóły dotyczące optymalizacji badania znajdują się w sekcji Dyskusja.

2. Izolacja DNA z pojedynczych komórek

UWAGA: Metoda ta może być również stosowana dla niewielkich próbek zbiorczych obejmujących do 100 komórek.

  1. Pozyskać pojedyncze komórki za pomocą odpowiedniej metody, takiej jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)19 lub laserowa mikrodysekcja20, w jak najmniejszej objętości do odpowiedniego naczynia (np. płytki 96-dołkowej). Zastosowanie barwnika do oceny żywotności komórek przed lub w trakcie izolacji pojedynczych komórek zminimalizuje prawdopodobieństwo izolacji martwych komórek. Jeśli jest to pożądane, posortowane pojedyncze komórki należy przenieść bezpośrednio do buforu lizującego i przechowywać w temperaturze -80 °C (do 6 miesięcy) przed analizą.
  2. Poddać komórki lizie w małej objętości (<10 µL) odpowiedniego buforu lizującego (bufor użyty w niniejszym badaniu opisany jest w kroku 2.2.1.).
    UWAGA: Wszystkie dane uzyskane z komórek w tym badaniu pochodzą z lizatów pojedynczych komórek lub pul 20 komórek (wielkość prób określono w legendach do rycin). Na efektywne tworzenie emulsji olej/kropla podczas etapu generowania kropli w protokole PCR z generowaniem kropli może znacząco wpływać obecność detergentów w próbce; dlatego zaleca się zweryfikowanie kompatybilności wszystkich buforów do lizy komórek z generowaniem kropli przy zamierzonej stężeniu wejściowym przed przystąpieniem do analizy próbek eksperymentalnych oraz stosowanie najmniejszej praktycznej objętości buforu lizującego. Poniższy protokół lizy minimalizuje wpływ na wydajność generowania kropli.
    1. Przygotować bufor lizujący zawierający 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1% TWEEN-20 oraz 200 µg/mL Proteinase K.
    2. Do każdej próbki dodać 2,5 µL buforu lizującego, uszczelnić płytkę specjalną folią uszczelniającą, a następnie odwirować próbki z prędkością 1,000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C.
    3. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 30 min w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą ustawioną na 105 °C, aby zapobiec kondensacji cieczy na pokrywie płytki.
    4. Do każdej próbki dodać 7,5 µL wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcową objętość próbki 10 µL, ponownie uszczelnić płytkę, a następnie odwirować próbki z prędkością 1,000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C.
    5. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 80 °C przez 15 min (podgrzewana pokrywa ustawiona na 105 °C), aby dezaktywować Proteinase K.
    6. Odwirować próbki z prędkością 1,000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywać w lodzie.
  3. Przejść do kroku 3 poniżej.
    UWAGA: Lizaty komórkowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przed kontynuacją kroku 3; jednakże, w miarę możliwości należy stosować świeżo elowany DNA, aby wyeliminować ryzyko degradacji DNA w wyniku cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Przygotowanie próbek

UWAGA: Należy upewnić się, że na każdej płytce testowej znajdują się powtórzenia techniczne próbek oraz kontrole bez matrycy (NTC), aby zapewnić dokładność wyników. Zakres dynamiczny testu PCR z generowaniem kropel wynosi do 120 000 kopii amplikonu docelowego na reakcję. W przypadku lizatów pojedynczych komórek lub małych próbek zbiorczych rozcieńczenie prawdopodobnie nie będzie konieczne i mieszaninę lizatu można wprowadzić bezpośrednio do reakcji w celu pomiaru liczby kopii mtDNA (np. próbkę lizatu o objętości 10 µL można podzielić i przeprowadzić w trzech powtórzeniach, wprowadzając 3 µL bezpośrednio do każdego testu). Jednak zastosowanie nierozcieńczonego lizatu z komórek o bardzo wysokiej liczbie kopii mtDNA (np. oocytów) lub zawierających większą liczbę komórek (np. 50-100) może przekroczyć ten zakres dynamiczny. W takich przypadkach wymagane jest wstępne rozcieńczenie seryjne w celu ustalenia odpowiedniego czynnika rozcieńczenia, który zapobiegnie nasyceniu testu dla danego typu komórek/liczby komórek (szczegóły znajdują się w sekcji Representative Results).

  1. Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, wymieszać w vortexie i krótko odwirować przed użyciem.
  2. Przygotować na lodzie mieszaninę master mix (bez DNA próbki) zgodnie z opisem w (Tabeli 2).
    UWAGA: Jeśli pomiar dotyczy tylko jednego amplikonu docelowego, należy dodać dodatkowe 2,55 µL wody wolnej od nukleaz na próbkę, aby uzyskać końcową objętość 22 µL. Przygotować wystarczającą ilość master mix dla liczby analizowanych próbek i NTC, a także ilość potrzebną do wypełnienia pustych dołków wymaganych na płytce PCR do generowania kropli (patrz następny krok).
  3. Krótko wymieszać przygotowany master mix w vortexie i nalać wymaganą objętość (22 µL minus objętość DNA wejściowego) do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR do generowania kropli. Próbki należy rozmieścić w pełnych kolumnach na płytce 96-dołkowej; wszelkie puste dołki w niepełnych kolumnach należy wypełnić master mixem i wykorzystać jako NTC.
  4. Dodać DNA wejściowe do każdego dołka z próbką oraz wodę wolną od nukleaz/bufor eluujący do dołków NTC, aby doprowadzić całkowitą objętość każdego z nich do 22 µL.
  5. Uszczelnić płytkę samoprzylepną folią uszczelniającą, umieścić na wytrząsarce przy 2 000 rpm przez 1 min, a następnie odwirować przy 1 000 x g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C.
  6. Umieścić płytkę na lodzie i przejść do Kroku 4.
    UWAGA: Przygotowane płytki można przechowywać na lodzie i chronić przed światłem przez krótki czas (np. 1-2 h) przed przystąpieniem do generowania kropli.

4. Generowanie kropel

UWAGA: Schemat pokładu urządzenia do generowania kropel, wspomniany w tej sekcji, znajduje się na Rysunku 1A.

  1. Włącz generator kropli.
  2. Upewnij się, że butelka z olejem do generowania kropli jest umieszczona w pozycji E platformy urządzenia. Jeśli pojawi się komunikat, postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby wymienić butelkę.
  3. Kliknij Configure Sample Plate na ekranie dotykowym. Zaznacz wszystkie kolumny na płytce z próbkami, które zawierają próbki lub próbki ślepe.
    UWAGA: Wprowadzenie nazwy płytki oraz szczegółów eksperymentu na tym etapie jest opcjonalne i nie jest wymagane do kontynuowania konfiguracji eksperymentu.
  4. Kliknij OK, aby zatwierdzić konfigurację płytki; na platformie urządzenia zapalą się pomarańczowe kontrolki wskazujące pozycje, w których należy umieścić materiały eksploatacyjne.
  5. Włóż wkłady generatora kropli do pozycji B na platformie urządzenia, aż wszystkie kontrolki zmienią kolor na zielony.
  6. Umieść pusty pojemnik na zużyte końcówki w pozycji C na platformie urządzenia.
  7. Zdejmij pokrywy z pudełek z końcówkami z filtrem i włóż je do pozycji D na platformie urządzenia, aż wszystkie kontrolki zmienią kolor na zielony.
  8. Zdejmij przylepną folię uszczelniającą z płytki z próbkami i umieść ją w pozycji F platformy urządzenia, aż kontrolka zmieni kolor na zielony.
  9. Umieść pustą 96-dołkową płytkę do zbierania kropli w bloku chłodzącym (wstępnie schłodzonym do -20 °C) i włóż ją do pozycji G platformy urządzenia, aż kontrolka zmieni kolor na zielony.
  10. Kliknij Start Droplet Generation na ekranie dotykowym urządzenia.
  11. Kliknij Start Run na ekranie dotykowym urządzenia. Pokrywa urządzenia zamknie się automatycznie. Po inicjalizacji na ekranie dotykowym wyświetli się czas pozostały do zakończenia generowania kropli.
  12. Po zakończeniu generowania kropli sprawdź wizualnie płytkę z zebranymi próbkami, aby potwierdzić obecność warstwy emulsji kropelkowej nad fazą olejową w każdym dołku (Rysunek 1B).
    UWAGA: Jeśli warstwa emulsji kropelkowej nie jest widoczna, nie kontynuuj eksperymentu i sprawdź, czy na poprzednich etapach protokołu nie wystąpiły błędy.
  13. Usuń zużyte materiały eksploatacyjne z platformy urządzenia i opróżnij pojemnik na zużyte końcówki.
  14. Włącz zgrzewarkę do płytek, ustaw temperaturę na 180 °C i czas zgrzewania na 5 s, a następnie odczekaj, aż urządzenie osiągnie temperaturę roboczą.
  15. Włóż płytkę z zebranymi próbkami do uchwytu zgrzewarki i nałóż na nią nową folię uszczelniającą czerwoną linią do góry. Należy uważać, aby nie dotknąć dolnej strony folii.
    UWAGA: Uchwyt do płytek powinien być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) i wkładany do szuflady zgrzewarki dopiero podczas nakładania folii, aby zapobiec przekazywaniu ciepła na płytkę z próbkami.
  16. Gdy zgrzewarka osiągnie temperaturę roboczą, naciśnij Eject na ekranie dotykowym urządzenia; szuflada otworzy się automatycznie.
  17. Wsuń uchwyt z płytką do szuflady zgrzewarki i naciśnij Seal. Szuflada zamknie się automatycznie, a następnie otworzy ponownie po zakończeniu zgrzewania.
  18. Umieść zgrzaną płytkę z powrotem w bloku chłodzącym, wyłącz zgrzewarkę i przejdź niezwłocznie do kroku 5.
    UWAGA: Na tym etapie krople są niestabilne, dlatego należy rozpocząć etap PCR w ciągu 1 h od zakończenia generowania kropli.

5. PCR

  1. Umieść zamkniętą płytkę do zbierania kropel w termocyklerze PCR wyposażonym w blok z 96 głębokimi dołkami i uruchom protokół cykli termicznych opisany w Tabeli 3.
    UWAGA: Ustaw temperaturę grzanej pokrywy na 105 °C, a objętość próbki na 40 µL. Kroki denaturacji oraz przyłączania/wydłużania muszą obejmować szybkość zmiany temperatury wynoszącą 2 °C/s, aby olej miał czas na wyrównanie temperatury do wartości docelowej.
  2. Przejdź do kroku 6.
    UWAGA: Po zakończeniu protokołu cykli termicznych krople stają się bardziej stabilne, a płytkę można przechowywać do 4 dni w temperaturze 4 °C przed przejściem do następnego kroku.

6. Odczyt kropel

  1. Włącz czytnik kropel i podłączony do niego komputer.
  2. Sprawdź poziom cieczy w butelkach z olejem i z odpadami czytnika kropel, a w razie potrzeby odpowiednio je uzupełnij lub opróżnij.
  3. Włóż płytkę zawierającą próbki po PCR do uchwytu płytki czytnika kropel, nałóż pokrywę na górę uchwytu i zabezpiecz ją czarnymi klipsami blokującymi. Nie zdejmuj folijnej pokrywki z płytki z próbkami.
  4. Naciśnij przycisk Open/Close na pokrywie czytnika kropel, aby ją otworzyć.
  5. Wsuń uchwyt płytki czytnika kropel z płytką z próbkami do komory czytnika i stabilnie umieść go na podstawie magnetycznej.
  6. Naciśnij przycisk Open/Close na pokrywie czytnika kropel, aby ją zamknąć.
  7. Otwórz interfejs oprogramowania analitycznego, wybierz kartę Add Plate i przygotuj nową płytkę z próbkami w następujący sposób:
    1. Kliknij Add Plate, a następnie Configure Plate.
    2. W karcie Plate Information wprowadź Plate Name, wybierz Supermix for Probes (no dUTP) z menu rozwijanego Supermix i wprowadź nazwę pliku w polu Save Data File As.
    3. W karcie Well Selection zaznacz do analizy odpowiednie studzienki i kliknij Include Selected Wells.
      UWAGA: Kroki 6.7.4 – 6.7.7 są opcjonalne.
    4. W karcie Well Information wybierz studzienki do opisania.
      UWAGA: Przykład interfejsu karty Well Information znajduje się na Rysunku 1D.
    5. Wybierz Direct Quantification (DQ) z menu rozwijanego Experiment Type, wypełnij pola Sample Description, Sample Type oraz Target Name i w razie potrzeby dodaj Well Notes i/lub Plate Notes.
    6. Kliknij Apply. Informacje z pól zostaną przypisane do wybranych studzienek.
    7. Powtarzaj kroki 6.7.4–6.7.6, aż wszystkie studzienki z próbkami zostaną opisane.
  8. Po zakończeniu konfiguracji płytki kliknij Start Run.
  9. Po zakończeniu analizy wyrzuć pustą płytkę z próbkami i w razie potrzeby opróżnij butelkę z odpadami czytnika kropel.
  10. Przejdź do kroku 7.

7. Analiza wyników

UWAGA: Czytnik kropelek mierzy intensywność fluorescencji w kanałach FAM i HEX dla każdej kropelki w próbce. W przypadku poprawnego oznaczenia kropelki dzielą się na dwie kategorie dla każdej sondy: negatywne (co oznacza, że cel nie był obecny w kropelce) lub pozytywne (co oznacza, że cel był obecny w kropelce). Przed analizą próbek należy upewnić się, że każda studzienka zawiera >10 000 kropelek i wykazuje dwie wyraźnie oddzielone populacje kropelek o niskiej fluorescencji (negatywne) i wysokiej fluorescencji (pozytywne) w każdym kanale (Rysunek 2A).

  1. Wybierz zakładkę Data Analysis i otwórz plik do analizy z menu My Datafiles.
  2. Kliknij zakładkę 1D Amplitude w przypadku eksperymentów jednobarwnych lub zakładkę 2D Amplitude w przypadku eksperymentów dwubarwnych.
  3. Zastosuj próg fluorescencji dla każdego kanału, aby odróżnić krople pozytywne od negatywnych. Oprogramowanie analityczne spróbuje automatycznie ustawić próg dla każdej próbki i każdego kanału, jednak jeśli proces ten zawiedzie lub wynik wyda się niedokładny, ustaw próg ręcznie w następujący sposób:
    1. Wybierz studzienki wymagające ustawienia progu.
    2. Ręcznie ustaw próg w pustej przestrzeni między populacjami pozytywną a negatywną na wykresie amplitudy, korzystając z narzędzia Threshold Line Mode. Podczas ręcznego ustawiania progów w widoku 2D upewnij się, że celownik jest umieszczony tak, aby cztery populacje kropli (podwójnie negatywne, pojedynczo pozytywne FAM, pojedynczo pozytywne HEX oraz podwójnie pozytywne) były wyraźnie odseparowane.
      UWAGA: Ustawianie progu można przeprowadzać dla każdej studzienki z osobna lub zastosować do wielu studzienek jednocześnie.
  4. Po ustawieniu progów dla wszystkich próbek wyeksportuj wyniki do pliku .csv w celu dalszej analizy, klikając zakładkę Data Table, wybierając Import/Export, a następnie Export Visible Data to CSV. Wprowadź odpowiednią nazwę pliku i kliknij Save.
  5. Oblicz liczbę kopii mtDNA w próbce początkowej zgodnie z poniższym wzorem:
    Liczba kopii = stężenie docelowe mtDNA × 22 × 1/frakcja całkowitego wkładu lizatu
    UWAGA: W przypadku użycia dwóch sond mitochondrialnych stężenia obu celów są uśredniane przed wykonaniem obliczeń. Dla próbek zawierających więcej niż jedną komórkę liczbę kopii na komórkę oblicza się poprzez podzielenie wyniku przez liczbę komórek w próbce. Ważne jest, aby użyć wartości „Concentration” (tj. liczby kopii na mikrolitr) pomnożonej przez początkową objętość próbki 22 µL, a nie wartości „Copies per 20 µL” obliczonej w pliku .csv, ponieważ przy obliczaniu bezwzględnej liczby kopii w próbce początkowej należy uwzględnić kopie mtDNA pozostałe w 2 µL nadmiaru wymaganego przez generator kropel.
  6. W przypadku komórek z heteroplazmicznymi delecjami mtDNA oblicz liczbę kopii, korzystając z wyników dla celu mtDNA poza obszarem delecji (tj. celu obecnego w cząsteczkach mtDNA z delecją oraz w cząsteczkach WT). Heteroplazmię delecji oblicza się, wykorzystując stężenia celu wewnątrz obszaru delecji oraz celu poza obszarem delecji w następujący sposób:
    Wzór na procentowy udział cząsteczek mtDNA z delecją; równanie stosunku stężeń w analizie genetycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po wygenerowaniu kropelek w każdej studience widoczna jest wyraźna warstwa nieprzezroczystych kropelek unoszących się na powierzchni fazy olejowej (Ryc. 1B). Formowanie kropelek może być negatywnie wpływać przez obecność detergentów w lizacie wejściowym podczas przeprowadzania eksperymentów na pojedynczych komórkach. Stosując protokół lizy opisany w sekcji 2.1.2., rutynowo uzyskuje się wydajność kropelek przekraczającą zalecany poziom 10 000, mimo obecności niewielkiej ilości pozostałego TWE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do szerokiego zakresu typów i gatunków komórek, oprócz tych omówionych powyżej, chociaż staranna optymalizacja nowych projektów testów będzie kluczowa, aby zapewnić utrzymanie dokładności i powtarzalności metody przy odchodzeniu od wcześniej zwalidowanych kombinacji starter/sonda. Podczas pracy z pojedynczymi komórkami ważne jest, aby upewnić się, że pobieranie próbek odbywa się tak dokładnie, jak to możliwe (np. przy użyciu rygorystycznych parametrów pojedynczych komórek podczas so...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękuję dr L Bozhilovej za porady dotyczące analizy statystycznej danych PCR dotyczących generowania kropel. Dziękuję dr H Zhang za dostarczenie oocytów używanych do generowania danych w Rysunek 3C; i Rysunek 4B. Praca ta została przeprowadzona przez SPB w Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9) Uniwersytetu Cambridge i sfinansowana przez Wellcome Trust Principal Research Fellowship organizowane przez PFC (212219/Z/18/Z).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50% roztwór Tween-20Novex3005
Zautomatyzowany olej generujący kropelki Bio Rad1864110Komercyjny preparat olejowy stosowany do wytwarzania emulsji olejowo-kropelkowej (stosowany w kroku 4.1 protokołu)
Maszyna do PCR C1000 z blokiem głębokiej studniBio Rad1851197termocykler PCR wyposażony w blok grzewczy do głębokiej studni, używany do lizy komórek (krok protokołu 2.1.2.) i cyklu PCR (krok protokołu 5)
Blok chłodzący płytkę zbiorcząBio Rad12002819Blok chłodzący, który utrzymuje próbki w stanie schładzonym podczas generowania kropel (używany w kroku 4.3 protokołu)
płytki 96-dołkowe ddPCR Bio Rad1200192596-dołkowe końcówki do pipet przeznaczone do stosowania w generatorze kropel QX200 AutoDG, służące do przygotowania próbek (krok 3.4 protokołu) i pobierania kropelek (krok protokołu 4.3)
olej do czytnika kropelek ddPCR Bio Rad1863004Komercyjna formulacja olejowa używana przez czytnik kropelek (używany w kroku 6.1 protokołu)
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Bio Rad1863023Komercyjny supermiks do stosowania w eksperymentach ddPCR z wykorzystaniem sond (używany w Kroku 3.3 protokołu)
Wkłady z automatycznym generatorem kropel DG32 Bio Rad1864108Wkłady mikroprzepływowe stosowane w generatorze kropelkowym QX200 AutoDG do generowania emulsji olejowo-kropelkowej (stosowane w kroku 4.3 protokołu 4.3)
Surowica bydlęca płoduGibco10270-106Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca
Pokrywy płytek foliowych Bio Rad1814040Foliowe osłony płytek używane do uszczelniania płytek zbierających kropelki po wytworzeniu kropel (stosowane w kroku 4.6 protokołu)
Komórki HEK 293TTakara632180Komercyjny subklon transformowanej ludzkiej embrionalnej linii komórek nerkowych, HEK 293, wyrażający antygen SV40 Large-T
Komórki HeLaECACC93021013Ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy
Wysoki poziom glukozy DMEMGibco133453644,5 g/l D-glukozy, z L-glutaminą i pirogronianem sodu
Ludzkie cybrydyUniversity of Miami
Mysie fibroblasty embrionalne Uniwersytet w NewcastleUwiecznione na myszach
Woda bez nukleazUszczelkiAM9937
PierceSP-0027Przezroczyste uszczelki samoprzylepne, używane tylko do wytwarzania kropli przed kroplami (w kroku 4.6 należy użyć uszczelki foliowej)
Kosze na śmieci z końcówką do pipetBio Rad1864125Jednorazowy pojemnik na śmieci służący do zbierania wyrzuconych końcówek w generatorze kropel QX200 AutoDG (użyty w kroku 4.3 protokołu
)Końcówki do pipet do systemu AutoDG Bio Rad1864120Filtrowane końcówki do pipet przeznaczone do użytku w generatorze kropel QX200 AutoDG (używanym w kroku 4.3 protokołu)
Pierwotne ludzkie komórki fibroblastów skórnychNewcastle Biobank
Startery/sondyIDTN/ADokładne sekwencje startera/sondy będą zależne od testu. Startery i sondy użyte w tym badaniu podano w tabeli 1
proteinazy K 20 mg/mlZgrzewarkaAM2546
PX1Rad1814000Nakłada uszczelki foliowe na płytki próbek ddPCR po wytworzeniu kropelki (używane w kroku protokołu 4.6)
Oprogramowanie QX ManagerBio Rad12012172Oprogramowanie do konfiguracji i analizy czytnika kropel (używane w krokach protokołu 6 i 7)
Generator kropel QX200 AutoDGBio Rad1864101Automatyczny generator kropel mikroprzepływowych (używany w Kroku 4 Protokołu)
Czytnik kropel QX200Bio Rad1864003Czytnik kropel (używany w Kroku 6 Protokołu)
Wstępnie ustawione kryształy Trizma pH 8,3SigmaT8943-100G
C57Bl/6 płytkowe PCR Ambion Roztwór do płytek PCR Ambion Bio

Bibliografia

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
  3. D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
  6. Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146(2013).
  7. Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
  8. Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
  9. Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
  10. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  11. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).
  12. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  13. Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
  14. O'Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
  15. Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
  16. Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
  17. Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
  18. Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).
  19. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).
  20. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
  21. Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
  22. Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186(2016).
  23. Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
  24. Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
  25. Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
  26. Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
  27. Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
  28. Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
  29. Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).
  30. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
  31. Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
  32. Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza pojedynczych kom rekcyfrowy PCR kropelkowyheteroplazmia mitochondrialnagenerowanie kropliuszczelnianie p ytek PCRanaliza progulizy kom rekheteroplazmia delecyjna
Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.