Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondrialne (mt)DNA ssaków to mała, okrągła, dwuniciowa, wewnątrzmitochondrialna cząsteczka DNA, kodująca 13 podjednostek łańcucha transportu elektronów. W przeciwieństwie do diploidalnego genomu jądrowego, większość komórek zawiera znacznie więcej kopii mtDNA, od mniej niż 100 do ponad 200 000 kopii w zależności od typu komórki. Liczba kopii mtDNA jest coraz częściej wykorzystywana jako biomarker wielu stanów zwyrodnieniowych i chorób związanych z wiekiem, a zatem dokładny pomiar liczby kopii mtDNA staje się kluczowym narzędziem zarówno w badaniach, jak i diagnostyce. Mutacje w mtDNA, często występujące jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) lub delecje, mogą występować we wszystkich kopiach mtDNA w komórce (tzw. homoplazmia) lub jako mieszanina zmutowanych kopii mtDNA i WT (określanych jako heteroplazmia). Heteroplazmatyczne mutacje mtDNA są główną przyczyną klinicznej patologii mitochondriów, zarówno w rzadkich chorobach, jak i w rosnącej liczbie powszechnych chorób o późnym początku, takich jak choroba Parkinsona. Określenie poziomu heteroplazmii obecnej w komórkach jest kluczowym krokiem w diagnostyce rzadkich chorób mitochondrialnych oraz w badaniach mających na celu zrozumienie powszechnych zaburzeń o późnym początku, w których mitochondria mogą odgrywać rolę. Liczba kopii MtDNA i heteroplazmia są tradycyjnie mierzone za pomocą ilościowych testów opartych na (q)PCR lub głębokiego sekwencjonowania. Jednak niedawne wprowadzenie technologii ddPCR zapewniło alternatywną metodę pomiaru obu parametrów. Oferuje kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, w tym możliwość pomiaru bezwzględnej liczby kopii mtDNA i wystarczającą czułość, aby dokonywać dokładnych pomiarów z pojedynczych komórek nawet przy niskiej liczbie kopii. Przedstawiono szczegółowy protokół opisujący pomiar liczby kopii mtDNA w pojedynczych komórkach za pomocą ddPCR, zwany odtąd PCR z generacją kropelkową, z możliwością jednoczesnego pomiaru heteroplazmii w komórkach z delecjami mtDNA. Omówiono również możliwość rozszerzenia tej metody o pomiar heteroplazmii w komórkach z SNP mtDNA.
Wprowadzenie
Mitochondrialne (mt)DNA ssaków to mały (ok. 16,5 Kb), kolisty genom DNA znajdujący się w macierzy mitochondrialnej, który koduje 37 genów, w tym dwa rRNA, 22 tRNA i 13 genów kodujących białka1. W przeciwieństwie do genomu jądrowego, który zawiera jedną (haploidalną) lub dwie (diploidalne) kopie każdego genu na komórkę, mtDNA jest obecne w wielu kopiach w mitochondriach każdej komórki, od dziesiątek kopii (np. dojrzałych spermatocytów) do setek tysięcy kopii (np. oocytów)2,3. Konsekwencją tej wielokopijnej natury jest to, że mutacje w genomie mtDNA, które mogą istnieć jako polimorfizmy p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Dobrostanu Zwierząt (AWERB) Uniwersytetu w Cambridge.
UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania próbek przed generowaniem kropel muszą być przeprowadzane w czystym obszarze roboczym przed-PCR, najlepiej w komorze sterylizowanej promieniami UV, jeśli jest to możliwe. Opisany tutaj protokół wykorzystuje specjalistyczny sprzęt do PCR z generowaniem kropel (patrz Tabela materiałów); choć ogólna metoda powinna być możliwa do zastosowania w innych systemach, zaleca się zapoznanie z wytycznymi producenta dotyczącymi ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po wygenerowaniu kropelek w każdej studience widoczna jest wyraźna warstwa nieprzezroczystych kropelek unoszących się na powierzchni fazy olejowej (Ryc. 1B). Formowanie kropelek może być negatywnie wpływać przez obecność detergentów w lizacie wejściowym podczas przeprowadzania eksperymentów na pojedynczych komórkach. Stosując protokół lizy opisany w sekcji 2.1.2., rutynowo uzyskuje się wydajność kropelek przekraczającą zalecany poziom 10 000, mimo obecności niewielkiej ilości pozostałego TWE.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do szerokiego zakresu typów i gatunków komórek, oprócz tych omówionych powyżej, chociaż staranna optymalizacja nowych projektów testów będzie kluczowa, aby zapewnić utrzymanie dokładności i powtarzalności metody przy odchodzeniu od wcześniej zwalidowanych kombinacji starter/sonda. Podczas pracy z pojedynczymi komórkami ważne jest, aby upewnić się, że pobieranie próbek odbywa się tak dokładnie, jak to możliwe (np. przy użyciu rygorystycznych parametrów pojedynczych komórek podczas so.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękuję dr L Bozhilovej za porady dotyczące analizy statystycznej danych PCR dotyczących generowania kropel. Dziękuję dr H Zhang za dostarczenie oocytów używanych do generowania danych w Rysunek 3C; i Rysunek 4B. Praca ta została przeprowadzona przez SPB w Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9) Uniwersytetu Cambridge i sfinansowana przez Wellcome Trust Principal Research Fellowship organizowane przez PFC (212219/Z/18/Z).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 50% roztwór Tween-20 | Novex | 3005 | |
| Zautomatyzowany olej generujący kropelki | Bio Rad | 1864110 | Komercyjny preparat olejowy stosowany do wytwarzania emulsji olejowo-kropelkowej (stosowany w kroku 4.1 protokołu) |
| Maszyna do PCR C1000 z blokiem głębokiej studni | Bio Rad | 1851197 | termocykler PCR wyposażony w blok grzewczy do głębokiej studni, używany do lizy komórek (krok protokołu 2.1.2.) i cyklu PCR (krok protokołu 5) |
| Blok chłodzący płytkę zbiorczą | Bio Rad | 12002819 | Blok chłodzący, który utrzymuje próbki w stanie schładzonym podczas generowania kropel (używany w kroku 4.3 protokołu) |
| płytki 96-dołkowe ddPCR | Bio Rad | 12001925 | 96-dołkowe końcówki do pipet przeznaczone do stosowania w generatorze kropel QX200 AutoDG, służące do przygotowania próbek (krok 3.4 protokołu) i pobierania kropelek (krok protokołu 4.3) |
| olej do czytnika kropelek ddPCR | Bio Rad | 1863004 | Komercyjna formulacja olejowa używana przez czytnik kropelek (używany w kroku 6.1 protokołu) |
| ddPCR Supermix do sond (bez dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Komercyjny supermiks do stosowania w eksperymentach ddPCR z wykorzystaniem sond (używany w Kroku 3.3 protokołu) |
| Wkłady z automatycznym generatorem kropel DG32 | Bio Rad | 1864108 | Wkłady mikroprzepływowe stosowane w generatorze kropelkowym QX200 AutoDG do generowania emulsji olejowo-kropelkowej (stosowane w kroku 4.3 protokołu 4.3) |
| Surowica bydlęca płodu | Gibco | 10270-106 | Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca |
| Pokrywy płytek foliowych | Bio Rad | 1814040 | Foliowe osłony płytek używane do uszczelniania płytek zbierających kropelki po wytworzeniu kropel (stosowane w kroku 4.6 protokołu) |
| Komórki HEK 293T | Takara | 632180 | Komercyjny subklon transformowanej ludzkiej embrionalnej linii komórek nerkowych, HEK 293, wyrażający antygen SV40 Large-T |
| Komórki HeLa | ECACC | 93021013 | Ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy |
| Wysoki poziom glukozy DMEM | Gibco | 13345364 | 4,5 g/l D-glukozy, z L-glutaminą i pirogronianem sodu |
| Ludzkie cybrydy | University of Miami | ||
| Mysie fibroblasty embrionalne | Uniwersytet w Newcastle | Uwiecznione na myszach | |
| Woda bez nukleaz | Uszczelki | AM9937 | |
| Pierce | SP-0027 | Przezroczyste uszczelki samoprzylepne, używane tylko do wytwarzania kropli przed kroplami (w kroku 4.6 należy użyć uszczelki foliowej) | |
| Kosze na śmieci z końcówką do pipet | Bio Rad | 1864125 | Jednorazowy pojemnik na śmieci służący do zbierania wyrzuconych końcówek w generatorze kropel QX200 AutoDG (użyty w kroku 4.3 protokołu |
| )Końcówki do pipet do systemu AutoDG | Bio Rad | 1864120 | Filtrowane końcówki do pipet przeznaczone do użytku w generatorze kropel QX200 AutoDG (używanym w kroku 4.3 protokołu) |
| Pierwotne ludzkie komórki fibroblastów skórnych | Newcastle Biobank | ||
| Startery/sondy | IDT | N/A | Dokładne sekwencje startera/sondy będą zależne od testu. Startery i sondy użyte w tym badaniu podano w tabeli 1 |
| proteinazy K 20 mg/ml | Zgrzewarka | AM2546 | |
| PX1 | Rad | 1814000 | Nakłada uszczelki foliowe na płytki próbek ddPCR po wytworzeniu kropelki (używane w kroku protokołu 4.6) |
| Oprogramowanie QX Manager | Bio Rad | 12012172 | Oprogramowanie do konfiguracji i analizy czytnika kropel (używane w krokach protokołu 6 i 7) |
| Generator kropel QX200 AutoDG | Bio Rad | 1864101 | Automatyczny generator kropel mikroprzepływowych (używany w Kroku 4 Protokołu) |
| Czytnik kropel QX200 | Bio Rad | 1864003 | Czytnik kropel (używany w Kroku 6 Protokołu) |
| Wstępnie ustawione kryształy Trizma pH 8,3 | Sigma | T8943-100G |
Bibliografia
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
