Artykuł metodologiczny

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63877

⸱

2 czerwca 2022

 , 
1The Salk Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Streszczenie

5′-trifosforan jest niezbędną modyfikacją kwasu nukleinowego występującą przez całe życie i coraz częściej używaną jako funkcjonalna modyfikacja oligonukleotydów w biotechnologii i biologii syntetycznej. Oligonukleotydowe 5′-trifosforany były historycznie przygotowywane in vitro metodami enzymatycznymi. Jednak metody te ograniczają się do naturalnych oligonukleotydów RNA, mają silne preferencje sekwencyjne i mają tendencję do wytwarzania niejednorodnych produktów. Nowe metody chemicznej trifosforylacji uzupełniają zarówno obniżone koszty zautomatyzowanej syntezy oligonukleotydów za pomocą chemii fosforoamidytu, jak i różnorodny zakres dostępnych obecnie modyfikacji nukleotydów. W ten sposób synteza trifosforanów oligonukleotydów o dowolnej sekwencji i długości, opcjonalnie zawierających różne nienaturalne modyfikacje, jest teraz dostępna.

Ten artykuł przedstawia odpowiednie metody i techniki chemicznej trifosforylacji oligonukleotydów przy użyciu fosforochlorydu salicylu i pirofosforanu. Metoda ta wykorzystuje dostępne na rynku odczynniki, jest kompatybilna z większością oligonukleotydów otrzymanych standardowymi metodami syntezy w fazie stałej i może być zakończona w ciągu 2 godzin po syntezie oligonukleotydów, przed deprotekcją i oczyszczeniem. Wykazano dwa zastosowania chemicznie trifosforylowanych oligonukleotydów jako substratów dla katalitycznych enzymów RNA, w tym syntezę lustrzanej wersji rybozymu młota z niebiologicznych trifosforanów L-RNA.

Wprowadzenie

Forma RNA z 5′-trifosforanem jest powszechnie występująca w biologii, ponieważ powstaje w wyniku transkrypcji RNA we wszystkich domenach życia oraz podczas replikacji RNA w cyklu życiowym wielu wirusów RNA. Trifosforany te służą jako substrat do tworzenia mRNA z czapeczką 7-metyloguanylową u eukariotów i w związku z tym odgrywają kluczową rolę w ekspresji białek1. W przeciwieństwie do tego, grupa trifosforanowa jest zachowana u bakterii i wirusów; w związku z tym 5′-trifosforany RNA są rozpoznawane przez regulatory odpowiedzi odporności wrodzonej u eukariotów2,3,4,5,6,7. Poza biologią opracowano szereg rybozymów ligaz RNA wykorzystujących 5′-trifosforan in vitro8, które zmodyfikowano do zastosowań w testach diagnostycznych9,10,11,12,13,14,15. Jeden z takich rybozymów może być wykorzystany do syntezy zależnej od matrycy L-RNA, niebiologicznego enancjomeru „lustrzanego odbicia” naturalnego D-RNA, z niewielkich 5′-trifosforanowych oligonukleotydów L-RNA16,17,18. Rutynowe przygotowanie trifosforanowanych oligonukleotydów o różnej sekwencji i składzie szkieletu jest niezbędne do badania tych układów.

Najczęstszą i najbardziej dostępną metodą przygotowywania 5′-trifosforanów RNA w laboratorium jest transkrypcja in vitro. Jednak RNA wytwarzane tą metodą jest ograniczone pod względem sekwencji i rozmiaru przez wymagania promotora i substratu enzymu polimerazy RNA. Do tego celu najczęściej wykorzystuje się polimerazę RNA T7 oraz jej wyspecjalizowane pochodne19,20,21,22. RNA transkrybowane in vitro za pomocą tych enzymów musi rozpoczynać się od puryny na końcu 5′ i wykazuje silną preferencję dla puryn w pierwszych 10 nukleotydach23,24. Ponadto enzymatyczna inkorporacja nukleotydów z modyfikacjami zasady lub szkieletu jest w najlepszym przypadku mało wydajna, a częściej niemożliwa przy użyciu naturalnych polimeraz, co ogranicza możliwość produkcji 5′-trifosforanów oligonukleotydów składających się z czegoś innego niż naturalne D-RNA. Kolejnym czynnikiem ograniczającym jest fakt, że RNA generowane poprzez transkrypcję in vitro może wykazywać znaczną heterogeniczność na końcach 5′ i 3′, a w przypadku produktów krótszych niż 20 nt jest wytwarzane jako produkty niezwykle heterogeniczne23,24,25,26,27.

W przeciwieństwie do tego, chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów otrzymywanych za pomocą syntezy fosforamidytowej w fazie stałej28,29,30,31,32,33,34,35 może być wykorzystana do przygotowania 5′-trifosforanów oligonukleotydów o długości od 3 do 50 nt i dowolnej sekwencji. Dodatkowo, przed 5′-trifosforylacją do oligonukleotydów można wprowadzić szeroki wachlarz modyfikacji kwasów nukleinowych dostępnych w syntezie fosforamidytowej14,15,16,17,18,29,36. Wiele z tych metod wykorzystuje odczyn do fosfitylacji – fosforochlorek salicylowy, który został opracowany przez Ludwiga i Ecksteina do trifosforylacji mononukleozydów w fazie ciekłej37. Trifosforylację oligonukleotydów tym odczynnikiem przeprowadza się w fazie stałej poprzez fosfitylację grupy 5′-hydroksylowej oligonukleotydu, konwersję do trifosforanu w reakcji z pirofosforanem oraz utlenianie, a następnie standardowe procedury odszczepiania oligonukleotydu z nośnika stałego, deprotekcji i oczyszczania (Rycina 1)28.

Schemat syntezy chemicznej przedstawiający przygotowanie fosforamidytu nukleozydu z użyciem odczynników i rozpuszczalników.
Rysunek 1: Schemat trifosforylacji syntetycznych oligonukleotydów. W pierwszym kroku grupa 5ʹ-hydroksylowa oligonukleotydu zostaje poddana fosfitylowaniu za pomocą SalPCl. W kolejnym kroku 5ʹ-fosforyt salicylowy reaguje z TBAP, tworząc cykliczny metafosforyt, który w trzecim kroku ulega utlenieniu w roztworze utleniającym do syntezatora DNA/RNA (0,1 M jodu/pirydyny/H2O/THF), generując cykliczny 5ʹ-trimetafosforan, który szybko hydrolizuje w tym samym roztworze do liniowego 5ʹ-trifosforanu28,33,37. Następne zasadowe odszczepienie z litego nośnika CPG oraz deprotekcja oligonukleotydu w wodnym MeNH2/amoniaku spowoduje hydrolizę pozostałego cyklicznego trimetafosforanu do formy liniowej. Skróty: SalPCl = chlorofosforyt salicylowy; TBAP = pirofosforan tributyloamoniu; THF = tetrahydrofuran; CPG = szkło o kontrolowanych porach; MeNH2 = metyloamina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Mimo że wczesne publikacje opisujące tę metodę często wskazywały na niskie wydajności i powstawanie niepożądanych produktów ubocznych28,37,38, staranne utrzymanie warunków bezwodnych jest wystarczające do rutynowego uzyskiwania wysokich wydajności. Można to osiągnąć poprzez dokładne przygotowanie odczynników oraz zastosowanie prostego urządzenia reakcyjnego złożonego ze standardowych komponentów plastikowych. W niniejszej pracy prezentujemy odpowiednie etapy chemicznej trifosforylacji oligonukleotydów, w tym przygotowanie odczynników, montaż komory reakcyjnej, przeprowadzenie reakcji trifosforylacji oraz następującą po niej deprotekcję i oczyszczanie trifosforylowanych oligonukleotydów. Przedstawiono również reprezentatywne zastosowanie oligonukleotydów trifosforylowanych na końcu 5′ jako substratów dla rybozymów ligazowych w syntezie większych produktów kwasów nukleinowych z naturalnym szkieletem D-RNA oraz abiotycznym szkieletem L-RNA.

Protokół

1. Zautomatyzowana synteza w fazie stałej oligonukleotydów z grupą 5′-hydroksylową na nośniku stałym

  1. Przygotować automatyczny syntezator DNA/RNA, dostarczając odczynniki i fosforamidyty zgodnie ze składem docelowego oligonukleotydu oraz instrukcją obsługi urządzenia.
  2. Załadować do syntezatora kolumnę syntezy zawierającą wspórkę stałą i zsyntetyzować oligonukleotydy zgodnie z protokołami urządzenia syntezującego.
    UWAGA: Procedura trifosforylacji została zoptymalizowana dla oligonukleotydów przygotowanych w skali 1 µmole.
  3. Usunąć 5′-dimetoksytrytylową grupę ochronną, aby uzyskać 5′-hydroksylowy oligonukleotyd na wspórce stałej, co odbywa się w ramach syntezy oligonukleotydu w poprzednim kroku lub poprzez przeprowadzenie końcowego etapu detrytylacji zgodnie z protokołami urządzenia syntezującego.
  4. Zdjąć z syntezatora kolumnę zawierającą 5′-hydroksylowy oligonukleotyd na wspórce stałej, suszyć pod próżnią laboratoryjną przez 10 min w celu usunięcia resztek rozpuszczalnika, a następnie przejść do trifosforylacji (sekcje 3 i 4) po przygotowaniu materiałów do trifosforylacji (sekcja 2).
    UWAGA: Jeśli kolumna nie zostanie użyta natychmiast, wysuszona kolumna może być przechowywana w atmosferze normalnej w szczelnym plastikowym pojemniku z desykatorem w temperaturze -20 °C. Na tym etapie dalsze suszenie nie jest wymagane, ponieważ kolumna zostanie dokładnie wysuszona przed trifosforylacją w sekcji 3.

2. Przygotowanie materiałów do trifosforylacji

  1. Podłączyć suche źródło argonu z regulowanym ciśnieniem do kolektora gazowego z co najmniej dwiema liniami i połączyć z bulbulatorem. Upewnić się, że linie kończą się plastikowymi strzykawkami o pojemności 1 mL, aby ułatwić podłączenie do aparatury reakcyjnej.
  2. Przygotować sprzęt używany podczas trifosforylacji, w tym plastikowe strzykawki 1 mL, trójdrożny kurek z polipropylenu, igły niekarcujące, probówki polipropylenowe 1,5 mL oraz małą metalową szpatułkę. Przechowywać je w szczelnym pojemniku lub eksykatorze z osuszaczem w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 dzień przed użyciem.
  3. Przygotować po 30 mL bezwodnego 1,4-dioksanu, mieszaniny dioksanu z pirydyną w stosunku objętościowym 3:1, N,N-dimetyloformamidu (DMF) oraz acetonitrylu (ACN) w wysuszonych szklanych butelkach 30 mL z pułapkami osuszającymi (sita molekularne 4 Å w szczelnych woreczkach membranowych) co najmniej 1 dzień przed użyciem. Uszczelnić septami gumowymi i przechowywać w eksykatorze z osuszaczem.
  4. Przechowywać stały 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxafosforyn-4-on (salicylowy fosforochloridyt, SalPCl) w oryginalnym opakowaniu wewnątrz szczelnego słoika z osuszaczem w temperaturze 4 °C. Zawsze przepłukiwać pojemnik argonem pomiędzy użyciami.
  5. Przygotować roztwór pirofosforanu tributyloamoniowego (TBAP) co najmniej 5 dni przed reakcją trifosforylacji:
    1. Odważyć 1-5 g stałego TBAP do wysuszonej szklanej butelki 30 mL i rozpuścić w 1 mL DMF oraz 0,5 mL tributyloaminy na każdy gram TBAP.
    2. Dodać trzy pułapki osuszające, uszczelnić butelkę septem gumowym pod argonem i przedmuchać argonem przez 30 min w celu odgazowania.
    3. Przechowywać w szczelnym słoiku z osuszaczem w temperaturze 4 °C przez 5 dni, aby umożliwić sitom molekularnym pochłonięcie wszystkich śladów wody. Przechowywać słoik w temperaturze -20 °C i przygotować nową porcję po 6 miesiącach.

3. Montaż i użytkowanie aparatury do trifosforylacji

  1. Jeśli kolumna do syntezy była przechowywana w temperaturze -20 °C, należy poczekać, aż ogrzeje się do temperatury pokojowej.
  2. Złożyć komorę reakcyjną przedstawioną na Rysunku 2:
    1. Przygotować przedkomorę: wyjąć tłok z suchej strzykawki 1 mL, odciąć górną część strzykawki nożyczkami lub żyletką i przymocować strzykawkę do kolumny do syntezy. Przymocować kurek trójdrożny do górnej części strzykawki, a boczny wlot kurka połączyć z suchym źródłem argonu z mydlanką, tak aby górny wlot kurka stanowił port wstrzykiwania odczynników.
    2. Zabezpieczyć aparat na statywie za pomocą zacisków i uszczelnić wszystkie połączenia przedniej części układu folią woskową. Ustawić kurek tak, aby port wstrzykiwania był zamknięty, a aparat otwarty na źródło argonu. Zamknąć mydlankę i pozwolić argonowi pod niskim ciśnieniem (<10 psi) przepływać przez komorę reakcyjną przez 5 min.
      UWAGA: Można ustawić kilka komór reakcyjnych równolegle, aby przeprowadzić trifosforylację 2-4 oligonukleotydów. Należy jednak zarezerwować jedną linię z kolektora do doprowadzania argonu do butelek z odczynnikami.
    3. Ponownie otworzyć mydlankę i przymocować do dołu kolumny do syntezy strzykawkę, która będzie służyć jako strzykawka odpadowa. Wielokrotnie przedmuchać kolumnę argonem za pomocą strzykawki odpadowej, a następnie ponownie przymocować strzykawkę z całkowicie wciśniętym tłokiem.
      UWAGA: Poza momentami ładowania odczynników, kurek powinien być ustawiony tak, aby port wstrzykiwania był zamknięty, a aparat otwarty na źródło argonu, jak pokazano na Rysunku 2A. Podobnie strzykawka odpadowa powinna być przymocowana, a połączenie z kolumną do syntezy uszczelnione folią woskową, chyba że trwa aktywne usuwanie odczynników.
  3. Aby dodać odczynnik lub rozpuszczalnik:
    1. Przymocować igłę do suchego źródła argonu i wprowadzić ją do septa butelki z odczynnikiem lub rozpuszczalnikiem, uważając, aby nie zanurzyć igły w zawartości butelki.
    2. Przygotować suchą strzykawkę z igłą i wprowadzić ją do septa butelki z odczynnikiem lub rozpuszczalnikiem, nie zanurzając jej w zawartości butelki. Napełnić strzykawkę argonem, wyciągnąć igłę z septa i wypuścić argon. Ponownie napełnić strzykawkę argonem i wypuścić go; następnie napełnić strzykawkę wymaganą objętością rozpuszczalnika lub odczynnika pod ciśnieniem argonu.
    3. Ustawić kurek w aparacie tak, aby źródło argonu było zamknięte, a port wstrzykiwania otwarty (Rysunek 2B). Szybko wyjąć napełnioną strzykawkę z igłą z butelki źródłowej, wytrzeć rozpuszczalnik z boku lub końcówki igły i wprowadzić igłę do portu wstrzykiwania. Wprowadzić odczynnik do przedkomory aparatu, wyjąć igłę i zamknąć port wstrzykiwania, ponownie otwierając aparat na źródło argonu.
    4. Delikatnie wciągnąć ciecz z przedkomory przez całą kolumnę do syntezy za pomocą strzykawki odpadowej, tak aby cała ciecz znajdowała się w strzykawce odpadowej. Następnie powoli przepchnąć roztwór z powrotem do kolumny do syntezy, upewniając się, że w kolumnie nie ma pęcherzyków gazu. Aby wymieszać lub wstrząsnąć roztworem, delikatnie przesuwać go w górę i w dół kolumny za pomocą strzykawki odpadowej.
      UWAGA: Należy zawsze przemieszczać ciecz powoli i delikatnie przez komorę reakcyjną, aby upewnić się, że żadne uszczelki nie zostały przerwane, co mogłoby doprowadzić do dostania się powietrza do aparatu.
  4. Aby usunąć odczynnik lub rozpuszczalnik z kolumny:
    1. Powoli wciągnąć roztwór do strzykawki odpadowej. Po przejściu głównej części roztworu do strzykawki odpadowej, przedmuchać układ argonem, aby wypłukać pozostały rozpuszczalnik z kolumny.
    2. Usunąć folię woskową z okolic połączenia ze strzykawką odpadową, następnie wyjąć strzykawkę i wylać roztwór odpadowy. Zastąpić strzykawkę odpadową nową, suchą strzykawką i ponownie uszczelnić połączenie folią woskową.

Schemat montażu kolumny chromatograficznej i konfiguracja dla eksperymentu oczyszczania białek.
Rysunek 2: Aparatura do trifosforylacji. Podczas mieszania lub reakcji urządzenie (A) jest otwarte na źródło argonu (i) i zamknięte dla powietrza poprzez regulację trójdrożnego zaworu (ii). Odczynniki są pobierane z komory wstępnej (iii) do kolumny syntezy (iv) za pomocą strzykawki odpadowej (v). Odczynniki są usuwane poprzez pobranie całego płynu do strzykawki odpadowej (v) i jego wylanie. Podczas ładowania odczynników (B) trójdrożny zawór (ii) jest otwarty na atmosferę, a odczynnik jest wprowadzany do komory wstępnej (iii) za pomocą strzykawki i igły (vi). (C) Fotografia zmontowanej aparatury ustawionej zgodnie ze schematem (A) do mieszania i reakcji odczynników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Triphosphorylation syntezowanego oligonukleotydu z 5′-hydroksylą na kolumnie

  1. Wyjąć roztwór SalPCl oraz TBAP z przechowywania w temperaturze -20 °C i pozwolić im ogrzać się do temperatury pokojowej przed użyciem.
  2. Dodać 200 µL pirydyny/dioksanu do komory wstępnej, zgodnie z krokami 3.3.1-3.3.3. Jednak nie należy wprowadzać rozpuszczalnika na kolumnę syntezy aż do kroku 4.4.
  3. Za pomocą suchej metalowej szpatułki odważyć 6-12 mg SalPCl do suchej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL i rozpuścić w 100 µL dioksanu, delikatnie zasysając i wypuszczając rozpuszczalnik strzykawką wewnątrz probówki.
  4. Dodać rozpuszczony SalPCl do komory wstępnej i wprowadzić go na kolumnę syntezy, zgodnie z krokiem 3.3. Pozostawić do reakcji na 15 min, mieszając roztwór co 5 min. Usunąć i zutylizować roztwór SalPCl zgodnie z krokiem 3.4.
    UWAGA: SalPCl jest dodawany w dużym nadmiarze i będzie wiązać wszelką wodę pochłoniętą podczas przygotowania i wprowadzania do komory reakcyjnej. Jednak wprowadzenie jakiejkolwiek wilgoci podczas kroków 4.5 i 4.6 obniży wydajność końcowego oligonukleotydu 5′-trifosforanu.
  5. Dodać 250 µL roztworu TBAP do komory wstępnej i wprowadzić go na kolumnę syntezy, zgodnie z krokiem 3.3. Pozostawić do reakcji na 20 min, mieszając co 5 min. Usunąć i zutylizować roztwór TBAP zgodnie z krokiem 3.4.
  6. Przemyć kolumnę 0.5 mL DMF, a następnie 0.5 mL ACN, usuwając rozpuszczalnik po każdym dodaniu zgodnie z krokami 3.3 i 3.4.
  7. Dodać 250 µL roztworu utleniającego (0.1 M jodu w tetrahydrofuranie (THF)/pirydynie/wodzie, 88:10:2) do komory wstępnej i wprowadzić go na kolumnę syntezy, zgodnie z krokiem 3.3. Pozostawić do reakcji na 30 min, mieszając co 10 min. Usunąć i zutylizować roztwór utleniający zgodnie z krokiem 3.4.
  8. Przemyć kolumnę 0.5 mL ACN i usunąć go zgodnie z krokami 3.3 i 3.4.
  9. Zdemontować aparat reakcyjny. Przemyć kolumnę syntezy 5 mL ACN i wysuszyć kolumnę.

5. Odczepianie od nośnika stałego, deprotekcja i oczyszczanie

  1. Usuń wysuszoną żywicę nośnika stałego z kolumny do syntezy i przenieś ją do 1,5 mL polipropylenowej probówki z zakrętką i silikonowym pierścieniem uszczelniającym (o-ringiem).
  2. Zawieś żywicę w 1 mL mieszaniny w stosunku 1:1 wodnego amoniaku (28%-30%) i wodnej metyloaminy (AMA, 40%) i szczelnie zamknij probówkę. Inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 min, mieszając okresowo poprzez delikatne odwracanie39. W przypadku oligonukleotydów dłuższych niż 40 nt zastosuj łagodniejszą procedurę w temperaturze pokojowej przez 2 h.
    OSTROŻNIE: Podgrzewanie roztworu AMA spowoduje powstanie wysokiego ciśnienia w probówce. Jeśli probówka nie zostanie szczelnie zamknięta lub nie zostanie użyty kompatybilny z amoniakiem (silikonowy) pierścień uszczelniający, może dojść do ucieczki gazu lub wycieku rozpuszczalnika, co może zagrozić bezpieczeństwu lub obniżyć wydajność produktu końcowego. Nigdy nie otwieraj probówki, gdy jej temperatura jest wyższa od temperatury otoczenia, ponieważ gorący roztwór AMA może gwałtownie wydzielać gaz.
  3. Schłodź probówkę na lodzie i krótko odwiruj (6 000-12 000 × g przez 10 s). Usuń nadpływ z żywicy, przefiltruj go przez strzykawkę wyposażoną w filtr 0,2 µm i przenieś do nowej, sterylnej probówki polipropylenowej. Odparuj roztwór do suchości za pomocą wirówki próżniowej wyposażonej w chemiczną pułapkę neutralizującą amoniak.
    UWAGA: Jeśli syntetyczny oligonukleotyd nie zawiera nukleotydów RNA z grupami ochronnymi 2′-sylilowymi, przejdź do kroku 5.8.
  4. Usuń grupy ochronne sylilowe, rozpuszczając wysuszony materiał w 1 mL 1 M fluorku tetrabutylammonium (TBAF) w THF, podgrzewając do 55 °C, wstrząsając w razie potrzeby do całkowitego rozpuszczenia oligonukleotydu i inkubując w temperaturze pokojowej przez 16-24 h40,41.
  5. Zneutralizuj roztwór TBAF, dodając 1 mL 1 M buforu Tris o pH 7,5, a THF usuń za pomocą wirówki próżniowej.
  6. Usuń sole TBAF, korzystając z jednorazowej kolumny do chromatografii wykluczania molekularnego, zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku oligonukleotydów krótszych niż 15 nt potwierdź elucję produktu, zbierając eluat w frakcjach i identyfikując główne frakcje produktu poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm na spektrofotometrze UV-Vis.
  7. Skoncentruj odchroniony oligonukleotyd RNA poprzez liofilizację lub za pomocą wirówki próżniowej (jeśli ma mniej niż 15 nt) lub poprzez wytrącanie etanolem (jeśli ma więcej niż 15 nt).
  8. Przygotuj żel poliakrylamidowy w skali preparatywnej (10%-20% poliakrylamidu / 8 M mocznika / 1x TBE), używając roztworu zapasowego akrylamidu i bis-akrylamidu w stosunku 19:1, zgodnie z odpowiednimi protokołami dla wielkości oligonukleotydu, płytki żelowej i uchwytu. Zamontuj płytkę żelową w uchwycie z 1x TBE w zbiornikach i przeprowadź wstępny przebieg przy 35 W (lub zgodnie z formatem płytki żelowej) przez co najmniej 30 min.
  9. Rozpuść stały oligonukleotyd w buforze do nakładania na żel z mocznikiem (8 M mocznika, 10% sacharozy, 50 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA z barwnikami błękitem bromofenolowym i cyjanolem ksylenowym) i podgrzej do 80 °C. Nałóż na żel poliakrylamidowy i prowadź elektroforezę przez 1-2 h przy 25-35 W (lub zgodnie z formatem płytki żelowej i rozmiarem oligonukleotydu).
    UWAGA: W przypadku oligonukleotydów krótszych niż 15 nt należy pominąć błękit bromofenolowy lub cyjanol ksylenowy w buforze do nakładania na żel, jeśli którykolwiek z nich migruje wspólnie z produktem, ponieważ usunięcie tych barwników z eluowanego oligonukleotydu bez wytrącania etanolem jest trudne.
  10. Po zakończeniu elektroforezy żelowej wyjmij płytkę z uchwytu, rozmontuj ją i owiń żel folią z polichlorku winylu. Zidentyfikuj prążki produktu za pomocą cieniowania tylnego światłem UV o długości 254 nm i wytnij główny prążek produktu za pomocą żyletki.
  11. Wyodrębnij oligonukleotyd z wyciętego żelu metodą rozdrabniania i namaczania (crush and soak)42.
    1. Rozdrobnij wycięty fragment żelu, przeciskając go przez plastikową strzykawkę lub mechanicznie.
    2. Dla oligonukleotydów dłuższych niż 15 nt:
      1. Eluuj w 3-krotnej objętości buforu do rozdrabniania i namaczania (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) przez co najmniej 12 h przy mieszaniu lub wstrząsaniu.
      2. Usuń stałe fragmenty żelu, przepuszczając roztwór przez strzykawkę z filtrem 0,2 µm i skoncentruj oligonukleotyd poprzez wytrącanie etanolem.
    3. Dla oligonukleotydów krótszych niż 15 nt:
      1. Eluuj w 3-krotnej objętości wody wolnej od nukleaz przez co najmniej 12 h przy mieszaniu lub wstrząsaniu.
      2. Usuń stałe fragmenty żelu, przepuszczając roztwór przez strzykawkę z filtrem 0,2 µm i skoncentruj poprzez liofilizację.
      3. Usuń pozostałe sole i substancje rozpuszczone, korzystając z jednorazowej kolumny do chromatografii wykluczania molekularnego, jak w kroku 5.6. Skoncentruj poprzez liofilizację.
  12. Przechowuj oczyszczone trifosforylowane oligonukleotydy w temperaturze -20 °C w buforze TE (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) lub podobnym buforze do przechowywania oligonukleotydów.
    1. Wyznacz stężenie oligonukleotydu, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
      UWAGA: Szacowany współczynnik ekstynkcji oligonukleotydu nie powinien zależeć od stanu jego 5′-fosforylacji i może być obliczony z jego sekwencji przy użyciu kalkulatora współczynnika ekstynkcji oligonukleotydów.
    2. Potwierdź trifosforylację za pomocą spektrometrii mas. Szukaj oczekiwanej masy o wartość +239,94 Da większej w stosunku do masy oligonukleotydu z 5′-hydroksylową końcówką.
      UWAGA: Zarówno spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą, jak i jonizacja elektrorznawna (odpowiednio MALDI-MS lub ESI-MS) nadają się do identyfikacji stanu trifosforylacji oligonukleotydu przy zastosowaniu protokołów zoptymalizowanych dla kwasów nukleinowych. ESI-MS zapewnia bardziej spójne wyniki ze względu na niższą stopę fragmentacji jonów; reprezentatywna usługa komercyjna jest podana w Tabeli materiałów.

6. Oligonukleotydy trifosforanowe jako substraty dla samoreplikacji rybozymu

OSTRZEŻENIE: 32P jest izotopem promieniotwórczym, a poniższe kroki powinny być wykonywane zgodnie ze standardowymi protokołami bezpieczeństwa dotyczącymi pracy z materiałami promieniotwórczymi w laboratorium oraz przez badacza certyfikowanego do pracy z materiałami promieniotwórczymi przez odpowiednie działy BHP (Environmental Health and Safety). Alternatywnie, samoreplikujący się substrat rybozymu A można przygotować syntetycznie z etykietą fluoresceinową na końcu 5′-14 i obrazować fluorescencyjnie, zgodnie z krokiem 7.9.

  1. Przygotować roztwór A jako mieszaninę rybozymu samoreplikującego E i RNA substratu A znakowanego 5′-32P14 w stężeniach odpowiednio 0,30 µM i 30 µM. Przygotować roztwory B-transkrybowany oraz B-syntetyczny z 15 µM trifosforylowanego RNA substratu B, otrzymanego odpowiednio poprzez transkrypcję in vitro14 lub chemiczną trifosforylację jak opisano powyżej, w buforze EPPS 75 mM, pH 8,5, oraz 37,5 MgCl2. Oba roztwory doprowadzić do temperatury 42 °C.
    UWAGA: Wszystkie komponenty RNA wyszczególniono w Tabeli materiałów.
  2. Aby zainicjować samoreplikację, szybko zmieszać 5 µL roztworu A z 10 µL roztworu B-transkrybowanego lub B-syntetycznego do uzyskania końcowych stężeń: 0,1 µM E, 10 µM A, 10 µM B, 25 mM MgCl2 oraz 50 mM buforu EPPS, pH 8,5. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 42 °C.
  3. W regularnych odstępach czasu pobierać aliquoty 0,5 µL i gasić je w 9,5 µL buforu do ładowania żeli z formamidem (95% formamid; 10 mM EDTA, pH 8).
  4. Przygotować analityczny żel poliakrylamidowy/8 M mocznika/1x TBE zgodnie z odpowiednimi protokołami dla płyt żelowych i stojaka. Złożyć odlewany żel i płytkę w stojaku do żeli, wypełnić zbiorniki buforem 1x TBE i przeprowadzić wstępny rozbieg przy 40 W (lub zgodnie z parametrami dla różnych płytek i stojaków) przez 30 min.
  5. Podgrzać zgaszone próbki reakcyjne do 80 °C, nanieść 5 µL próbki do każdego dołka i prowadzić elektroforezę przy 40 W przez około 40 min (lub zgodnie z parametrami dla różnych płytek i stojaków).
  6. Wyjąć płytkę z żelem ze stojaka, rozłożyć i zawinąć żel w folię z polichlorku winylu. Przykryć żel ekranem fosforowym i naświetlać przez 1 h (lub zgodnie z wartościami cpm dla 32P); zeskanować ekran za pomocą skanera do żeli fluorescencyjnych/fosforyzujących.
  7. Ilościowo określić wydajność reakcji za pomocą oprogramowania do analizy obrazów żeli.
    1. Otworzyć obraz żelu w narzędziu Analysis Toolbox, wybrać Analysis | Shape Definition, zaznaczyć Areas | the rectangle shape i narysować prostokąty o tej samej wielkości wokół prążków odpowiadających nieprzereagowanemu A oraz produktowi E dla każdego czasu i obu reakcji.
    2. Wybrać Analysis | Background Subtraction, zaznaczyć Areas | the rectangle shape i narysować prostokąt o tej samej wielkości w pustej części obrazu żelu. Zmienić metodę odejmowania tła dla wszystkich prostokątów na Image Rectangle.
    3. Wybrać Window | 2 Area Window, a następnie Edit | Export to Excel, aby wyeksportować ilościowe wartości wolumenów pikseli prążków do pliku arkusza kalkulacyjnego.
  8. Wykreślić zależność stężenia produktu E od czasu i dopasować dane do równania wzrostu logistycznego (1) za pomocą oprogramowania do statystycznego dopasowywania danych:
    [E] = Równanie ilustrujące model krzywej wzrostu; a/(1+b∙e^(-ct)), stosowane w analizie szybkości wzrostu. (1)
    Gdzie a to maksymalny zakres reakcji, b to stopień sygmoidalności, a c to wykładnicza szybkość wzrostu.
    1. W wyeksportowanym arkuszu podzielić wolumen produktu E przez sumę wolumenów substratu A i produktu E, aby wyznaczyć frakcyjną wydajność produktu dla każdego czasu i obu reakcji. Pomnożyć wynik przez początkowe stężenie substratu A (10 µM), aby wyznaczyć wydajność produktu E jako funkcję czasu.
    2. W oprogramowaniu do statystycznego dopasowywania danych wybrać File | New | New Project File, zaznaczyć XY w sekcji New Table & Graph i kliknąć Create. Wprowadzić czasy reakcji i wydajności produktu E dla obu reakcji w sąsiednich kolumnach i odpowiednio je nazwać (np. „time”, „transcribed B”, „synthetic B”).
    3. Wybrać Insert | New Analysis, zaznaczyć XY analyses | Nonlinear regression (curve fit), a następnie kliknąć OK. Wybrać Growth curves | Logistic growth i kliknąć OK; nie zmieniać żadnych innych parametrów. Sprawdzić parametry dopasowania i przedziały ufności w sekcji Results oraz wykres punktów danych i dopasowanych krzywych w sekcji Graphs.

7. Krzyżowe kopiowanie chiralne L-RNA

  1. Przygotuj 10 µL roztworu RNA zawierającego 20 µM polimeraza D-RNA 27.3t o odwróconej chiralności, 2 µM starter L-RNA znakowany fluoresceiną na końcu 5′, 4 µM biotynilowany szablon L-RNA hammerhead, oraz 20 µM pojedynczo L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG oraz pppCGC, w 10 µL z 50 mM Tris, pH 8,3. Przeprowadzić hybrydyzację RNA poprzez podgrzanie do 90 °C przez 1 min i chłodzenie do 23 °C w 0.2 °C/s w termocyklerze PCR. Patrz na Tabela materiałów w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat polimerazy, startera i matrycy.
  2. Inkubować roztwór RNA w temperaturze 17 °C i rozpocząć reakcję poprzez dodanie 10 µL z 2x buforu startowego (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl oraz 50 mM Tris, pH 8,3). Należy upewnić się, że końcowe stężenia wszystkich składników reakcji wynoszą 10 µM polimeraza, 1 µM starter, 2 µM szablon 10 µM każdy trynukleotyd 5′-trifosforan, 200 mM MgCl22, 250 mM NaCl oraz 50 mM Tris, pH 8,3.
  3. W miarę postępu reakcji należy pobrać 10 µL alikwoty i przerwać reakcję za pomocą 5 µL 0,5 M EDTA, pH 8.
  4. Do każdej próbki z zatrzymaną reakcją należy dodać 0,1 mg magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną (pojemność wiązania biotyny-oligonukleotydu 20 pmol) zawieszonych w 10 µL 1 M NaCl w buforze TE z dodatkiem 0,05% neutralnego detergentu w celu wychwycenia primerów z przedłużonym trimerem poprzez matrycę biotynilowaną i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej przy wytrząsaniu.
  5. Przyciągnij kuleczki za pomocą magnesu do wyłapywania kuleczek, usuń i odrzuć ciecz, a następnie dodaj 50 µL roztworu piorącego (250 mM NaCl w buforze TE z 0,05% neutralnego detergentu). Wymieszać kuleczki, ponownie je uchwycić i usunąć roztwór piorący. Powtórzyć czynność jeszcze raz.
  6. Aby eluować wydłużone primery z kulek, należy dodać 50 µL roztworu elucyjnego (25 mM NaOH z 0,05% neutralnego detergentu) i wymieszać kulki. Ponownie odzyskać kulki, usunąć roztwór elucyjny, zneutralizować 100 mM Tris (pH 7,5) i wytrącić etanolem.
  7. Przygotuj analityczny żel poliakrylamidowy/8 M mocznik/1x TBE zgodnie z odpowiednimi protokołami dla płytki i statywu do żelu. Umieść odlewnicę i płytkę w statywie, napełnij zbiorniki buforem 1x TBE i przeprowadź wstępny rozruch (prerun) przy mocy 40 W (lub zgodnie z instrukcją dla konkretnych płytek i statywów) przez 30 min.
  8. Rozpuścić wytrącone RNA w 10 µL buforu do ładowania żelu z formamidem, a następnie przygotować nieprzereagowany starter z końcowym znakowaniem w 0.5 µM w buforze do ładowania żelu z formamidem. Podgrzać próbki do 80 °Czaładuj 5 µL próbki w każdej studni, a następnie przeprowadzić elektroforezę w żelu przy mocy 40 W przez około 40 min (lub w zależności od zastosowanych płyt żelowych i zasilaczy).
  9. Wyjmij płytkę z żelem ze statywu i przeskanuj za pomocą fluorescencyjnego/fosforescencyjnego skanera żeli, aby zwizualizować produkty elongacji chiralnie przeciwstawnego L-RNA.

Wyniki

Oligonukleotydy należy syntetyzować zgodnie ze standardowymi protokołami dostosowanymi do fosforamidytów i automatycznego syntezatora DNA/RNA, pozostawiając produkt w postaci oligonukleotydu nieodłączonego od wsparcia stałego w oryginalnej plastikowej kolumnie syntezy, z usuniętą 5ʹ-końcową grupą dimetoksytritylową w celu uzyskania wolnej grupy 5ʹ-hydroksylowej (sekcja 1). Wszystkie oligonukleotydy użyte w tym pokazie przygotowano przy użyciu żywicy z kontrolowaną wielkością porów (CPG) 1 000 Å jako wsparcia stałego w skali 0,2 lub 1 µmole. Reprezentatywne przykłady kolumn syntezatora, żywic, odczynników i fosforamidytów znajdują się w Tabeli Materiałów. W przypadku reakcji na większą skalę może być konieczna korekta objętości i czasów zastosowanych w kolejnych krokach.

Reakcja trifosforylacji jest przeprowadzana na kolumnie w specjalnie zbudowanej komorze reakcyjnej (Rysunek 2, sekcja 3) przy użyciu standardowych, dostępnych komercyjnie komponentów wymienionych w Tabela materiałów i przebiega zgodnie ze schematem przedstawionym w Rysunek 1 (sekcja 4)28Podczas trifosforylacji niezbędne jest zachowanie rygorystycznych warunków bezwodnych; wszystkie rozpuszczalniki i odczynniki należy przygotować wcześniej nad sitami molekularnymi i całkowicie osuszyć przed użyciem (rozdział 2). Proces trifosforylacji trwa zazwyczaj 2 godziny, po czym wypłukaną i osuszoną kolumnę można poddać standardowym procedurom usuwania grup ochronnych i oczyszczania oligonukleotydów (rozdział 5).

Po usunięciu grup ochronnych trynukleotydy oligonukleotydowe są oczyszczane za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), wykazując w świetle UV jedną główną prążek produktu, który można wyciąć i wyeluować z żelu. Produkt 5′-trifosforanowy jest łatwo oddzielany od produktów ubocznych reakcji w przypadku krótkich oligonukleotydów, co pokazano dla 5ʹ-trifosforanów trinukleotydów DNA, pppAAA i pppCCC, oraz 5ʹ-trifosforanu trinukleotydowego L-RNA pppGAA na Rysunku 3A,B. Zarówno produkty 5′-hydroksylowe, jak i 5′-trifosforanowe dla trimerów DNA AAA i CCC zostały wycięte i zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas oraz odpowiednio oznaczone na Rysunku 3A. Dodatkowe prążki, widoczne w przypadku trimeru DNA AAA, zazwyczaj nie zawierają wystarczającej ilości materiału do odzyskania i identyfikacji. Obecność tych prążków koreluje jednak z dodatkowymi masami produktów w nieoczyszczonych produktach reakcji (Rysunek 3C), co zazwyczaj reprezentuje produkty uboczne w postaci 5′-difosforanów, monofosforanów i H-fosfonianów, o czym omówiono poniżej.

Po oczyszczaniu metodą PAGE większe oligonukleotydy można eluować metodą rozdrabniania i namaczania (crush and soak)42 z następującym wytrącaniem etanolem. Jednak oligonukleotydy krótsze niż 15 nt nie mogą być wydajnie wytrącone etanolem, w związku z czym wymagają zmodyfikowanej procedury elucji z żelu (krok 5.11.3). Jednorazowa kolumna do chromatografii wykluczania cząsteczkowego wymieniona w Tabeli materiałów jest przeznaczona wyłącznie do stosowania z oligonukleotydami dłuższymi niż 10 nt. Stwierdziliśmy jednak, że oligonukleotydy o długości nawet trzech nukleotydów (trymery) mogą być skutecznie odsolone zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Niemniej jednak przy odsalaniu krótkich oligonukleotydów (jak w krokach 5.6 i 5.11.3) zaleca się zbieranie eluatu z kolumny w frakcjach i identyfikację frakcji produktu poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Alternatywna kolumna do chromatografii wykluczania cząsteczkowego, zoptymalizowana dla krótszych oligonukleotydów, została podana w Tabeli materiałów. Końcowa wydajność z syntezy oligonukleotydów w skali 1 µmole po oczyszczaniu wynosi 50-300 nmol.

Triphosphorylation można potwierdzić za pomocą spektrometrii mas, gdzie produkt trifosforylowany posiada masę większą o +239,94 Da w porównaniu do oligonukleotydu z grupą 5′-hydroksylową, choć często obserwuje się obecność materiałów odpowiadających 5′-difosforanowi i monofosforanowi (odpowiednio +159,96 i +79,98 Da). Może również pojawić się produkt uboczny w postaci 5′-H-fosfonianu o masie większej o +63,98 Da względem masy 5′-OH; wysoki poziom tego produktu wskazuje, że warunki podczas trifosforylacji nie były wystarczająco bezwodne. Przed oczyszczaniem odprotekcjonowane oligonukleotydy zazwyczaj wykazują wszystkie te produkty (Rysunek 3C), natomiast oczyszczony materiał wykazuje piki odpowiadające produktowi 5′-trifosforanowemu wraz z 5′-difosforanami i monofosforanami (Rysunek 3D,E).

Sama spektrometria mas zazwyczaj nie pozwala na rygorystyczne określenie czystości 5′-trifosforanu ze względu na różnice w szybkościach jonizacji i fragmentacji trifosforanu podczas procesu jonizacji. Aby zmierzyć czystość produktu końcowego, zaleca się zastosowanie odwrotnej fazy chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas z jonizacją w źródle elektronspray (RP-LC/ESI-MS), szczególnie w przypadku dłuższych oligonukleotydów. Analiza 5ʹ-trifosforanów D-RNA pppACGAGG oraz pppGAGACCGCAACUUA za pomocą RP-LC/ESI-MS (odpowiednio Rysunek 4A,B) wykazuje typową czystość produktu końcowego, zawierającego 20% 5ʹ-difosforanu, ponieważ te dwie formy są trudne do rozdzielenia, gdy występują w dłuższych oligonukleotydach.

Syntetyczne oligonukleotydy z 5′-trifosforanem zazwyczaj sprawdzają się w badaniach biochemicznych równie dobrze lub lepiej niż materiały przygotowane enzymatycznie. W sekcji 6, jako przykład, podano substraty RNA o długości 14 nt z 5′-trifosforanem, przygotowane albo syntetycznie, albo przez in vitro transkrypcje porównano w reakcji samoreplikacji katalizowanej przez RNA14,15,43,44,45Ribozym E katalizuje łączenie substratów A i B w celu uzyskania nowej kopii E w reakcji autokatalitycznej zdolnej do wzrostu wykładniczego (Rycina 5A). E i 32Komponenty A znakowane fosforem ($\text{P}$) przygotowano poprzez in vitro transkrypcja, a trifosforylowany substrat B przygotowano albo syntetycznie, zgodnie z powyższym opisem, albo poprzez in vitro transkrypcja14Postęp reakcji samoreplikacji monitorowano poprzez pobieranie okresowych próbek, które poddano analizie za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE), a następnie poddano kwantyfikacji. poprzez skaner żeli fluorescencyjnych/fosforyzujących. Uzyskane dane, dopasowane do funkcji wzrostu logistycznego, wykazały, że zarówno transkrybowany, jak i syntetyczny substrat B wspomagają wzrost wykładniczy, przy czym syntetyczny B daje nieco większą ilość produktu (Rysunek 5B). Wynik ten może odzwierciedlać heterogeniczność składu na końcu 5′ RNA przygotowanego przez in vitro transkrypcja23,24.

Chemiczna trifosforylacja umożliwia również syntezę trifosforanów oligonukleotydów, których nie można przygotować biologicznie, ani in vitro, ani w komórkach. W sekcji 7 niebiologiczne trifosforany oligonukleotydów składające się z L-RNA, enancjomeru naturalnego D-RNA, przygotowane zgodnie z opisem w sekcjach 1-5, zostały użyte jako substraty dla „cross-chiralnego” rybozymu polimerazy D-RNA 27.3t (Rysunek 6A), który katalizuje sterowaną matrycą polimeryzację dłuższego produktu L-RNA z krótkich 5′-trifosforanów oligonukleotydów L-RNA w sposób niezależny od sekwencji. Przykładowo, rybozym ten może syntetyzować wersję L-RNA motywu samoprzecinającego hammerhead (Rysunek 6B)18. Oczyszczone trifosforany trinukleotydów L-RNA połączono z l-RNA primerem znakowanym fluoresceiną oraz matrycą L-RNA (Rysunek 6C), a następnie poddano reakcji z ligazą cross-chiralną. Próbki pobierane w trakcie reakcji analizowano metodą PAGE i obrazowano za pomocą fluorescencyjnego/fosforescencyjnego skanera żeli, aby wykazać syntezę wersji L-RNA rybozymu hammerhead zakodowanego przez matrycę (Rysunek 6D).

Wyniki elektroforezy, dane spektrometrii mas, analiza białek, wykresy intensywności względem masy.
Rycina 3: Oczyszczanie trynukleotydów 5ʹ-trifosforanowych. (A) Analiza PAGE (wizualizowana metodą cieniowania UV) trifosforylacji trynukleotydów DNA: tri-deoksyadenozyny (AAA, niebieski) i tri-deoksycytydyny (CCC, czerwony), celowo przeładowanych w celu wizualizacji niewielkich produktów ubocznych. Zarówno produkt 5ʹ-trifosforanowy (ppp), jak i materiał wyjściowy 5ʹ-hydroksylowy (OH) zostały wycięte i zidentyfikowane za pomocą MALDI-MS. (B) Preparatywna elektroforeza PAGE trifosforylacji trynukleotydu L-RNA GAA, z wyciętym głównym prążkiem produktu, zidentyfikowanym jako 5ʹ-trifosforan (ppp) za pomocą ESI-MS. (C) MALDI-MS surowych produktów reakcji po deprotekcji oraz (D) oczyszczonych produktów z (A). Oznaczono: 5ʹ-trifosforan (ppp; pppAAA oczekiwane 1 119 Da, zaobserwowano 1 118 Da; pppCCC oczekiwane 1 047 Da, zaobserwowano 1 046), 5ʹ-difosforan (pp), 5ʹ-monofosforan (p), 5ʹ-hydroksyl (OH) oraz 5ʹ-H-fosfonian (Hp). (E) Dekonwolucyjne widmo masowe z bezpośredniego wtrysku ESI-MS wyizolowanego produktu 5ʹ-trifosforanowego z (B), z oznaczonymi zidentyfikowanymi pikami (oczekiwane 1 181,6 Da, zaobserwowano 1 181,0 Da). Zaobserwowano również produkty 5ʹ-difosforanowe (pp), jak i piki jonów sodu dla produktów trifosforanowych i difosforanowych (+22 Da). Typowe piki zanieczyszczeń oznaczono gwiazdką. Dla ułatwienia porównania widma masowe znormalizowano do najwyższej intensywności zmierzonej w każdym widmie i przedstawiono jako procent tej wartości. Skróty: PAGE = elektroforeza w żelu poliakryamidowym; MALDI-MS = spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą; ESI-MS = spektrometria mas z jonizacją elektrospray. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres chromatograficzny przedstawiający intensywność piku w funkcji czasu retencji dla analizy związków pp, ppp.
Rycina 4: Analityczna RP-LC trifosforanowych oligonukleotydów D-RNA o długości 6 nt i 14 nt. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ oraz (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandemowa ESI-MS zidentyfikowała główny pik w obu przypadkach (~70%) jako 5ʹ-trifosforan (ppp), przy mniejszych ilościach 5ʹ-difosforanu (pp). Skróty: RP-LC = odwrotna faza chromatografii cieczowej; nt = nukleotydy; ESI-MS = spektrometria mas z jonizacją w rozpylaniu elektrycznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat struktury drugorzędowej RNA z wykresem stężenie-czas dla analizy kinetycznej.
Rysunek 5: Porównanie substratów oligonukleotydów 5ʹ-trifosforanowych przygotowanych metodą syntezy chemicznej lub transkrypcji in vitro. (A) Samoreplikujący się rybozym E liguje RNA A i 5′-trifosforylowane RNA B. (B) Porównanie reakcji samoreplikacji z użyciem 10 µM A i 10 µM B, syntetycznych (puste kółka) lub transkrybowanych in vitro (pełne kółka). (B) Dane dopasowano do równania wzrostu logistycznego: [E] = a / (1 + be-ct), gdzie a jest wydajnością końcową, b stopniem sygmoidalności, a c wykładniczą szybkością wzrostu. Szybkości wzrostu dla obu reakcji były identyczne i wynosiły 1,14 h-1, natomiast końcowy zakres był o 10% wyższy dla reakcji z syntetycznym B. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Struktura drugorzędowa RNA, schematy procesu transkrypcji, wyniki elektroforezy w układzie eksperymentalnym.
Rycina 6: Polimeryzacja L-RNA o przeciwnej chiralności za pomocą rybozymu. (A) Rybozym polimeraza D-RNA 27.3t, który katalizuje ligację L-RNA zależną od matrycy. (B) Produkt L-RNA syntetyzowany przez 27.3t tworzy część motywu endonukleazy typu hammerhead. (C) Polimeryzacja L-RNA katalizowana przez 27.3t z wykorzystaniem biotynylowanej matrycy L-RNA (brązowa), primera L-RNA z etykietą końcową (magenta) oraz czterech syntetycznie przygotowanych trynukleotydowych trifosforanów L-RNA (cyjan). (D) Analiza PAGE produktów elongacji z (B) po 4 h i 24 h, pokazująca wbudowanie każdego trynukleotydu aż do produktu o pełnej długości (czarna kropka). Niezreagowany primer L-RNA służy jako marker referencyjny. Skróty: PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym; M = marker referencyjny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisana tutaj procedura trifosforylacji jest zasadniczo zgodna z syntezą oligonukleotydów przy użyciu standardowej chemii fosforamidytów. Fosforamidyty nukleozydowe powinny mieć grupy ochronne o labilnej zasadzie zgodne z szybką deprotekcją w AMA39, w tym standardową β-cyjanoetylową na fosforynie oraz grupy izobutyrylowe, dimetyloformamidylowe, acetylowe, fenoksyacetylowe lub 4-izopropylofenoksyacetylowe na egzocyklicznych aminach nukleozasad. Grupy 2'-hydroksylowe rybozy powinny być chronione przez sililowe grupy ochronne, albo t-butylodimetylosililo (TBDMS), albo tri-izo-propylosililosmetylowe (TOM)40,41. Doniesiono również, że grupa labilna w postaci piwaloiloksymetylu (PivOM) jest zgodna z trifosforylacją chemiczną30.

Opisano wiele metod chemicznej trifosforylacji syntetycznych oligonukleotydów 28,29,30,31,32,33,34,35. Stwierdziliśmy, że trifosforylacja przy użyciu odczynnika Ludwiga-Ecksteina37 jest jedną z najbardziej dostępnych, nie wymagającą specjalistycznej syntezy odczynników ani specjalistycznego sprzętu. Oligonukleotydowe 5′-trifosforany otrzymane tą metodą były rutynowo stosowane jako substraty dla rybozymów ligazy RNA, w tym przy użyciu enzymatycznie niedostępnych trifosforanów oligonukleotydów L-RNA w celu uzyskania zależnej od matrycy syntezy i replikacji tego "lustrzanego odbicia" kwasu nukleinowego 14,16,17,18 . Metoda nadaje się również do otrzymywania małych 5′-trifosforylowanych RNA pętli macierzystej, które są silnymi aktywatorami wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u kręgowców 6,7.

Odczynnik Ludwiga-Ecksteina, fosforochloryd salicylu37, jest wysoce reaktywny z wodą i skutecznie usuwa wodę wprowadzoną podczas rozpuszczania odczynnika przed załadowaniem do kolumny oligonukleotydowej. Jednak po tym momencie 5′-fosforytylowany oligonukleotyd będzie preferencyjnie reagować z każdą wodą wprowadzoną do układu nad pirofosforanem, tworząc produkt uboczny 5′-H-fosfonianu po przetworzeniu 28,37,38. Staranne przygotowanie odczynników do trifosforylacji i komora reakcji trifosforylacji zapewniają, że ten produkt uboczny nie powstaje. Do suszenia rozpuszczalnikowego sita molekularne typu 4 A są sprzedawane w opakowaniach teflonowych kompatybilnych z większością rozpuszczalników organicznych pod różnymi nazwami handlowymi przez większość firm produkujących odczynniki do syntezy oligonukleotydów. Dodatkowe środki ostrożności, takie jak przeprowadzanie trifosforylacji w komorze rękawicowej w bezwodnej atmosferze, na ogół nie są konieczne.

Reakcja 5′-fosforylowanego oligonukleotydu z TBAP tworzy cykliczny półprodukt 5′-trimetafosfitu, który jest następnie utleniany do cyklicznego 5′-trimetafosforanu za pomocą roztworu utleniacza do syntezy oligonukleotydów (jod w wodzie/pirydynie/THF). Należy zauważyć, że komercyjne roztwory utleniacza wykorzystują różne ilości jodu i konieczne jest stosowanie wysokiego stężenia jodu 0,1 M, aby zapewnić całkowite utlenienie trifosforanu. Produkt cykliczny jest hydrolizowany do końcowego liniowego 5′-trifosforanu w tym samym roztworze37, a alternatywne, bezwodne roztwory utleniacza muszą być stosowane, jeśli pożądana jest linearyzacja z nukleofilami innymi niż woda (patrz poniżej dla zastosowań)33. Wszelkie pozostałości cyklicznego trimetafosforanu zostaną jednak zlinearyzowane podczas późniejszej alkalicznej deprotekcji oligonukleotydu. W wyniku hydrolizy cyklicznego 5′-trimetafosforanu powstaje tylko trifosforan liniowy, a nie rozgałęziony37,46.

Deprotekcja oligonukleotydów zazwyczaj nie musi być modyfikowana, aby dostosować się do 5′-trifosforylacji, ale należy podjąć kilka środków ostrożności. Trifosforan jest stosunkowo stabilny do krótkiej ekspozycji na warunki zasadowe, ale należy zachować ostrożność, aby nie wystawiać trifosforanu na działanie AMA dłużej niż to konieczne. Należy unikać ochrony grup, które wymagają dłuższego leczenia amoniakiem lub AMA przez ponad 10 minut w temperaturze 65 °C. Bardziej delikatne zabiegi, takie jak 2 godziny w amoniaku w temperaturze pokojowej, są dopuszczalne, jeśli są kompatybilne z innymi grupami ochronnymi fosforamidytu. Powszechna, szybka metoda deprotekcji syntetycznych oligonukleotydów RNA chronionych silanami wykorzystuje trihydrofluorek trietyloaminy i wysoką temperaturę47; należy jednak tego unikać podczas przygotowywania 5′-trifosforanów RNA, ponieważ stwierdzono, że przedłużające się warunki kwaśne przyspieszają hydrolizę trifosforanu31,32.

Preparatywna PAGE okazała się najprostszą i najbardziej wiarygodną metodą oczyszczania oligonukleotydów 5′-trifosforylowanych po deprotekcji (ryc. 3 i ryc. 4). Jednak preparatywna HPLC z odwróconymi fazami może być również stosowana do oczyszczania produktów trifosforylowanych. Obecność produktów 5′-difosforanu i, w mniejszym stopniu, 5′-monofosforanu jest rutynowo obserwowana podczas sprawdzania trifosforylacji za pomocą spektrometrii mas. Zaobserwowaliśmy fragmentację 5′-trifosforanu podczas spektrometrii mas z wysoce czystego materiału przygotowanego przez syntezę chemiczną lub transkrypcję, szczególnie jeśli instrument nie jest zoptymalizowany do analizy oligonukleotydów. Niemniej jednak analiza RP-LC często pokazuje, że 10% -20% produktu ubocznego 5′-difosforanu jest obecne w dłuższych oligonukleotydach 5′-trifosforylowanych (ryc. 4). Komercyjne preparaty pirofosforanu tributyloamonu mogą być zanieczyszczone nawet 20% monofosforanem, który otrzyma 5′-difosforan jako produkt uboczny podczas trifosforylacji30,31. Staranne przygotowanie tego odczynnika we własnym zakresie może dać znacznie czystsze zapasy TBAP31. Odkryliśmy jednak, że oligonukleotydy trifosforylowane przy użyciu komercyjnych źródeł TBAP nadal wykazują porównywalną lub większą reaktywność, gdy są stosowane jako substraty w reakcjach enzymatycznych (Figura 5B), w porównaniu z materiałem przygotowanym przez transkrypcję in vitro.

Jedno godne uwagi dalsze zastosowanie trifosforylacji oligonukleotydów z odczynnikiem Ludwiga-Ecksteina wykorzystuje cykliczny produkt pośredni trimetafosforytu33. Jeśli kolejny etap utleniania przeprowadza się z 1 M nadtlenkiem t-butylu w heksanach, który jest często stosowany do utleniania oligonukleotydów w warunkach bezwodnych, utlenianie fosforynu zachodzi bez hydrolizy z otwarciem pierścienia, dając cykliczny trimetafosforan. Ten produkt pośredni może być następnie poddany reakcji z pierwszorzędowymi nukleofilami aminowymi lub alkoholowymi, aby uzyskać 5′-trifosforany z modyfikacjami w γ-fosforanie. Modyfikacje te obejmują dodanie znacznika lipofilowego połączonego wiązaniem fosforoamidowym, co ułatwia szybkie oczyszczanie specyficzne dla trifosforanu przez RP-LC, a następnie kwaśną hydrolizę znacznika z trifosforanu33. Modyfikacje fluorescencyjne w pozycji γ-fosforanu mogą być również wprowadzone do użytku jako reportery fluorescencyjne w czasie rzeczywistym w reakcjach ligacji katalizowanych rybozymem15,33.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Gregowi Springsteenowi, Natashy Paul, Charlesowi Olea, Jr., Jonathanowi Sczepanskiemu i Katrinie Tjhung za użyteczne dyskusje na temat najlepszych praktyk dla chemicznych reakcji trifosforylacji oraz Geraldowi Joyce'owi za pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez grant MCB 2114588 z National Science Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m filtr strzykawkowy z polieterosulfonuMilliporeSigmaSLMP025SSFiltr strzykawkowy do usuwania pokruszonych cząstek żelu poliakryloamidowego (sekcja 5)
0,22 i mikro; m Filtr strzykawkowy z PTFEMilliporeFiltrstrzykawkowy Sigma SLLG013SL do usuwania żywicy CPG (sekcja 5)
Plastikowe strzykawki 1 mlThermoFisher Scientific14-823-434 (BD 309659)Elementy aparatu do trifosforylacji (sekcje 2– 4)
1,4-dioksan, bezwodnyrozpuszczalnik MilliporeSigma296309Triphosphorylation (sekcje 2– 4)
2-chloro-4H-1,3,2-benzodioksafosforyno-4-on, fosforochloryd salicylu (SalPCl)MiliporeSigma324124odczynnik trifosforylacji (sekcje 2– 4)
Butelki szklane 30 mlMilliporeSigma23232Butelki do przygotowania rozpuszczalników trifosforylacyjnych i roztworu TBAP (sekcja 2)
3-drogowy kran odcinający, poliwęglan/polipropylenBio-Rad Laboratories7328103Składnik aparatu do trifosforylacji (sekcje 2– 4)
40% roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu, 19:1Bio-Rad Laboratories1610144Dla STRONY (sekcje 5– 7)
Acetonitryl, bezwodny, 100 mlGlen Research40-4050-50Rozpuszczalnik trifosforylacji (sekcje 2 i ndash; 4)
Pułapka neutralizująca amoniakThermoFisher ScientificANT100 i ANS121Do stosowania z Speedvac DNA130 (sekcja 5)
Nadsiarczan amonu (APS)Bio-Rad Laboratories1610700Dla PAGE, katalizator do polimeryzacji akrylamidu (sekcje 5– 7)
Wodny amoniak, 28%miliporówSigma338818Do przygotowania odczynnika deprotekcyjnego AMA (sekcja 5)
Wodna metyloamina, 40%TCI AmericaTCI-M0137Do przygotowania odczynnika deprotekcji AMA (sekcja 5)
Automatyczny syntezator oligonukleotydów DNA / RNAPerSeptive BiosystemsExpedite 8909 Syntezator DNA/RNAdowolny syntezator oparty na kolumnie jest dopuszczalny (sekcja 1)
Magnes wychwytujący koralikiThermoFisher Scientific12320DDo wychwytywania kulek streptawidyny (sekcja 7)
Błękit bromofenolowyBio-Rad Laboratories1610404Do PAGE Bufor mocznikowy (sekcja 5)
Pompa olejowa do głębokiej próżniThermoFisher ScientificVLP200-115Do stosowania z liofilizatorem (sekcja 5)
Drierite dessicanty, 10-20 meshMilliporeSigma737828Środek osuszający do przechowywania chemikaliów i sprzętu do trifosforylacji (sekcje 1– 2)
Krzyżowo-chiralna polimeraza D-RNA 27,3tprzygotowana w domu185′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAAAAAA, GUCGACAAAG, CUUAUACAAG, AACUGUAUCA CCGGAGGGCG, AGCACCACC-3&PRIME;W przypadku reakcji rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)
Stałe podpory D-RNA CPG, 1,000Å, paczkowane 1 &mikro; kolumny syntezy kretówGlen Research20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, przedstawiciel 20-3430-41E, do syntezy oligonukleotydów D-RNA (sekcja 1)
Fosforamidyty chronione przez TOM D-RNAPrzedstawiciel ChemGenesANP-3201, 3202, 3203, 3205do syntezy oligonukleotydów D-RNA (sekcja 1)
Puste kolumny do syntezy przyspieszonej, 1&mikro; mGlen Research20-0021-01Kolumny do syntezy do użytku z syntezatorem Expedite DNA/RNA (sekcja 1)
EPPS, Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(3-propanosulfonowy), stałyMiliporeSigmaE1894Składnik buforu reakcyjnego rybozymu (sekcja 6)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), stałyMilliporeSigmaEDSDewalentny chelator jonów metali do stosowania w różnych ( Sekcje 5 i ndash; 7)
Filtry do kolumn syntezy ExpediteGlen Research20-0021-0FFiltry kolumn syntezy w stylu Expedite, do użytku z pustymi kolumnami syntezy (sekcja 1)
Skaner żelowy fluorescencyjny/fosforyzującyCytivaAmersham Typhoon RGB, 29187193Do wizualizacji analitycznej STRONY (sekcje 6– 7)
Formamid, dejonizowanyVWR Life Science97062Dla bufora ładującego żel formamidowy PAGE (sekcje 6– 7)
Oprogramowanie do kwantyfikacji obrazu żeluCytivaImageQuant TLDo ilościowego oznaczania zeskanowanych obrazów żelu (sekcja 6)
Szklany eksykatorMilliporeSigmaCLS3121150Przechowywanie rozpuszczalnika trifosforylacji (sekcja 2)
Stałe nośniki L-RNA CPG, 1,000 & Aring;, luzemChemGenesN-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10Synteza oligonukleotydów L-RNA (sekcja 1)
Matryca L-RNA młotaprzygotowana w domu185′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′W przypadku reakcji rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)
Starter L-RNAprzygotowany w domu185′-fluoresceina-GGCUCGA-3′W przypadku reakcji rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)
Fosforamidyty chronione L-RNAChemGenesOP ANP-5201, 5202, 5203, 5205Synteza oligonukleotydów L-RNA (sekcja 1)
Liofilizator/liofilizatorVirTisBenchtop KDo koncentracji oligonukleotydów (sekcja 5)
Chlorek magnezu sześciowodny, stałyMilliporeSigmaM2670Do reakcji rybozymowych (sekcje 6– 7)
N,N-dimetyloformamid, bezwodnyMiliporeRozpuszczalnik trifosforylacyjny Sigma227056(sekcja 2)
Kolumna odsalająca NAP-25 (żywica Sephadex G-25)ThermoFisher Scientific45000150Jednorazowe kolumny chromatograficzne wykluczające grawitacyjne z przepływem zawierającym żywicę Sephadex G-25 (sekcja 5)
Igła bez rdzenia ze stali nierdzewnej, 20 GThermoFisher Scientific14-815-410Igły do przekłuwania przegród gumowych (sekcje 2– 4)
Kalkulator współczynnika ekstynkcji oligonukleotydówZintegrowane technologie DNANarzędzie OligoAnalyzerModel najbliższego sąsiada Krótki kalkulator współczynnika ekstynkcji oligonukleotydu 260 nm (sekcja 5)
Roztwór utleniacza, 0,1 M Jod w THF / pirydynie / wodzieOdczynnik do trifosforylacjiChemGenesRN-1456
Tabliczki PAGETimberrock / CBSNGP-250-BO i NODla STRONY (sekcje 5– 7)
Zasilacz PAGEBio-Rad LaboratoriesPowerPac HV 1645056Dla PAGE (sekcje 5– 7)
Przekładki i grzebienie PAGE (analityczne)Timberrock / CBSVGS-0725 i VGC-0714Dla PAGE (sekcje 6– 7)
Przekładki i grzebienie PAGE (preparatywne)Timberrock / CBSVGS-3025R i VGC-3001Dla PAGE (sekcja 5)
Stojak PAGETimberrock / CBSASG-250Dla PAGE (sekcje 5– 7)
Parafilm MThermoFisher Scientific13-374-12 (Bemis PM999)Woskowa folia uszczelniająca do aparatu do trifosforylacji (sekcje 2– 4)
Termocykler PCRBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch ThermalcyclerDo reakcji rybozymów krzyżowych chiralnych (sekcja 7)
PD 10 Kolumna odsalająca (żywica Sephadex G-10)MilliporeSigmaGE17-0010-01Jednorazowe kolumny chromatograficzne wykluczające wielkość przepływu grawitacyjnego zawierające żywicę Sephadex G-10, do oligonukleotydów < 15 nt (sekcja 5)
Sita fosforoweCytiva28956480Do wizualizacji reprezentatywnego RNA znakowanego 32P (sekcja 6)
Odczynniki do syntezy fosforoamidytuGlen Research30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62, do standardowej syntezy RNA/DNA (sekcja 1)
Polipropylenowa zamykana rurka z nakrętkąMilliporeSigmaBR7807521,5 ml probówki mikrowirówkowe z nakrętką i silikonowym O-ringiem, do bezpiecznej deprotekcji AMA ( sekcja 5)
Pirydyna, bezwodnaMilliporeSigma270970Rozpuszczalnik trifosforylacji (sekcja 2)
Chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami/spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylającą (RP-LC/ESI-MS)Novatian/aUsługa komercyjna dla LC/MS specjalizująca się w oligonukleotydach (sekcja 5)
Przegroda gumowa (ID x OD 7,9 mm x 14 mm), białaMilliporeSigmaZ564702Przegrody do przygotowania rozpuszczalników trifosforylacyjnych i TBAP (sekcja 2)
Rybozym E z samoreplikatoremprzygotowany w domu145′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′W reakcjach rybozymowych z samoreplikatorem (sekcja 6)
Podłoże samoreplikatora Aprzygotowane w domu145′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU U-3′-OHDo reakcji rybozymów samoreplikatorowych (sekcja 6)
Substrat B samoreplikatora, transkrybowanyprzygotowany w domu145′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′W reakcjach rybozymowych z samoreplikatorem (sekcja 6)
Małe pułapki suszące, 4 i Aring; sita molekularneChemGenesDMT-1975Pułapki suszące do fosforamidytów syntezatora DNA/RNA i odczynników trifosforylacji (sekcje 1– 2)
Chlorek sodu (NaCl), stałaMilliporeSigmaS7653do stosowania w różnych (sekcje 5– 7)
Wodorotlenek sodu (NaOH), stałaMilliporeSigmaS8045do stosowania w różnych (sekcje 5– 7)
Oprogramowanie do dopasowywania danych statystycznychGraphPadPrismDo dopasowywania danych z analitycznego PAGE do modeli kinetycznych (sekcja 6)
Koraliki magnetyczne pokryte streptawidynąThermoFisher Scientific65002Do wychwytywania RNA znakowanego biotyną w reakcjach rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)
SacharozaMilliporeSigma84097Do bufora ładującego mocznik PAGE (sekcja 5)
TBE bufor biegowy, 10xThermoFisher ScientificAAJ62788K3Dla STRONY (sekcje 5– 7)
Fluorek tetrabutyloamoniowy, 1,0 M roztwór w TetrahydrofuranAldrich216143Do usuwania 2′-sililowych grup ochronnych (sekcja 5)
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Bio-Rad Laboratories1610801Do polimeryzacji akrylamidu dla PAGE (sekcje 5– 7)
TributyloaminaMilliporeSigma90781Odczynnik do trifosforylacji (sekcja 2)
Pirofosforan tributyloamonu (TBAP)MiliporeSigmaP8533Odczynnik trifosforylacji (sekcja 2)
Tris baseMilliporeSigmaT6666Środek buforujący do stosowania w różnych (sekcje 5– 7)
TWEEN20 detergent polisorbatowyMilliporeSigmaP7949Neutralny detergent do stosowania z kulkami magnetycznymi (sekcja 7)
MocznikMiliporeSigmaU5378Do bufora ładującego PAGE i żel (sekcje 5– 7)
Spektrofotometr UV-VisThermoFisher ScientificNanoDrop 2000, ND2000Do pomiaru stężeń oligonukleotydów (sekcja 5)
Wirówka próżniowaThermoFisher ScientificSavant Speedvac DNA130-115 Koncentrator próżniowyDo usuwania AMA i THF (sekcja 5)
Ksylen-cyjanolBio-Rad Laboratories1610423Do PAGE bufor ładujący mocznik (sekcja 5)
, (sekcja 4) sól sól

Bibliografia

  1. Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
  2. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  3. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  4. Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
  5. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
  6. Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5'-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
  7. Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5'-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
  8. Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
  9. Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
  10. Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
  11. Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
  12. Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
  13. Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
  14. Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
  15. Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
  16. Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
  17. Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
  18. Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
  19. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
  20. Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2'-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
  21. Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
  22. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  23. Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
  24. Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
  25. Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
  26. Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
  27. Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
  28. Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
  29. Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
  30. Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
  31. Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 1, Unit1.28 (2012).
  32. Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5'-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5'-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
  33. Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
  34. Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
  35. Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5'-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
  36. Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
  37. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
  38. Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2'-o-methylribonucleoside 5'-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
  39. Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
  40. Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
  41. Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
  42. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
  43. Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
  44. Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
  45. Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
  46. Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
  47. Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 3., Unit 3.6 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oligonukleotydy trifosforany5 trifosforansynteza na fazie sta ejsalicylachlorofosforanreakcja pirofosforanowasynteza L RNAoczyszczanie eloweelektroforeza w elu poliakrylamidowympolimeryzacja RNA
Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.