Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63874

⸱

21 kwietnia 2022

 ,  , 
1Cluster of Excellence "Hearing4all" and Research Centre Neurosensory Science, Department of Neuroscience, School of Medicine and Health Science, Carl von Ossietzky University Oldenburg

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół przetwarzania ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków poprzez immunoznakowanie aferentnych struktur synaptycznych i komórek rzęsatych, wygaszanie autofluorescencji w starzejącej się tkance, preparowanie i szacowanie długości ślimaka oraz ilościowe określanie synaps w stosach obrazów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego.

Streszczenie

Zakłada się, że utrata synaps wstęgowych łączących wewnętrzne komórki rzęsate i doprowadzające włókna nerwów słuchowych jest jedną z przyczyn utraty słuchu związanej z wiekiem. Najpowszechniejszą metodą wykrywania utraty synaps wstęgowych jest znakowanie immunologiczne, ponieważ pozwala na ilościowe pobieranie próbek z kilku lokalizacji tonotopowych w pojedynczym ślimaku. Jednak interesujące struktury są zakopane głęboko w ślimaku kostnym. Myszoskoczki są używane jako model zwierzęcy dla ubytku słuchu związanego z wiekiem. W tym miejscu opisano rutynowe protokoły fiksacji, znakowania immunologicznego całych wierzchowców ślimaka myszoskoczka, obrazowania konfokalnego oraz ilościowego określania liczby i objętości synaps wstęgowych. Ponadto zwrócono uwagę na szczególne wyzwania związane z pozyskiwaniem dobrego materiału od cennych starzejących się osobników.

Myszoskoczki są poddawane eutanazji i albo perfundowane sercowo, albo ich pęcherze bębenkowe są starannie wycinane z czaszki. Ślimaki są otwierane na wierzchołku i podstawie i bezpośrednio przenoszone do utrwalacza. Niezależnie od początkowej metody, ślimaki są postfiksowane, a następnie odkamieniane. Tkanka jest następnie znakowana pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko strukturom pre- i postsynaptycznym oraz komórkom rzęsatym. Następnie ślimaki są inkubowane z wtórnymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencją, które są specyficzne wobec odpowiednich przeciwciał pierwotnych. Ślimaki starszych myszoskoczków są następnie poddawane działaniu środka wygaszającego autofluorescencję w celu zmniejszenia zazwyczaj znacznej fluorescencji tła tkanek starszych zwierząt.

Na koniec, ślimaki są dzielone na 6-11 segmentów. Cała długość ślimaka jest rekonstruowana w taki sposób, aby można było wiarygodnie określić konkretne lokalizacje ślimaka u poszczególnych osób. Konfokalne stosy obrazów, pozyskiwane sekwencyjnie, pomagają wizualizować komórki rzęsate i synapsy w wybranych lokalizacjach. Stosy konfokalne są dekonwoluowane, a synapsy są albo liczone ręcznie za pomocą ImageJ, albo bardziej obszerna kwantyfikacja struktur synaptycznych jest przeprowadzana za pomocą procedur analizy obrazu napisanych specjalnie w Matlabie.

Wprowadzenie

Ubytek słuchu związany z wiekiem jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób na świecie, która dotyka ponad jedną trzecią światowej populacji w wieku 65 lat i starszych1. Podstawowe przyczyny są nadal przedmiotem dyskusji i są aktywnie badane, ale mogą obejmować utratę wyspecjalizowanych synaps łączących wewnętrzne komórki rzęsate (IHC) z aferentnymi włóknami nerwu słuchowego2. Te synapsy wstęgowe składają się ze struktury presynaptycznej, która ma pęcherzyki wypełnione połączonym z nią neuroprzekaźnikiem glutaminianem, a także postsynaptyczne receptory glutaminianu kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA)3,4,5. U myszoskoczka ~20 aferentnych włókien nerwowych słuchowych styka się z jednym IHC6,7,8. Włókna na IHC zwrócone w stronę modiolusu są przeciwstawne do dużych wstęg synaptycznych, podczas gdy włókna łączące się po stronie filaru IHC są skierowane w stronę małych wstążek synaptycznych (tj. w cats9, myszoskoczkach7, świnkach morskich10 i myszy3,11,12,13,14). Ponadto u myszoskoczka wielkość wstążek presynaptycznych i postsynaptycznych plam glutaminianu jest dodatnio skorelowana7,14. Włókna, które są przeciwstawne do dużych wstęg po stronie modiolarnej IHC, są małego kalibru i mają niskie spontaniczne wskaźniki i wysokie progi15. Istnieją dowody na to, że włókna o niskiej spontaniczności są bardziej podatne na ekspozycję na hałas10 i leki ototoksyczne16 niż włókna niskoprogowe o wysokiej spontaniczności, które znajdują się po stronie filaru IHCs15.

Utrata synaps wstęgowych jest najwcześniejszym zdarzeniem zwyrodnieniowym w ubytku słuchu związanym z wiekiem nerwowym ślimaka, podczas gdy utrata spiralnych komórek zwojowych i ich aferentnych włókien nerwowych słuchowych pozostaje w tyle17,18. Korelaty elektrofizjologiczne obejmują zapisy słuchowych reakcji pnia mózgu17 i złożone potencjały czynnościowe8; Nie odzwierciedlają one jednak subtelności utraty synaps, ponieważ włókna o niskiej spontaniczności nie przyczyniają się do tych pomiarów16. Bardziej obiecującymi wskaźnikami elektrofizjologicznymi są indeks neuronalny pochodzący z potencjału masy19 oraz peristimulus time response20. Są one jednak wiarygodne tylko wtedy, gdy zwierzę nie ma innych patologii ślimakowych, poza utratą włókien nerwowych słuchowych, które wpływają na aktywność pozostałych włókien nerwowych słuchowych8. Co więcej, behawioralnie oceniane progi u myszoskoczka nie były skorelowane z liczbą synaps21. W związku z tym wiarygodna kwantyfikacja ocalałych synaps wstęgowych, a tym samym liczby funkcjonalnych włókien nerwowych słuchowych, jest możliwa tylko poprzez bezpośrednie badanie tkanki ślimaka.

Myszoskoczek mongolski (Meriones unguiculatus) jest odpowiednim modelem zwierzęcym do badania ubytków słuchu związanych z wiekiem. Ma krótką żywotność, ma słuch niskotonowy podobny do ludzkiego, jest łatwy w utrzymaniu i wykazuje podobieństwa do ludzkich patologii związanych z ubytkiem słuchu związanym z wiekiem2,22,23,24. Myszoskoczki są uważane za starsze, gdy osiągną wiek 36 miesięcy, czyli pod koniec ich średniej długości życia22. Co ważne, wykazano związaną z wiekiem utratę synaps wstęgowych u myszoskoczków wychowywanych i starzejących się w cichym otoczeniu8,21.

Tutaj przedstawiono protokół do immunoznakowania, preparowania i analizowania ślimaków od myszoskoczków w różnym wieku, od młodych dorosłych do starszych. Stosuje się przeciwciała skierowane przeciwko składnikom presynapsy (CtBP2), postsynaptyczne plastry receptora glutaminianu (GluA2) i IHC (myoVIIa). Stosuje się wygaszacz autofluorescencji, który redukuje tło w starzejących się ślimakach i pozostawia nienaruszony sygnał fluorescencyjny. Ponadto podano opis, jak przeprowadzić sekcję ślimaka w celu zbadania zarówno nabłonka czuciowego, jak i prążkowia naczyniowego. Długość ślimaka jest mierzona, aby umożliwić wybór różnych lokalizacji ślimaka, które odpowiadają określonym najlepszym częstotliwościom25. Kwantyfikacja liczby synaps odbywa się za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ26. Dodatkowa kwantyfikacja woluminów i lokalizacji synaps w obrębie poszczególnych HC jest wykonywana za pomocą oprogramowania napisanego specjalnie w Matlabie. To oprogramowanie nie jest publicznie dostępne, ponieważ autorzy nie mają zasobów, aby zapewnić profesjonalną dokumentację i wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły i procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednie władze Dolnej Saksonii, Niemcy, z numerami zezwoleń AZ 33.19-42502-04-15/1828 i 33.19-42502-04-15/1990. Protokół ten dotyczy myszoskoczków mongolskich (M. unguiculatus) obu płci. Młody dorosły odnosi się do wieku 3-12 miesięcy, podczas gdy myszoskoczki są uważane za w wieku 36 miesięcy i starsze. Jeśli nie zaznaczono inaczej, i roztwory można przygotować i przechowywać w lodówce do kilku miesięcy (4-8 °C). Przed użyciem upewnij się, że i roztwory nie wytrąciły się.

1. Fiksacja i pobieranie organów

UWAGA: Jeśli potrzebne są tylko ślimaki, zaleca się przeprowadzenie nieco prostszej procedury utrwalania przez zanurzenie. Jeśli jednak potrzebny jest również dobrze zachowany mózg, to perfuzja przezsercowa jest jedyną opcją. Utrwalaczem w obu przypadkach jest 4% paraformaldehydu (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Powinien być świeżo przygotowany, ale można go przechowywać zamrożony do czasu użycia. Użyj podwielokrotności ~300 ml do perfuzji przezsercowej lub ~50-100 ml na ślimak do utrwalenia przez zanurzenie.

UWAGA: PFA jest substancją niebezpieczną; należy obchodzić się z nią zgodnie z ogólnymi procedurami bezpieczeństwa w laboratorium.

  1. Fiksacja przez perfuzję przezsercową
    1. Przepłucz zestaw perfuzyjny, aż rurka będzie wolna od pęcherzyków powietrza. Napełnij rurkę perfuzyjną PBS zawierającym heparynę (0,2 ml w 100 ml PBS), aby zapobiec krzepnięciu krwi. Zatrzymaj przepływ, gdy rurka zostanie napełniona PBS, a butelka do przechowywania płynów właśnie zostanie opróżniona; wlej do niego 200 ml rozmrożonego PFA.
      UWAGA: Konfiguracja jest teraz gotowa dla zwierzęcia. Pozostały PBS w rurce jest wystarczający do wypłukania krwi i po wznowieniu przepływu automatycznie pojawi się utrwalacz
      2. .
    2. Upewnij się, że istnieje system zbiórki odpadów dla odpływu PFA. Użyj świeżej kaniuli (19 G) i miej pod ręką duże nożyczki, kleszcze (ze spłaszczoną końcówką), hemostatyki, skalpel lub ostrą kaniulę oraz gumową matę ze szpilkami.
    3. Poddaj myszoskoczka eutanazji z dootrzewnowym przedawkowaniem pentobarbitalu (160 mg/ml, 0,3 ml na zwierzę, zakres masy ciała: 50-120 g). Włóż zwierzę z powrotem do klatki. Gdy zatrzymanie oddechu nastąpi w taki sposób, że oddech stanie się nieregularny w odstępach 30 s lub dłuższych, połóż myszoskoczka na grzbiecie na gumowej macie i przymocuj obie przednie łapy i jedną tylną łapę za pomocą szpilek (pozostaw jedną tylną łapę wolną do ruchu, aby lepiej ocenić powodzenie perfuzji; patrz uwaga po kroku 1.1.7).
    4. Aby otworzyć klatkę piersiową, podnieś skórę nad mostek za pomocą kleszczy i przetnij skórę nożyczkami około 0,5 cm poniżej mostka, aż widoczny będzie biały processus xiphoideus. Przytrzymaj mostek na processus xiphoideus za pomocą kleszczy i przetnij wzdłuż przepony, aby uzyskać dobry widok na klatkę piersiową. Pokrój żeberka bocznie po obu stronach, aż będzie dobry dostęp do serca. Upewnij się, że kąt nożyczek jest równoległy i płaski w stosunku do ciała myszoskoczka, aby uniknąć uszkodzenia narządów, a tym samym zapewnić zamknięty układ krążenia.
    5. Zaciśnij hemostat na mostku, podnieś klatkę piersiową i umieść hemostat na ramieniu myszoskoczka, nie opierając hemostatu na żadnych częściach ciała, aby uniknąć blokowania przepływu krwi.
    6. Lekko otwórz przepływ płynu, aż jedna kropla PBS wypłynie z kaniuli (19 G) mniej więcej co 2 s. Przytrzymaj serce kleszczami i obróć je nieco w lewo, tak aby lewa komora była wyraźnie widoczna. Włóż kaniulę do lewej komory pod kątem, który pozwala uniknąć penetracji przegrody. Trzymać igłę w miejscu ręcznie lub za pomocą innego hemostatu.
      UWAGA: Lewą i prawą komorę można rozróżnić na podstawie różnych odcieni kolorów; Lewa komora wydaje się jaśniejsza niż reszta tkanki serca.
    7. Powoli zwiększaj ciśnienie przepływu płynu i otwórz prawy przedsionek za pomocą cienkich nożyczek, skalpela lub innej kaniuli. Dalej otwórz przepływ płynu, aż w komorze kroplowej zaobserwuje się około 2-3 krople/s lub ustaw przepływ 4 ml/min dla pompy. Po ustabilizowaniu się serca upewnij się, że kaniula perfuzyjna pozostaje na swoim miejscu bez dalszego przytrzymywania.
      UWAGA: Oznakami udanej perfuzji są powolne skurcze mięśni, sztywnienie szyi i kończyn, blednięcie wątroby i zaróżowienie płuc. Oznaką nieudanej perfuzji jest wybielenie płuc, co wskazuje, że krążenie płucne jest ukrwione z powodu nakłucia przegrody.
    8. W przypadku nieudanej perfuzji spróbuj przesunąć kaniulę dalej w górę, do aorty i zacisnąć ją na miejscu za pomocą hemostatu.
    9. Odetnij głowę myszoskoczkowi. Usuń pęcherze, odetnij i odłam ich kość, jak opisano w kroku 1.2.2.
      UWAGA: Jeśli tkanka nie jest wystarczająco utrwalona, nabłonek czuciowy usunie się z narządu Cortiego podczas sekcji.
    10. Jeśli perfuzja nie wykazuje oznak utrwalenia w ciągu 5-10 minut, należy ją przerwać i natychmiast postępować zgodnie z poniższą procedurą utrwalania przez zanurzenie. W tym celu należy potraktować ślimak jak w kroku 1.2.2 i umieścić tkankę w około 50-80 ml 4% PFA w pojemnikach z zakrętką przez 1-2 dni na wytrząsarce 2D w temperaturze 8 °C.
      UWAGA: Ponieważ ostateczna ocena jakości fiksacji podczas perfuzji może być trudna, zaleca się rutynowe postfiksowanie ślimaka zgodnie z opisem.
  2. Utrwalenie przez zanurzenie w tkance
    1. Eutanazja myszoskoczków z dootrzewnowym przedawkowaniem pentobarbitalu (160 mg/ml, 0,3 ml na zwierzę, zakres masy ciała: 50-120 g). Kiedy myszoskoczek przestanie oddychać, odetnij głowę zwierzęciu.
    2. Usuń pęcherze i odetnij i odłam ich kość odpowiednio nożyczkami i kleszczami, aby dotrzeć do ślimaka. Usuń kanalik, kowadełko i kanały półkoliste. Wykonaj małe otwory na wierzchołku i w zwoju podstawy, ostrożnie drapiąc kość ślimaka kleszczami. Natychmiast przenieść pęcherze do nadmiaru zimnego utrwalacza (co najmniej 50 ml) i utrwalić tkankę w zimnym (4-8 °C) pod delikatnym mieszaniem (2D-shaker [100 obr./min]) przez 2 dni.
      UWAGA: Po utrwaleniu tkanki ślimaki mogą być natychmiast przetworzone lub przechowywane w PBS z 0,05% azydkiem sodu. UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Należy pamiętać, że długość przechowywania może negatywnie wpłynąć na jakość barwienia. Ograniczone badania sugerują, że barwienie immunologiczne wydawało się słabsze po 2 latach przechowywania tkanki w azydku sodu.

2. Przygotowanie tkanek i znakowanie immunologiczne

  1. Rozpuścić kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w proszku w PBS, aby otrzymać 0,5 M roztwór o pH 8. W tym celu umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym, napełnij ją około połową całkowitej ilości PBS i dodaj odpowiednią ilość proszku EDTA, co spowoduje powstanie kwaśnej zawiesiny. Ostrożnie dodać stężony roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), monitorując pH za pomocą pH-metru. Napełnij PBS do żądanej objętości końcowej i przefiltruj roztwór, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu.
    UWAGA: Proszek EDTA całkowicie się rozpuści dopiero wtedy, gdy zawiesina osiągnie neutralną wartość pH.
  2. W celu odwapnienia przenieś ślimaki do 80 ml 0,5 M EDTA w PBS. Inkubować tkankę w zimnym (4-8 °C) pod delikatnym mieszaniem na wytrząsarce 2D (100 obr./min) przez 2 dni.
    UWAGA: Po etapie odwapnienia tkanka może być przechowywana w PBS przez kilka dni do 3 tygodni przed kontynuowaniem pozostałych etapów przetwarzania. W przypadku przeciwciał, które znakują prążek naczyniowy, zaleca się przecięcie ślimaków na pół wzdłuż osi modiolarnej w tym miejscu (tj. przed barwieniem immunologicznym), aby zapewnić równomierny dostęp przeciwciał do ich odpowiednich celów. Jest to zależne od przeciwciał i nie dotyczy przeciwciał stosowanych tutaj do znakowania struktur synaptycznych i IHC. Do cięcia użyj kawałka łamliwej żyletki i uchwytu na ostrze (zgodnie z opisem w kroku 4.2).
  3. Wykonaj następujące czynności (do kroku 3.2) w probówkach reakcyjnych o pojemności 2 ml z bezpiecznym uszczelnieniem. Jeśli kawałek tkanki jest zbyt duży, aby zmieścić się w tubce, przytnij nadmiar tkanki nożyczkami. Aby poprawić penetrację przeciwciał, najpierw przeniknij tkankę w 1 ml 1% trytonu (Triton X-100) w PBS na wytrząsarce 2D (100 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyj chusteczkę 3x 1 ml 0,2% trytonu (Triton X-100) w PBS na wytrząsarce 2D (100 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 5 minut każdy.
  4. Aby zablokować niespecyficzne antygeny, należy inkubować ślimaki w 1 ml roztworu blokującego (3% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 0,2% trytonu, w PBS) na wytrząsarce 2D (100 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
    UWAGA: Roztwór blokujący można przygotować z wyprzedzeniem, ale nie powinien być starszy niż ~10 dni.
  5. Rozcieńczyć następujące przeciwciała pierwszorzędowe świeżo w tej samej podwielokrotności roztworu blokującego: anty-mioVIIa (miozyna VIIa) do znakowania IHC (poliklonalna króliczka IgG), rozcieńczona w stosunku 1:400; anty-CtBP2 (C-końcowe białko wiążące 2) do znakowania wstążek presynaptycznych (mysz monoklonalna IgG1), rozcieńczona w stosunku 1:400; i anty-GluA2 do znakowania plastrów receptora postsynaptycznego (mysz monoklonalna IgG2a), rozcieńczona w stosunku 1:200. Upewnij się, że ślimaki są całkowicie pokryte roztworem przeciwciał (zwykle 0,4 ml) i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  6. Następnie umyj chusteczkę 5x 0,2% trytonem w PBS na wytrząsarce 2D (100 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 5 min każda. Wybierz przeciwciała drugorzędowe tak, aby pasowały do gatunków gospodarzy ich pierwotnych odpowiedników i ponownie świeżo rozcieńczyć je w 3% BSA, 0,2% tryton, w PBS: kozioł anty-mysi (IgG1)-Alexa fluorofor (AF) 488, rozcieńczony 1:1,000; kozi anty-mysi (IgG2a)-AF568, rozcieńczony w stosunku 1:500; i osły anty-królicze AF647 (IgG), rozcieńczone 1:1,000. Owiń probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluorescencji. Inkubować ślimaki w 0,4 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny
    UWAGA: Ograniczone badania wykazały, że inkubacja tkanki ślimaka w temperaturze 37 °C przez 24 godziny z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi skutkowała jaśniejszym barwieniem immunologicznym niż w przypadku bardziej powszechnej procedury inkubacji z niższymi temperaturami i krótszym czasem trwania.
  7. Myć ślimaki 2x 1 ml 0,2% trytonu w PBS przez 5 minut każdy i 3x PBS przez 5 minut każdy na wytrząsarce 2D (100 obr./min) w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Po tych etapach mycia ślimaki mogą pozostać w PBS w lodówce w temperaturze ~4 °C przez kilka dni.

3. Leczenie gaszeniem autofluorescencji (opcjonalnie)

UWAGA: Ślimaki od myszoskoczków w średnim i starszym wieku wykazują rozległą autofluorescencję tła. W tkankach młodego dorosłego leczenie wygaszaczem autofluorescencji nie jest konieczne. Zasadniczo możliwe jest zastosowanie wygaszacza autofluorescencji przed zabiegiem barwienia immunologicznego, co pozwala uniknąć niezamierzonego zmniejszenia pożądanej fluorescencji przeciwciał. Jednak zgodnie z kartą katalogową producenta, stosowanie detergentów (takich jak Triton X-100 w obecnym protokole) nie jest już możliwe, ponieważ usuwają one środek wygaszający z tkanki.

  1. Przeciąć ślimaki na pół pod mikroskopem stereoskopowym, jak opisano w kroku 4.2.
  2. Wymieszać wygaszacz autofluorescencji z 70% etanolem, aby otrzymać 5% roztwór i inkubować ślimaki w tym roztworze na wytrząsarce 2D w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Przemyć ślimaki 3x 1 ml PBS na wytrząsarce 2D w temperaturze pokojowej przez 5 minut każdy.
    UWAGA: Wygaszacz autofluorescencji jest niebezpieczny i szkodliwy. Podczas obchodzenia się z tą substancją należy nosić rękawice.

4. Końcowa dokładna sekcja

  1. Wypreparuj ślimak pod mikroskopem stereoskopowym. Napełnij styropianową szalkę Petriego i jej pokrywkę PBS i miej pod ręką dwie cienkie kleszcze, sprężynowe nożyczki Vannas, uchwyt na ostrze i łamliwą żyletkę. Odłamać kawałki żyletki, aby uzyskać powierzchnię cięcia ~2-4 mm w zależności od etapu rozwarstwiania. Przygotuj szkiełko mikroskopowe, umieszczając trzy krople podłoża montażowego w rzędzie.
    UWAGA: Powierzchnia tnąca żyletki szybko się zużywa. Ostrze należy wymienić po wypreparowaniu i zamontowaniu mniej więcej co drugiego elementu ślimaka.
  2. Jeśli nie zostało to jeszcze zrobione w kroku 3.1, najpierw przetnij ślimak na pół wzdłuż modiolusa pod mikroskopem stereoskopowym. W tym celu umieść kawałek żyletki dłuższy niż zwinięta długość ślimaka w uchwycie na ostrze. Umieść ślimak na szalce Petriego i odetnij nadmiar tkanki kawałkiem żyletki. Przytrzymaj ślimak na miejscu za pomocą cienkich kleszczyków i przetnij na pół wzdłuż modiolus.
  3. Zacznij od jednej połowy, ale drugą połowę również zostaw na szalce Petriego. Ostrożnie przymocuj połówkę ślimaka kleszczami tak, aby krawędź tnąca była skierowana do góry. Użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby odciąć kość ślimaka powyżej helicotremy, zakrywając wierzchołek.
  4. Aby rozpocząć oddzielanie kawałków ślimaka, odizoluj środkowy skręt, przecinając nożyczkami modiolus i nerw słuchowy, powyżej (scala vestibuli) i poniżej (scala tympani).
  5. Przeciąć kość ślimaka pokrywającą prążek naczyniowy w przewodzie ślimakowym. Wykonaj dwa nacięcia po obu stronach kości ślimakowej powyżej narządu Cortiego i wzdłuż prążkowia naczyniowego i użyj żyletki, aby ostatecznie oddzielić kawałki ślimaka.
    UWAGA: Prążek naczyniowy jest dobrze widoczny jako ciemny pasek. Przecięcie wzdłuż rozstępu naczyniowego pozostawia narząd Cortiego nienaruszony.
  6. Opcjonalnie: Aby zebrać prążki naczyniowe, ostrożnie przeciąć narząd Cortiego i prążek naczyniowy, aby je rozdzielić. Pozostaw prążek naczyniowy połączony z więzadłem spiralnym (przyczepionym do kości pokrywającej zewnętrzną powierzchnię ślimaka) i usuń odwapnioną kość za pomocą kleszczy. Umieść element prążkiem do góry na szkiełku mikroskopowym w kropli podłoża montażowego.
    UWAGA: Jeśli zebrany kawałek jest zbyt mocno zakrzywiony, może być konieczne podzielenie go na mniejsze kawałki, aby był wystarczająco płaski do zamontowania na suwaku.
  7. Przenieś kawałki ślimaka na wypełnioną PBS pokrywę polistyrenowej szalki Petriego, upewniając się, że całe mocowania ślimaka leżą jak najbardziej płasko na szkiełku. Usuń nadmiar tkanki, takiej jak części więzadła spiralnego po stronie brzusznej i części rąbka spiralnego po stronie nerwowej. Ostrożnie usuń membranę tektorialną za pomocą bardzo cienkich kleszczyków.
  8. Umieść kawałki ślimaka na szkiełku w kropli podłoża montażowego. Umieść całe mocowania ślimaka z narządem Cortiego skierowanym do góry na szkiełku, aby uniknąć zasłaniania IHC w ścieżce optycznej obrazowania. Poszukaj wgłębienia rąbka spiralnego w bliskiej odległości od IHC, które jest widoczne po przesunięciu części ślimaka do płaszczyzny strzałkowej, aby zidentyfikować stronę, która ma być skierowana do góry.
    UWAGA: Aby cyfrowo zrekonstruować cały ślimak z jego poszczególnych części podczas dalszej obróbki, zdecydowanie zaleca się udokumentowanie szkiców elementów i zanotowanie punktów orientacyjnych. Ponadto elementy powinny być idealnie ułożone we właściwej kolejności na szkiełku.
  9. Powtarzaj kroki od 4.3 do 4.8, aż cały ślimak zostanie przeniesiony na szkiełko mikroskopowe. W razie potrzeby dodaj więcej podłoża montażowego, nakryj szkiełko i uszczelnij szkiełko nakrywkowe czarnym lakierem do paznokci pomalowanym na krawędziach. Pozostaw do wyschnięcia w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj szkiełko w ciemności w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nawet jeśli części samego nabłonka czuciowego zostaną przypadkowo utracone, ważne jest, aby mimo to zamontować to, co pozostało z części ślimaka, aby prawidłowo oszacować długość.

5. Pomiar długości ślimaka

  1. Zmierz długość ślimaka na podstawie obrazów jego fragmentów w jasnym polu za pomocą systemu mikroskopu epifluorescencyjnego i powiązanego oprogramowania. Zapisuj obrazy o małym powiększeniu (obiektyw 4x) z każdego elementu ślimaka i użyj narzędzia do pomiaru lasso w oprogramowaniu mikroskopu, aby narysować linię wzdłuż rzędu IHC na każdym z obrazów. Oblicz całkowitą długość, dodając długości wszystkich elementów.
    UWAGA: Jeśli w elemencie ślimaka brakuje części nabłonka czuciowego, należy interpolować linię.
  2. Aby zdefiniować lokalizacje ślimaka, które powinny być analizowane w pojedynczym ślimaku, oblicz odpowiadające im odległości od wierzchołka, korzystając z równania podanego przez Müller25. Zaznacz te miejsca, na przykład, na wydruku z kawałków ślimaka.

6. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego

  1. Do obrazowania w wysokiej rozdzielczości należy używać mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 40x (apertura numeryczna 1,3) i odpowiednim olejem.
    UWAGA: Jeśli mikroskop konfokalny ma odwróconą ścieżkę światła, szkiełko musi być ustawione do góry nogami. W takim przypadku należy dać próbce około 30 minut na zatonięcie i stabilnie oprzeć się na szkiełku nakrywkowym przed rozpoczęciem końcowego skanowania. Alternatywnie należy użyć podłoża montażowego, które jest płynne przez cały czas trwania sekcji, ale później krzepnie i jednocześnie zachowuje fluorescencję.
  2. Aktywuj odpowiednie lasery: w tym protokole stosuje się dwa optycznie pompowane lasery półprzewodnikowe o długościach fal λ = 488 nm i λ = 522 nm oraz laser diodowy o długości fali λ = 638 nm. Wybierz zakres emisji znaczników fluorescencji (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Gdy detektor hybrydowy zlicza uwolnione fotony, umieść linię lasera w odległości co najmniej 10 nm od krzywej emisji.
    UWAGA: Ważne jest, aby przeprowadzić wstępne kontrole za pomocą pojedynczo znakowanej tkanki, aby upewnić się, że wybrane pasma detektora wyraźnie oddzielają kanały kolorów (tj. nie prowadzą do przesłuchów kanałów). Fale radiowe interferują z detektorem hybrydowym, co skutkuje maksymalną liczbą fotonów, a tym samym powoduje artefakty w stosie. Dlatego unikaj używania telefonu komórkowego w pobliżu mikroskopu.
  3. Powiększ tkankę, aż obraz obejmie 10 IHC. Wybierz rozdzielczość obrazu zgodnie z próbkowaniem Nyquista, które zwykle wynosi ~40-60 nm/piksel. Ustaw rozmiar kroku w kierunku z na 0,3 μm, a prędkość obrazowania na 400-700 Hz.
    UWAGA: Oba te ustawienia (rozmiar kroku i szybkość obrazowania) stanowią kompromis między zastosowaniem optymalnych parametrów obrazowania a oszczędnością czasu skanowania.
  4. Wykonaj dwukierunkowe pobieranie próbek, aby skrócić czas obrazowania. Zgromadź ramkę dla kanału 488 nm i 638 nm 3x oraz dla kanału 522 nm 6x; Dodatkowo uśrednij linie 3x dla każdego kanału. Wybierz początek i koniec stosu w wymiarze z.
  5. Ustaw wzmocnienie na 100 podczas korzystania z detektora hybrydowego (tryb zliczania), aby uniknąć zmniejszenia stosunku sygnału do szumu. Ustaw moc lasera tak, aby żaden piksel nie był nasycony w obszarze zainteresowania, ale struktury pokrywały w większości pełny zakres 8 bitów. Zacznij od niskiej mocy lasera wynoszącej 0,5% i zwiększaj ją, aż struktury będą widoczne.
    UWAGA: Dobre barwienie zazwyczaj wymaga mocy lasera od 0,1% do 5%.
  6. Użyj oprogramowania do dekonwolucji do przetwarzania post hoc stosów obrazów, aby usunąć rozmyte halo wokół małych struktur fluorescencyjnych za pomocą teoretycznej funkcji rozproszenia punktowego. Użyj tych samych ustawień dla każdego stosu w eksperymencie. Zapisz zdekonwolucjonizowane obrazy jako .tif lub .ics.
    UWAGA: Etykieta myoVIIa (IHC) nie korzysta z dekonwolucji i można ją pominąć w celu zaoszczędzenia czasu. Oprogramowanie wykorzystuje metadane plików graficznych; Należy jednak określić kilka parametrów, takich jak ścieżka światła, medium do zatapiania lub medium zanurzeniowe.

7. Kwantyfikacja synaps

  1. Otwórz kopię zdekonwoluowanych stosów w ogólnodostępnym oprogramowaniu ImageJ za pomocą dodatkowej wtyczki Biovoxxel, która jest również dostępna na ich stronie internetowej.
  2. Dostosuj kolory poszczególnych kanałów, dzieląc kanały (punkt menu Obraz | Kolor | Podziel kanały) i scalanie (punkt menu Obraz | Kolor | Scal kanały) je ponownie, przypisując różne kolory. Konwertowanie obrazu na stos RGB (punkt menu Obraz | Kolor | Stosuj do RGB) i dostosuj jasność i kontrast (Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast | albo Auto, albo suwak w odniesieniu do maksimum), w razie potrzeby, tak aby struktury pre- i postsynaptyczne oraz etykieta IHC przyjemnie odróżniały się od tła.
  3. Wybierz pięć IHC i oznacz je za pomocą narzędzia tekstowego (IHC1-IHC5), klikając żądane miejsce w stosie. Otwórz menedżera zwrotu z inwestycji (punkt menu Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji); Zaznacz pole wyboru Etykiety, aby oznaczyć punkty liczbą. Powiększ obszar IHC, który Cię interesuje.
  4. Użyj narzędzia punkt/wielopunktowy w trybie wielopunktowym (kliknij narzędzie prawym przyciskiem myszy, aby wybrać tryb punktowy lub wielopunktowy). Kliknij na funkcjonalną synapsę wstęgową (tj. wstążkę presynaptyczną w bliskim zestawieniu z postsynaptycznym plastrem glutaminianu) podczas przewijania przez wymiar z.
    UWAGA: W zależności od stopnia nakładania się pikseli i koloru wybranego dla każdego kanału, udostępnione piksele są wyświetlane w kolorach mieszanych. Zazwyczaj rozróżnienie między poszczególnymi funkcjonalnymi synapsami jest proste, ponieważ są one wystarczająco oddalone od siebie.
  5. Po zaznaczeniu wszystkich interesujących Cię struktur kliknij przycisk Dodaj w graficznym interfejsie użytkownika menedżera ROI. Kliknij dowolną nazwę i wybierz Zmień nazwę.
    UWAGA: Etykiety punktów nadal pozostają w obrębie wszystkich płaszczyzn stosu, gdy w menu opcji narzędzia punktów jest zaznaczone pole wyboru Pokaż wszystko (kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia punkt), co pomaga uniknąć wielokrotnego liczenia tej samej synapsy wstążki.
  6. Wybierając następny IHC do zliczenia, unikaj przypadkowego dodawania zliczeń, dostosowując obraz tak, aby w pełni wyświetlić następny IHC za pomocą narzędzia ręcznego. Zmień narzędzie z wielopunktowego na narzędzie punktowe, aby uniknąć dodawania większej liczby punktów punktowych do poprzednio zapisanych danych. Kliknij interesującą Cię strukturę w następnym IHC i zmień z powrotem na narzędzie wielopunktowe. Powtarzaj kroki od 7.4 do 7.5, aż zostaną ocenione wszystkie interesujące Cię IHC.
  7. Aby zapisać dane, kliknij zestaw danych w menedżerze ROI, a następnie zmierz. Poczekaj, aż pojawi się nowe okno z listą zmierzonych punktów danych. Zapisz tę listę jako plik arkusza kalkulacyjnego (punkt menu Plik | Zapisz jako). Zapisz obraz, aktywując opcję Pokaż wszystko w menedżerze ROI. Kliknij Spłaszcz, aby na stałe dodać etykiety punktowe do stosu. Zamykając stos obrazów, wyraź zgodę na zapisanie zmian.

8. Analiza objętości i położenia synaps na komórce rzęsatej

UWAGA: Autorzy użyli specjalnie zaprogramowanej procedury opartej na Matlabie. Ponieważ nie jest on publicznie dostępny, jest on tutaj opisany tylko w ogólnych terminach (zobacz również7). Jeśli jest zainteresowany jego użyciem, skontaktuj się z jego autorem. Procedura oczekuje potrójnie znakowanego (IHC, pre- i postsynaptycznego) stosu obrazów w formacie TIFF jako danych wejściowych, prowadzi użytkownika przez różne etapy analizy za pomocą interfejsu graficznego i zapewnia obszerne wyniki w formacie arkusza kalkulacyjnego.

  1. Znormalizuj położenie struktur synaptycznych do układu współrzędnych 3D zdefiniowanego przez zasięg indywidualnego IHC na osi filar-modiolar i osi wierzchołkowo-podstawnej ślimaka oraz oś górna (płytka kutykularna) do dolnej (biegun synaptyczny) IHC.
    UWAGA: Objętości elementów synaptycznych (zarówno pre-, jak i postsynaptycznych oraz łączna objętość funkcjonalnych synaps) są podane w μm3 i znormalizowane do odpowiedniej wartości mediany3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ślimaki pobierano albo po perfuzji układu sercowo-naczyniowego całego zwierzęcia utrwalaczem, albo poprzez szybką sekcję po uśmierceniu zwierzęcia i utrwaleniu przez imersję. W przypadku tej drugiej metody komórki IHC pozostawały na swoim miejscu podczas sekcji, podczas gdy w sytuacjach nieudanej perfuzji i tym samym niewystarczającego utrwalenia tkanki, nabłonek sensoryczny był często zniszczony. Należy zauważyć, że autorzy napotkali przypadki, w których utrwalenie ślimaków po perfuzji transkardialnej było niewystarczaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dzięki metodzie opisanej w niniejszym protokole możliwe jest znakowanie immunologiczne IHC i struktur synaptycznych w ślimakach od młodych dorosłych i starszych myszoskoczków, identyfikacja przypuszczalnych funkcjonalnych synaps poprzez kolokalizację elementów pre- i postsynaptycznych, przypisanie ich do poszczególnych IHC oraz ilościowe określenie ich liczby, objętości i lokalizacji. Przeciwciała użyte w tym podejściu znakowały również zewnętrzne komórki rzęsate (OHC; myoVIIa) i ich wstęgi presynaptyczne. Co więcej, rea...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Lichunowi Zhangowi za pomoc w ustanowieniu metody oraz Jednostce Obsługi Mikroskopii Fluorescencyjnej, Uniwersytetu Carla von Ossietzky'ego w Oldenburgu, za korzystanie z urządzeń do obrazowania. Badania zostały sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach niemieckiej strategii doskonałości -EXC 2177/1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina Frakcja V bez biotynyCarl Roth0163.2
anty-CtBP2 (mysz monoklonalna IgG1)BD Biosciences, Eysins612044
anty-GluA2 (mysz monoklonalna IgG2a)MiliporeMAB39
anty-mysie (IgG1)-AF 488Sondy molekularne Inc.A21121
anty-miozynaVIIa (poliklonalny królik IgG)Proteus Biosciences25e6790
Uchwyt ostrza i Breaker - Płaskie szczękiFine Science Tools10052-11
Nożyczki do tętnic Bonn - Końcówka kulkowaFine Science Tools14086-09
Grubość szkiełka nakrywkowego 1,5 H, 24 x 60 mmCarl RothLH26.1
Jednorazowe ostrze chirurgiczneHenry Schein0473
osioł anty-królik (IgG)-AF647Life Technologies-Sondy molekularneA-31573
Dumont #5 - Drobne kleszczeNarzędzia do nauki11254-20
Kleszcze do #5SF DumontNarzędzia do nauki o naprawie11252-00
Etanol, absolut 99,8%Fisher Scientific12468750
Kwas etylenodiaminotetraoctowyCarl Roth8040.2
ExcelPióro Microsoft Corporation
Ostrze obosiecznePLANO112-9
G19 KaniulaHenry Schein9003633
koza anty-mysia (IgG2a)-AF568InvitrogenA-21134
HeparynaRatiopharmN68542.04
Huygens EssentialsScientific Volume Imaging
ImageJFidżi
Immersol, Olejek immersyjny 518FCarl Zeiss10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)Braun4062957E
ISM596DPompa perystaltycznaIsmatec
KL 1600 LEDŹródło światła Schott150.600do stereomikroskopu
Pakiet aplikacji Leica XLeica Microsystem CMS GmbH
System Leica TCS SP8Leica Microsystem CMS GmbH
MatlabThe Mathworks Inc.
Nożyczki Mayo Carbide Tungston ToghCutFine Science Tools14512-17
Mini-100 Orbital-GenieScientific IndustriesSI-M100do użytku w zimnym środowisku
Narcoren (pentobarbital)Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-EINikon
NIS ElementsNikon Europe B.V.
ParaformaldehydCarl Roth0335.3
szalka Petriego bez otworów wentylacyjnychAvantor VWR390-1375
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem:
fosforan disodowyAppliChemA1046
Fosforan monopotasowyCarl Roth3904.1
Chlorek potasuCarl Roth6781.1
Chlorek soduSigma Aldrich31434-M
Pojemniki z nakrętkamiSarstedt75.562.300
Azydek soduCarl RothK305.1
Kleszcze studenckie AdsonNarzędzia naukowe91106-12
Student Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools91308-12
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostEprediaJ1800AMNZ
Triton  XCarl Roth3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence QuencherBiotium23007
Nożyczki sprężynowe Vannas, 3mmFine Science Tools15000-00
Vectashield Średni montaż zapobiegający blaknięciu VectorLaboratoriesH-1000
Vibrax VXR basicIKA0002819000
VX 7 Nasadka do naczyń do Vibrax VXR basicIKA953300
Wild TYP 355110 (Stereoskop)Wild Heerbruggnie jest już dostępny
precyzyjnej

Bibliografia

  1. Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
  2. Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
  3. Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
  4. Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
  5. Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
  6. Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
  7. Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
  8. Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
  9. Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
  10. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  11. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  12. Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
  13. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).
  14. Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933(2020).
  15. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  16. Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
  17. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  18. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  19. Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).
  20. Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).
  21. Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
  22. Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
  23. Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
  24. Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  25. Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).
  28. Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).
  29. Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).
  30. Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
  31. Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
  32. Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).
  33. Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).
  34. Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
  35. Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Liczenie synaps wstążkowychimmunoznakowanie ślimakaślimak gerbilautrata słuchu związana z wiekiemwewnętrzne komórki rzęskoweobrazowanie konfokalnewygaszacz autofluorescencjisekcja ślimakaanaliza w programie ImageJkwantyfikacja synaptyczna
Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.