Artykuł metodologiczny

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

DOI:

10.3791/63885

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entomopatogeniczne nicienie z rodzajów Heterorhabditis i Steinernema są obowiązkowymi pasożytami owadów żyjących w glebie. Główną cechą ich cyklu życiowego jest wzajemne powiązanie z bakteriami Photorhabdus i Xenorhabdus. Nicienie są w stanie zlokalizować i wniknąć do odpowiednich gospodarzy owadów, obalić odpowiedź immunologiczną owadów i skutecznie się rozmnażać, aby wyprodukować następne pokolenie, które będzie aktywnie polować na nowe ofiary owadów w celu zarażenia. Ze względu na właściwości swojego cyklu życiowego nicienie entomopatogeniczne są popularnymi środkami kontroli biologicznej, które są stosowane w połączeniu z insektycydami do zwalczania destrukcyjnych szkodników owadzich w rolnictwie. Jednocześnie te pasożytnicze nicienie stanowią narzędzie badawcze do analizy patogenności nicieni i odpowiedzi anty-nicieni gospodarza. Badania te są wspomagane przez niedawny rozwój technik genetycznych i podejść transkryptomicznych w celu zrozumienia roli cząsteczek wydzielanych przez nicienie podczas infekcji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół dotyczący utrzymywania nicieni entomopatogenicznych i stosowania procedury knockdown genu. Metodologie te dodatkowo wspierają funkcjonalną charakterystykę entomopatogenicznych czynników infekcji nicieniami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad entomopatogenicznymi nicieniami (EPN) zintensyfikowały się w ciągu ostatnich kilku lat, głównie ze względu na użyteczność tych pasożytów w zintegrowanych strategiach ochrony przed szkodnikami i ich udział w podstawowych badaniach biomedycznych1,2. Ostatnie badania ustaliły, że EPN jest organizmem modelowym, w którym bada się składniki genetyczne nicieni, które są aktywowane na różnych etapach procesu infekcji. Informacje te dostarczają kluczowych wskazówek na temat natury i liczby cząsteczek wydzielanych przez pasożyty w celu zmiany fizjologii gospodarza i destabilizacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej owadów3,4. Jednocześnie wiedza ta jest często uzupełniana przez nowe szczegóły dotyczące rodzaju szlaków sygnalizacji immunologicznej gospodarza owada i funkcji, które regulują w celu ograniczenia wnikania i rozprzestrzeniania się patogenów5,6. Zrozumienie tych procesów ma kluczowe znaczenie dla wyobrażenia sobie obu stron dynamicznej interakcji między EPN a ich owadzimi gospodarzami. Lepsze zrozumienie relacji EPN – owad żywiciel niewątpliwie ułatwi podobne badania na pasożytniczych nicieniach ssaków, które mogą prowadzić do identyfikacji i charakterystyki czynników infekcyjnych, które zakłócają działanie układu odpornościowego człowieka.

Nicienie EPN Heterorhabditis sp. i Steinernema sp. mogą infekować szeroką gamę owadów, a ich biologia była wcześniej intensywnie badana. Te dwa pasożyty nicieni różnią się sposobem rozmnażania, przy czym Heterorhabditis jest samozapłodniony, a Steinernema przechodzi rozmnażanie amfimityczne, chociaż ostatnio wykazano, że S. hermaphroditum rozmnaża się przez samozapłodnienie hermafrodytów lub przez partenogenezę7,8,9. Inną różnicą między nicieniami Heterorhabditis i Steinernema jest ich symbiotyczny mutualizm z dwoma odrębnymi rodzajami bakterii Gram-ujemnych, odpowiednio Photorhabdus i Xenorhabdus, które są silnymi patogenami owadów. Bakterie te znajdują się w wolno żyjącym i nieżerującym zakaźnym stadium młodocianym (IJ) EPN, które wykrywają podatnych gospodarzy, uzyskują dostęp do hemocoela owada, gdzie uwalniają związane z nimi bakterie, które szybko się replikują i kolonizują tkanki owadów. Zarówno EPN, jak i ich bakterie wytwarzają czynniki wirulencji, które rozbrajają obronę owadów i upośledzają homeostazę. Po śmierci owadów nicienie IJ rozwijają się, aby stać się dorosłym EPN i zakończyć swój cykl życiowy. Nowa kohorta IJ utworzona w odpowiedzi na brak pożywienia i przeludnienie w zwłokach owadów w końcu pojawia się w glebie, aby polować na odpowiednich gospodarzy9,10,11,12.

Tutaj opisany jest skuteczny protokół do utrzymywania, wzmacniania i genetycznego manipulowania nicieniami EPN. W szczególności protokół przedstawia replikację symbiotycznych H. bacteriophora i S. carpocapsae IJs, wytwarzanie IJ nicieni aksenowych, produkcję hermafrodytów H. bacteriophora do mikroiniekcji, przygotowanie dsRNA oraz technikę mikroiniekcji. Metody te są niezbędne do zrozumienia molekularnych podstaw patogeniczności nicieni i odporności antynieniowej gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja symbiotycznych zakaźnych młodocianych nicieni

  1. Przykryj szalkę Petriego (10 cm) kawałkiem bibuły filtracyjnej i dodaj około 10-15 larw Galleria mellonella (Rysunek 1A).
  2. Za pomocą pipety dozować 2 ml wody zawierającej około 25-50 IJ na 10 μl zawiesiny na woskownice. Przechowuj szalkę Petriego w szafce w temperaturze pokojowej.
  3. W zależności od wilgotności bibuły filtracyjnej dodawaj 1-2 ml wody co 2 dni. Robaki woskowe zakażone IJ zwykle umierają w ciągu 48 godzin.
  4. Przygotuj pułapki wodne White'a około 10 dni po zarażeniu woskownic IJs8 (Rysunek 1B,C). Ostrożnie przenieś martwe owady na nienamoczoną część bibuły filtracyjnej. Użyj wody z kranu, aby napełnić dolną szalkę Petriego i umieść nakrętkę z probówki o pojemności 15 ml jako przekładkę do wentylacji.
  5. Ostrożnie przenieś miękkie i delikatne woskownice, powoli podnosząc je z bibuły filtracyjnej za pomocą plastikowych kleszczy. Używaj wody z kranu zamiast wody demineralizowanej lub dejonizowanej. Te ostatnie powodują agregację nicieni.
    1. Upewnij się, że poziom wody w syfonie sięga około połowy wysokości szalki Petriego. Spodziewaj się, że poziom wody będzie się zmieniał z czasem w zależności od warunków temperatury i wilgotności w pomieszczeniu.
  6. Gdy woda na małej szalce Petriego stanie się mętna z powodu obecności nicieni, użyj pipety, aby przenieść nową generację IJ do kolby do hodowli komórkowych T25 lub T75.
  7. Dodaj wodę z kranu do około 40% objętości, aż do osiągnięcia odpowiedniej gęstości (Rysunek 1C). Unikać przekrwienia nicieni i przechowywać kolby do hodowli komórkowych poziomo.
  8. Dodaj więcej wody na dolną szalkę Petriego i powtarzaj kroki 1.6 i 1.7, aż IJ przestaną wyłaniać się z tusz owadów w ciągu około 3-5 dni.

2. Produkcja zakaźnych młodocianych nicieni aksenicznych

UWAGA: Nicienie akseniczne są używane, ponieważ po dysocjacji kompleksu nicienio-bakterii wewnątrz owada, każdy partner mutualistyczny wywołuje odrębną odpowiedź immunologiczną gospodarza5. Zmutowany szczep Ret16 Photorhabdus temperata jest używany, ponieważ bakterie te wspomagają wzrost H. bacteriophora, ale nie są w stanie skolonizować nicienia gut13,14.

  1. Młodociany zakaźny Heterorhabditis bacteriophora
    1. Za pomocą sterylnej końcówki pipety lub szpatułki zeskrob kilka płatków zamrożonej kultury P. temperata Ret16 na płytkę MacConkey i rozprowadź smugi w poszukiwaniu pojedynczych kolonii. Inkubować płytkę przez 2-3 dni w temperaturze 28 °C.
    2. Zaszczepić 10 ml bulionu LB z kolonią w probówce o pojemności 50 ml i inkubować kulturę przez noc w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wytrząsaniem. Używaj tylko kolonii fazy pierwotnej, które są czerwone na agarze MacConkey. Kolonie fazy wtórnej będą białawe na agarze MacConkey.
    3. Przepłukać 100 μl nocnej hodowli 900 μl 1x PBS, odwirowując w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy 17 900 x g. Zdekantować supernatant. Rozcieńczyć kulturę 10x w 1x PBS. Pozostaw tubkę na lodzie.
    4. Zanurz woskownice w 70% roztworze etanolu, osusz owady ręcznikiem papierowym i umieść je w probówce o pojemności 50 ml.
    5. Umieść rurkę na lodzie na 20 minut, aby unieruchomić woskownice.
    6. Użyj bibuły filtracyjnej, aby przykryć górną i dolną połowę szalki Petriego (10 cm). Pokrywkę szalki Petriego pokrytą bibułą filtracyjną należy użyć jako podstawy do wstrzykiwań. Zwilżyć bibułę filtracyjną dolnej szalki Petriego i przenieść na lód, aby pomóc wstrzykniętym woskownicom w regeneracji.
    7. Odpipetować 50 μl lodowatych bakterii na kawałku parafilmu i przygotować strzykawkę igłową 22 G. Delikatnie nacisnąć tłok, aby usunąć powietrze z końcówki igły.
    8. Trzymaj woskowinę blisko tylnego końca pod stereoskopem (Ryc. 2).
    9. Wstrzyknąć 50 μl kultury bakteryjnej w grzbietową stronę klatki piersiowej, najlepiej na styku dwóch segmentów. Aby zminimalizować uszkodzenia wewnętrzne, należy wstrzyknąć tuż pod naskórek, jak to możliwe równolegle do woskownicy. To naturalne, że kropla hemolimfy wykrwawia się po przekłuciu woskowiny
    10. Przenieś wstrzyknięte owady na szalkę Petriego.
    11. Powtarzaj kroki 2.1.7-2.1.9, aż wszystkie owady zostaną wstrzyknięte wraz z bakteriami. Aby znieczulić owady, umieść je na lodzie na 5 minut.
    12. Umieść szalkę Petriego w ciemności (np. w szufladzie lub szafce) i dodaj wodę z kranu do bibuły filtracyjnej, jeśli wydaje się sucha. Robaki ulegają 2 dni po wstrzyknięciu i stają się ceglastoczerwone po około 3-4 dniach. Jeśli owady wydają się brązowe, oznacza to, że infekcja bakteryjna nie powiodła się.
    13. Po 7 dniach od zakażenia przenieś owady o charakterystycznym ceglastoczerwonym kolorze na świeżą szalkę Petriego wyłożoną bibułą filtracyjną i kontynuuj "Produkcję symbiotycznych zakaźnych młodych nicieni" z kroku 1. Jeśli używasz nicieni symbiotycznych, powtórz procedurę od kroku 2.1. przy użyciu nowo wyprodukowanych IJ z pierwszej rundy.
    14. Sterylizacja powierzchniowa H. bacteriophora IJs
      1. Zebrać wystarczającą ilość symbiotycznych H. bacteriophora i kandydujących aksenowych IJ przez odwirowanie, aby uzyskać 100 μl osadu w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      2. Dodaj 500 μl 5% wybielacza do osadu w każdej probówce do mikrowirówki i odwróć. Inkubować przez 10 minut. Wirować przy 17 900 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.
      3. Umyj granulat 1 ml sterylnej wody i powtórz wirowanie. Usunąć supernatant. Powtórz ten krok jeszcze cztery razy.
    15. Weryfikacja axenicity
      1. Odpipetować 400 μl sterylnej wody do przemytych symbiotycznych i kandydujących nicieni H. bacteriophora.
      2. Umieść nicienie na owadach na szalce Petriego i odpowiednio oznacz zabiegi.
      3. Umieść szalki Petriego z zainfekowanymi owadami w ciemności i okresowo sprawdzaj, czy woskownice zmieniają kolor na czerwony.
        UWAGA: Robaki woskowe zakażone nicieniami symbiotycznymi H. bacteriophora stają się czerwone w ciągu 2 dni od zakażenia. Przebarwienia woskowiny są spowodowane wydzielaniem różnych związków wytwarzanych przez mutualistyczne bakterie Photorhabdus podczas procesu infekcji. Brak czerwonego koloru u zakażonych woskownic 4 dni po zakażeniu potwierdza, że H. bacteriophora są akseniczne. Dzieje się tak, ponieważ bakterie P. temperata Ret16 nie są obecne w jelicie nicieni.
    16. Alternatywna metoda weryfikacji aksenności
      1. Sterylizuj powierzchniowo symbiotyczne H. bacteriophora IJ i kandydujące akseniczne H. bacteriophora IJ, jak opisano w kroku 2.1.14.
      2. Homogenizować około 500 IJs w 500 μL sterylnego 1x PBS w probówkach do mikrofuge za pomocą sterylnych tłuczków. Odwirować homogenat, zdekantować supernatant i rozprowadzić go na agarze LB. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 24 godziny.
      3. Policz jednostki tworzące kolonie (CFU) dla każdej płytki. Próbki z aksenu H. bacteriophora nie utworzą żadnych kolonii symbiotycznych bakterii P. luminescens.
  2. Steinernema carpocapsae Zakaźne osobniki młodociane
    1. Przygotowanie płytek z agarem lipidowym (300 ml roztworu daje około 20 podzielonych płytek)
      1. Zważ 2,4 g bulionu odżywczego, 4,5 g ekstraktu drożdżowego i 1,5 g agaru i dodaj je do 267 ml wody dejonizowanej. Autoklaw roztworu.
      2. Dodaj 3 ml 1 M MgCl2, 1,2 ml oleju kukurydzianego i 28,8 ml 7% syropu kukurydzianego.
      3. Przygotować i dodać do roztworu 300 μl 30 mg/ml kanamycyny i 300 μl 50 mg/ml ampicyliny (sterylizowane filtrem 0,2 μm).
      4. Zdekantować mieszaninę na jedną połowę podzielonej szalki Petriego/podzielonej płytki.
    2. Przygotowanie trawnika bakteryjnego X. nematophila (szczep ΔrpoS)
      1. Hodowla X. nematophila (Xn) ΔrpoS bezpośrednio z zamrożonego bakteryjnego zapasa w 2 ml roztworu LB/kan/amp na wytrząsarce w temperaturze 30 °C przez noc.
      2. Zaszczepić 5 ml pożywki LB zawierającej 30 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ampicyliny z 250 μl nocnej kultury i hodować bakterie przez noc na shakerze.
        UWAGA: Bakterie Xn nie rozwijają się dobrze, gdy są smugowane bezpośrednio na selekcyjnych pożywkach agarowych lipidowych z zamrożonego wywaru. W razie potrzeby pierwszorzędową i drugorzędową fazę Xn można najpierw potwierdzić na pożywce NBTA (agar odżywczy uzupełniony 25 mg błękitu bromotymolowego l-1 i 40 mg chlorku trifenylotetrazolu l-1) przed rozpoczęciem świeżej hodowli płynnej.
      3. Odpipetować 100 μl kultury na płytki z agarem lipidowym i rozprowadzić na całej płytce za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 30 °C.
    3. Sterylizacja powierzchniowa S. carpocapsae IJs
      1. Pozostawić kolbę zawierającą IJ pod takim kątem, aby IJ opadły do rogu kolby. Odessać 1 ml osiadłych IJ do probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 17 900 x g przez 10 s. Usunąć supernatant.
      2. Dodaj 1 ml 1% świeżo przygotowanego roztworu wybielacza. Odwróć probówki, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 1 minutę (długotrwała inkubacja wybielacza doprowadzi do śmierci IJ). Wirować ponownie przez 10 s. Usunąć supernatant.
      3. Aby usunąć pozostałości wybielacza, umyj nicienie 1 ml sterylnej wody destylowanej i odwiruj przez 10 sekund. Usuń supernatant. Powtórz pranie jeszcze cztery razy.
      4. Oszacuj liczbę IJ na ml, licząc 10-20 μl przemytych IJ pod stereoskopem i odpowiednio dostosuj stężenie IJ.
    4. Hodowla S. carpocapsae IJs
      1. Przenieść pipetą około 1000 IJs na płytki podzielone z agarem lipidowym (Rysunek 3, ilustracja po lewej). Umieść talerze w nawilżonej szafce lub szufladzie. Użyj wilgotnych ręczników papierowych, aby zwiększyć wilgotność. Utrzymuj płytki w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
      2. Sprawdzaj ręczniki papierowe co drugi dzień, aby upewnić się, że pozostają wilgotne. W razie potrzeby co drugi dzień dolewaj wodę do ręczników papierowych, aby utrzymać wilgotność w szafce lub szufladzie. Alternatywnie umieść łaźnię wodną na dnie szafki, aby zwiększyć wilgotność.
      3. Kiedy pojawiają się tylko IJ, dodaj wodę po drugiej stronie płytki i umieść warstwę bibuły filtracyjnej na środku płytki (syfon, Rysunek 3, ilustracja po prawej). Zebrać tę wodę zawierającą IJ z pierwszej rundy do kolby do hodowli komórkowych T75. Są to nicienie Round I S. carpocapsae.
      4. Ponownie wysterylizować powierzchnię wybielaczem (krok 2.2.3) i powtórzyć proces od kroku 2.2 przy użyciu nicieni S. carpocapsae z rundy 1. Wynikiem będzie runda 2 nicieni S. carpocapsae.
      5. Sprawdzaj pod stereoskopem co kilka dni, aby śledzić rozwój nicieni.
    5. Weryfikacja stanu aksonicznego S. carpocapsae IJs
      1. Wysterylizuj powierzchniowo Round 1, Round 2 i symbiotyczne S. carpocapsae IJs wybielaczem, jak opisano w kroku 2.2.3.
      2. Homogenizuj około 400-700 IJ w probówkach do mikrofuge za pomocą sterylnych plastikowych tłuczków. Odwirować homogenat, zdekantować supernatant i rozprowadzić roztwór na płytkach agarowych LB. Przechowywać płytki agarowe w inkubatorze ustawionym na temperaturę 28 °C przez 24 godziny.
      3. Policz tworzenie się CFU dla każdej płytki. Próbki od nicieni aksenowych nie powodują żadnego wzrostu bakterii.
    6. Weryfikacja stanu aksenicznego S. carpocapsae IJs metodą PCR
      1. Wysterylizuj powierzchniowo Round 1, Round 2 i symbiotyczne S. carpocapsae IJs wybielaczem, jak opisano w kroku 2.2.3.
      2. Ekstrahować DNA z homogenatu. Szczegółowa procedura ekstrakcji została opisana w sekcji 4.1.2 poniżej.
      3. Przeprowadzić PCR przy użyciu starterów XptA2 o temperaturze wyżarzania 61 °C:
        XptA (Biblioteka Miniaturowa) F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
        XptA (Biblioteka Miniaturowa) R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
        UWAGA: Te startery wzmacniają owadobójczy gen XptA2 X. nematophila, wytwarzając amplikon o wielkości 231 pz. Program cykliczny był następujący: 95 °C przez 2 min, 34 cykle po 95 °C przez 30 s, temperatura wyżarzania 61 °C przez 1 min i 73 °C przez 1 min, a następnie 72 °C przez 10 min.
      4. Wizualizuj amplifikowane fragmenty przez oddzielenie w 1,5% żelu agarozowym. Próbki sterylizowane powierzchniowo aksenem nie tworzą żadnych prążków.

3. Hodowla hermafrodytów H. bacteriophora do mikroiniekcji

  1. Przygotuj 6 cm płytki Petriego z NA+chol (1,5x bulion odżywczy, 1,5% agar i 10 μg/ml cholesterolu).
  2. Przygotuj 3 ml roztworu PP3 (2% Protease Peptone #3, PP3) w probówce hodowlanej o pojemności 10 ml.
  3. Za pomocą sterylnej końcówki o pojemności 20 μl zeskrobać górną część bulionu glicerolowego P. luminescens (sterylny glicerol 25% obj.) utrzymywanego w temperaturze -80 °C i wrzucić go do probówki hodowlanej.
  4. Inkubować probówkę przez noc w wytrząsarce o kontrolowanej temperaturze, ustawionej na 28 °C, 200 obr./min.
  5. Następnego dnia kultura będzie miała jasnoczerwony kolor. Umieść 50 μl kultury na 6 cm szalce Petriego NA+chol i rozprowadź ją za pomocą rozsiewacza bakteryjnego w sposób okrężny.
  6. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 28 °C. Trawnik P. luminescens będzie gotowy w ciągu 24-36 godzin i będzie miał jasnoczerwony kolor.
  7. Zaszczepić płytkę 50-100 powierzchniowo wysterylizowanymi IJ i utrzymywać płytkę w temperaturze 28 °C.
  8. Zdrowy hermafrodyta L4 zacznie pojawiać się około 48-54 godzin po inokulacji. Do wstrzykiwań potrzebne są zdrowe, niewygłodzone hermafrodyty L4 H. bacteriophora hermafrodyty.

4. Przygotowanie dsRNA

  1. Wzór podkładu
    1. Zaprojektuj startery dla dsRNA, aby celować w regiony egzonów ~ 500 par zasad DNA H. bacteriophora.
      1. Startery dla obszarów zainteresowania można określić za pomocą Primer3 (https://primer3.ut.ee) lub podobnego programu, wybierając optymalną długość produktu 500 par zasad, Tm 60 °C i długość startera 22 nukleotydy.
      2. Dodaj miejsce T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) do końców 5′ każdego startera do przodu, aby umożliwić transkrypcję in vitro.
  2. Izolacja genomowego DNA
    1. Użyj genomowego DNA wyizolowanego z zamrożonych osadów ~ 50 000 H. bacteriophora IJs do syntezy dsRNA.
    2. Użyć osadu IJ zawieszonego w 50 μl buforu do lizy (50 mM KCl, 0,05% (w/v) żelatyny, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 μg/ml proteinazy K, 2,5 mM MgCl2) umieszczonego w temperaturze -80 °C na co najmniej 30 min.
    3. Homogenizuj pastylkę za pomocą małego tłuczka w kształcie tuby.
    4. Podgrzać roztwór do temperatury pokojowej i inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, wirując co 15 minut.
    5. Denaturację proteinazy K poprzez inkubację homogenizowanej tkanki przez 15 minut w temperaturze 95 °C.
    6. Schłodzić próbkę do temperatury 4 °C i odwirować przy 3 400 x g przez 1 minutę.
    7. Otrzymany supernatant należy wykorzystać jako matrycę do późniejszej reakcji PCR.
    8. Przygotuj reakcję PCR o objętości 50 μl, używając komercyjnej mieszanki wzorcowej z 200 ng matrycy DNA, 0,2 μM startera do przodu i do tyłu oraz sugerowanymi przez producenta warunkami cyklu.
    9. Przeanalizuj reakcję PCR na 1,2% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy w wyniku reakcji powstały pojedyncze prążki o przewidywanej wielkości.
  3. Synteza dsRNA
    1. Użyj komercyjnego zestawu do transkrypcji.
    2. Do transkrypcji in vitro należy użyć reakcji PCR o objętości 5 μl. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Inkubować reakcję przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.
    4. Oczyść reakcje transkrypcji in vitro za pomocą komercyjnego zestawu z użyciem octanu amonu/etanolu w celu zagęszczenia dsRNA.
    5. Zawiesić granulowane dsRNA w 10 μl wody wolnej od RNaz.
    6. Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru.
    7. Oceń jakość, oddzielając dsRNA na 1,2% żelu agarozowym

5. Mikroiniekcja

UWAGA: Podkładka iniekcyjna to szklane szkiełko nakrywkowe z warstwą 2% (w/v) agarozy na środku. Kiedy robaki, które mają zostać wstrzyknięte, zostaną przeniesione do tych opuszków, warstwa agarozy unieruchomi je do zabiegu. Zwykle dodatkowe pady są przechowywane w pobliżu mikroskopu do ogólnego użytku.

  1. Przygotowanie podkładki iniekcyjnej
    1. Zagotuj 2% agarozy w wodzie, dodając 0,2 g agarozy do 10 ml wody.
    2. Umieść 1-4 krople (~50 μl) na środku cienkiego szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 50 mm x 70 mm.
    3. Użyj innego szkiełka nakrywkowego, aby spłaszczyć kroplę.
    4. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia na 2-3 minuty przed zsunięciem szkiełka nakrywkowego na boki.
    5. Zaznaczyć literą "R" prawą stronę szkiełka nakrywkowego skierowanego do góry.
    6. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 1 dzień przed ich użyciem.
  2. Przygotowanie igieł iniekcyjnych
    1. Użyj szklanych kapilar o średnicy 1,0 mm zawierających wewnętrzne drobne włókno. Pozwala to na sprawne napełnianie igły.
      UWAGA: Można użyć dowolnego komercyjnego ściągacza igieł (np. Narishige PB-7).
    2. Włącz ściągacz igieł.
    3. Upewnij się, że grzałka jest ustawiona na maksimum, a elektrozawór jest ustawiony na 8.40, aby zapewnić wymaganą ostrość igły i odpowiednią długość.
    4. Włóż rurkę kapilarną do grzbietu górnego pokrętła przez żarnik i dokręć górne pokrętło. Górna część rurki kapilarnej będzie na poziomie górnej części ściągacza igieł, a żarnik grzewczy będzie znajdował się w środku kapilary.
    5. Przesuń dolną jednostkę do góry, a następnie dokręć dolne pokrętło. Upewnij się, że kapilara jest bezpiecznie umieszczona.
    6. Zamknij pokrywę ściągacza igieł i naciśnij start. Zaświeci się zielone światło. Po kilku minutach kapilara zostanie podgrzana i rozsunięta, aby rozdzielić się na dwie połowy.
      UWAGA: Dwie oddzielone igły nie są tej samej długości, ale obie mogą być używane do wstrzykiwań. Preferowane są dłuższe końcówki igieł.
    7. Ułóż igły w pozycji pionowej z ich czubkami skierowanymi w dół za pomocą kawałka plasteliny. Alternatywnie, przechowuj igły na szalce Petriego przytrzymywanej przez dwa paski plasteliny.
  3. Ładowanie igły
    UWAGA: Roztwór kwasu nukleinowego musi być odwirowywany przez co najmniej 10 minut przy 20,784 x g w celu osadzenia zanieczyszczeń, które mogą być obecne w zawiesinie. Odwirowanie zanieczyszczeń zapobiega blokowaniu przepływu igły iniekcyjnej.
    1. Użyj jednej z dwóch metod, aby załadować kwasy nukleinowe do igieł.
    2. Metoda 1
      1. Za pomocą pipety przenieść około 0,5 μl odwirowanej próbki DNA na niewyciągnięty koniec igły do wstrzykiwań. Pojawi się to jako niewielka kropla płynu znajdująca się na górze rurki kapilarnej.
      2. Odstawić na 5 do 7 minut, aby próbka cieczy zajęła koniec igły. Produktem końcowym będzie wypełniona igła bez pęcherzyków powietrza.
      3. Przed wstrzyknięciem należy użyć mikroskopu preparacyjnego, aby potwierdzić obecność roztworu w końcówce igły.
    3. Metoda 2
      1. Użyj końcówek do ładowania mikrowtryskiwacza.
      2. Za pomocą tej końcówki ładującej odpipetować 5 μl roztworu kwasu nukleinowego.
      3. Gdy wyciągnięta igła znajduje się na ściągaczu igły, poluzuj górne pokrętło, przesuń górną ciągniętą igłę lekko do góry i ponownie dokręć pokrętło.
      4. Ostrożnie włożyć końcówkę ładowarki do rurki kapilarnej i wysunąć ją do dolnej części igły iniekcyjnej.
      5. Odpipetować roztwór kwasu nukleinowego do igły do wstrzykiwań.
      6. Wyjmij ładowarkę z ciągniętej igły i trzymaj ją oddzielnie do dalszego ładowania, jeśli jest to wymagane. Pamiętaj, aby wymienić ładowarki podczas ładowania innej mieszanki kwasów nukleinowych.
  4. Przygotowanie mikroskopu iniekcyjnego
    UWAGA: Mikroskop odwrócony z rozproszonym oświetleniem z podstawy mikroskopu służy do przygotowania robaków, mikroiniekcji i odzyskiwania. Opisano zastosowanie odwróconego mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z obiektywami 10x i 40x. Mikroskop jest wyposażony w manipulator igły, który przytrzymuje igłę i ustawia ją w odpowiedniej pozycji do wstrzyknięcia. Olej do mikroiniekcji stosuje się, aby zapobiec szybkiemu odwodnieniu robaka na warstwie agarozy wkładki iniekcyjnej. Sugerowanym olejem do użycia jest Halocarbon Oil 700.
    1. Włącz lampę i skalibruj jasność za pomocą panelu sterowania.
    2. Sprawdź liczbę na pryzmacie Wollaston kondensatora; będzie ona odpowiadać używanemu obiektywowi (40x).
    3. Upewnij się, że wieżyczka DIC, oznaczona symbolem "DIC", znajduje się we właściwej pozycji.
    4. Upewnij się, że pokrętło na obiektywie jest ustawione na zero (0).
    5. Obróć pierścień Ph w prawo do końca.
    6. Wyreguluj polaryzator w taki sposób, aby strzałka znajdowała się w pozycji poziomej.
    7. Połóż kartkę papieru na scenie, aby obserwować punkt centralny (światło).
    8. Zamknij membranę polową do momentu, w którym na papierze pojawi się plama.
    9. Użyj pokrętła po lewej stronie, aby przesunąć skraplacz w górę iw dół do punktu, w którym widoczna jest bardzo ostra plama światła na kawałku papieru.
    10. Powoli otwieraj przysłonę polową do momentu, w którym widoczny jest mały krąg światła.
    11. Zabierz kartkę papieru.
    12. Upewnij się, że plamka świetlna znajduje się na środku obiektywu. W przeciwnym razie wyrównaj plamkę świetlną ze środkiem obiektywu, regulując srebrne na górze kondensatora.
    13. Całkowicie otwórz membranę polową.
    14. Sprawdź, czy analizator ICT/P jest wciśnięty.
  5. Montaż igły iniekcyjnej na mikroskopie
    1. Włączyć dopływ azotu gazowego do igły do mikroiniekcji. Ciśnienie gazu do igły będzie wynosić około 20 psi.
    2. Sprawdź, czy pokrętła mikromanipulatora (część mikroskopu, która porusza igłą) są ustawione na środku, co pozwala na najszerszy zakres ruchu, gdy igła jest zamontowana.
    3. Odkręć zespół przytrzymujący metalowy pręt, aby wyjąć go z uchwytu igły.
    4. Włóż nową igłę do górnej części mikroskopu, a następnie zainstaluj gumową uszczelkę, aby utrzymać igłę na miejscu.
    5. Zabezpiecz dolną część uchwytu igły, dopasowując go do zespołu.
    6. Włóż igłę w rowek na mikromanipulatorze i odpowiednio ją przykręć, aby utrzymać ją stabilnie. Upewnij się, że śruba znajduje się około 1 cala od końca mikromanipulatora.
    7. Umieść końcówkę igły na środku pola widzenia pod kątem około 45° w stosunku do płytki stage, używając pokręteł i zgrubnych elementów sterujących z mikromanipulatora. Bardzo ważne jest, aby pozostawić końcówkę igły na tyle wysoko, aby nie pękła przypadkowo.
  6. Łamanie igieł
    1. Umieść igłę w mikromanipulatorze w miejscu, w którym końcówka igły normalnie pęka, aby umożliwić przepływ przez nią roztworu kwasu nukleinowego.
    2. Przełam kapilary i umieść je na szklanym szkiełku zawierającym kroplę oleju do mikroiniekcji.
    3. Umieść szkiełko na mikroskopie i ustaw ostrość.
    4. Ustaw końcówkę igły na tym samym poziomie, co strona kapilarnej, używając precyzyjnych elementów sterujących mikroskopu (Rysunek 4).
    5. Włącz na krótko przepływ azotu za pomocą siłownika nożnego, aby upewnić się, że końcówka igły nie jest złamana. Wystarczy szybkie włączanie i wyłączanie.
    6. Delikatnie przesuwaj igłę, tak aby ledwo dotykała boku naczynia włosowatego.
    7. Lekko postukaj w bok mikroskopu, aby złamać końcówkę igły.
    8. Wyjmij igłę z kapilary i włącz przepływ azotu, aby sprawdzić, czy igła jest prawidłowo złamana.
    9. Igła wytworzy małą kroplę iniekcji około pięć razy większą niż końcówka igły (Rysunek 4). Jeśli kropla do wstrzykiwania jest mniejsza, należy dodatkowo złamać końcówkę. Jeśli kropla do wstrzykiwań jest większa, należy spróbować użyć świeżej igły.

6. Mikroiniekcja

  1. Odpipetować kroplę oleju do mikroiniekcji na podkładkę iniekcyjną.
  2. Zanurz wysterylizowany płomieniem kilof w kropli oleju do mikroiniekcji i zbierz młodego H. Bacteriophora dorosły nicień z talerza.
  3. Nicienie należy pobrać z części płytki, które nie znajdują się w pobliżu trawnika bakteryjnego, aby zapobiec przenoszeniu dużej liczby komórek bakteryjnych do podkładki iniekcyjnej. Zbierz także nicienie z dobrze uformowanymi gonadami.
  4. Przesunąć nicienie do podkładki iniekcyjnej i ustawić je pionowo tak, aby gonady były skierowane w stronę igły. Upewnij się, że srom jest skierowany w tym samym kierunku co igła do wstrzykiwań, a dwa dystalne ramiona gonady są w przeciwnym kierunku i przylegają do ściany ciała nicienia.
    UWAGA: Podobnie jak Pristionchus pacificus, gonada H. bacteriophora migruje grzbietowo z brzusznej pozycji sromu, a następnie migruje z powrotem do pozycji brzusznej.
  5. Sprawdź, czy ilość oleju jest wystarczająca, aby zapobiec wysuszeniu nicieni, nie pozwalając nicieniom wędrować.
  6. Ustaw ostrość nicieni za pomocą obiektywu 10x, trzymając igłę znacznie nad szkiełkiem. W oleju gonady nicieni są postrzegane jako dwa wyraźne obszary blisko przedniej i tylnej części robaka. Upewnij się, że gonady są ostre, a nie inne części robaka.
  7. Ułóż nicienie pod kątem od 15° do 45° w kierunku igły do wstrzykiwań, co zapewni więcej miejsca na igłę wewnątrz gonady. Podejście to zapobiega również przechodzeniu igły przez całe ciało nicienia, gdy igła jest wprowadzana do gonady.
  8. Ustawić igłę do wstrzykiwań i nicienie na tym samym poziomie, stopniowo obniżając igłę, aż zostanie zogniskowana (Rysunek 5). Upewnij się, że gdy igła jest opuszczana, pozostaje obok nicienia, a nie nad robakiem.
  9. Użyj obiektywu 40x, aby skupić się na ramieniu syncytialnej gonady nicienia.
  10. Przesuwaj igłę w górę iw dół za pomocą precyzyjnego regulatora, aż końcówka znajdzie się w ostrości razem z ramieniem syncytialnej gonady nicienia.
  11. Powoli przesuwaj nicienie w kierunku igły, korzystając z etapu ślizgowego. Następnie delikatnie popchnij gonadę do pozycji z igłą przy ścianie ciała nicienia, co spowoduje skuteczną penetrację igły do wnętrza ciała nicienia.
  12. Na krótko nadepnij na siłownik nożny, aby rozpocząć przepływ roztworu kwasu nukleinowego. Wystarczy szybkie włączanie/wyłączanie. Jeśli igła znajduje się wewnątrz gonady, gonada wypełni się roztworem i pęcznieje.
  13. Gdy igła zostanie zapewniona we właściwej pozycji, napełnij gonadę roztworem kwasu nukleinowego, aż ramiona gonady zostaną wypełnione. Ważne jest, aby unikać wydalania płynu z robaka przez otwór, w którym przebiła go igła.
  14. Korzystając ze stolika przesuwnego, ostrożnie odsuń robaka od igły.
  15. Podnieś igłę i obróć ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
  16. Umieść kroplę bufora 1x PBS na wierzchu robaka, aby unosił się na wodzie.
  17. Użyj wysterylizowanego płomieniem kilofa, aby podnieść robaka i umieść go w kolejnej kropli M9 na świeżej płytce zasianej P. luminescens, aby pozbyć się robaka z nadmiaru oleju.
  18. Usuń nicienie z M9 i umieść je po drugiej stronie trawnika bakteryjnego.
  19. Za pomocą tej samej płytki przenieść kilka wstrzykniętych nicieni.
  20. W ciągu 2-3 dni oceń nicienie pierwszego pokolenia (F1) pod kątem fenotypu transgenicznego. Rozdziel transgeniczne nicienie F1 na poszczególne płytki, aby określić, które robaki będą generować stabilne linie transgeniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić status nicieni H. bacteriophora, które przeszły aksenizację, określono obecność lub brak kolonii bakterii P. luminescens w IJ. W tym celu zebrano osad około 500 IJ, który został wcześniej wysterylizowany powierzchniowo i zhomogenizowany w PBS. Leczenie kontrolą pozytywną składało się z osadu składającego się z około 500 IJ z kultury nicieni zawierającej symbiotyczne bakterie P. luminescens. Osady nicieni aksenizowanych i kontroli pozytywnej homogenizowano w 1x PBS. Homogenaty pipetow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie molekularnych podstaw zakażenia nicieniami entomopatogenicznymi i odporności przeciw nicieniom owadów wymaga oddzielenia pasożytów od wzajemnie powiązanych bakterii 13,15,16. Nicienie entomopatogeniczne H. bacteriophora i S. carpocapsae żyją razem z bakteriami Gram-ujemnymi P. luminescens i X. nematophila, odpowiednio17. Wykazano wcześniej, że oba gatunki ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu George'a Washingtona za krytyczną lekturę manuskryptu. Wszystkie figury graficzne zostały wykonane przy użyciu BioRender. Badania w laboratoriach I. E., J. H. i D. O'H. były wspierane przez George Washington University i Columbian College of Arts and Sciences oraz fundusze na badania interdyscyplinarne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaVWR97062-244
Zestaw Ambion Megascript T7Thermo Fisher ScientificAM1333
AmpicillinFisher Scientific611770250
Kolba do hodowli komórkowych T25Fisher Scientific156367
Kolba do hodowli komórkowych T75Fisher Scientific156499
ChoiceTaq MastermixDenville ScientificC775Y42
Olej kukurydzianyVWR470200-112
Syrop kukurydzianyMP Biomedicals/VWRIC10141301
Probówka hodowlana 10 mlFisher Scientific14-959-14
Eppendorf Femtotips Końcówki do mikroładowarekEppendorfE5242956003
EtanolMillipore-SigmaE7023
Tuba Falcon 50 mlFisher Scientific14-432-22
Mikrowtryskiwacz FemtojetEppendorf5252000021
Bibuła filtracyjnaVWR28320-100
Galleria mellonella waxormsPetco-Glass
Szkiełko nakrywkoweFisher Scientific12-553-46450 x 24 mm
Olej halowęglowy 700SigmaH8898
Pętla inokulacyjnaVWR12000-806
KanamycynaVWR97062-956
Kapilary ze szkła borokrzemianowego Kwik-FilWorld Precision Instruments1B100F-31,0 mm
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB proszek młynka agarowego 500 g
LB BulionFisher ScientificBP1426-500LB młynek do rosołu w proszku 500 g
Leica DM IRB Odwrócony mikroskop badawczyMikroskopCentral-MacConkey
mediumMillipore-SigmaM7408-250G
MEGAclear Zestaw do czyszczenia transkrypcjiThermo Fisher ScientificAM1908
Probówka do mikrowirówekVWR76332-0641,5 ml
NanoDrop 2000 SpektrofotometrThermo Fisher ScientificND-2000
Strzykawka igłowaVWRBD30515522G
Bulion odżywczyMillipore-Sigma70122-100G
ParafilmVWR52858-076
Podzielona szalka PetriegoVWR490005-212
PBSVWR97062-732Bufor PBS Tabletki biotechnologiczne startery PCR klasy 200 tab
Azenta-Pestle
Millipore-SigmaBAF199230001Bel-Art Jednorazowy tłuczek
Petriego 6 cmVWR25384-09260 x 15 mm
szalka Petriego 10 mmVWR10799-19235 x 10 mm
Proteose Peptone #3Thermo Fisher Scientific211693
Drożdże ekstraktMillipore-SigmaY1625
szalka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
  3. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  4. Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983(2020).
  5. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  6. Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202(2021).
  7. Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
  8. Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
  9. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
  10. Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
  11. Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660(2021).
  12. Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177(2018).
  13. Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
  14. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
  15. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
  16. Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
  18. Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
  19. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568(2020).
  20. Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
  21. Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
  22. McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla nicieniwyciszanie gen wodporno gospodarzam odice zaka nenicienie aksenicznebakterie symbiotyczneGalleria mellonellasterylizacja powierzchniowabiologiczna kontrola

Powiązane artykuły