Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie elektrokardiogramu w czasie rzeczywistym podczas treningu na bieżni u myszy

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63873

⸱

5 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine I, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 3Institute of Cardiovascular Physiology and Pathophysiology, Biomedical Center, Ludwig-Maximilians-University, 4Institute of Surgical Research at the Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Elektrokardiogram (EKG) jest kluczową zmienną do zrozumienia elektrofizjologii serca. Ćwiczenia fizyczne mają korzystne działanie, ale mogą być również szkodliwe w kontekście chorób układu krążenia. Manuskrypt ten przedstawia metodę rejestrowania EKG w czasie rzeczywistym podczas ćwiczeń, która może służyć do zbadania jego wpływu na elektrofizjologię serca u myszy.

Streszczenie

Regularne ćwiczenia fizyczne są głównym czynnikiem wpływającym na zdrowie układu sercowo-naczyniowego, wpływając na różne procesy metaboliczne i elektrofizjologiczne. Jednak w niektórych chorobach serca, takich jak dziedziczne zespoły arytmii, np. kardiomiopatia arytmogenna (ACM) lub zapalenie mięśnia sercowego, ćwiczenia fizyczne mogą mieć negatywny wpływ na serce, prowadząc do proarytmogennej produkcji substratu. Obecnie mechanizmy molekularne leżące u podstaw remodelingu proarytmogennego związanego z ćwiczeniami są w dużej mierze nieznane, dlatego nie jest jasne, jaka częstotliwość, czas trwania i intensywność ćwiczeń można uznać za bezpieczne w kontekście choroby (chorób).

Proponowana metoda pozwala badać proarytmiczne/antyarytmiczne efekty ćwiczeń fizycznych poprzez połączenie treningu na bieżni z monitorowaniem EKG w czasie rzeczywistym. Wszczepialne urządzenia telemetryczne służą do ciągłego rejestrowania EKG swobodnie poruszających się myszy przez okres do 3 miesięcy, zarówno w spoczynku, jak i podczas treningu na bieżni. Oprogramowanie do akwizycji danych wraz z modułami analitycznymi służy do analizy podstawowych parametrów EKG, takich jak tętno, czas trwania fali P, interwał PR, odstęp QRS czy czas trwania QT w spoczynku, w trakcie i po treningu. Ponadto oceniane są parametry zmienności rytmu serca (HRV) oraz występowanie zaburzeń rytmu serca. Krótko mówiąc, manuskrypt ten opisuje krok po kroku podejście do eksperymentalnego zbadania wpływu ćwiczeń na elektrofizjologię serca, w tym potencjalną przebudowę proarytmogenną w modelach mysich.

Wprowadzenie

Regularna aktywność fizyczna jest ważna dla zdrowego życia. Niektóre schorzenia sercowo-naczyniowe prowadzą jednak do sytuacji, w których ta zdroworozsądkowa zgodność jest co najmniej wątpliwa. U pacjentów z zapaleniem mięśnia sercowego aktualne dane wskazują nawet na niekorzystne skutki ćwiczeń, dlatego zaleca się wstrzymanie wszystkich ćwiczeń na pewien czas u tych pacjentów1,2,3. W innych chorobach sercowo-naczyniowych (CVD), takich jak dziedziczne zespoły arytmii, istnieje stosunkowo mniej dowodów na odpowiedni poziom ćwiczeń4,5,6,7, co sprawia, że poradnictwo kliniczne w tych przypadkach, głównie dla młodych i aktywnych fizycznie pacjentów, jest bardzo trudne.

Niekorzystne przebudowy prowadzące do zmniejszenia kurczliwości i niewydolności serca oraz proarytmogenne przemodelowanie prowadzące do arytmii i nagłej śmierci sercowej zostały zasugerowane jako cechy charakterystyczne szkodliwego wpływu ćwiczeń na serce8. Duża liczba badań wskazuje na korzystny wpływ umiarkowanych ćwiczeń na szerokie spektrum różnych chorób9,10. Intensywny trening może mieć jednak szkodliwy wpływ na serce, prowadząc do arytmii, zwłaszcza u zdrowych sportowców11. Chociaż procesy przebudowy strukturalnej prowadzące do wrażliwej proarytmicznej produkcji substratu mogą leżeć u podstaw tej paradoksalnej sytuacji, jak wykazano w maratończykach12, specyficzne mechanizmy niekorzystnej przebudowy związanej z wysiłkiem fizycznym zarówno u osób zdrowych, jak i u pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi pozostają w dużej mierze nieznane.

U zwierząt, szczególnie u myszy, opracowano kilka odpowiednich modeli do naśladowania szerokiego zakresu chorób sercowo-naczyniowych13,14. Ponadto w myszach ustalono różne modele ćwiczeń i protokoły treningowe15,16,17, w tym trening na bieżni z napędem, dobrowolne bieganie na kółkach (VWR) i pływanie17,18. Ocena elektrofizjologii serca za pomocą monitorowania EKG klasycznie zależy od bezpośredniego połączenia przewodzącego między zwierzęciem a jakimś urządzeniem wykrywającym. W związku z tym albo zwierzęta muszą być znieczulone, np. w celu uzyskania zapisów EKG za pomocą ostrych elektrod19, albo zwierzęta muszą być unieruchomione za pomocą ogranicznika 20, albo jakość danych jest obniżona z powodu artefaktów ruchu, np. podczas korzystania z paw-electrodes21 lub platform przewodzących22 pozwalając tylko na podstawową analizę. W związku z tym żadne z wyżej wymienionych podejść nie jest zgodne z protokołami treningowymi, a w konsekwencji uniemożliwia badania nad mechanizmami związanymi z ćwiczeniami prowadzącymi do niekorzystnej przebudowy u myszy. Wszczepialne urządzenia telemetryczne mogą pokonać te przeszkody i są obecnie najpotężniejszym narzędziem i złotym standardem do oceny elektrofizjologii myszy in vivo u zwierząt przytomnych i poruszających się23,24. Obecne rozwiązania sprzętowe telemetrii zostały opracowane do monitorowania myszy w ich klatkach25,26 i zwykle wymagają umieszczenia odbiornika pod klatką w celu akwizycji danych, co sprawia, że monitorowanie w czasie rzeczywistym poza tymi okolicznościami jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy podejście do badania wpływu ćwiczeń na elektrofizjologię serca i arytmogenezę poprzez rejestrację EKG w czasie rzeczywistym podczas treningu na bieżni u myszy przy użyciu wszczepionych urządzeń telemetrycznych. Wszystkie uzyskane parametry zostały przeanalizowane zgodnie z wcześniejszym opisem Tomsits et al.23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu Monachijskiego i wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Rząd Bawarii, Monachium, Niemcy (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-200). W badaniu wykorzystano cztery samce myszy C57BL / 6N wyhodowanych we własnym typie dzikim.

1. Przygotowanie i chirurgiczne wszczepienie nadajnika

UWAGA: Szczegółowy protokół przygotowania i implantacji nadajnika znajduje się w McCauley et al.26.

  1. Przygotowanie nadajnika
    1. Używaj nowych nadajników bezpośrednio, ponieważ są one sterylne. Jeśli nadajniki są ponownie używane, wyczyść urządzenie, umieszczając je w soli fizjologicznej, aby pozbyć się plam krwi, usunąć wszelkie fragmenty tkanki przylegające do nadajnika i elektrod ołowianych. Po wstępnym czyszczeniu, jeśli to konieczne, zanurz nadajnik w 1% roztworze czyszczącym (patrz Tabela materiałów) na 4 godziny w celu dalszego czyszczenia nadajnika.
    2. Aktywuj nadajnik, umieszczając dostarczony magnes w bliskiej odległości. Po aktywacji przetestuj sygnał z nadajnika za pomocą urządzenia radiowego na częstotliwości AM 530 Hz. Ostry i wyraźny sygnał dźwiękowy wskazuje, że nadajnik jest aktywowany, podczas gdy nieaktywowany nadajnik nie daje żadnego sygnału.
  2. Przygotowanie chirurgiczne i implantacja
    UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne muszą być przeprowadzane w czystych i sterylnych warunkach.
    1. Przed użyciem zdezynfekuj wszystkie powierzchnie i sprzęt wielokrotnego użytku oraz używaj sterylnych materiałów jednorazowego użytku, np. gazy, rękawiczek itp.
    2. Przygotuj przewody nadajnika, skracając je do optymalnych długości, przewód ujemny (biały) do około 3,5 cm, a przewód dodatni (czerwony) do 2,5 cm. Usuń czerwono-białą osłonę izolacyjną na końcówce elektrod, wykonując małe nacięcie, aby odsłonić 5-7 mm przewodu przewodzącego.
      UWAGA: Te długości są sugerowane dla 9-12-tygodniowych myszy BALB/c lub C57BL/6 o wadze ~25 g. Należy skorygować, czy zwierzęta wykorzystane w badaniu są większe/cięższe.
    3. Zwróć uwagę na wagę nadajnika i masę korpusu myszy. Zwróć również uwagę na numer seryjny i wartości kalibracji nadajnika dostarczone przez DSI.
      UWAGA: Masa ciała zwierzęcia służy do obliczania dawek środków znieczulających i przeciwbólowych. Początkowa masa ciała jest również wykorzystywana jako odniesienie do oceny powrotu do zdrowia zwierząt po operacji.
    4. Znieczulenie myszy w komorze indukcyjnej podłączonej do parownika izofluranu przepłukanego 2%-3% izofluranem (vol/vol) napędzanym 1 l/min 100% tlenu. Poczekaj na pełny początek narkozy i sprawdź odruch szczypania palców u nóg i powiek, aby zapewnić odpowiednią głębokość narkozy przed kontynuacją.
    5. Następnie należy ułożyć znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na plecach i użyć maści (patrz Tabela Materiałów), aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu. Zabieg chirurgiczny należy przeprowadzić w czystych warunkach na sali operacyjnej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C. Włożyć sondę doodbytniczą jako czujnik temperatury.
    6. Utrzymuj znieczulenie poprzez ciągłe stosowanie izofluranu (1,5%-2%). Fentanyl (0,50 μg/g) należy wstrzykiwać dootrzewnowo w celu znieczulenia. Podłącz adsorber do instalacji wentylacyjnej, aby zapobiec ulatnianiu się nadmiaru gazu do sali operacyjnej (zalecane).
    7. Włożyć igłowe elektrody EKG w oba ramiona i elektrodę uziemiającą do lewej nogi myszy, aby uzyskać konfigurację EKG odprowadzeniowego I w celu monitorowania EKG podczas operacji i uzyskania wyjściowego EKG.
    8. Ogolić brzuch i klatkę piersiową oraz zdezynfekować obszar operacji za pomocą chlorheksydyny/alkoholu (patrz tabela materiałów). Za pomocą pęsety napnij skórę i wykonaj 1,5-2 cm nacięcie brzusznej linii środkowej brzucha za pomocą nożyczek (laparotomia).
    9. Wykonaj kieszeń podskórną (ok. 1 mm) w prawej górnej części klatki piersiowej i w dolnej lewej klatce piersiowej poniżej serca do umieszczenia przewodów elektrod, jak pokazano na Rysunek 1.
    10. Delikatnie umieść korpus nadajnika w otrzewnej nad jelitem. Wbić igłę 14 G podskórnie z obu kieszeni w prawej górnej części klatki piersiowej i dolnej lewej kieszeni na piersi wykonanej wcześniej, aby utworzyć tunel do pozycjonowania elektrody.
    11. Przeprowadź czerwoną i białą elektrodę przez igłę, aby umieścić je w konfiguracji odprowadzenia II. Ustaw i zamocuj końcówki elektrod za pomocą szwów 6.0, elektrody dodatniej (czerwonej) w lewej dolnej części klatki piersiowej i elektrody ujemnej (białej) w prawej górnej części klatki piersiowej.
    12. Zszyć wszystkie nacięcia za pomocą szwów 6.0 i nałożyć środek dezynfekujący (patrz tabela materiałów) na rany. Przenieś zwierzę do klatki regeneracyjnej (tylko jedno zwierzę/klatka) i umieść je pod źródłem ciepła, aby utrzymać temperaturę ciała aż do pełnego wyzdrowienia z narkozy. Dopiero po pełnym wyzdrowieniu i osiągnięciu zdolności do utrzymania pozycji leżącej mostka, zwierzę może zostać w razie potrzeby ponownie umieszczone w towarzystwie.
    13. Zapewnij zwierzęciu odpowiednią dawkę leków przeciwbólowych i antybiotyków po operacji. Stosuj karprofen (5 μg/g) jako środek przeciwbólowy i enrofloksacynę (5 μg/g) jako antybiotyk. Monitoruj ranę w regularnych odstępach czasu, aby upewnić się, że nie występuje stan zapalny lub rozejście się rany.
    14. Po 7-10 dniach rekonwalescencji pooperacyjnej zwierzę jest gotowe do odbycia treningu na bieżni. Upewnij się, że rany są prawidłowo zagojone, a mysz jest zdrowa przed rozpoczęciem treningu.
      UWAGA: Po zakończeniu okresu eksperymentalnego, zastosowanie nadajników telemetrycznych nie wymaga specjalnej metody eutanazji. Wybór metody zależy od późniejszej analizy i jej szczególnych wymagań dotyczących stanu tkanek, a także od lokalnych zasad i przepisów dotyczących opieki nad zwierzętami oraz zatwierdzenia przez odpowiednią lokalną komisję etyczną.

2. Akwizycja danych

  1. Wstępne ustalenia
    1. Aby rozpocząć akwizycję danych, umieść klatkę dla zwierząt na odbiorniku sygnału. Podłącz odbiornik sygnału do systemu akwizycji danych składającego się z matrycy wymiany danych i interfejsu sygnałowego. Podłącz system akwizycji danych do komputera z oprogramowaniem do akwizycji w celu wizualizacji danych (patrz szczegóły konfiguracji w Rysunek 2A).
    2. Uruchom oprogramowanie i potwierdź nazwę użytkownika i licencję na następnym ekranie, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj. Kliknij Sprzęt, aby skonfigurować nadajnik i urządzenie odbiorcze sygnału. Wybierz opcję Edit Physio Tel/HD (MX2) Configuration, aby otworzyć okno konfiguracji.
    3. Wybierz opcję MX2 Configuration (Konfiguracja MX2) w widoku listy na karcie konfiguracji, aby wyświetlić wszystkie dostępne przetworniki i ich numery seryjne w kolumnie "dostępne". Kliknij i przeciągnij wszczepiony nadajnik z dostępnej kolumny do wybranej kolumny.
      UWAGA: Jeśli nadajnik jest wymieniony w wybranej kolumnie, jest on również dodawany do konfiguracji MX2 w zakładce konfiguracji po lewej stronie.
    4. Kolorowe ikony obok numeru seryjnego nadajnika wskazują stan. Sprawdź stan wszystkich nadajników: zielony ze znacznikiem wyboru = nadajnik jest zsynchronizowany i gotowy; czerwony z wykrzyknikiem = nadajnik aktualnie niedostępny, np. jest aktualnie skonfigurowany w eksperymencie na innym systemie; Żółty = nadajnik synchronizuje się lub nie ma podłączonych żadnych odbiorników. Upewnij się, że świeci się zielone światło wskazujące nominalny transfer danych.
    5. Aby skonfigurować nadajnik, wybierz numer seryjny dodanego nadajnika i kliknij Utwórz nowy implant. Wybierz ETA-F10 z menu rozwijanego modelu implantu, aby wyświetlić szczegóły implantu.
    6. Wybierz model i numer seryjny odbiornika z menu po lewej stronie odbiornika (odbiorników) powiązanego z implantem. W tym menu pojawi się lista podłączonych i podłączonych odbiorników z polem wyboru.
    7. Kliknij Wyszukaj implant ETA, aby przypisać odbiornik sygnału do wszczepionego nadajnika. Otwórz menu typu sygnału i wybierz EKG z częstotliwością próbkowania 1 000 Hz. Wprowadź wartości kalibracji na odwrocie opakowania implantu. Wybierz opcję Zapisz i wyjdź.
    8. Kliknij Ustawienia na pasku menu i wybierz Ustawienia tematu. Pojawi się okno dialogowe ze szczegółami tematu. Wprowadź żądaną nazwę pliku, która zostanie zapisana w ustawieniach tematu.
    9. Wybierz płeć zwierzęcia i wybierz Mysz z rozwijanego menu gatunków. Otwórz menu rozwijane analizy i wybierz EKG (moduł). W razie potrzeby zmień domyślne oznaczenia na EKG i jednostki na mV. Wybierz wyzwalacz obok EKG.
    10. Kliknij EKG pod nazwą tematu w menu po prawej stronie, aby otworzyć menu szczegółów kanału. Z listy parametrów wybierz żądane parametry EKG, takie jak Num (numer cyklu), HR (tętno) lub interwały, takie jak PR-I, QT-I, RR-I, QRS itp.
    11. Aby skonfigurować wyświetlanie, kliknij Setup na pasku menu i wybierz Experiment Setup. Pojawi się okno dialogowe konfiguracji. Wybierz Ustawienia wykresu z menu po prawej stronie, aby zdefiniować do 16 okien graficznych dostarczających zarówno surowe dane, np. sygnały EKG, jak i parametry pochodne, np. pętlę XY, trend tętna. Aby wyświetlić EKG, zaznacz pole wyboru Włącz stronę dla strony 1.
  2. Trening na bieżni z jednoczesnym zapisem EKG w czasie rzeczywistym
    1. Przygotuj konfigurację eksperymentalną, jak pokazano na Rysunek 2B dla bieżni 2-torowej z monitorowaniem EKG w czasie rzeczywistym podczas treningu.
      UWAGA: Do treningu zalecana jest 5-pasmowa bieżnia dla gryzoni (patrz tabela materiałów). Konfiguracja składa się z przenośnika taśmowego podzielonego na pięć przedziałów roboczych oraz jednostki sterującej z ekranem dotykowym. Każda komora biegowa składa się z przezroczystego pudełka z pleksiglasu z pokrywą, zamontowanego na przenośniku taśmowym. W każdym pomieszczeniu znajduje się siatka porażająca prądem, w której krótkie impulsy elektryczne działają jak bodziec, aby zwierzę mogło działać. Każda komora jest indywidualnie podłączona do jednostki sterującej, aby umożliwić regulację intensywności wstrząsu w zależności od komory. Jednostka sterująca może wyświetlać przebiegnięty dystans, liczbę wstrząsów i całkowity czas trwania wstrząsów. Ponieważ wszystkie komory korzystają z tego samego przenośnika taśmowego, prędkość i nachylenie można regulować tylko dla wszystkich przedziałów w tym samym czasie.
    2. Aby umożliwić dobrą transdukcję sygnału podczas treningu, umieść odbiornik sygnału na górze pudełka, ustanawiając pas do biegania ze zwierzęciem, jak pokazano na Rysunek 2B. Dokładne położenie odbiornika sygnału na pasie jezdnym różni się u poszczególnych zwierząt ze względu na różne proporcje sygnału do szumu.
      1. Przesuwaj odbiornik sygnału, aż zostanie znaleziona optymalna pozycja na pasie jezdnym. Zrób to, przeprowadzając eksperyment testowy na trenowanym zwierzęciu i zanotuj pozycję o najlepszym stosunku sygnału do szumu. Użyj tej optymalnej pozycji dla rzeczywistego eksperymentu.
        UWAGA: Ze względu na rozmiar odbiornika sygnału i umiejscowienie odbiornika prostopadle do osi torów biegowych (jak pokazano na Rysunek 2B), tylko dwa zwierzęta mogą trenować w tym samym czasie z monitorowaniem EKG w tej konfiguracji.
    3. Podziel trening na bieżni na następujące dwie fazy.
      1. Faza aklimatyzacji: czas, w którym zwierzę jest przystosowane do warunków treningu. Wykonaj 1-tygodniowy protokół aklimatyzacji, jak pokazano w Tabeli 1, z prędkością biegu i czasem treningu dla każdego dnia zgodnie z opisem.
      2. Faza treningu: Po aklimatyzacji trenuj zwierzę ze stałą prędkością przez określony czas dziennie, w sumie X dni. W przypadku tego protokołu należy przeprowadzić 5-dniowy trening przez 3 tygodnie ze stałą prędkością 25 cm/s i czasem trwania 60 minut/dzień (tabela 2). Po 5 dniach treningu należy zapewnić 2-dniową przerwę przed kolejnym tygodniem treningu.
        UWAGA: X określa całkowitą liczbę dni treningu i jest definiowany na podstawie celu eksperymentalnego.
    4. Włącz bieżnię. Ustaw nachylenie bieżni, prędkość i intensywność wstrząsów zgodnie z protokołem treningowym. Użyj nachylenia w górę 5°, co prowadzi do umiarkowanego poziomu stresu (zalecane). Użyj tego samego nachylenia w fazie aklimatyzacji i fazie treningu.
      UWAGA: Nachylenie bieżni określa intensywność treningu; Wybierz żądane nachylenie. Protokół treningowy może się różnić w zależności od celu eksperymentu.
    5. Naciśnij Ustawienia w jednostce sterującej i wybierz Test siatki. Spowoduje to otwarcie ekranu wyboru rozmiaru siatki. Wybierz Myszy. Pojawi się ekran testu siatki z dwoma podtestami: testem wstrząsowym i testem czyszczenia. Naciśnij Start, aby rozpocząć test wstrząsów. Pojawi się komunikat ostrzegający użytkownika o wstrząsach testowych. Aby rozpocząć test, potwierdź ostrzeżenie, dotykając ekranu.
    6. Umieść przewodzącą część akcesorium z gąbki dostarczonego z bieżnią na siatce bieżni. Umieść go, aż na ekranie pojawi się słowo Podaj. Przetestuj wszystkie siatki w ten sposób. Test zakończy się automatycznie po pomyślnym przejściu wszystkich pasów ruchu, ale użytkownik może go zatrzymać w dowolnym momencie, naciskając przycisk Stop.
    7. Aby kontynuować test czyszczenia, naciśnij przycisk >> i Start i poczekaj na uruchomienie testu. Ten test również zatrzyma się automatycznie, gdy tylko wszystkie pasy ruchu go przejdą. Jeśli test zakończy się niepowodzeniem, na ekranie pojawi się komunikat ostrzegawczy. Dotknij komunikatu, aby zobaczyć wynik.
      UWAGA: Testy te mają na celu sprawdzenie czystości i działania siatki. Siatki muszą być czyste, aby zapewnić dobre wykrywanie zwierząt, a następnie prawidłowe dostarczanie bodźca elektrycznego, jeśli zajdzie taka potrzeba. Jeśli test zakończy się niepowodzeniem, wyczyść kratki, sprawdź, czy wszystkie są prawidłowo podłączone i powtórz test.
    8. Przenieść zwierzę do kabiny biegowej. Umieść odbiornik sygnału na przezroczystej skrzynce i podłącz odbiornik sygnału za pomocą połączeniowego do systemu akwizycji danych, który składa się z matrycy wymiany danych i interfejsu sygnałowego, który z kolei łączy się z komputerem z uruchomionym oprogramowaniem akwizycyjnym w celu wyświetlenia sygnału EKG podczas eksperymentu.
    9. Naciśnij Start, aby przejść do trybu biegu. Zwierzęta otrzymają krótki impuls elektryczny w kontakcie z siecią elektryczną, który skieruje zwierzę w kierunku pasa biegowego. Użyj minimalnej intensywności wstrząsu 0.1 mA. Jest to wystarczające do zmotywowania zwierząt, ale nie jest widoczne w zapisie EKG. Spróbuj umieścić granulki jedzenia poza liniami biegowymi w polu widzenia zwierzęcia, aby było zmotywowane.
      UWAGA: Zakres podany przez producenta dla porażenia prądem elektrycznym wynosi 0,1 mA-2 mA. Zwiększenie intensywności wstrząsu może być konieczne w różnych szczepach myszy lub w różnych warunkach eksperymentalnych, niemniej jednak zalecamy stosowanie najniższej możliwej intensywności wstrząsu. Alternatywnie, aby zmniejszyć ogólne porażenie prądem, spróbuj utrzymać zwierzę na pasie biegowym, delikatnie je popychając, np. wacikami do uszu lub stymulując je delikatnym podmuchem sprężonego powietrza. Jeśli zwierzęta są dobrze wyszkolone, sieć elektryczną i tor biegowy można oddzielić kawałkiem styropianu, aby uniknąć niepożądanych wstrząsów.
    10. Jeśli zwierzę nie trenuje i nie może być zmotywowane nawet za pomocą porażenia prądem, usuń je z protokołu treningowego na ten dzień, jeśli nie nastąpi poprawa w ciągu pierwszych 15 minut eksperymentu.
    11. Po zakończeniu pozwól zwierzęciu odpocząć przez 5 minut po treningu przed przeniesieniem go z powrotem do klatki. Wyjmij odbiornik sygnału z przezroczystego pudełka i umieść go z powrotem pod klatką, jak pokazano na Rysunek 2A. Wyłącz bieżnię, aby uniknąć niechcianych wstrząsów.
    12. Wyczyść pas bieżni, komory bieżni i sieć elektryczną bezalkoholowym środkiem czyszczącym. Czyste pasy prowadzą do lepszych wyników treningu.
      UWAGA: Podczas treningu ważne jest, aby stale sprzątać pasy, ponieważ zwierzęta przestają biegać po brudnych pasach. Używamy wacików do uszu, aby pozbyć się odchodów zwierzęcych podczas treningu.

3. Analiza danych

UWAGA: W zależności od indywidualnych celów badawczych, można uzyskać i przeanalizować różne parametry. Protokół ten koncentruje się na dwóch aspektach: analizie ilościowych cech EKG oraz występowaniu arytmii przed, w trakcie i po treningu przy użyciu podejścia opisanego wcześniej przez Tomsitsa iwsp.23; oraz analiza zmienności rytmu serca (HRV)27.

  1. Analiza EKG
    1. Szczegółowy opis można znaleźć w Tomsits et al.23. Krótko mówiąc, uruchom oprogramowanie, potwierdź nazwę użytkownika i numer seryjny licencji na oprogramowanie, a następnie kliknij Kontynuuj.
    2. Aby otworzyć plik z rozszerzeniem. PnmExp, kliknij Załaduj eksperyment. Otworzy się okno dialogowe przeglądania w poszukiwaniu folderu, wybierz plik i kliknij Otwórz.
    3. Przejdź do pozycji Akcje/ Rozpocznij przegląd na pasku narzędzi i wybierz okno dialogowe Załaduj dane przeglądu, które zawiera przegląd wszystkich badanych i ich zarejestrowanych sygnałów w ramach wcześniej wybranego eksperymentu.
    4. Wybierz plik do analizy, klikając pole wyboru obok jego nazwy w panelu Tematy po lewej stronie ekranu. Aby przeanalizować EKG, zaznacz pole wyboru obok opcji EKG w panelu typów sygnałów.
    5. Wybierz całe nagranie lub zdefiniuj zakres lub czas trwania za pomocą opcji zakresu czasu. Kliknij OK, aby załadować wybrany zestaw danych do przeglądu, a okna dla zdarzeń i parametrów otworzą się automatycznie.
    6. Aby wyświetlić EKG, kliknij Ustawienia wykresu na pasku narzędzi menu, aby otworzyć nowe okno. Wybierz Podstawowy w typie sygnału, wprowadź Czas 0:00:00:01, a następnie wybierz żądane etykietowanie, jednostkę wyświetlania oraz limity osi dolnej i wysokiej, wprowadzając odpowiednie pola tekstowe. Potwierdź, klikając pole wyboru Włącz stronę, a pojawi się zdefiniowane okno śledzenia EKG.
    7. Dostosuj wymiary osi X i osi Y EKG, klikając dwukrotnie. Kliknij lewym przyciskiem myszy na ślad, aby wyświetlić adnotację fali oraz poprawnie rozpoznać i opisać każdy segment ścieżki, falę P, Q, R, T.
      UWAGA: Jeśli adnotacje nie są poprawne, do optymalizacji można użyć kilku opcji, QRS, PT, Zaawansowane, Szum, Znaki, Uwagi, Precyzja, np. opcji Analizuj/Atrybuty za pomocą prawego przycisku myszy. Szczegółowy opis znajduje się w Tomsits et al.23.
    8. Wybierz wymagane parametry EKG z okna parametrów i skopiuj je do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.
  2. Wykrywanie arytmii
    1. Aby wykryć arytmię, kliknij Eksperyment/Wgląd w dane, aby otworzyć nowe okno wglądu w dane.
    2. Zdefiniuj niestandardowe reguły wyszukiwania, aby wyświetlić nagranie w panelu wyszukiwania. Utwórz nowe wyszukiwanie, wybierając pozycję Utwórz nowe wyszukiwanie po kliknięciu prawym przyciskiem myszy na liście wyszukiwania.
    3. W menu rozwijanym okna dialogowego wprowadzania zdefiniuj odpowiednią regułę wyszukiwania i kliknij OK, aby dodać tę regułę wyszukiwania do listy. Aby zastosować reguły wyszukiwania, kliknij i przeciągnij je do interesującego Cię kanału po lewej stronie.
    4. W panelu wyników wyświetlana jest każda sekcja w zapisie EKG, do której ma zastosowanie reguła. Szczegółowe informacje na temat różnych reguł wyszukiwania można znaleźć w Tomsits et al.23. Aby zapoznać się z dwiema przykładowymi zasadami, bradykardią i tachykardią, zobacz definicję i opis poniżej.
      UWAGA: Dla tych reguł wyszukiwania fizjologiczne tętno myszy jest definiowane zgodnie z Kaese et al.28 jako 500-724 uderzenia/min, co odpowiada długości cyklu 82-110 ms.
      1. Bradykardia: W podejściu dwuetapowym zidentyfikuj każdy pojedynczy interwał RR dłuższy niż 120 ms. Ponieważ bradykardia wymaga więcej niż jednego wydłużonego interwału RR, zdefiniuj dodatkową regułę wyszukiwania, aby zidentyfikować tylko 20 kolejnych interwałów RR dłuższych niż 120 ms jako bradykardię w następujący sposób: bradykardia pojedyncza jako wartość (HR cyc0) <500 i bradykardia jako seria (Bradykardia-pojedyncza, 1) >=20. Kliknij OK, aby dodać tę regułę wyszukiwania do listy.
      2. Postępując zgodnie z tym samym podejściem dla tachykardii, zdefiniuj tachykardię pojedynczą jako wartość (HRcyc0) >724, identyfikując każdy pojedynczy interwał RR, który jest krótszy niż 82 ms, a następnie dodaj dodatkową regułę wyszukiwania Tachykardia jako seria (Tachykardia-pojedyncza, 1) >=20. Kliknij OK, aby dodać tę regułę wyszukiwania do listy.
  3. Analiza zmienności rytmu serca
    UWAGA: Analiza zmienności tętna (HRV) nie jest wykonywana w oprogramowaniu do akwizycji i wymaga eksportowania danych z oprogramowania do akwizycji w czytelnym formacie. W tym miejscu przedstawiamy krótki przewodnik krok po kroku dotyczący eksportu danych w powszechnie używanym europejskim formacie danych (EDF).
    1. Uruchom oprogramowanie, potwierdź nazwę użytkownika i numer seryjny, a następnie kliknij Kontynuuj.
    2. Aby wyeksportować zapis EKG do np. analizy HRV, kliknij Eksperyment i wybierz Eksportuj do EDF. W oknie Eksport do EDF wybierz numer zwierzęcia, sprawdź EKG, wybierz zakres czasowy, dla którego dane będą eksportowane i kliknij na Eksport.
      UWAGA: Nie ma ograniczeń co do eksportowanego zakresu czasu ustawionego przez oprogramowanie, przetwarzanie większej ilości danych zajmie po prostu więcej czasu. Możliwe jest również podzielenie eksportów na sekcje, np. 24 godziny i w razie potrzeby ich ponowna integracja w późniejszym czasie.
    3. Uruchom oprogramowanie analityczne używane do analizy HRV (patrz Tabela materiałów), kliknij Plik i wybierz Otwórz, aby załadować żądany plik EDF.
    4. Kliknij HRV i wybierz Ustawienia. Spowoduje to otwarcie okna do ustawiania różnych parametrów. W obszarze Wykrywanie dudnień wybierz gatunek, dla którego przeprowadzana jest analiza HRV. Wybór gatunku spowoduje ustawienie wartości szerokości przedziału histogramu, progu pRR i wartości uśredniania SDARR w panelu Analiza na wstępnie zdefiniowany standard.
    5. Wybierz pozycję HRV i wybierz pozycję Widok raportu. Skopiuj wyniki do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy statystycznej.
    6. Jakość sygnału może być znacznie niższa podczas faz treningu. Jeśli tak, ręcznie wybierz cykle z widocznymi P i QRS do późniejszej analizy. Wyklucz z analizy błędne znaczniki danych i znaczniki danych bez wyraźnych fal P. Zrób to pod dokładnym rozważeniem doświadczonego analityka EKG, aby uniknąć wyeliminowania dobrych punktów danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W zależności od indywidualnych celów badawczych, późniejsza analiza uzyskanych danych telemetrycznych będzie się znacznie różnić. W niniejszym opracowaniu demonstrujemy wykonalność tej metody poprzez uzyskanie danych dobrej jakości zarejestrowanych podczas okresów treningowych oraz przedstawiamy przykładowe wyniki analiz EKG i zmienności rytmu serca przed, w trakcie i po treningu. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM), a wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu odpowiedniego o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aktualne wytyczne zalecają regularną aktywność fizyczną, ponieważ wykazano, że jest ona ważnym modyfikatorem czynników ryzyka sercowo-naczyniowego30. Istnieje również coraz więcej dowodów na to, że umiarkowana aktywność fizyczna może chronić przed migotaniem przedsionków (AF) zarówno w prewencji pierwotnej, jak i wtórnej 31,32,33. Wręcz przeciwnie, sportowcy wytrzymałościowi, tacy jak maratończycy, mają w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 do P. Tomsits), Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK; 81X2600255 do S. Clauss), Corona Foundation (S199/10079/2019 do S. Clauss) oraz ERA-NET ds. Chorób Sercowo-Naczyniowych (ERA-CVD; 01KL1910 do S. Clauss). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła o rozmiarze 14Sterican584125
Dowolna mysznp. Jackson Laboratories
BepanthenBayer1578675
Karprofen 0,005 mg/&mikro; LZoetis53716-49-7
Data Exchange Matrix 2.0 (MX2)Data Science InternationalZarządza komunikacją między implantami telemetrycznymi PhysioTel i PhysioTel HD a komputerem akwizycyjnym.
Enrofloksacyna 25 mg/mlBaytril400614.00.00
Fentanyl 0,5 mg/10 mlBraun Melsungen
Drobne kleszczeFine Science Tools11295-51
Pięciopasmowa bieżnia dla myszyPanlab - Harvard Apparatus76-0896Zawiera bieżnię, jednostkę sterującą z ekranem dotykowym, gąbkę i
Nożyczki do tęczówkiNarzędzia do nauki o wysokiej jakości14084-08
Izofluran 1 mL/mlCp-Pharma31303
System parowników izofluranuHugo Sachs Elektronik34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910Zawiera komorę indukcyjną, jednostkę do odprowadzania gazu i filtry węglowe
LabChart Pro 8.1.16ADInstruments
MagnetData Science International
Zmodyfikowany obwód BainaHugo Sachs Elektronik73-4860Zawiera maskę anestezjologiczną dla myszy
Złącza modułoweData Science Internationalpołączeniowe między odbiornikiem, interfejsem sygnału i Matrix 2.0 (MX2)
Novafil s 5-0Medtrocin/Covidien88864555-23
Octal BioAmpADInstrumentsFE238-0239Wzmacniacz do zapis EKG powierzchniowego
OcteniseptSchü lke121418
Oxygen 5 LLinde2020175Zawiera regulator ciśnienia
Nadajnik PhysioTel ETA-F10Data Science International
Odbiornik PhysioTel RPC-1Data Science Międzynarodowyodbiornik sygnału
Ponemah 6.42Data Science InternationalOprogramowanie do analizy EKG
PowerlabADInstruments3516-1277Urządzenie sprzętowe do akwizycji EKG Suface. Zawiera przewody elektrody EKG
Prism 8.0.1Graph Pad
Radio Device (Sony AF/AM)Sony
Signal InterfaceData Science InternationalOdbiera i synchronizuje sygnały cyfrowe z danymi telemetrycznymi w Ponemah v6.x.
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools91500-09
Platforma chirurgicznaKent ScientificSURGI-M
Tergazyme 1%Alconox13051.0Komercyjny roztwór czyszczący
PęsetaKent ScientificINS600098-2

Bibliografia

  1. Halle, M., et al. Myocarditis in athletes: A clinical perspective. European Journal of Preventive Cardiology. , (2020).
  2. Maron, B. J., et al. Eligibility and disqualification recommendations for competitive athletes with cardiovascular abnormalities: Task force 3: Hypertrophic cardiomyopathy, arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy and other cardiomyopathies, and myocarditis: A scientific statement from the American Heart Association and American College of Cardiology. Circulation. 132 (22), 273-280 (2015).
  3. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  4. Eberly, L., Garg, L., Vidula, M., Reza, N., Krishnan, S. Running the risk: Exercise and arrhythmogenic cardiomyopathy. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 23 (10), 64(2021).
  5. Lang, C. N., Steinfurt, J., Odening, K. E. Avoiding sports-related sudden cardiac death in children with congenital channelopathy: Recommendations for sports activities. Herz. 42 (2), 162-170 (2017).
  6. Maron, B. J., et al. Recommendations for physical activity and recreational sports participation for young patients with genetic cardiovascular diseases. Circulation. 109 (22), 2807-2816 (2004).
  7. Martinez-Sole, J., et al. Facts and gaps in exercise influence on arrhythmogenic cardiomyopathy: New insights from a meta-analysis approach. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 702560(2021).
  8. Sharma, S., Merghani, A., Mont, L. Exercise and the heart: the good, the bad, and the ugly. European Heart Jorunal. 36 (23), 1445-1453 (2015).
  9. Guasch, E., Mont, L. Diagnosis, pathophysiology, and management of exercise-induced arrhythmias. Nature Reviews. Cardiology. 14 (2), 88-101 (2017).
  10. Konhilas, J. P., et al. Exercise can prevent and reverse the severity of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research. 98 (4), 540-548 (2006).
  11. Trivedi, S. J., et al. Differing mechanisms of atrial fibrillation in athletes and non-athletes: alterations in atrial structure and function. European Heart Journal. Cardiovascular Imaging. 21 (12), 1374-1383 (2020).
  12. Clauss, S., et al. MicroRNAs as biomarkers for acute atrial remodeling in marathon runners (The miRathon study--A sub-study of the Munich marathon study). PLoS One. 11 (2), 0148599(2016).
  13. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  14. Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  15. Poole, D. C., et al. Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1100-1138 (2020).
  16. Pynn, M., Schafer, K., Konstantinides, S., Halle, M. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice. Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).
  17. Wang, Y., Wisloff, U., Kemi, O. J. Animal models in the study of exercise-induced cardiac hypertrophy. Physiological Research. 59 (5), 633-644 (2010).
  18. Massett, M. P., Matejka, C., Kim, H. Systematic review and meta-analysis of endurance exercise training protocols for mice. Frontiers in Physiology. 12, 782695(2021).
  19. Ha, T. W., Oh, B., Kang, J. O. Electrocardiogram recordings in anesthetized mice using lead II. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e61583(2020).
  20. Mongue-Din, H., Salmon, A., Fiszman, M. Y., Fromes, Y. Non-invasive restrained ECG recording in conscious small rodents: a new tool for cardiac electrical activity investigation. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 454 (1), 165-171 (2007).
  21. Chu, V., et al. Method for non-invasively recording electrocardiograms in conscious mice. BMC Physiology. 1, 6(2001).
  22. Sato, S. Multi-dry-electrode plate sensor for non-invasive electrocardiogram and heart rate monitoring for the assessment of drug responses in freely behaving mice. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 97, 29-35 (2019).
  23. Tomsits, P., et al. Analyzing long-term electrocardiography recordings to detect arrhythmias in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62386(2021).
  24. Gkrouzoudi, A., Tsingotjidou, A., Jirkof, P. A systematic review on the reporting quality in mouse telemetry implantation surgery using electrocardiogram recording devices. Physiology & Behavior. 244, 113645(2022).
  25. Russell, D. M., McCormick, D., Taberner, A. J., Malpas, S. C., Budgett, D. M. A high bandwidth fully implantable mouse telemetry system for chronic ECG measurement. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2011, 7666-7669 (2011).
  26. McCauley, M. D., Wehrens, X. H. Ambulatory ECG recording in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1739(2010).
  27. Thireau, J., Zhang, B. L., Poisson, D., Babuty, D. Heart rate variability in mice: a theoretical and practical guide. Experimental Physiology. 93 (1), 83-94 (2008).
  28. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).
  29. Roussel, J., et al. The complex QT/RR relationship in mice. Scientific Reports. 6, 25388(2016).
  30. Visseren, F. L. J., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice: Developed by the Task Force for cardiovascular disease prevention in clinical practice with representatives of the European Society of Cardiology and 12 medical societies With the special contribution of the European Association of Preventive Cardiology (EAPC). European Heart Journal. 42 (34), 3227(2021).
  31. Buckley, B. J. R., Lip, G. Y. H., Thijssen, D. H. J. The counterintuitive role of exercise in the prevention and cause of atrial fibrillation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 319 (5), 1051-1058 (2020).
  32. Elliott, A. D., et al. Association between physical activity and risk of incident arrhythmias in 402 406 individuals: evidence from the UK Biobank cohort. European Heart Journal. 41 (15), 1479-1486 (2020).
  33. Qureshi, W. T., et al. Cardiorespiratory fitness and risk of incident atrial fibrillation: Results from the Henry Ford Exercise Testing (FIT) project. Circulation. 131 (21), 1827-1834 (2015).
  34. Abdulla, J., Nielsen, J. R. Is the risk of atrial fibrillation higher in athletes than in the general population? A systematic review and meta-analysis. Europace: European pacing, arrhythmias, and cardiac electrophysiology of the European Society of Cardiology. 11 (9), 1156-1159 (2009).
  35. Centurion, O. A., et al. The association between atrial fibrillation and endurance physical activity: How much is too much. Journal of Atrial Fibrillation. 12 (3), 2167(2019).
  36. Calvo, N., et al. Emerging risk factors and the dose-response relationship between physical activity and lone atrial fibrillation: a prospective case-control study. Europace: European pacing, arrhythmias, and cardiac electrophysiology of the European Society of Cardiology. 18 (1), 57-63 (2016).
  37. Khan, H., et al. Cardiorespiratory fitness and atrial fibrillation: A population-based follow-up study. Heart Rhythm. 12 (7), 1424-1430 (2015).
  38. Morseth, B., et al. Physical activity, resting heart rate, and atrial fibrillation: the Tromso Study. European Heart Journal. 37 (29), 2307-2313 (2016).
  39. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  40. Xiao, L., et al. Ibrutinib-mediated atrial fibrillation attributable to inhibition of C-terminal Src kinase. Circulation. 142 (25), 2443-2455 (2020).
  41. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).
  42. Renner, S., et al. Porcine models for studying complications and organ crosstalk in diabetes mellitus. Cell and Tissue Research. 380 (2), 341-378 (2020).
  43. Schuttler, D., et al. A practical guide to setting up pig models for cardiovascular catheterization, electrophysiological assessment and heart disease research. Lab Animal (NY). 51 (2), 46-67 (2022).
  44. De Wijs-Meijler, D. P., et al. Surgical placement of catheters for long-term cardiovascular exercise testing in swine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53772(2016).
  45. Borzsei, D., et al. Multiple applications of different exercise modalities with rodents. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 3898710(2021).
  46. Kaplan, M. L., et al. Cardiac adaptations to chronic exercise in mice. The American Journal of Physiology. 267 (3), Pt 2 1167-1173 (1994).
  47. Fewell, J. G., et al. A treadmill exercise regimen for identifying cardiovascular phenotypes in transgenic mice. The American Journal of Physiology. 273 (3), Pt 2 1595-1605 (1997).
  48. Kemi, O. J., Loennechen, J. P., Wisloff, U., Ellingsen, O. Intensity-controlled treadmill running in mice: cardiac and skeletal muscle hypertrophy. Journal of Applied Physiology. 93 (4), Bethesda. Md. 1301-1309 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele mysieEKG w czasie rzeczywistymtelemetria implantowalnazmienność rytmu sercawykrywanie arytmiielektrofizjologia sercaodbiornik sygnałufizjologia wysiłku
Monitorowanie elektrokardiogramu w czasie rzeczywistym podczas treningu na bieżni u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.