Przedstawiono protokół przetwarzania ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków poprzez immunoznakowanie aferentnych struktur synaptycznych i komórek rzęsatych, wygaszanie autofluorescencji w starzejącej się tkance, preparowanie i szacowanie długości ślimaka oraz ilościowe określanie synaps w stosach obrazów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakłada się, że utrata synaps wstęgowych łączących wewnętrzne komórki rzęsate i doprowadzające włókna nerwów słuchowych jest jedną z przyczyn utraty słuchu związanej z wiekiem. Najpowszechniejszą metodą wykrywania utraty synaps wstęgowych jest znakowanie immunologiczne, ponieważ pozwala na ilościowe pobieranie próbek z kilku lokalizacji tonotopowych w pojedynczym ślimaku. Jednak interesujące struktury są zakopane głęboko w ślimaku kostnym. Myszoskoczki są używane jako model zwierzęcy dla ubytku słuchu związanego z wiekiem. W tym miejscu opisano rutynowe protokoły fiksacji, znakowania immunologicznego całych wierzchowców ślimaka myszoskoczka, obrazowania konfokalnego oraz ilościowego określania liczby i objętości synaps wstęgowych. Ponadto zwrócono uwagę na szczególne wyzwania związane z pozyskiwaniem dobrego materiału od cennych starzejących się osobników.
Myszoskoczki są poddawane eutanazji i albo perfundowane sercowo, albo ich pęcherze bębenkowe są starannie wycinane z czaszki. Ślimaki są otwierane na wierzchołku i podstawie i bezpośrednio przenoszone do utrwalacza. Niezależnie od początkowej metody, ślimaki są postfiksowane, a następnie odkamieniane. Tkanka jest następnie znakowana pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko strukturom pre- i postsynaptycznym oraz komórkom rzęsatym. Następnie ślimaki są inkubowane z wtórnymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencją, które są specyficzne wobec odpowiednich przeciwciał pierwotnych. Ślimaki starszych myszoskoczków są następnie poddawane działaniu środka wygaszającego autofluorescencję w celu zmniejszenia zazwyczaj znacznej fluorescencji tła tkanek starszych zwierząt.
Na koniec, ślimaki są dzielone na 6-11 segmentów. Cała długość ślimaka jest rekonstruowana w taki sposób, aby można było wiarygodnie określić konkretne lokalizacje ślimaka u poszczególnych osób. Konfokalne stosy obrazów, pozyskiwane sekwencyjnie, pomagają wizualizować komórki rzęsate i synapsy w wybranych lokalizacjach. Stosy konfokalne są dekonwoluowane, a synapsy są albo liczone ręcznie za pomocą ImageJ, albo bardziej obszerna kwantyfikacja struktur synaptycznych jest przeprowadzana za pomocą procedur analizy obrazu napisanych specjalnie w Matlabie.
Wprowadzenie
Ubytek słuchu związany z wiekiem jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób na świecie, która dotyka ponad jedną trzecią światowej populacji w wieku 65 lat i starszych1. Podstawowe przyczyny są nadal przedmiotem dyskusji i są aktywnie badane, ale mogą obejmować utratę wyspecjalizowanych synaps łączących wewnętrzne komórki rzęsate (IHC) z aferentnymi włóknami nerwu słuchowego2. Te synapsy wstęgowe składają się ze struktury presynaptycznej, która ma pęcherzyki wypełnione połączonym z nią neuroprzekaźnikiem glutaminianem, a także postsynaptyczne receptory glutaminianu kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły i procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednie władze Dolnej Saksonii, Niemcy, z numerami zezwoleń AZ 33.19-42502-04-15/1828 i 33.19-42502-04-15/1990. Protokół ten dotyczy myszoskoczków mongolskich (M. unguiculatus) obu płci. Młody dorosły odnosi się do wieku 3-12 miesięcy, podczas gdy myszoskoczki są uważane za w wieku 36 miesięcy i starsze. Jeśli nie zaznaczono inaczej, i roztwory można przygotować i przechowywać w lodówce do kilku miesięcy (4-8 °C). Przed użyciem upewnij się, że i roztwory nie wytrąciły się.
1. Fiksacja i pobieranie organów
UWAGA: Jeśli potrzebne....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ślimaki pobierano albo po perfuzji układu sercowo-naczyniowego całego zwierzęcia utrwalaczem, albo poprzez szybką sekcję po uśmierceniu zwierzęcia i utrwaleniu przez imersję. W przypadku tej drugiej metody komórki IHC pozostawały na swoim miejscu podczas sekcji, podczas gdy w sytuacjach nieudanej perfuzji i tym samym niewystarczającego utrwalenia tkanki, nabłonek sensoryczny był często zniszczony. Należy zauważyć, że autorzy napotkali przypadki, w których utrwalenie ślimaków po perfuzji transkardialnej było niewystarczaj.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dzięki metodzie opisanej w niniejszym protokole możliwe jest znakowanie immunologiczne IHC i struktur synaptycznych w ślimakach od młodych dorosłych i starszych myszoskoczków, identyfikacja przypuszczalnych funkcjonalnych synaps poprzez kolokalizację elementów pre- i postsynaptycznych, przypisanie ich do poszczególnych IHC oraz ilościowe określenie ich liczby, objętości i lokalizacji. Przeciwciała użyte w tym podejściu znakowały również zewnętrzne komórki rzęsate (OHC; myoVIIa) i ich wstęgi presynaptyczne. Co więcej, rea.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Lichunowi Zhangowi za pomoc w ustanowieniu metody oraz Jednostce Obsługi Mikroskopii Fluorescencyjnej, Uniwersytetu Carla von Ossietzky'ego w Oldenburgu, za korzystanie z urządzeń do obrazowania. Badania zostały sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach niemieckiej strategii doskonałości -EXC 2177/1.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Albumina Frakcja V bez biotyny | Carl Roth | 0163.2 | |
| anty-CtBP2 (mysz monoklonalna IgG1) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anty-GluA2 (mysz monoklonalna IgG2a) | Milipore | MAB39 | |
| anty-mysie (IgG1)-AF 488 | Sondy molekularne Inc. | A21121 | |
| anty-miozynaVIIa (poliklonalny królik IgG) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Uchwyt ostrza i Breaker - Płaskie szczęki | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Nożyczki do tętnic Bonn - Końcówka kulkowa | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Grubość szkiełka nakrywkowego 1,5 H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Jednorazowe ostrze chirurgiczne | Henry Schein | 0473 | |
| osioł anty-królik (IgG)-AF647 | Life Technologies-Sondy molekularne | A-31573 | |
| Dumont #5 - Drobne kleszcze | Narzędzia do nauki | 11254-20 | |
| Kleszcze do #5SF Dumont | Narzędzia do nauki o naprawie | 11252-00 | |
| Etanol, absolut 99,8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Pióro Microsoft Corporation | ||
| Ostrze obosieczne | PLANO | 112-9 | |
| G19 Kaniula | Henry Schein | 9003633 | |
| koza anty-mysia (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparyna | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fidżi | ||
| Immersol, Olejek immersyjny 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Pompa perystaltyczna | Ismatec | |
| KL 1600 LED | Źródło światła Schott | 150.600 | do stereomikroskopu |
| Pakiet aplikacji Leica X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| System Leica TCS SP8 | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Nożyczki Mayo Carbide Tungston ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | do użytku w zimnym środowisku |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-EI | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyd | Carl Roth | 0335.3 | |
| szalka Petriego bez otworów wentylacyjnych | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem: | |||
| fosforan disodowy | AppliChem | A1046 | |
| Fosforan monopotasowy | Carl Roth | 3904.1 | |
| Chlorek potasu | Carl Roth | 6781.1 | |
| Chlorek sodu | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Pojemniki z nakrętkami | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Azydek sodu | Carl Roth | K305.1 | |
| Kleszcze studenckie Adson | Narzędzia naukowe | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannas, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Średni montaż zapobiegający blaknięciu Vector | Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Nasadka do naczyń do Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereoskop) | Wild Heerbrugg | nie jest już dostępny |
Bibliografia
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging coch....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
