Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63889

⸱

17 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Septyny to białka cytoszkieletu. Oddziałują z błonami lipidowymi i mogą wykrywać, ale także generować krzywiznę błony w skali mikronów. W tym protokole opisujemy oddolne metodologie in vitro do analizy deformacji błony, wrażliwego na krzywiznę wiązania septyny i ultrastruktury włókien septyny.

Streszczenie

Przebudowa błony zachodzi stale w błonie plazmatycznej i w obrębie organelli komórkowych. Aby w pełni przeanalizować rolę środowiska (warunki jonowe, skład białek i lipidów, krzywizna błony) oraz różnych partnerów związanych z określonymi procesami przekształcania błon, podejmujemy podejścia oddolne in vitro. W ostatnich latach pojawiło się duże zainteresowanie ujawnieniem roli białek septyny związanych z poważnymi chorobami. Septyny są niezbędnymi i wszechobecnymi białkami cytoszkieletu, które oddziałują z błoną plazmatyczną. Są one zaangażowane między innymi w podział komórek, ruchliwość komórek, neuromorfogenezę i spermiogenezę. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób septyny oddziałują i organizują się na błonach, aby następnie wywołać deformacje błony i jak mogą być wrażliwe na określone krzywizny błony. Niniejszy artykuł ma na celu rozszyfrowanie wzajemnych zależności między ultrastrukturą septyn na poziomie molekularnym a przebudową błony zachodzącą w skali mikronów. W tym celu pączkujące drożdże i kompleksy septyny ssaków poddano rekombinowanej ekspresji i oczyszczeniu. Następnie zastosowano kombinację testów in vitro do analizy samoorganizacji septyn na błonie. Do zbadania zależności między samoorganizacją septyny, zmianą kształtu błony i krzywizną błony wykorzystano dwuwarstwowe warstwy lipidowe (SLB), gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV), duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) i faliste podłoża.

Wprowadzenie

Septyny to białka tworzące włókna cytoszkieletu, które oddziałują z błonami lipidowymi. Septyny są wszechobecne u eukariontów i niezbędne do wielu funkcji komórkowych. Zostały one zidentyfikowane jako główne regulatory podziału komórek u pączkujących drożdży i ssaków1,2. Biorą udział w wydarzeniach przekształcających błonę, ciliogenezie3 i spermiogenezie4. W komórkach ssaków septyny mogą również wchodzić w interakcje z aktyną i mikrotubulami5,6,7 w spoiwie zależnym od GTPaz Rho (BORG)8. W różnych tkankach (neurons9, cilia3, spermatozoa10), septyny zostały zidentyfikowane jako regulatory barier dyfuzyjnych dla komponentów związanych z błoną11. Wykazano również, że septyny regulują pęcherzyki błonowe i tworzenie się wypukłości12. Septyny, będące białkami wielozadaniowymi, są zaangażowane w powstawanie różnych powszechnych chorób13. Ich nieprawidłowa regulacja jest związana z pojawieniem się nowotworów14 i chorób neurodegeneracyjnych15.

W zależności od organizmu, kilka podjednostek septyny (dwie u Caenorhabditis elegans do 13 u ludzi) łączy się, tworząc kompleksy, których organizacja zmienia się w sposób zależny od tkanki16. Podstawowy blok budulcowy septyny składa się z dwóch do czterech podjednostek, występujących w dwóch egzemplarzach i samoskładających się w sposób palindromiczny przypominający pręt. W drożdżach pączkujących septyny są oktamerowe17,18. In situ septyny są często zlokalizowane w miejscach o krzywiźnie mikrometrowej; Znajdują się one w miejscach zwężenia podziału, u podstawy rzęsek i dendrytów oraz na pierścieniu plemników19,20. Na błonie rola septyn wydaje się być podwójna: są one zaangażowane w przekształcanie dwuwarstwy lipidowej i utrzymanie integralności błony21. W związku z tym badanie właściwości biofizycznych białek i/lub podjednostek tworzących włókna septyny w błonie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli. Aby przeanalizować specyficzne właściwości septyn w dobrze kontrolowanym środowisku, odpowiednie są oddolne podejścia in vitro. Do tej pory tylko kilka grup opisało właściwości biofizyczne septyn in vitro20,22,23. W związku z tym, w porównaniu z innymi włóknami cytoszkieletu, obecna wiedza na temat zachowania septyn in vitro pozostaje ograniczona.

Ten protokół opisuje, jak można analizować organizację włókien septyny, zmianę kształtu membrany i wrażliwość na krzywiznę19. W tym celu zastosowano kombinację metod mikroskopii optycznej i elektronowej (mikroskopia fluorescencyjna, mikroskopia krioelektronowa [cryo-EM] i skaningowa mikroskopia elektronowa [SEM]). Zmiana kształtu błony gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) o rozmiarach mikrometra jest wizualizowana za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii optycznej. Analizę ułożenia i ultrastruktury włókien septyny związanych z pęcherzykami lipidowymi przeprowadza się za pomocą cryo-EM. Analizę wrażliwości krzywizny septyny przeprowadza się za pomocą SEM, badając zachowanie włókien septyny związanych z dwuwarstwami lipidowymi opartymi na ciele stałym, osadzonymi na falistych podłożach o zmiennych krzywiznach, co umożliwia analizę wrażliwości krzywizny zarówno dla krzywizn dodatnich, jak i ujemnych. W porównaniu z poprzednią analizą20,24, tutaj proponujemy zastosowanie kombinacji metod, aby dokładnie przeanalizować, w jaki sposób septyny mogą się samoorganizować, synergistycznie deformować błonę i być wrażliwe na krzywiznę. Uważa się, że protokół ten jest przydatny i można go dostosować do każdego białka nitkowatego, które wykazuje powinowactwo do błon.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Określanie przekształcania błony za pomocą gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUVs)

UWAGA: W tej sekcji generowane są GUV, aby naśladować deformacje błony, które mogą być indukowane przez septyny w kontekście komórkowym. Rzeczywiście, w komórkach septyny często występują w miejscach o krzywiznach rzędu mikrometrów. GUV mają rozmiary od kilku do kilkudziesięciu mikrometrów i mogą ulegać deformacjom. Są one zatem odpowiednie do badania wszelkich deformacji indukowanych przez septyny w skali mikrometrycznej. Lipidy fluorescencyjne, a także septyny znakowane fluorescencyjnie (z użyciem zielonego białka fluorescencyjnego [GFP]), są wykorzystywane do śledzenia zachowania zarówno lipidów, jak i białek via mikroskopia fluorescencyjna.

  1. Przygotowanie buforów i roztworów
    1. Przygotować bufor do wzrostu GUV (50 mM NaCl, 50 mM sacharozy i 10 mM Tris [pH = 7,8]) oraz bufor do obserwacji (75 mM NaCl i 10 mM Tris [pH = 7,8]).
    2. Zmierzyć (za pomocą komercyjnego osmometru) i dostosować osmolarność buforów do obserwacji i wzrostu (teoretycznie 170 mOsmol·L-1), dodając niewielkie ilości NaCl, aż ich odpowiednie osmolarności zostaną wyrównane. Przefiltrować bufory za pomocą filtra 0,2 µm. Rozdzielić bufor do wzrostu na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego użytku. Bufor do obserwacji przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Różnica w osmolarności między obydwoma buforami nie powinna przekraczać 5%.
    3. Przygotować roztwór β-kazeiny o stężeniu 5 mg·mL-1 w buforze do obserwacji. Zapewnić całkowite rozpuszczenie (po kilku godzinach w temperaturze 4 °C przy mieszaniu magnetycznym). Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 µm, rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować mieszaniny lipidowe przy całkowitym stężeniu lipidów 3 mg·mL-1 w chloroformie. Zastosować skład (mol%) obejmujący: 56,8% L-α-fosfatydylocholiny z jaj (EggPC), 15% cholesterolu, 10% 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminy (DOPE), 10% 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-seryny (DOPS), 8% L-α-fosfatydyloinozytolu-4,5-bisfosforanu z mózgu (PI(4,5)P2) oraz 0,2% Bodipy-TR-Ceramide w celu wzmocnienia oddziaływań białko-lipid i ułatwienia wbudowania PI(4,5)P225.
    UWAGA: Chloroformem należy posługiwać się pod wyciągiem, używając rękawiczek nitrylowych i okularów ochronnych. Roztwory chloroformu należy pipetować szklanymi strzykawkami, unikając plastiku, ponieważ chloroform rozpuszcza tworzywa sztuczne. Przed i po użyciu należy wypłukać strzykawki, pipetując chloroform 5–10 razy. Do pipetowania konkretnych lipidów fluorescencyjnych należy używać osobnych strzykawek, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym. Lipidy można przechowywać w chloroformie w temperaturze -20 °C w bursztynowych fiolkach szklanych z nakrętką teflonową. Przed zamknięciem fiolki należy wypełnić argonem i uszczelnić parafilmem, aby zapobiec utlenianiu lipidów.
  3. Elektroformowanie GUV z użyciem układu z drutami platynowymi
    UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schemat kroków eksperymentalnych oraz zdjęcie komory.
    1. Dokładnie oczyścić komorę i druty platynowe w następujący sposób, aby usunąć wszelkie pozostałości lipidów.
    2. Zanurzyć druty i komorę w acetonie i poddać sonikacji przez 10 min. Przetrzeć je ostrożnie ręcznikiem papierowym nasączonym acetonem.
    3. Złożyć komorę, wkładając druty, ponownie zanurzyć w acetonie i poddać sonikacji przez 10 min. Przetrzeć raz jeszcze acetonem, upewniając się, że druty są całkowicie czyste. Zanurzyć komorę w etanolu, poddać sonikacji przez 10 min i przetrzeć etanolem.
    4. Na koniec zanurzyć komorę w wodzie dejonizowanej, poddać sonikacji przez 10 min i osuszyć strumieniem azotu lub powietrza.
      UWAGA: Komora teflonowa (Rysunek 1B) została wykonana na zamówienie w warsztacie zakładowym. Posiada ona trzy przedziały, które mogą być uszczelniane z obu stron za pomocą szkiełek podstawkowych. Druty platynowe można wprowadzić do komory przez otwory o średnicy 1,3 mm.
    5. Po oczyszczeniu komory nanieść 3–4 krople na przedział (każda kropla ma ok. 0,1 μL) mieszaniny lipidowej o stężeniu 3 mg·mL-1 na każdy drut platynowy. Obrócić druty o 180° i nanieść 3–4 krople lipidów na przedział po przeciwnej stronie każdego drutu platynowego. Upewnić się, że krople nie stykają się ze sobą. Na całą komorę wymagane jest około 5 µL mieszaniny lipidowej.
    6. Umieścić komorę wzrostową w komorze próżniowej na 30 min, aby usunąć wszelkie ślady chloroformu.
      UWAGA: Najlepiej zastosować próżnię głęboką (0,1 mbar). Po wysuszeniu lipidy są podatne na utlenianie, dlatego nie powinny pozostawać na powietrzu dłużej niż przez kilka minut.
    7. Nanieść smar wysokopróżniowy na dno komory (strona najbliższa drutom) wzdłuż obwodu trzech przedziałów za pomocą strzykawki i docisnąć czyste szkiełko podstawkowe (22 mm x 40 mm) do smaru, aby zapewnić idealne uszczelnienie. Uszczelnić oba końce komory (tj. w miejscach wejścia/wyjścia drutów) za pomocą pasty uszczelniającej (płytek woskowych). Analogicznie nałożyć smar próżniowy po drugiej stronie komory.
    8. Wypełnić przedziały buforem do wzrostu (~1 mL na komorę) za pomocą pipety. Nie mieszać roztworu zbyt szybko ani zbyt silnie, aby zapobiec odwarstwieniu się filmu lipidowego z drutów. Hermetycznie zamknąć górę komory za pomocą szkiełka podstawkowego 22 mm x 40 mm, dociskając je do smaru. Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, delikatnie docisnąć szkiełko od środka ku krawędziom.
      1. Umieścić komorę w lodówce w temperaturze 4 °C i podłączyć druty do generatora funkcji (funkcja sinusoidalna przy 500 Hz). Ustawić napięcie efektywne 350 mV dla krótszego okresu wzrostu (tj. 6 h) lub 250 mV dla dłuższego okresu wzrostu (tj. 12–16 h), zgodnie z opisem i optymalizacją w badaniu Bebera i wsp.25.
    9. Zdjąć szkiełka podstawkowe, wytrzeć uszczelniacz i smar oraz wyjąć druty. Umyć i wyszorować komorę ręcznikiem papierowym, używając naprzemiennie wody i etanolu (≥70%).
      UWAGA: Optymalne napięcie i ramy czasowe dla wzrostu GUV zależą od wielu parametrów, od stężenia soli w buforze po geometrię komory (tj. odległości między drutami a rozmiaru komory). Aby zapewnić powtarzalność, przy każdym powtórzeniu eksperymentu należy używać tej samej komory. Druty znajdują się w bliskim sąsiedztwie dna komory, dzięki czemu lipidy można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazować lipidy na każdym etapie (patrz. Rysunek 1C,D), aby upewnić się, że proces elektroformowania przebiegł pomyślnie.
  4. Inkubacja septyn z pęcherzykami
    1. Zebrać GUV z drutów za pomocą przyciętych końcówek pipet (otwór ~1 mm) zbliżonych do drutów. Następnie pipetować roztwór wzdłuż całego drutu. Procedura ta zapobiega generowaniu silnych przepływów lamellarnych, które mogłyby zniszczyć GUV. Po tym kroku przycinanie końcówek pipet nie jest już wymagane, ponieważ przepływy lamellarne nie uszkadzają GUV znajdujących się w roztworze.
      UWAGA: Ze względu na obecność PI(4,5)P2 w mieszaninie lipidowej, zebrane GUV muszą być przechowywane nie dłużej niż przez 2–3 h przed eksperymentem. Rzeczywiście PI(4,5)P2 szybko ulega solubilizacji i septyny przestają wiązać się z błonami kilka godzin po ich sformowaniu. Jednak raz związane z błoną, septyny pozostają w niej przez kilka dni.
    2. Rozcieńczyć roztwór stokowy septyn wyłącznie w Tris 10 mM (pH 8), aby osiągnąć osmolarność równą osmolarności buforu do wzrostu; w razie potrzeby dodatkowo rozcieńczyć roztwór septyn w buforze do obserwacji. Dodać zamierzoną objętość zebranych GUV (50–100 µL do całkowitej objętości 200 µL). Inkubację przeprowadzić bezpośrednio w komorze obserwacyjnej po pasywacji β-kazeiną (patrz. poniżej). Wymagany jest czas oczekiwania 20–30 min do osiągnięcia stanu równowagi.
      UWAGA: Ekspresja i oczyszczanie oktamerycznych kompleksów septyn (ludzkich lub drożdży pączkowych) są szczegółowo opisane w innych artykułach17. W skrócie, septyny były eksprimowane w Escherichia coli, oczyszczane w laboratorium za pomocą etapów chromatografii powinowactwa, wykluczania wielkości i wymiany jonowej, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C w wodnym roztworze 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl i 5 mM MgCl2 przy stężeniu ~1 mg·mL-1 (3 µM). Wysokie stężenie soli stosuje się, aby zapobiec agregacji septyn. Kompleksów septyn nie należy zagęszczać za pomocą urządzenia do odwirowywania filtracyjnego, ponieważ indukuje to agregację i tym samym zmniejsza wydajność białka.
  5. Obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego i/lub spinning disk
    1. Aby zapobiec przywieraniu GUV do powierzchni i/lub ich pękaniu, spasywować komorę obserwacyjną, inkubując ją z roztworem β-kazeiny 5 mg·mL-1 przez 30 min.
    2. Usunąć roztwór β-kazeiny i przenieść roztwór septyna-GUV (krok 1.4.2.) do komory obserwacyjnej za pomocą pipety. Pozostawić GUV do osedymentowania na dno komory przez 10–15 min.
      UWAGA: Rozbieżność w składzie między wnętrzem GUV a zewnętrznym buforem stwarza niedopasowanie zarówno gęstości, jak i współczynnika załamania światła. Dzięki niedopasowaniu współczynnika załamania GUV są widoczne w optycznej mikroskopii świetlnej w prześwietleniu.
    3. Za pomocą mikroskopii konfokalnej zwizualizować sygnał fluorescencyjny lipidów, aby sprawdzić jakość GUV i stan lamellarności błony. Ocenić gęstość septyn związanych z GUV, rejestrując sygnał fluorescencyjny septyn po przeprowadzeniu odpowiedniej kalibracji25. Wykonać akwizycję serii obrazów Z-stack w odstępach przestrzennych 0,4 µm, aby przeanalizować i zwizualizować trójwymiarowe deformacje pęcherzyków wywołane oddziaływaniem między septynami a błoną.
      UWAGA: Stosowano obiektywy imersyjne z powiększeniem 60- lub 100-krotnym. Używano standardowych mikroskopów konfokalnych lub spinning disk (Tabela Materiałów) z rozmiarem piksela odpowiednio 250 nm i 110 nm. Należy dostosować warunki obrazowania do danego urządzenia. Do roztworu nie dodawano żadnych specjalnych środków przeciwko fotoblaknięciu.

Schemat procesu hydratacji filmu lipidowego z układem eksperymentalnym i obrazami mikroskopowymi do analizy struktury.
Rycina 1: Elektroformowanie GUV. (A) Schematyczne przedstawienie procesu elektroformowania z użyciem drucików platynowych. (B) Zdjęcie własnoręcznie wykonanego urządzenia teflonowego z zamontowanymi drucikami platynowymi używanymi do generowania GUV metodą elektroformowania. Druciki mają średnicę 0,5 mm i są oddalone od siebie o 3 mm. (C) GUV (obiekty sferyczne) obserwowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii optycznej podczas procesu wzrostu. Nieprzezroczysta strefa na dole obrazu to drucik platynowy. (D) GUV (okrągłe obiekty fluorescencyjne) obserwowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej podczas wzrostu na druciku platynowym. Paski skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Analiza organizacji ultrastrukturalnej filamentów septyn za pomocą krio-mikroskopii elektronowej

UWAGA: Pęcherzyki nie nadają się do obrazowania za pomocą standardowych metod mikroskopii elektronowej. W rzeczywistości próbki są suszone przy użyciu standardowych metod barwienia negatywnego. Podczas odwodnienia pęcherzyki mogą ulegać niespecyficznym deformacjom, co często prowadzi do powstania wypustek lipidowych. Kriomikroskopia elektronowa jest zatem znacznie lepszą strategią do obserwacji specyficznych deformacji pęcherzyków. W przypadku zastosowania cryo-EM próbki są zatopione w cienkiej (~100-200 nm) warstwie witryfikowanego lodu, co pozwala zachować próbki w stanie zbliżonym do natywnego. GUV są jednak zbyt duże (kilkadziesiąt mikrometrów), aby można je było zatopić w cienkim lodzie i tym samym obrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Dlatego generowane są duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV), których średnice mieszczą się w zakresie ~50-500 nm, aby określić, w jaki sposób septyny mogą deformować pęcherzyki i jak rozmieszczają się one na ich powierzchni.

  1. Generowanie dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUVs)
    1. W fiolce szklanej przygotować 50 µg mieszaniny lipidów rozpuszczonych w chloroformie o składzie molowym: 57% EggPC, 15% cholesterolu, 10% DOPE, 10% DOPS i 8% mózgowego PI(4,5)P2), co zostało zoptymalizowane w celu zwiększenia oddziaływania septyn z membraną.
    2. Osuszyć roztwór w strumieniu argonu, aby wytworzyć w fiolce suchy film lipidowy. Umieścić fiolkę w próżni na 30 min, aby całkowicie osuszyć lipidy.
    3. Ponownie rozpuścić film lipidowy w 50 µL roztworu wodnego (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2), aby uzyskać stężenie końcowe 1 mg·mL-1, wymieszać w vortexie przez 10 s i przenieść roztwór do probówki.
      UWAGA: LUVs muszą zostać użyte natychmiast do inkubacji z septynami. W przeciwnym razie oddziaływanie białko-lipid będzie słabe z powodu solubilizacji PI(4,5)P2. Ten prosty proces ponownego rozpuszczania generuje heterogenną populację pęcherzyków o średnicach od 50 nm do 500 nm. Zatem jednocześnie badany jest cały zakres średnic, a tym samym krzywizn.
  2. Inkubować septyny z rozpuszczonymi lipidami przy końcowych stężeniach lipidów i septyn wynoszących odpowiednio 0,1 mg·mL-1 (około 300 nM) i 20 nM, w buforze o wysokim zasoleniu (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Inkubować próbkę przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  3. Zamrażanie szokowe w celu witryfikacji próbki
    1. poddać działaniu wyładowań koronowych (glow-discharge) siateczki z dziurawego węgla (300 mesh) od strony węglowej przez 30 s przy 5 mA za pomocą generatora plazmy, a następnie włożyć siateczkę do urządzenia do zamrażania szokowego w warunkach wysokiej wilgotności.
    2. Zaadsorbować 4 µL próbki (Krok 2.2.) na poddanej działaniu wyładowań koronowych stronie węglowej siateczki. Bezpośrednio przed adsorpcją próbki dodać do roztworu złote kuleczki o średnicy 5-10 nm, jeśli próbki mają zostać wykorzystane do generowania serii nachyleń metodą kriotomografii.
      UWAGA: Gęstość złotych kuleczek musi zostać sprawdzona i dostosowana empirycznie i zależy od dostawcy. Zoptymalizowana gęstość to 10-15 złotych kuleczek w polu widzenia.
    3. Osuszyć próbki przez blotowanie od strony gładkiej, aby odessać kroplę próbki z przeciwległej strony.
      UWAGA: Czas blotowania wynosi zazwyczaj 4 s, a pozycja papieru filtrującego i siła blotowania są dostosowywane empirycznie poprzez testowanie i sprawdzanie alternatywnych pozycji papieru w celu optymalizacji jakości (grubości) lodu i gęstości materiału.
    4. Przenieść siateczki do mikroskopu lub przechowywać je w pojemniku z ciekłym azotem.
      UWAGA: Użycie siateczek z dziurawego węgla jest niezbędne, aby uwzględnić polidyspersyjność rozmiarów pęcherzyków. Blotowanie próbki z przeciwległej strony sprzyja zwiększonej adsorpcji materiału biologicznego na siateczce.
  4. Obrazowanie metodą krio-mikroskopii elektronowej
    1. Włożyć siateczki do mikroskopu elektronowego (EM) przystosowanego do obserwacji krio-EM. Przeskanować całą siateczkę, tworząc mapę całej próbki przy niskim powiększeniu (zazwyczaj 120x), aby wybrać obszary z lepszą jakością lodu (tj. cienkim i dobrze zwitryfikowanym).
    2. W celu zbierania 2D danych krio-EM, pozyskać obrazy przy rozmiarze piksela około 2 Å na piksel, aby sprawdzić jakość próbki. Upewnić się, że widoczne są zarówno filamenty septyn, jak i dwuwarstwa lipidowa.
    3. W celu zbierania danych krio-elektronowej tomografii, wybrać obszary zainteresowania z zdeformowanymi pęcherzykami. Upewnić się, że w polu widzenia znajduje się wystarczająca liczba złotych kuleczek (co najmniej 10).
    4. Zależnie od oprogramowania używanego do zbierania danych z serii nachyleń, wybrać pozycje ostrości i śledzenia w odpowiedniej odległości od obszaru zainteresowania. Zebrać serie nachyleń, zmieniając kąt nachylenia od -60° do +60°, wykonując obraz co 2°-3°.
      UWAGA: Całkowita dawka powinna wynosić około lub mniej niż 100 elektronów/Å2. Rozmiar piksela waha się od 1,3 Å do 2,1 Å, w zależności od mikroskopu użytego do zbierania danych. Idealnie jest stosować symetryczny kątowo schemat zbierania danych w następujący sposób: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Jednak goniometry mikroskopów z wejściem bocznym nie zapewniają wystarczającej stabilności mechanicznej, aby osiągnąć takie schematy symetryczne. Alternatywnie, akwizycję można rozpocząć od 0° do 34°, a następnie przeprowadzić drugą sekwencję kątową od -2° do -60° i zakończyć końcową sekwencją od 36° do 60°. Celem jest zebranie pierwszych obrazów (z najmniejszymi uszkodzeniami radiacyjnymi) przy najmniejszych kątach. Co więcej, do wizualizacji ultrastruktury pęcherzyków i związanych filamentów septyn można użyć standardowego mikroskopu krio-EM (200 kV, włókno z heksaborku lantanu (LaB6) i boczne wprowadzenie próbki). Jeśli jednak celem jest dalsze przetwarzanie obrazów (np. uśrednianie subtomogramów), najlepiej użyć najnowszej generacji mikroskopów z emiterem polowym (FEG) wyposażonych w detektory bezpośrednie. W niniejszym protokole ograniczamy opis do akwizycji rekonstrukcji 3D i pomijamy uśrednianie subtomogramów.
  5. Rekonstrukcja 3D z kriotomografii i segmentacja
    1. Użyć pakietu oprogramowania IMOD (Tabela materiałów) do wyrównywania obrazów z serii nachyleń i rekonstrukcji 3D26,27. W programie IMOD przeprowadzić wyrównanie serii nachyleń w oparciu o pozycjonowanie punktów referencyjnych (złotych kuleczek). Dodatkowo, jeśli jest to konieczne, przeprowadzić wyznaczenie i korekcję funkcji przenoszenia kontrastu (CTF) w IMOD26. Na koniec wykonać rekonstrukcję 3D w IMOD, rygorystycznie przestrzegając każdego kroku.
    2. Ręcznie segmentować dwuwarstwy lipidowe i filamenty septyn za pomocą modułu 3Dmod27 z pakietu IMOD w celu wizualizacji.

3. Analiza wrażliwości septyny na krzywiznę przy użyciu SEM

UWAGA: Aby zrozumieć, w jaki sposób septyny mogą być wrażliwe na zakrzywienia w skali mikrometrycznej, zastosowano podejście in vitro polegające na inkubacji kompleksów filamentów septyn z lipidowymi dwuwarstwami osadzonymi na falistych wzorach w skali mikrometrycznej.

  1. Projektowanie falistych replik z NOA (Norland optical adhesive) na podstawie falistych wzorów z polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. Wykorzystaj pofalowane wzory z PDMS o amplitudzie 250 nm i 2 µm periodyczność boczna lub inne wymiary w celu oceny krzywizn odpowiednich dla badanego białka.
      UWAGA: Faliste wzory z PDMS są projektowane i generowane zgodnie z opisem w pracy Nania et al.28,29.
    2. W środowisku pomieszczenia czystego nanosić 5 µL nanosi się ciekły NOA na okrągłą szklaną lamellkę o średnicy 1 cm, a następnie nakłada na kroplę szablon z PDMS. Próbkę naświetla się światłem UV (320 nm) przez 5 min, aby fotopolimeryzować ciekły NOA w cienką warstwę polimerową. Następnie ostrożnie odrywa się szablon z PDMS od lamellki z nowo spolimeryzowanym NOA.
      UWAGA: NOA jest powszechnie stosowanym, optycznie przezroczystym klejem, odpowiednim do obrazowania w mikroskopii optycznej. Ponadto NOA wykazuje odporność na procesy utrwalania chemicznego i barwienia wykonywane przed obrazowaniem SEM. Do uzyskania podobnych rezultatów można użyć żywic NOA 71 oraz NOA 81. Początkowy wzór z PDMS może zostać wykorzystany wielokrotnie do sporządzenia replik z NOA. Uzyskane repliki z NOA można przechowywać w pudełku w temperaturze pokojowej przez wiele miesięcy.
  2. Generowanie wspieranej dwuwarstwy lipidowej i inkubacja białek
    1. Poddać filmy NOA działaniu oczyszczacza plazmowego (plazma powietrzna) przez 5 min w celu nadania powierzchni właściwości hydrofilowych.
    2. Przygotować roztwór małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) o składzie molowym: 57% EggPC, 15% cholesterolu, 10% DOPE, 10% DOPS i 8% PI(4,5)P z mózgu.2 przy całkowitym stężeniu lipidów wynoszącym 1 mg·mL⁻¹-1Przygotować SUV, resuspendując wysuszony film lipidowy w buforze obserwacyjnym, zgodnie z opisem w kroku 2.1.3. Roztwór delikatnie sonikować w myjce ultradźwiękowej przez 5–10 min, aż stanie się przezroczysty.
      UWAGA: Roztwór SUV można przechowywać w zamrożeniu przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C.
    3. Umieść szkiełka podstawowe z naniesionymi wzorami NOA w dołkach pudełek do hodowli komórkowej. Nanieś 100 µL o stężeniu 1 mg·mL⁻¹-1 roztwór SUV na świeżo poddane wyładowaniom żarowym wzory NOA (Krok 3.2.1.) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Krok ten indukuje fuzję SUV z powierzchnią wzoru NOA w celu wytworzenia wspieranej dwuwarstwy lipidowej.
    4. Dokładnie przemyj preparaty 6 razy buforem do septyn (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2)2) w celu usunięcia nieprzypisanego SUV. Po każdym płukaniu nie dopuszczać do całkowitego wyschnięcia próbki.
    5. Rozcieńczyć roztwór zapasowy oktamerycznej septyny w buforze wysokosolnym do septyn (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2)2) przy użyciu buforu do septyn (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) do stężeń końcowych w zakresie od 10 nM do 100 nM i objętości 1 ml. Inkubować roztwór białka na szkiełkach przez ok. 1 h w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Objętość jest wystarczająco duża, aby parowanie nie stanowiło problemu.
  3. Przygotowanie próbek do analizy SEM
    UWAGA: W mikroskopii elektronowej opracowano różne protokoły analizy struktur białkowych i ich montażu. Niniejszy protokół pozwala na zachowanie organizacji filamentów septyn, wykorzystując metodę utrwalania opracowaną przez Svitkinę i współpracowników.30 jest on łatwy w implementacji. Ponadto protokół ten optymalizuje obserwacje w wysokiej rozdzielczości przy użyciu SEM.
    1. Przygotowanie odczynników i roztworów stokowych
      UWAGA: Niniejszy protokół wymaga zastosowania kilku odczynników i roztworów, które można przygotować z wyprzedzeniem lub bezpośrednio przed inkubacją. Należy przestrzegać podanych instrukcji, aby uniknąć powstawania artefaktów lub braku reaktywności chemicznej.
      1. Roztwór stokowy kodylanu sodu 0,2 M: Aby przygotować ten roztwór o podwójnym stężeniu, rozpuścić 2,14 g sproszkowanego kodylanu sodu w ok. 40 ml wody destylowanej przy mieszaniu magnetycznym. Po całkowitym rozpuszczeniu dostosować pH do wartości 7,4 poprzez ostrożne dodanie 0,1 M HCl (ok. 1 ml na 50 ml roztworu), a następnie uzupełnić końcową objętość wodą destylowaną. Roztwór ten można przechowywać przez 24–48 h w 4°C.
      2. 2% glutaraldehyd (GA) w 0,1 M kdakodylanie sodu (roztwór utrwalający): przygotować ten roztwór bezpośrednio przed użyciem, rozcieńczając GA o wysokiej czystości klasy EM roztworem 0,2 M kakodylanu sodu (patrz wyżej). Należy użyć komercyjnego roztworu stokowego GA o stężeniu 25%–50% ze względu na jego zoptymalizowaną trwałość w przechowywaniu przy 4 °CAby przygotować 10 ml roztworu utrwalającego, należy rozcieńczyć 0,8 ml 25% komercyjnego roztworu GA w 4,2 ml wody destylowanej i 5 ml 0,2 M kakodylanu sodu.
      3. 1% czterotlenek osmu (OsO4) w 0,1 M kakodylanie sodu: Przygotuj ten drugi roztwór utrwalający bezpośrednio przed użyciem, rozcieńczając komercyjny 4% OsO4 roztwór zapasowy z 0,2 M kacodylanem sodu (patrz wyżej). Dla 4 ml OsO4 roztwór utrwalający, rozcieńczyć 1 ml 4% komercyjnego $\text{OsO}_4$4 roztwór zawierający 1 ml wody destylowanej i 2 ml 0,2 M kacodylanu sodu.
        UWAGA: Należy użyć komercyjnego 4% OsO44 roztwór zapasowy w rozbijalnych szklanych ampułkach ze względu na ich właściwości przechowywania i obchodzenia się z nimi. Należy zauważyć, że OsO4 wykazuje wysoką reaktywność. Należy upewnić się, że jego barwa jest lekko żółta, a nie ciemna.
      4. 1% kwas taninowy (TA) w wodzie: Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Przygotować roztwór TA w celu uzyskania końcowego stężenia 1% TA w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej. Rozpuścić 10 mg w 1 mL wody destylowanej i mieszać w wirówce typu vortex przez kilka minut. Roztworu TA nie można przechowywać i musi on zostać przefiltrowany za pomocą 0.2 µm przefiltrować przed użyciem.
      5. 1% roztwór octanu uranylu (UA) w wodzie Przygotować roztwór UA, aby uzyskać końcowe stężenie 1% UA w wodzie destylowanej. Rozpuścić 10 mg w 1 ml wody destylowanej, a następnie mieszać w wstrząsarku wirującym (vortex) przez co najmniej 30 min do 1 h lub wstrząsać w temperaturze pokojowej. Roztwór ten można przechowywać przez 1 miesiąc w 4 °C lecz może łatwo wytrącić się w postaci osadu, dlatego należy go przefiltrować za pomocą 0.2 µm przefiltrować przed użyciem.
      6. Szereg rozcieńczeń roztworów etanolu. Przygotować roztwory etanolu w wodzie o stężeniach 50%, 70%, 95% i 100%. Ostatnią kąpiel przygotować z nowo otwartych butelek etanolu 100% lub z etanolu 100%, który był odwadniany przez co najmniej 24 h za pomocą sit molekularnych (nominalna średnica porów = 4 Å), aby usunąć z próbek wszelkie ślady wody, które mogłyby zakłócić proces suszenia i napylania. Należy uważać, aby nie wstrząsać tym roztworem, ponieważ może to spowodować resuspensję cząsteczek krzemianów.
        UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z odczynnikami chemicznymi stosowanymi w niniejszym protokole. Glutaraldehyd, tetratlenek osmu, kakodylan sodu i octan uranylu są wysoce toksyczne, przy czym octan uranylu jest dodatkowo radioaktywny. Wszelkie manipulacje z odczynnikami oraz ich odpadami muszą być przeprowadzane z wykorzystaniem środków ochrony indywidualnej (rękawice, fartuchy laboratoryjne, okulary ochronne) i zbiorowej (dygestoria i osłony z pleksiglasu), zgodnie z procedurami obowiązującymi w danym laboratorium.
    2. Fiksacja próbek
      1. Przemyj próbki (tj. szkiełka NOA z fuzyjnymi wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi i inkubowanym białkiem) buforem PBS. Zastąp PBS roztworem utrwalającym GA, uprzednio podgrzanym do 37 °C i pozostawić reakcję na 15 min. Próbki można następnie przechowywać w 4 °C.
      2. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć utrwalone próbki 3 razy 0,1 M kwasem kakodylowym (5 min każdego płukania) przy delikatnym wstrząsaniu.
      3. Inkubować próbki w OsO44 roztwór utrwalający przez 10 min przy maksymalnej ochronie przed światłem, aby umożliwić utrwalenie struktur błonowych i zwiększyć przewodność elektryczną próbek. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć próbki 3x w wodzie destylowanej (5 min na każde przemywanie) przy delikatnym wstrząsaniu.
      4. Inkubować przemyte próbki w przefiltrowanym roztworze utrwalającym TA przez maksymalnie 10 min. Usunąć roztwór TA i przemyć próbki 3x wodą destylowaną (5 min każdego płukania) przy łagodnym wstrząsaniu.
      5. Próbki po przemyciu inkubować przez 10 min w świeżo przefiltrowanym roztworze utrwalającym UA, zapewniając maksymalną ochronę przed światłem. Usunąć roztwór UA i przemyć próbki 3x w wodzie destylowanej (po 5 min na każde przemywanie), delikatnie wstrząsając.
    3. Odwadnianie próbek i suszenie w punkcie krytycznym
      UWAGA: Suszenie na powietrzu jest niedozwolone, aby uniknąć uszkodzenia próbek wskutek niepożądanych napięć powierzchniowych podczas przejścia ze stanu ciekłego w stan gazowy. W EM opracowano dwie metody: metodę fizyczną polegającą na osiągnięciu stanu nadkrytycznego CO2 i omijając jego punkt krytyczny (31 °C, 74 bar) lub metodę chemiczną polegającą na odparowaniu heksametylodisilazanu (HMDS), środka suszącego o obniżonym napięciu powierzchniowym. CO2 a HMDS słabo mieszają się z wodą. W związku z tym wszystkie ślady wody muszą zostać zastąpione rozpuszczalnikiem przejściowym (etanolem), aby uniknąć ewentualnych uszkodzeń na późniejszym etapie procesów suszenia.
      1. Inkubować próbki przez 2–3 min w każdym roztworze etanolu, zaczynając od kąpieli w etanolu 50% aż do 100% (bezwodnego).
        UWAGA: Ze względu na szybkie odparowywanie etanolu pomiędzy kąpielami, manipulowanie próbkami musi odbywać się sprawnie, aby uniknąć ich wyschnięcia na powietrzu.
      2. Przenieście szkiełka przedmiotowe do punktu krytycznego suszarki wypełnionej uprzednio etanolem i postępujcie zgodnie z instrukcjami producenta.
        UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano aparat automatyczny, jednak można użyć dowolnego systemu. Protokoły mogą różnić się w zależności od urządzenia, ale muszą zostać zoptymalizowane w celu całkowitego usunięcia etanolu (25 kąpieli w niniejszym protokole) oraz zmniejszenia prędkości dla poszczególnych wymian rozpuszczalnika (CO2 wloty i etanol/CO2 wyloty) oraz końcową depresuryzację (w niniejszym protokole trwa ona prawie 1 h).
      3. Po zakończeniu suszenia w punkcie krytycznym próbki należy niezwłocznie umieścić w eksyكاتهorze do czasu ich montażu i napylania. Ponieważ wysuszone próbki są silnie higroskopijne, należy poddać je napylaniu (patrz poniżej) tak szybko, jak to możliwe.
        UWAGA: Alternatywnie można zastosować HMDS, co stanowi tańszą i szybszą metodę. Choć HMDS nie był testowany na naszych próbkach, podejście to przyniosło dobre wyniki w obserwacji białek znajdujących się na wewnętrznej powierzchni błon komórkowych.31,32.
    4. Montaż i napylanie próbek.
      UWAGA: Ze względu na to, że próbki biologiczne wykazują słabe właściwości przewodnictwa elektrycznego, przed obserwacją za pomocą SEM muszą zostać pokryte przewodzącą warstwą metalu. W tym celu stosuje się napylanie magnetronowe z plazmą.
      1. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do stubów, które będą wykorzystywane do przyszłych obserwacji za pomocą SEM. Użyj farby srebrnej ze względu na jej lepszą przewodność elektryczną w porównaniu z dyskami węglowymi. Na górną powierzchnię szkiełka nakrywkowego nanieś pasek farby srebrnej i upewnij się, że połączenie ze stubem jest prawidłowe. Unikaj tworzenia aglomeratów farby.
        UWAGA: Srebrny pasek farby musi być cienki, aby uniknąć kontaktu próbki z soczewką obiektywu SEM podczas pracy z wysoką rozdzielczością (tj. przy małej odległości roboczej).
      2. Należy odczekać do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.
        UWAGA: Czas trwania tego etapu może się różnić w zależności od ilości i grubości warstwy farby srebrowej. Czas ten można skrócić, korzystając z klosza próżniowego lub urządzenia do napylania oraz pompy wstępnej przez 10–30 min.
      3. Należy użyć aparatury wyposażonej w głowicę do rozpylania magnetronowego z plazmą oraz platformę rotacyjno-planetarną, postępując zgodnie ze standardowymi protokołami dostarczonymi przez producenta. W niniejszym przypadku w aparaturze wytworzono próżnię do poziomu 2,5 x 10-5 mbar, przepłukany jednokrotnie wysokiej jakości argonem, a następnie ustawiony na 8,0 x 10-3 mbar
      4. Przeprowadź wstępne napylanie (120 mA przez 60 s), aby usunąć warstwę tlenków z powierzchni. Następnie, przy użyciu monitora grubości warstwy, nanieś 1,5 nm wolframu (90 mA, odległość robocza = 50 mm).
        UWAGA: Urządzenie do napylania musi być idealnie czyste, aby zapewnić powtarzalność odparowywania filmu. Proces napylania należy przerwać natychmiast po osiągnięciu docelowej grubości. Końcowa grubość filmu jest obliczana i korygowana w późniejszym etapie. Filmy o grubości około 1,5 nm wykazują średnio poprawkę po korekcie wynoszącą 0,7 nm przy użyciu naszej aparatury. Ponieważ wartości korekty te są zbliżone do wartości docelowej, wykonuje się serię napylań, aby ocenić, a następnie odjąć tę korektę od wartości docelowej.
      5. Przechowywać próbki w próżni, aby chronić je przed powietrzem otoczenia aż do momentu i w trakcie wszystkich analiz SEM.
        UWAGA: Rodzaj metalu użytego do napylania ma znaczenie. Platyna (Pt), mimo że jest powszechnie stosowanym materiałem, daje powłokę słabej jakości przy grubości filmu Pt dostosowanej do filamentów septyn (1,5 nm). Przy wysokich rozdzielczościach film Pt o grubości 1,5 nm nie wykazuje spójności; w konsekwencji rozmiar klastrów Pt i filamentów septyn staje się zbliżony, co prowadzi do błędnych interpretacji podczas procesu segmentacji filamentów.33 (patrz Rycina 2A, wstawka). Wolfram stanowi dobrą alternatywę dla Pt, ponieważ charakteryzuje się mniejszą wielkością ziarna, która jest ledwie widoczna w SEM o wysokiej rozdzielczości (patrz Rysunek 2B, wstawka). Niemniej jednak czysty wolfram łatwo ulega utlenianiu, co prowadzi do wystąpienia silnych artefaktów związanych z efektem naładowania podczas obserwacji w SEM, jeżeli procedura opisana w kroku 3.3.4. nie zostanie ściśle przestrzegana.
  4. Obrazy należy pozyskać przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego z emiterem polowym (FESEM).
    UWAGA: Technologie SEM zostały niedawno ulepszone w celu zwiększenia rozdzielczości, a zastosowane rozwiązania zależą od producenta (np.., optyka elektronowa, deceleracja wiązki, soczewka magnetyczna). Ten wzrost rozdzielczości (dostępny u kilku producentów), zwłaszcza przy niskim napięciu przyspieszającym (blisko nanometra przy 1 kV), jest niezbędny do rozdzielenia struktur nanometrycznych podobnych do sieci septyn.
    1. Uzyskanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości poprzez detekcję pierwotnych elektronów wtórnych (SE1) za pomocą detektora „in-lens” przy zastosowaniu następujących ustawień.
    2. Ustaw napięcie przyspieszające na 3 kV. Ustaw prąd wiązki za pomocą 20 μm aperturę (dla kolumn Zeiss Gemini I lub równoważną 34 pA) lub z 15 μm apertura (dla kolumn Zeiss Gemini I lub równoważna do 18,5 pA), jeżeli wymagane jest ograniczenie efektów ładowania.
    3. Do obserwacji należy używać rozdzielczości w zakresie od 21,25 nm/piksel do 1,224 nm/piksel, a do analizy danych rozdzielczości ok. 5,58 nm/piksel (powiększenie 20 000x zgodnie z referencją Polaroid 545).
    4. Ustaw odległość roboczą w przedziale od 1 mm do 2 mm dla obserwacji o wysokiej rozdzielczości lub około 3 mm, jeśli wymagana jest większa głębia ostrości. Przerwanie dostosowuj prędkość skanowania oraz integrację linii, aby zapewnić stały stosunek sygnału do szumu przy czasie akwizycji wynoszącym około 30–45 s na obraz.

Obrazy z mikroskopu elektronowego skaningowego, komórki krwi na powierzchniach roślinnych, analiza naukowa.
Rysunek 2: Wpływ materiału naniesionego na filamenty septyn na falistych wzorach PDMS. SEM filamentów septyn pokrytych metodą rozpylania albo (A) 1,5 nm platyny, wykazujących wzór „wysuszonej, spękanej gleby”, typowy dla braku kohezji między klastrami jąder platyny, lub (B) 1,5 nm wolframu pokrytego gładką i spójną warstwą. Pasek skali = 200 nm. Białe kwadraty reprezentują powiększone widoki w prawym dolnym rogu. Sferyczne kropelki to małe pęcherzyki lipidowe oddziałujące z septynami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Deformacje GUV
Typowe konfokalne obrazy fluorescencyjne GUV, które zmieniły kształt po inkubacji z septynami w warunkach sprzyjających polimeryzacji septyn, przedstawiono na Rysunku 3. Niezmodyfikowane GUV (Rysunek 3A) miały idealnie sferyczny kształt. Po inkubacji z filamentami septyn drożdży *Saccharomyces cerevisiae* w stężeniu powyżej 50 nM pęcherzyki wydawały się zdeformowane. Przy stężeniu oktamerów septyn drożdży *Saccharomyces cerevi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak wspomniano powyżej, zastosowano mieszaninę lipidów, która zwiększa inkorporację PI(4,5)P2 w dwuwarstwie lipidowej, a tym samym ułatwia interakcje septyna-błona. Rzeczywiście, wykazaliśmy w innym miejscu25 , że pączkujące septyny drożdży oddziałują z pęcherzykami w sposób specyficzny dla PI(4,5)P2. Ten skład lipidowy został dostosowany empirycznie na podstawie badań przesiewowych wielu kompozycji i jest obecnie szeroko stosowany przez autorów. Z lipidami PI(4,5)P2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Patricii Bassereau i Danielowi Lévy za ich przydatne rady i dyskusje. Prace te skorzystały ze wsparcia ANR (Agence Nationale de la Recherche) na finansowanie projektu "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, oraz projektu "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin jest finansowany przez Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" i Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa był wspierany przez Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink był wspierany przez Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) za pośrednictwem projektu "BaSyC-Building a Synthetic Cell". Dotacja grawitacyjna (024.003.019). Dziękujemy Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) oraz Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Dziękujemy Instytutowi Obrazowania Komórek i Tkanek (PICT-IBiSA), Instytutowi Curie, członkowi francuskiej Narodowej Infrastruktury Badawczej France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-serynaAvanti Polar Lipids840035
Sonikator do kąpieliElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemikalia: NaCl, Tris-HCl, sacharoza, KCl, MgCl2, B-kazeina, chloroform, kakodylan sodu, kwas garbnikowy, etanolSigma Aldrich
Mikroskop konfokalnynikonwirujący dysk lub konfokalny
Suszarka punktu krytycznegoLeica microsystemsCPD300
Generator wody dejonizowanejMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α- fosfatydylocholinaAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Aldehyd glutarowy 25 %, roztwór wodnyThermo Fischer scientific50-262-19
Smar wysokopróżniowy, oprogramowanie Dow corningVWR
IMODhttps://bio3d.colorado.edu/imod/Pakiet oprogramowania do wyrównywania obrazów w seriach pochylonych i rekonstrukcji 3D
Lacey Formvar/siatki do mikroskopii elektronowej Eloise01883-F
LipidyAvanti Polar Lipids
L-&alfa;-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanAvanti Polar Lipids840046
Parownik metalowyLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 i NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Mikroskopia deltatetraoksydu osmu 4%19170
OsmometrLö ser15 M
Oczyszczacz plazmowyAlcatelpascal 2005 SD
Generator plazmyMikroskopia elektronowa Nauka
Sprzęt do zamrażania wgłębnegoLeica MicrosystemsEMGP
Transmisyjny mikroskop elektronowyThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Nauka22451ten produkt nie jest już dostępny w sprzedaży
Płytki woskowe, VitrexVWR

Bibliografia

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916(2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122(2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850(2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420(2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119(2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349(2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Filamenty septyntest in vitrowspierane lipidowe dwuwarstwygigantyczne p cherzyki jednowarstwoweskaningowa mikroskopia elektronowakriomikroskopia elektronowabia ka cytoszkieletusamorze bienie
Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.