Obecny protokół opisuje urządzenie do testowania tarcia, które stosuje jednocześnie wzajemne przesuwanie i normalne obciążenie do dwóch stykających się biologicznych powierzchni stykających się.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Obecny protokół opisuje urządzenie do testowania tarcia, które stosuje jednocześnie wzajemne przesuwanie i normalne obciążenie do dwóch stykających się biologicznych powierzchni stykających się.
W pierwotnej chorobie zwyrodnieniowej stawów (OA), normalne "zużycie" związane ze starzeniem się hamuje zdolność chrząstki do podtrzymywania jej funkcji nośnych i smarnych, sprzyjając szkodliwemu środowisku fizycznemu. Interakcje cierne chrząstki stawowej i błony maziowej mogą wpływać na homeostazę stawów poprzez zużycie na poziomie tkanek i mechanotransdukcję komórkową. Aby zbadać te procesy mechaniczne i mechanobiologiczne, opisano urządzenie zdolne do odtworzenia ruchu stawu. Urządzenie do badania tarcia kontroluje dostarczanie obustronnego ruchu transmisyjnego i normalnego obciążenia do dwóch stykających się powierzchni biologicznych. W badaniu tym przyjęto konfigurację błony maziowej na chrząstce, a pomiary współczynnika tarcia przedstawiono dla testów wykonywanych w kąpieli soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub płynie stawowym (SF). Testy przeprowadzono dla różnych naprężeń kontaktowych, podkreślając właściwości smarne SF przy dużych obciążeniach. To urządzenie do testowania tarcia może być używane jako bioreaktor biomimetyczny do badania fizycznej regulacji żywych tkanek stawowych w odpowiedzi na zastosowane obciążenie fizjologiczne związane z diastrodialną artykulacją stawu.
Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest wyniszczającą, zwyrodnieniową chorobą stawów, która dotyka ponad 32 miliony dorosłych Amerykanów, a jej koszty zdrowotne i społeczno-ekonomiczne wynoszą ponad 16,5 miliarda dolarów1. Choroba klasycznie charakteryzowała się degradacją chrząstki stawowej i kości podchrzęstnej; jednak zmiany w błonie maziowej zyskały ostatnio uznanie, ponieważ zapalenie błony maziowej zostało powiązane z objawami i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów2,3,4. W pierwotnej (idiopatycznej) chorobie zwyrodnieniowej stawów normalne "zużycie" związane ze starzeniem się hamuje zdolność chrząstki do podtrzymywania jej funkcji nośnych i smarnych. Wykazano, że naprężenia generowane przez długotrwały kontakt ślizgowy warstw chrząstki stawowej lub kontakt ślizgowy chrząstki z materiałami implantu ułatwiają zużycie rozwarstwiające przez podpowierzchniową awarię zmęczeniową5,6. Ponieważ w obrębie joint7,8, interakcje cierne chrząstki stawowej i błony maziowej mogą wpływać na homeostazę stawów poprzez zużycie na poziomie tkanki i mechanotransdukcję komórkową. Aby zbadać te mechaniczne i mechanobiologiczne procesy, zaprojektowano urządzenie, które odtwarza ruch złącza ze ścisłą kontrolą obciążenia ściskającego i ciernego5,6,9,10,11,12,13.
Obecny protokół opisuje urządzenie do testowania tarcia, które dostarcza ruch odwrotny, translacyjny i obciążenie ściskające do stykających się powierzchni eksplantatów żywej tkanki. Sterowane komputerowo urządzenie pozwala użytkownikowi kontrolować czas trwania każdego testu, przyłożone obciążenie, zakres ruchu etapu tłumaczenia oraz prędkość tłumaczenia. Urządzenie jest modułowe, co pozwala na testowanie różnych powierzchni współpracujących, takich jak tkanka na tkance (chrząstka na chrząstce i błona maziowa na chrząstce) oraz tkanka na szkle. Oprócz pomiarów funkcjonalnych uzyskanych przez tester, tkanki i składniki kąpieli smarowej mogą być oceniane przed i po badaniu w celu oceny zmian biologicznych nadanych przez dany schemat doświadczalny.
Badania nad trybologią chrząstki są prowadzone od dziesięcioleci i opracowano kilka technik pomiaru współczynników tarcia między chrząstką a szkłem i chrząstki na chrząstce14,15. Różne podejścia są motywowane przez interesujący nas przegub i/lub mechanizm smarowania. Często istnieje kompromis między kontrolą zmiennych eksperymentalnych a rekapitulacją parametrów fizjologicznych. Urządzenia typu wahadłowego wykorzystują nienaruszone połączenia jako punkt podparcia prostego wahadła, w którym jedna powierzchnia stawu swobodnie przesuwa się nad drugą powierzchnią14,16,17,18. Zamiast używać nienaruszonych połączeń, pomiary tarcia można uzyskać, przesuwając eksplantaty chrząstki po pożądanych powierzchniach14,19,20,21,22,23,24,25. Zgłaszane współczynniki tarcia chrząstki stawowej różniły się w szerokim zakresie (od 0,002 do 0,5) w zależności od warunków pracy14,26. Urządzenia zostały stworzone w celu replikowania ruchu obrotowego23,27,28. Gleghorn et al.26 opracowali wielodołkowy niestandardowy trybometr do obserwacji profili smarowania chrząstki za pomocą analizy krzywej Stribecka, a liniowy oscylacyjny ruch ślizgowy został zastosowany między chrząstką a płaską szklaną powierzchnią czołową.
To urządzenie ma na celu izolowanie reakcji tarcia i badanie mechanobiologii żywych tkanek w różnych warunkach obciążenia. Urządzenie wykorzystuje uproszczoną konfigurację testową symulującą artykulację stawu poprzez przesuwanie ściskające, która może przybliżyć zarówno ruch toczny, jak i ślizgowy, przy założeniu, że opór w czystym ruchu toczenia jest znikomy w stosunku do zmierzonego współczynnika tarcia chrząstki stawowej29. Pierwotnie zbudowany do badania wpływu ciśnienia płynu śródmiąższowego na reakcję tarcia chrząstki stawowej9, tester był od tego czasu używany do zgłębiania takich tematów, jak efekty tarcia wynikające z usunięcia powierzchownej strefy chrząstki10, smarowanie wpływu płynu maziowego11, hipotezy zużycia chrząstki5,6,30oraz pomiary tarcia błony maziowej o tkankę13. Bioreaktor do testowania tarcia może przeprowadzać eksperymenty z tarciem w sterylnych warunkach, zapewniając nowy mechanizm do badania, w jaki sposób siły tarcia wpływają na reakcje mechanobiologiczne żywej chrząstki i błony maziowej. Konstrukcja ta może być wykorzystana jako bioreaktor biomimetyczny do badania fizycznej regulacji żywych tkanek stawowych w odpowiedzi na zastosowane obciążenie fizjologiczne związane z diagonalną artykulacją stawu.
To badanie przedstawia konfigurację do testowania tarcia między chrząstką stawową a chrząstką w szerokim zakresie naprężeń kontaktowych i w różnych kąpielach smarowych. Powierzchnia przegubowa większości stawów to w dużej mierze tkanka maziowa31. Podczas gdy ślizganie się błony maziowej na chrząstce nie występuje na pierwotnych powierzchniach nośnych, interakcje tarcia między dwiema tkankami mogą nadal mieć ważne implikacje dla naprawy na poziomie tkanki i mechanotransdukcji komórek. Wcześniej wykazano, że podobne do fibroblastów synowiocyty (FLS) znajdujące się w warstwie wewnętrznej błony maziowej są mechanowrażliwe, reagując na naprężenia ścinające wywołane płynem32. Wykazano również, że stretch33,34 i naprężenie ścinające wywołane płynem35 modulują produkcję smaru FLS. W związku z tym bezpośredni kontakt ślizgowy między błoną maziową a chrząstką może stanowić kolejny bodziec mechaniczny dla komórek rezydujących w błonie maziowej.
Opublikowano tylko kilka raportów na temat współczynników tarcia błony maziowej31,36. Estell et al.13 starali się rozszerzyć poprzednią charakterystykę, wykorzystując biologicznie istotne powierzchnie przeciwstawne. Dzięki zdolności urządzenia do badania tarcia do badania żywych tkanek, możliwe jest naśladowanie fizjologicznych interakcji tkanek podczas artykulacji stawu, aby wyjaśnić rolę kontaktowego naprężenia ścinającego na funkcję synowiocytów i jego wkład w przesłuch między błoną maziową a chrząstką. Ten ostatni jest zaangażowany w pośredniczenie w zapaleniu stawów maziowych w zapaleniu stawów i po urazie. Ze względu na fizyczną bliskość chrząstki do błony maziowej i mazi stawowej, które zawierają synowiocyty wykazujące zdolność multipotencjalną, w tym chondrogenezę, postuluje się, że synowiocyty odgrywają rolę w homeostazie i naprawie chrząstki poprzez wszczepienie do powierzchni stawowej. W tym kontekście, kontakt fizyczny i wzajemne ścinanie chrząstki-błony maziowej i błony maziowej-błony maziowej może zwiększyć dostępność synowacytów do regionów uszkodzenia chrząstki37,38,39,40. Badania wykorzystujące konfiguracje błony maziowej na chrząstce nie tylko dostarczą wglądu w mechanikę tkanek dużych stawów i trybologię, ale mogą również prowadzić do nowych strategii utrzymania zdrowia stawów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Do niniejszego badania wykorzystano młodociane stawy kolanowe bydła, uzyskane z lokalnej rzeźni. Badania na takich próbkach bydła są zwolnione z obowiązku Kalifornijskiego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt (IACUC).
1. Projektowanie urządzenia do testowania tarcia
UWAGA: Schematyczne przedstawienie urządzenia do badania tarcia jest pokazane w Rysunek 1. Urządzenie jest zbudowane na sztywnej płycie podstawy (nie pokazanej), która służy jako platforma do podparcia konstrukcji.
2. Przygotowanie i montaż próbki
3. Testy tarcia
UWAGA: Do tych testów używany jest niestandardowy program LabVIEW i związany z nim sprzęt (zobacz Dodatkowe pliki kodowania). Należy pamiętać, że kod niestandardowy został zbudowany w programie LabVIEW 2010 i został zachowany w tej samej starszej wersji. W związku z tym kod może nie być zgodny z najnowszą wersją oprogramowania. Następujące ostrzeżenia przycisków i odwołania do interfejsu użytkownika będą miały zastosowanie tylko do kodu niestandardowego. W przypadku pracy z inną wersją oprogramowania podobny program niestandardowy można napisać, modyfikując kod.
4. Przetwarzanie danych
UWAGA: Do przetwarzania danych używany jest niestandardowy program MATLAB (zobacz Dodatkowe pliki kodowania). Kod wywołuje pliki wyjściowe określone przez niestandardowy kod LabVIEW.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Konfiguracja synovium-on-chrząstka została użyta do badania tarcia eksplantatów młodego bydła. Błona maziowa została zamontowana na akrylowej płycie obciążeniowej o średnicy 10 mm w taki sposób, aby warstwa wewnętrzna stykała się z leżącą poniżej chrząstką. Jako powierzchnię współpracującą z chrząstką zastosowano pasek piszczelowy (Rysunek 6A). Paski piszczelowe zostały nacięte na głębokość około 1,4 mm i rozmiar 10 mm x 30 mm. Próbki badano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w kąpieli soli fizjolog...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W stawie istnieje dynamiczne środowisko mechaniczne, w którym chrząstka jest poddawana siłom ściskającym, rozciągającym i ścinającym oraz ciśnieniom hydrostatycznym i osmotycznym44,45. Chociaż chrząstka jest główną tkanką nośną stawu, błona maziowa ulega również interakcjom tarcia z powierzchnią chrząstki i z samą sobą w regionach, w których tkanka się fałduje. Fizyczne interakcje między chrząstką a błoną maziową są prawdopodobnie odpowiedzialne za przenoszenie k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Ta praca była wspierana przez Orthopaedic Scientific Research Foundation, NIH 5R01 AR068133, NIH TERC 5P41EB027062 i NIGMS R01 692 GM083925 (ID fundatora: 10.13039/100000057).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Folia aluminiowa | Reynolds Group Holdings | Reynolds Wrap | Sterylne zbieranie tkanek |
| Obudowa akrylowa z aluminiową ramą | Wykonany | Element testera tarcia | |
| Autoklawowalne woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem | Fisherbrand | 01-812-54 | Sterylizacja narzędzi |
| Autoklaw | Buxton | Sterylizacja narzędzi | |
| Zlewka (250 mL) | Pyrex Vista | 70000 | Pobieranie tkanek |
| Betadine (roztwór do przygotowania jodu powidonu) | Medline Industries, LP | MDS093906 | Sterylne pobieranie tkanek |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Labconco | Purifier Logic+ Klasa II, typ A2 BSC | Sterylne pobieranie tkanek |
| Stempel Biospy | Steritool Inc. | 50162 | Pobieranie tkanek |
| Nóż do pudełek | American Safety Razor Company | 94-120-71 | Pobieranie tkanek |
| Okrągły słupek akrylowo-silikonowy (synovium) | Wykonane | Mocowanie tkanek | |
| Pożywki | hodowlane Wykonane | DMEM (nr kat. 11-965-118; Gibco) uzupełnione o 50 μ g/ml L-proliny (Kat. Nr P5607; Sigma), 100 μ g/ml pirogronianu sodu (Kat. Nr S8636; Sigma), 1% ITS (Kat. Nr 354350; Corning) i 1% antybiotyku– przeciwgrzybicze (Kat. Nr 15-240-062, Gibco) | |
| Cyjanoakrylan (Loctite 420 Clear) | Henkel | 135455 | Montaż tkanek |
| Ciężary własne | OHAUS | Normalne obciążenie | |
| Etanol 200 proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | Rozcieńczony do 70 % |
| stałej bazy | ThorLabs, Inc. | SB1T | Element testera tarcia |
| Kleszcze (zbiór błony maziowej) | Fine Science Tools | 11019-12 | Kleszcze do pobierania tkanek |
| (montaż błony maziowej) | Excelta | 3C-S-PI | Montaż tkanek |
| Poziomy enkoder liniowy (do etapu translacji) | RSF Electronics, Inc. | MSA 670.63 | Tester tarcia; rozdzielczość systemu 1 µ m |
| Pistolet do klejenia na gorąco i klej | FPC Corporation | Surebonder Pro 4000A | Montaż tkanek |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | LabVIEW 2010 | Program testowania tarcia |
| Ogniwo obciążnikowe | JR3 Inc. | 20E12A-M25B | Tester tarcia; rozdzielczość 0.0019 lbs w x& y, rozdzielczość 0,0038 funta w z |
| Płyta dociskowa | Wykonane | O-ring do montażu tkanek | |
| Parker | S1138AS568-009 | Montaż tkanek | |
| szalce Petriego (60 mm) | Falcon | 351007 | Montaż tkanek |
| Pozycjoner roboczy PivotLok (uchwyt piszczeli) | Industry Depot, Pivot Lok | PL325 | Pobieranie tkanek |
| Zdejmowana podstawa | ThorLabs, Inc. | SB1B | Element testera tarcia |
| Stojak | Zbieranie tkanek | ||
| Ostrza skalpela | Havel's Inc. | FSC22 | Uchwyt do zbioru tkanek |
| Rękojeść skalpela | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Nr 4 | Śrubokręt do zbierania tkanek |
| Wera | 3334 | Etap pobierania tkanek | |
| JMAR | Element testera tarcia | ||
| Silnik krokowy | Oriental Motor Co., Ltd. | PK266-03B | Element testera tarcia |
| Narzędzie ssące | Virtual Industries, Inc. | PEN-VAC Pióro próżniowe | Montaż tkanek |
| Pręt nośny | Wykonane | Montaż tkanek | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14061-09 | Montaż tkanek |
| Płyn maziowy (bydlęcy) | Animal Technologies, Inc. | Kąpiel do badania tarcia | |
| Kąpiel testowa | Specjalnie wykonana | fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z inhibitorami proteazy: 0,04% biocyd na bazie izotiazolonu (Proclin 950 Cat. Nr 46878-U; Sigma) i 0,1% inhibitor proteazy - 0,05 M kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA (Kat. Nr 0369; Sigma) | |
| Inkubator do hodowli tkankowych | Fisher Scientific | Isotemp | Sterylna kultura |
| Pionowy enkoder liniowy (do etapu ładowania) | Renishaw | T1031-30A | Element testera tarcia; Rozdzielczość 20 nm |
| Siłownik cewki drgającej | H2W Technologies | NCC20-15-027-1RC | Element testera tarcia |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie