Artykuł metodologiczny

Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn

DOI:

10.3791/63889

⸱

17 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Septyny to białka cytoszkieletu. Oddziałują z błonami lipidowymi i mogą wykrywać, ale także generować krzywiznę błony w skali mikronów. W tym protokole opisujemy oddolne metodologie in vitro do analizy deformacji błony, wrażliwego na krzywiznę wiązania septyny i ultrastruktury włókien septyny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebudowa błony zachodzi stale w błonie plazmatycznej i w obrębie organelli komórkowych. Aby w pełni przeanalizować rolę środowiska (warunki jonowe, skład białek i lipidów, krzywizna błony) oraz różnych partnerów związanych z określonymi procesami przekształcania błon, podejmujemy podejścia oddolne in vitro. W ostatnich latach pojawiło się duże zainteresowanie ujawnieniem roli białek septyny związanych z poważnymi chorobami. Septyny są niezbędnymi i wszechobecnymi białkami cytoszkieletu, które oddziałują z błoną plazmatyczną. Są one zaangażowane między innymi w podział komórek, ruchliwość komórek, neuromorfogenezę i spermiogenezę. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób septyny oddziałują i organizują się na błonach, aby następnie wywołać deformacje błony i jak mogą być wrażliwe na określone krzywizny błony. Niniejszy artykuł ma na celu rozszyfrowanie wzajemnych zależności między ultrastrukturą septyn na poziomie molekularnym a przebudową błony zachodzącą w skali mikronów. W tym celu pączkujące drożdże i kompleksy septyny ssaków poddano rekombinowanej ekspresji i oczyszczeniu. Następnie zastosowano kombinację testów in vitro do analizy samoorganizacji septyn na błonie. Do zbadania zależności między samoorganizacją septyny, zmianą kształtu błony i krzywizną błony wykorzystano dwuwarstwowe warstwy lipidowe (SLB), gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV), duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) i faliste podłoża.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Septyny to białka tworzące włókna cytoszkieletu, które oddziałują z błonami lipidowymi. Septyny są wszechobecne u eukariontów i niezbędne do wielu funkcji komórkowych. Zostały one zidentyfikowane jako główne regulatory podziału komórek u pączkujących drożdży i ssaków1,2. Biorą udział w wydarzeniach przekształcających błonę, ciliogenezie3 i spermiogenezie4. W komórkach ssaków septyny mogą również wchodzić w interakcje z aktyną i mikrotubulami5,6,7 w spoiwie zależnym od GTPaz Rho (BORG)8. W różnych tkankach (neurons9, cilia3, spermatozoa10), septyny zostały zidentyfikowane jako regulatory barier dyfuzyjnych dla komponentów związanych z błoną11. Wykazano również, że septyny regulują pęcherzyki błonowe i tworzenie się wypukłości12. Septyny, będące białkami wielozadaniowymi, są zaangażowane w powstawanie różnych powszechnych chorób13. Ich nieprawidłowa regulacja jest związana z pojawieniem się nowotworów14 i chorób neurodegeneracyjnych15.

W zależności od organizmu, kilka podjednostek septyny (dwie u Caenorhabditis elegans do 13 u ludzi) łączy się, tworząc kompleksy, których organizacja zmienia się w sposób zależny od tkanki16. Podstawowy blok budulcowy septyny składa się z dwóch do czterech podjednostek, występujących w dwóch egzemplarzach i samoskładających się w sposób palindromiczny przypominający pręt. W drożdżach pączkujących septyny są oktamerowe17,18. In situ septyny są często zlokalizowane w miejscach o krzywiźnie mikrometrowej; Znajdują się one w miejscach zwężenia podziału, u podstawy rzęsek i dendrytów oraz na pierścieniu plemników19,20. Na błonie rola septyn wydaje się być podwójna: są one zaangażowane w przekształcanie dwuwarstwy lipidowej i utrzymanie integralności błony21. W związku z tym badanie właściwości biofizycznych białek i/lub podjednostek tworzących włókna septyny w błonie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli. Aby przeanalizować specyficzne właściwości septyn w dobrze kontrolowanym środowisku, odpowiednie są oddolne podejścia in vitro. Do tej pory tylko kilka grup opisało właściwości biofizyczne septyn in vitro20,22,23. W związku z tym, w porównaniu z innymi włóknami cytoszkieletu, obecna wiedza na temat zachowania septyn in vitro pozostaje ograniczona.

Ten protokół opisuje, jak można analizować organizację włókien septyny, zmianę kształtu membrany i wrażliwość na krzywiznę19. W tym celu zastosowano kombinację metod mikroskopii optycznej i elektronowej (mikroskopia fluorescencyjna, mikroskopia krioelektronowa [cryo-EM] i skaningowa mikroskopia elektronowa [SEM]). Zmiana kształtu błony gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) o rozmiarach mikrometra jest wizualizowana za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii optycznej. Analizę ułożenia i ultrastruktury włókien septyny związanych z pęcherzykami lipidowymi przeprowadza się za pomocą cryo-EM. Analizę wrażliwości krzywizny septyny przeprowadza się za pomocą SEM, badając zachowanie włókien septyny związanych z dwuwarstwami lipidowymi opartymi na ciele stałym, osadzonymi na falistych podłożach o zmiennych krzywiznach, co umożliwia analizę wrażliwości krzywizny zarówno dla krzywizn dodatnich, jak i ujemnych. W porównaniu z poprzednią analizą20,24, tutaj proponujemy zastosowanie kombinacji metod, aby dokładnie przeanalizować, w jaki sposób septyny mogą się samoorganizować, synergistycznie deformować błonę i być wrażliwe na krzywiznę. Uważa się, że protokół ten jest przydatny i można go dostosować do każdego białka nitkowatego, które wykazuje powinowactwo do błon.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wyznaczanie kształtu membrany za pomocą gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV)

UWAGA: W tej sekcji generowane są GUV w celu naśladowania deformacji błony, które mogą być wywołane przez septyny w kontekście komórkowym. Rzeczywiście, w komórkach septyny często znajdują się w miejscach z krzywiznami mikrometrowymi. GUV mają rozmiary od kilku do kilkudziesięciu mikrometrów i mogą ulegać deformacji. W związku z tym są odpowiednie do oznaczania wszelkich deformacji spowodowanych septyną w skali mikrometrycznej. Fluorescencyjne lipidy, a także znakowane fluorescencyjnie septyny (przy użyciu białka zielonej fluorescencji [GFP]) są używane do śledzenia zachowania zarówno lipidów, jak i białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

  1. Przygotowanie i roztworów
    1. Przygotować bufor wzrostu GUV (50 mM NaCl, 50 mM sacharozy i 10 mM Tris [pH = 7,8]) oraz bufor obserwacyjny (75 mM NaCl i 10 mM Tris [pH = 7,8]).
    2. Zmierzyć (za pomocą komercyjnego osmometru) i dostosować osmolarność obserwacyjnych i wzrostowych (teoretycznie 170 mOsmol·L-1), dodając niewielkie ilości NaCl, aż ich odpowiednie osmolarności będą równe. Przefiltrować za pomocą filtra 0,2 μm. Podwielokrotnić bufor wzrostowy i przechowywać go w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania. Przechowywać bufor obserwacyjny w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Różnica w osmolarności między oboma nie powinna przekraczać 5%.
    3. Przygotować roztwór 5 mg·mL-1 β-kazeiny w buforze obserwacyjnym. Zapewnić całkowite rozpuszczenie (po kilku godzinach w temperaturze 4 °C z mieszaniem magnetycznym). Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm, podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować mieszaniny lipidów o całkowitym stężeniu lipidów 3 mg·mL-1 w chloroformie. Użyj kompozycji (mol%) 56,8% L-α-fosfatydylocholiny jaj (EggPC), 15% cholesterolu, 10% 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy (DOPE), 10% 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryny (DOPS), 8% L-α-fosfatydyloinozytolu-4,5-bisfosforanu mózgu (PI(4,5)P2) i 0,2% Bodipy-TR-Ceramidu, aby wzmocnić interakcje białko-lipid i sprzyjać włączeniu PI(4,5)P225.
    UWAGA: Z chloroformem należy obchodzić się pod wyciągiem za pomocą rękawic nitrylowych i okularów ochronnych. Pipetować roztwory chloroformu szklanymi strzykawkami i unikać plastiku, ponieważ chloroform rozpuszcza plastik. Przed i po użyciu należy przepłukać strzykawki, pipetując chloroform 5x-10x. Używaj oddzielnych strzykawek do pipetowania określonych fluorescencyjnych lipidów, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Lipidy mogą być przechowywane w chloroformie w temperaturze -20 °C w fiolce z bursztynowego szkła pokrytej teflonem. Fiolki muszą być wypełnione argonem przed zamknięciem i uszczelnione parafilmem, aby zapobiec utlenianiu lipidów.
  3. Elektroformowanie GUV za pomocą układu drutów platynowych
    UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schemat etapów eksperymentu oraz zdjęcie komory.
    1. Dokładnie wyczyść komorę i druty platynowe w następujący sposób, aby usunąć wszelkie pozostałości lipidów.
    2. Zanurz przewody i komorę w acetonie i poddaj sonikacji przez 10 minut. Przetrzyj je ostrożnie chusteczką papierową z acetonem.
    3. Zmontuj komorę, wkładając przewody, ponownie zanurz w acetonie i poddaj sonizacji przez 10 minut. Przetrzyj jeszcze raz acetonem, upewniając się, że przewody są całkowicie oczyszczone. Zanurz komorę w etanolu, poddaj sonikacji przez 10 minut i przetrzyj etanolem.
    4. Na koniec zanurz komorę w wodzie dejonizowanej, sonikuj przez 10 minut i osusz strumieniem azotu lub powietrza.
      UWAGA: Komora teflonowa (Rysunek 1B) została wykonana na zamówienie w warsztacie wewnętrznym. Mieszczą się w nim trzy komory, które można uszczelnić z obu stron za pomocą szklanych szkiełek nakrywkowych. Druty platynowe można wprowadzać do komory przez otwory o średnicy 1,3 mm.
    5. Po oczyszczeniu komory nałóż 3-4 krople na komorę (każda kropla to około 0,1 μL)) mieszaniny lipidów 3 mg·mL-1 na każdym drucie platynowym. Obróć druty o 180° i umieść 3-4 kropelki lipidów na komorę po przeciwnej stronie każdego platynowego drutu. Upewnij się, że krople nie stykają się ze sobą. Potrzeba około 5 μl mieszaniny lipidów na całą komorę.
    6. Umieść komorę wzrostową w komorze próżniowej na 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady chloroformu.
      UWAGA: Najlepsza jest głęboka próżnia (0.1 mbar). Po wysuszeniu lipidy są podatne na utlenianie i dlatego nie należy ich pozostawiać na powietrzu dłużej niż kilka minut.
    7. Za pomocą strzykawki nanieść smar wysokopróżniowy na dno komory (strona najbliżej przewodów) wzdłuż obwodu trzech komór i docisnąć czyste (22 mm x 40 mm) szkiełko nakrywkowe do smaru, aby zapewnić doskonałe uszczelnienie. Uszczelnij oba końce komory (tj. w miejscach wejścia/wyjścia przewodów) za pomocą pasty uszczelniającej (płytki woskowe). Podobnie nałóż smar próżniowy po drugiej stronie komory.
    8. Napełnij komory buforem wzrostu (~1 ml na komorę) za pomocą pipety. Nie mieszaj roztworu zbyt szybko ani mocno, aby zapobiec oderwaniu się filmu lipidowego od drutów. Uszczelnij hermetycznie górną część komory za pomocą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 mm x 40 mm, dociskając je do smaru. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, delikatnie dociśnij szklane szkiełko nakrywkowe od środka do krawędzi.
      1. Umieść komorę w lodówce o temperaturze 4 °C i podłącz przewody do generatora funkcji falowych (funkcja sinusoidalna przy 500 Hz). Ustaw efektywne napięcie na 350 mV dla krótszego okresu wzrostu (tj. 6 godzin) lub 250 mV dla dłuższego okresu wzrostu (tj. 12-16 godzin), jak już przedstawiono i zoptymalizowano w badaniu Beber et al.25.
    9. Usuń szkiełka nakrywkowe, zetrzyj szczeliwo i smar, a następnie usuń druty. Umyj i wyszoruj komorę chusteczką papierową, używając naprzemiennie wody i etanolu (≥70%.
      UWAGA: Optymalne napięcie i skala czasowa dla wzrostu GUV zależą od wielu parametrów, od stężenia soli buforowej po geometrię komory (tj. odległość między drutami i wielkość komory). Używaj tej samej komory za każdym razem, gdy eksperyment jest powtarzany, aby zapewnić powtarzalność. Przewody znajdują się w pobliżu dna komory, dzięki czemu lipidy można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wyobraź sobie lipidy na każdym etapie (patrz Rysunek 1C,D), aby upewnić się, że proces elektroformacji zakończył się sukcesem.
  4. Inkubacja septyny z pęcherzykami
    1. Zbieraj GUV z przewodów za pomocą wstępnie przyciętych końcówek pipet (otwór ~1 mm), które są umieszczane w pobliżu przewodów. Następnie odpipetuj roztwór wzdłuż całego drutu. Procedura ta zapobiega powstawaniu silnych przepływów lamelowych, które mogłyby zakłócić pracę GUV. Po wykonaniu tego kroku obcinanie końcówek pipet nie jest już wymagane. Rzeczywiście, przepływy płytkowe nie uszkadzają GUV w roztworze.
      UWAGA: Ze względu na obecność PI(4,5)P2 w mieszaninie lipidów, zebrane GUV muszą być przechowywane nie dłużej niż 2-3 godziny przed eksperymentem. Rzeczywiście, PI(4,5)P2 ulega szybkiej soludyzacji, a septyny nie wiążą się już z błonami kilka godzin po ich utworzeniu. Jednak po związaniu septyny z błoną pozostają związane przez kilka dni.
    2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy septyny w Tris 10 mM (pH 8) wyłącznie w celu osiągnięcia osmolarności równej osmolarności buforu wzrostu; w razie potrzeby rozcieńczyć roztwór septyny dalej w buforze obserwacyjnym. Dodaj zamierzoną objętość zebranych GUV (50-100 μL, aby uzyskać całkowitą objętość 200 μL). Przeprowadzić inkubację bezpośrednio w komorze obserwacyjnej po pasywacji β-kazeiną (patrz poniżej). Do osiągnięcia równowagi wymagany jest czas oczekiwania 20-30 min.
      UWAGA: Ekspresja i oczyszczanie kompleksów oktamerycznych septyny (drożdży ludzkich lub pączkujących) jest obszernie opisane w innych artykułach17. Krótko mówiąc, septyny ulegały ekspresji w Escherichia coli, oczyszczano w laboratorium przy użyciu etapów chromatografii powinowactwa, wykluczania wielkości i chromatografii jonowymiennej, a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C w roztworze wodnym 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl i 5 mM MgCl2 przy stężeniu ~1 mg·mL-1 (3 μM). Stosuje się wysokie stężenie soli, aby uniknąć agregacji septyny. Kompleksy septyny nie powinny być zagęszczane przez urządzenie do odwirowywania z filtrem, które indukuje agregację, a tym samym zmniejsza wydajność białka.
  5. Obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego i/lub wirującego dysku
    1. Aby zapobiec przywieraniu GUV do powierzchni i/lub wybuchowi, należy pasywować komorę obserwacyjną, inkubując ją z roztworem 5 mg·mL-1 β-kazeiny przez 30 minut.
    2. Usunąć roztwór β-kazeiny i przenieść roztwór septyny-GUV (krok 1.4.2.) do komory obserwacyjnej za pomocą pipety. Pozostaw GUV na dnie komory przez 10-15 min.
      UWAGA: Rozbieżność składu między wnętrzem GUV a zewnętrznym buforem powoduje niedopasowanie zarówno gęstości, jak i współczynnika załamania światła. Ze względu na niedopasowanie współczynnika załamania światła, GUV są widoczne w mikroskopii optycznej światła transmisyjnego.
    3. Za pomocą mikroskopii konfokalnej zwizualizuj sygnał fluorescencyjny lipidów, aby sprawdzić jakość GUV i stan blaszkowatości błony. Oceń gęstość septyn związanych z GUV, rejestrując sygnał fluorescencyjny septyn po wykonaniu prawidłowej kalibracji25. Wykonaj akwizycję stosu Z w odstępie przestrzennym 0,4 μm, aby przeanalizować i uwidocznić deformacje 3D pęcherzyków wywołane interakcją między septynami a błoną.
      UWAGA: Zastosowano obiektywy immersyjne z olejkiem o powiększeniach 60 lub 100-krotnych. Użyto standardowych mikroskopów konfokalnych lub z wirującym dyskiem (Tabela materiałów) o rozmiarach pikseli odpowiednio 250 nm i 110 nm. Do danego urządzenia należy dostosować warunki obrazowania. Do roztworu nie dodano żadnych specjalnych środków wybielających przeciw fotobieleniu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Elektroformacja GUV. (A) Schematyczne przedstawienie procesu elektroformacji z użyciem drutów platynowych. (B) Zdjęcie teflonowego urządzenia domowej roboty zmontowanego z drutów platynowych używanych do generowania GUV metodą elektroformacji. Przewody mają średnicę 0,5 mm i 3 mm odstępy między sobą. (C) GUV (obiekty sferyczne) obserwowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii optycznej podczas procesu wzrostu. Nieprzezroczysta strefa u dołu obrazu to drut platynowy. (D) GUV (okrągłe obiekty fluorescencyjne) obserwowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej podczas wzrostu na drucie platyny. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Analiza ultrastrukturalnej organizacji włókien septynowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej

UWAGA: Pęcherzyki nie nadają się do obrazowania standardowymi metodami mikroskopii elektronowej. Rzeczywiście, próbki są suszone przy użyciu standardowych metod barwienia ujemnego. Po odwodnieniu pęcherzyki mogą ulegać niespecyficznym deformacjom, co często prowadzi do wypukłości lipidów. Mikroskopia krioelektronowa jest zatem znacznie lepszą strategią obserwacji określonych deformacji pęcherzyków. Za pomocą cryo-EM próbki są osadzane w cienkiej (~100-200 nm) warstwie zeszklonego lodu, która zachowuje próbki w stanie zbliżonym do stanu rodzimego. Układy GUV są jednak zbyt duże (kilkadziesiąt mikrometrów), aby można je było zatopić w cienkim lodzie i tym samym zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W związku z tym generowane są duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV), których średnice wahają się od ~50-500 nm, w celu określenia, w jaki sposób septyny mogą deformować pęcherzyki i jak układają się na pęcherzykach.

  1. Wytwarzanie dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV)
    1. Przygotuj 50 μg mieszanki lipidów rozpuszczonej w chloroformie o składzie molowym 57% EggPC, 15% cholesterolu, 10% DOPE, 10% DOPS i 8% PI(4,5)P2 mózgu), który jest zoptymalizowany w celu zwiększenia interakcji septyny z błoną w szklanej fiolce.
    2. Wysuszyć roztwór pod przepływem argonu, aby wytworzyć wysuszony film lipidowy w fiolce. Umieścić fiolkę pod próżnią na 30 minut, aby całkowicie wysuszyć lipid.
    3. Rozpuścić film lipidowy w 50 μl roztworu wodnego (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2) w celu uzyskania końcowego stężenia 1 mg·mL-1, wirować przez 10 s i przenieść roztwór do probówki.
      UWAGA: LUV należy użyć od razu do inkubacji z septynami. W przeciwnym razie oddziaływanie białko-lipid będzie słabe z powodu rozpuszczania PI(4,5)P2. Ten prymitywny proces resolubilizacji generuje niejednorodną populację pęcherzyków o średnicach od 50 nm do 500 nm. W związku z tym jednocześnie badany jest cały zakres średnic, a tym samym krzywizn.
  2. Inkubować septyny z rozpuszczonymi lipidami przy końcowych stężeniach lipidów i septyny odpowiednio 0,1 mg·mL-1 (około 300 nM) i 20 nM w buforze o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2). Inkubować próbkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Zamrażanie wgłębne w celu zeszklenia próbki
    1. Żarzące się i wyładowcze dziurawe siatki węglowe (300 oczek) po stronie węglowej przez 30 s przy 5 mA za pomocą generatora plazmy i włóż siatkę do maszyny do zamrażania wgłębnego w wilgotnym środowisku.
    2. Adsorbować 4 μl próbki (etap 2.2.) po stronie rozżarzonej węgla siatki. Bezpośrednio przed adsorpcją próbki dodaj do roztworu złote kulki o długości fali 5-10 nm, w przypadku, gdy próbki zostaną wykorzystane do wygenerowania serii pochylonych za pomocą kriotomografii.
      UWAGA: Gęstość złotych koralików musi być przesiewana i dostosowywana empirycznie i zależy od dostawcy. Optymalna gęstość to 10-15 złotych koralików w polu widzenia.
    3. Osuszyć próbki od gołej strony, aby zassać kroplę próbki po przeciwnej stronie.
      UWAGA: Czas blottingu wynosi zwykle 4 s, a położenie bibuły filtracyjnej i siła blottingu są regulowane empirycznie poprzez testowanie i przesiewanie alternatywnych pozycji bibuły filtracyjnej w celu optymalizacji jakości lodu (grubości) i gęstości materiału.
    4. Przenieś siatki do mikroskopu lub przechowuj je w pojemniku z ciekłym azotem.
      UWAGA: Użycie dziurawych siatek węglowych jest niezbędne, aby dostosować się do polidyspersyjności w wielkości pęcherzyków. Osuszanie próbki z przeciwnej strony sprzyja zwiększonej adsorpcji materiału biologicznego na siatce.
  4. Obrazowanie w mikroskopii krioelektronowej
    1. Włóż siatki do mikroskopu elektronowego (EM) wyposażonego w obserwację krio-EM. Przesiewaj całą siatkę, generując mapę całej próbki w małym powiększeniu (zwykle przy powiększeniu 120x), aby wybrać obszary wyświetlające lepszy lód (tj. cienki i dobrze zeszklony).
    2. W celu zbierania danych Cryo-EM 2D należy zebrać obrazy o rozmiarze piksela około 2 A na piksel, aby sprawdzić jakość próbki. Upewnij się, że zarówno włókna septyny, jak i dwuwarstwa lipidowa są widoczne.
    3. W celu zebrania danych z tomografii krioelektronowej wybierz obszary zainteresowania z deformowanymi pęcherzykami. Upewnij się, że w polu widzenia znajduje się wystarczająca ilość złotych koralików (co najmniej 10).
    4. Zgodnie z oprogramowaniem używanym do zbierania danych dotyczących serii pochylonych, wybierz pozycje ostrości i śledzenia, aby być wystarczająco daleko od obszaru zainteresowania. Zbieraj pochylone serie, zmieniając kąt nachylenia od -60° do +60°, zbierając obraz co 2°-3° stopni.
      UWAGA: Całkowita dawka powinna wynosić około lub mniej niż 100 elektronów/A2. Rozmiar piksela waha się od 1,3 A do 2,1 A, w zależności od mikroskopu używanego do zbierania danych. Idealnie, preferowany jest schemat symetrii kątowej do zbierania danych w następujący sposób: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. Jednak goniometry mikroskopów z bocznym wejściem nie zapewniają wystarczającej stabilności mechanicznej, aby osiągnąć te symetryczne schematy. Alternatywnie akwizycję można rozpocząć od 0° do 34°, następnie wykonać drugą sekwencję kątową od -2° do -60°, a zakończyć sekwencją końcową od 36° do 60°. Celem jest zebranie pierwszych obrazów (z najmniejszymi uszkodzeniami promieniowania) pod najmniejszymi kątami. Ponadto, aby uwidocznić ultrastrukturę pęcherzyków i związanych włókien septyny, można użyć standardowego mikroskopu krio-EM (200 kV, żarnik heksaborku lantanu (LaB6) i wejście boczne próbki). Jeśli jednak ktoś chce kontynuować przetwarzanie obrazu (na przykład uśrednianie metodą subtomogramu), najlepiej jest użyć mikroskopów z pistoletem do emisji polowej najnowszej generacji (FEG) wyposażonych w detektory bezpośrednie. W tym protokole ograniczamy nasz opis do pozyskiwania rekonstrukcji 3D i pomijamy uśrednianie subtomogramowe.
  5. Rekonstrukcja 3D na podstawie kriotomografii i segmentacji
    1. Użyj pakietu oprogramowania IMOD (Tabela materiałów) do wyrównywania obrazu serii pod kątem i rekonstrukcji 3D26,27. W IMOD wykonaj wyrównanie serii pochylenia w oparciu o pozycjonowanie fiducials (złote koraliki). Ponadto, jeśli zajdzie taka potrzeba, należy przeprowadzić wyznaczanie i korekcję funkcji transferu kontrastu (CTF) w ramach IMOD26. Na koniec osiągnij rekonstrukcję 3D za pomocą IMOD, rygorystycznie przestrzegając każdego kroku.
    2. Ręcznie segmentuj dwuwarstwy lipidowe i włókna septyny za pomocą 3Dmod27 z pakietu oprogramowania IMOD, w celu wyświetlenia.

3. Analiza wrażliwości septyny na krzywiznę za pomocą SEM

UWAGA: Aby zrozumieć, w jaki sposób septyny mogą być wrażliwe na mikrometrowe krzywizny, zastosowano podejście in vitro do inkubacji kompleksów włókien septynowych z dwuwarstwami lipidowymi opartymi na solidnym nośniku osadzonym na falistych wzorach w skali mikrometrowej.

  1. Zaprojektowanie falistej repliki NOA (klej optyczny Norland) z falistych wzorów z polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. Użyj pofałdowanych wzorów PDMS o amplitudzie 250 nm i okresowości bocznej 2 μm lub innych wymiarach, aby oznaczyć krzywizny odpowiednie dla białka będącego przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: Pofałdowane wzory PDMS są projektowane i generowane zgodnie z opisem w Nania et al.28,29.
    2. W pomieszczeniu czystym nanieś 5 μl ciekłego NOA na okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 1 cm i umieść szablon PDMS na kropli. Poddaj działaniu światła UV (320 nm) przez 5 minut, aby fotopolimeryzować ciekły NOA w cienką warstwę polimerową. Następnie delikatnie oderwij szablon PDMS od szkiełka nakrywkowego ze świeżo spolimeryzowanym NOA.
      UWAGA: NOA jest powszechnym optycznie przezroczystym klejem odpowiednim do obrazowania mikroskopią optyczną. Ponadto NOA jest odporny na chemiczne procesy utrwalania i barwienia przeprowadzane przed obrazowaniem SEM. Zarówno żywice NOA 71, jak i NOA 81 mogą być stosowane z podobnymi wynikami. Początkowy wzorzec PDMS mógł być używany kilkakrotnie do produkcji replik NOA. Otrzymane repliki NOA mogą być przechowywane w pudełku w temperaturze pokojowej przez wiele miesięcy.
  2. Wytwarzanie podpartej dwuwarstwy lipidowej i inkubacja białek
    1. Folie NOA należy traktować za pomocą środka do czyszczenia plazmą powietrzną przez 5 minut, aby powierzchnia była hydrofilowa.
    2. Przygotować roztwór małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) o składzie molowym 57% EggPC, 15% cholesterolu, 10% DOPE, 10% DOPS i 8% PI(4,5)P2 w mózgu przy całkowitym stężeniu lipidów 1 mg·mL-1. Przygotować SUV-y poprzez ponowne zawieszenie wysuszonego filmu lipidowego w buforze obserwacyjnym, jak opisano w kroku 2.1.3. Delikatnie sonikować roztwór za pomocą sonikatora do kąpieli przez 5-10 minut, aż roztwór stanie się przezroczysty.
      UWAGA: Roztwór SUV-ów można przechowywać w stanie zamrożonym przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C.
    3. Włóż szkiełka nakrywkowe podtrzymujące wzory NOA do studzienek w pudełkach do hodowli komórkowych. Umieścić 100 μl roztworu 1 mg·mL-1 SUV na świeżo rozżarzonych wzorach NOA (krok 3.2.1.) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ten etap indukuje fuzję SUV-ów z powierzchnią wzoru NOA w celu wytworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej.
    4. Dokładnie przepłukać szkiełka 6 razy buforem septynowym (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) w celu usunięcia niestopionego SUV. Po każdym płukaniu nigdy nie pozwól, aby próbka całkowicie wyschła.
    5. Rozcieńczyć oktamerycznego roztworu podstawowego septyny w buforze septynowym o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM MgCl2) za pomocą buforu septynowego (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2) do końcowych stężeń w zakresie od 10 nM do 100 nM i objętości 1 ml. Inkubować roztwór białka na szkiełkach przez ~1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Objętość jest na tyle duża, że parowanie nie stanowi problemu.
  3. Przygotowanie próbki do analizy SEM
    UWAGA: W mikroskopii elektronowej opracowano różne protokoły do analizy struktur białek i ich składania. Obecny protokół zachowuje organizację włókien septyny, wykorzystując protokół utrwalania pochodzący z Svitkina et al.30, który jest łatwy do wdrożenia. Poza tym protokół ten optymalizuje obserwacje SEM o wysokiej rozdzielczości.
    1. Przygotowanie odczynników i roztworów podstawowych
      UWAGA: Ten protokół wymaga kilku odczynników i roztworów, które można przygotować z wyprzedzeniem lub tuż przed inkubacją. Postępuj zgodnie z podanymi instrukcjami, aby uniknąć artefaktów lub braku reaktywności chemicznej.
      1. Kakodylan sodu 0,2 M roztwór podstawowy: Aby przygotować ten roztwór o podwójnej mocy, rozpuść 2,14 g proszku kakodylanu sodu w ~ 40 ml wody destylowanej pod mieszaniem magnetycznym. Po całkowitym rozpuszczeniu dostosować pH do 7,4, delikatnie dodając 0,1 M HCl (~1 ml na 50 ml roztworu) i uzupełnić końcową objętość wodą destylowaną. Roztwór ten można przechowywać przez 24-48 godzin w temperaturze 4°C.
      2. 2% aldehydu glutarowego (GA) w 0,1 M kakodylanu sodu (roztwór utrwalający): Przygotuj ten roztwór tuż przed użyciem, rozcieńczając wysoce czysty GA klasy EM 0,2 M roztworem kakodylanu sodu (patrz wyżej). Używaj komercyjnego roztworu podstawowego GA o stężeniu 25%-50% ze względu na jego zoptymalizowaną pojemność magazynowania w temperaturze 4 °C. Aby przygotować 10 ml roztworu utrwalającego, rozcieńczyć 0,8 ml 25% handlowego roztworu GA z 4,2 ml wody destylowanej i 5 ml 0,2 M kakodylanu sodu.
      3. 1% tetratlenek osmu (OsO4) w 0,1 M kakodylanu sodu: Przygotować ten drugi roztwór utrwalający tuż przed użyciem, rozcieńczając dostępny na rynku 4% roztwór podstawowy OsO4 0,2 M kakodylanu sodu (patrz wyżej). W przypadku 4 ml roztworu utrwalającego OsO4 rozcieńczyć 1 ml 4% komercyjnego roztworu OsO4 z 1 ml wody destylowanej i 2 ml 0,2 M kakodylanu sodu.
        UWAGA: Stosować komercyjny 4% roztwór podstawowy OsO4 w rozszczepialnych szklanych bańkach ze względu na ich właściwości przechowywania i przenoszenia. Należy pamiętać, że OsO4 jest wysoce reaktywny. Upewnij się, że jego kolor jest lekko żółty i nie ciemny.
      4. 1% kwas garbnikowy (TA) w wodzie: Przygotuj ten roztwór tuż przed użyciem. Przygotować roztwór TA, aby uzyskać końcowe stężenie 1% TA w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Rozpuścić 10 mg w 1 ml wody destylowanej i wirować przez kilka minut. Roztwór TA nie może być przechowywany i przed użyciem należy go przefiltrować filtrem 0,2 μm.
      5. 1% roztwór octanu uranylu (UA) w wodzie Przygotować roztwór UA, aby uzyskać końcowe stężenie 1% UA w wodzie destylowanej. Rozpuścić 10 mg w 1 ml wody destylowanej i wirować przez co najmniej 30 minut do 1 godziny, wirując lub wstrząsając w temperaturze pokojowej. Roztwór ten może być przechowywany przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C, ale może łatwo się wytrącać i dlatego przed użyciem należy go przefiltrować filtrem 0,2 μm.
      6. Stopniowane serie roztworów etanolu Przygotuj 50%, 70%, 95% i 100% roztwory etanolu w wodzie. Przygotować końcową kąpiel z nowo otwartych butelek ze 100% etanolem lub ze 100% etanolu, który był odwadniany przez co najmniej 24 godziny, za pomocą sit molekularnych (nominalna średnica porów = 4 A) w celu usunięcia z próbek wszelkich śladów wody, które mogłyby zakłócać suszenie i powlekanie. Należy uważać, aby nie potrząsać tym roztworem, ponieważ może to spowodować ponowne zawieszenie cząstek krzemianu.
        UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z odczynnikami chemicznymi używanymi w tym protokole. Aldehyd glutarowy, tetratlenek osmu, kakodylan sodu i octan uranylu są wysoce toksyczne, octan uranylu jest również radioaktywny. Wszelka manipulacja odczynnikami i ich odpadami musi odbywać się przy użyciu środków ochrony indywidualnej (rękawice, fartuchy laboratoryjne, okulary ochronne) i zbiorowej (dygestoria i osłony z pleksiglasu), zgodnie z procedurami specyficznymi dla laboratorium.
    2. Utrwalanie próbki
      1. Przepłukać próbki (tj. szkiełka NOA ze stopionymi dwuwarstwami lipidowymi i inkubowanym białkiem) PBS. Zastąp PBS roztworem utrwalającym GA podgrzanym w temperaturze 37 °C i pozwól reakcji postępować przez 15 minut. Próbki można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
      2. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć utrwalone próbki 3 razy 0,1 M kakodylanem sodu (5 minut na przemycie) delikatnie wstrząsając.
      3. Próbki należy inkubować w roztworze utrwalającym OsO4 przez 10 minut, zapewniając maksymalną ochronę przed światłem, aby umożliwić utrwalenie struktur błoniastych i zwiększyć przewodność elektryczną próbek. Usunąć roztwór utrwalający i umyć próbki 3x w wodzie destylowanej (5 minut na mycie) delikatnie wstrząsając.
      4. Umyte próbki inkubować w przefiltrowanym roztworze utrwalającym TA przez maksymalnie 10 minut. Usunąć roztwór TA i umyć próbki 3 razy w wodzie destylowanej (5 minut na płukanie), delikatnie wstrząsając.
      5. Umyte próbki inkubować w świeżo przefiltrowanym roztworze utrwalającym UA przez 10 minut, zapewniając maksymalną ochronę przed światłem. Usunąć roztwór UA i umyć próbki 3x w wodzie destylowanej (5 minut na mycie) delikatnie wstrząsając.
    3. Dehydratacja próbki i suszenie w punkcie krytycznym
      UWAGA: Suszenie powietrzem jest niedozwolone, aby uniknąć uszkodzenia próbek przez niepożądane napięcia powierzchniowe podczas zmiany stanu ciekłego na gazowy. W EM ustalono dwie metody: fizyczną metodę osiągania stanu nadkrytycznego CO2 i omijania jego punktu krytycznego (31 °C, 74 bary) lub chemiczną metodę odparowywania heksametylodilazanu, czyli środka suszącego o obniżonym napięciu powierzchniowym. CO2 i HMDS słabo mieszają się z wodą. W związku z tym wszystkie ślady wody muszą zostać zastąpione rozpuszczalnikiem przejściowym (etanolem), aby uniknąć późniejszych uszkodzeń podczas procesów suszenia.
      1. Próbki inkubować przez 2-3 minuty w każdym roztworze etanolu, zaczynając od 50% do 100% (bezwodnej) kąpieli etanolowej.
        UWAGA: Ponieważ parowanie etanolu między kąpielami jest szybkie, obchodzenie się z próbką również musi być szybkie, aby uniknąć wysuszenia na powietrzu.
      2. Przenieś szkiełka szklane do suszarki w punkcie krytycznym wstępnie napełnionej etanolem i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
        UWAGA: W tym protokole zastosowano aparaturę automatyczną, ale można użyć dowolnego systemu. Protokoły mogą się różnić dla każdego urządzenia, ale muszą być zoptymalizowane w celu całkowitego usunięcia etanolu (25 kąpieli w tym protokole) i zmniejszenia prędkości dla różnych wymian rozpuszczalników (wloty CO2 i wyloty etanolu/CO2 ) oraz końcowego rozhermetyzowania (prawie 1 godzina w tym protokole).
      3. Po zakończeniu suszenia w punkcie krytycznym próbki należy natychmiast przechowywać w eksykatorze do czasu ich zamontowania i powlekania. Ponieważ wysuszone próbki są wysoce higroskopijne, należy je jak najszybciej pokryć (patrz poniżej).
        UWAGA: Alternatywnie, HMDS może zaoferować tańszą i szybszą metodę. Chociaż HDMS nigdy nie był testowany na naszych próbkach, to podejście dało dobre wyniki obserwacji białek na wewnętrznej powierzchni błon komórkowych31,32.
    4. Przykładowy montaż i powlekanie.
      UWAGA: Ponieważ próbki biologiczne mają słabe właściwości przewodności elektrycznej, przed obserwacją SEM należy je pokryć przewodzącą folią metalową. W ten sposób stosuje się rozpylanie plazmowo-magnetronowe.
      1. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do odcinków, które będą używane do przyszłych obserwacji SEM. Użyj srebrnej farby ze względu na jej lepszą przewodność elektryczną w porównaniu z dyskami węglowymi. Dodaj pasek srebrnej farby do górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego i upewnij się, że połączenie z króćcem jest zadowalające. Unikaj aglomeratów farby.
        UWAGA: Srebrny pasek farby musi być cienki, aby uniknąć kontaktu między próbką a soczewką obiektywu SEM podczas pracy w wysokich rozdzielczościach (tj. małej odległości roboczej).
      2. Poczekaj, aż rozpuszczalnik całkowicie odparuje.
        UWAGA: Czas trwania tego kroku może się różnić w zależności od ilości i grubości osadu farby srebrnej. Ten krok można skrócić, używając słoika dzwonowego lub powlekarki i próżni wstępnej przez 10-30 minut.
      3. Używaj aparatury wyposażonej w plazmowo-magnetronową głowicę rozpylającą i obrotowy stolik planetarny i postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami dostarczonymi przez producenta. W tym przypadku aparatura została opróżniona do 2,5 x 10-5 mbar, przeczyszczona 1x wysokiej jakości argonem, a następnie dostosowana do 8,0 x 10-3 mbar.
      4. Wykonaj napylanie wstępne (120 mA przez 60 s), aby usunąć warstwę tlenku z powierzchni. Następnie nanieść 1,5 nm wolframu (90 mA, odległość robocza = 50 mm) za pomocą monitora grubości folii.
        UWAGA: Powlekarka musi być doskonale wyczyszczona, aby zapewnić powtarzalność parowania filmu. Powłokę należy zatrzymać po osiągnięciu docelowej grubości. Ostateczna grubość warstwy jest obliczana i korygowana. Folie o długości fali około 1,5 nm mają średnio 0,7 nm po korekcie przy użyciu naszej aparatury. Ponieważ te wartości korekcji są bliskie wartości docelowej, wykonuje się serię powłok w celu oceny, a następnie odjęcia tej korekty od wartości docelowej.
      5. Próbki należy przechowywać w próżni w celu ochrony przed otaczającym powietrzem do czasu przeprowadzenia wszystkich analiz SEM.
        UWAGA: Charakter metalu używanego do rozpylania ma znaczenie. Pt, mimo że jest powszechnie stosowanym materiałem, skutkuje powłokcją niskiej jakości o grubości warstwy Pt dostosowanej do włókien septynowych (1,5 nm). Przy wysokich rozdzielczościach filmowi Pt 1,5 nm brakuje spójności; rozmiar klastrów Pt i włókien septyny staje się w ten sposób podobny, co prowadzi do błędnych interpretacji podczas procesu segmentacji filamentu33 (patrz Rysunek 2A, wstawka). Wolfram jest dobrą alternatywą dla Pt, ponieważ wyświetla mniejszy rozmiar ziarna, ledwo widoczny w SEM o wysokiej rozdzielczości (patrz Rysunek 2B, wstawka). Niemniej jednak czysty wolfram łatwo ulega utlenieniu, co prowadzi do silnych artefaktów efektu ładowania podczas obserwacji SEM, jeśli procedura została opisana w kroku 3.3.4. nie jest ściśle przestrzegany.
  4. Obrazy należy uzyskać za pomocą mikroskopu SEM z emisją polową (FESEM).
    UWAGA: Technologie SEM zostały niedawno zaktualizowane w celu poprawy rozdzielczości, a technologie zależą od producenta (np. optyka elektronowa, opóźnienie wiązki, soczewka magnetyczna). Ten przyrost rozdzielczości (dostępny u kilku producentów), zwłaszcza przy niskim napięciu przyspieszającym (blisko nanometru przy 1 kV), jest niezbędny do rozdzielenia struktur nanometrycznych podobnych do sieci septynowych.
    1. Osiągnij obrazowanie w wysokiej rozdzielczości poprzez detekcję pierwotnych elektronów wtórnych (SE1) za pomocą detektora "w obiektywie" przy użyciu następujących ustawień.
    2. Ustaw napięcie przyspieszające na 3 kV. Ustal prąd wiązki z aperturą 20 μm (dla kolumn Zeiss Gemini I lub odpowiednikiem 34 pA) lub z aperturą 15 μm (dla kolumn Zeiss Gemini I lub odpowiednikiem 18.5 pA), jeśli potrzebne jest tłumienie efektów ładowania.
    3. Do obserwacji używaj rozdzielczości od 21,25 nm/piksel do 1,224 nm/piksel, a do analizy danych używaj rozdzielczości ~5,58 nm/piksel (powiększenie 20 000x zgodnie z odniesieniem do Polaroida 545).
    4. Ustaw odległość roboczą między 1 mm a 2 mm w przypadku obserwacji w wysokiej rozdzielczości i około 3 mm, jeśli wymagana jest zwiększona głębia ostrości. Stale dostosowuj prędkość skanowania i integrację linii, aby zapewnić stały stosunek sygnału do szumu z czasem akwizycji około 30-45 s na obraz.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Wpływ materiału osadzonego na włóknach septyny na faliste wzory PDMS. SEM włókien septyny pokrytych przez rozpylanie albo (A) 1,5 nm platyny, wykazujących wzór "suchej popękanej gleby" typowy dla braku spoistości między skupiskami jąder platyny, albo (B) 1,5 nm wolframu pokrytego gładką i spoistą warstwą. Podziałka = 200 nm. Białe kwadratowe pola reprezentują powiększone widoki w prawym dolnym rogu. Kuliste kuleczki to małe pęcherzyki lipidowe oddziałujące z septynami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

deformacje GUVs
Typowe obrazy fluorescencji konfokalnej GUV przekształconych po inkubacji z septynami są wyświetlane w Rysunek 3, w warunkach, w których przegrody polimeryzują. Gołe GUV-y (Rysunek 3A) były idealnie kuliste. Po inkubacji z ponad 50 nM pączkującymi włóknami septyny drożdży, pęcherzyki wydawały się zdeformowane. Do stężenia 100 nM pączkujących octtamerów septyny drożdży, pęcherzyki wydawały się fasetowane, a deformacje pozostawały statyczne, a zat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wspomniano powyżej, zastosowano mieszaninę lipidów, która zwiększa inkorporację PI(4,5)P2 w dwuwarstwie lipidowej, a tym samym ułatwia interakcje septyna-błona. Rzeczywiście, wykazaliśmy w innym miejscu25 , że pączkujące septyny drożdży oddziałują z pęcherzykami w sposób specyficzny dla PI(4,5)P2. Ten skład lipidowy został dostosowany empirycznie na podstawie badań przesiewowych wielu kompozycji i jest obecnie szeroko stosowany przez autorów. Z lipidami PI(4,5)P2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Patricii Bassereau i Danielowi Lévy za ich przydatne rady i dyskusje. Prace te skorzystały ze wsparcia ANR (Agence Nationale de la Recherche) na finansowanie projektu "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, oraz projektu "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin jest finansowany przez Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" i Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa był wspierany przez Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink był wspierany przez Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) za pośrednictwem projektu "BaSyC-Building a Synthetic Cell". Dotacja grawitacyjna (024.003.019). Dziękujemy Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) oraz Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Dziękujemy Instytutowi Obrazowania Komórek i Tkanek (PICT-IBiSA), Instytutowi Curie, członkowi francuskiej Narodowej Infrastruktury Badawczej France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-serynaAvanti Polar Lipids840035
Sonikator do kąpieliElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemikalia: NaCl, Tris-HCl, sacharoza, KCl, MgCl2, B-kazeina, chloroform, kakodylan sodu, kwas garbnikowy, etanolSigma Aldrich
Mikroskop konfokalnynikonwirujący dysk lub konfokalny
Suszarka punktu krytycznegoLeica microsystemsCPD300
Generator wody dejonizowanejMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α- fosfatydylocholinaAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Aldehyd glutarowy 25 %, roztwór wodnyThermo Fischer scientific50-262-19
Smar wysokopróżniowy, oprogramowanie Dow corningVWR
IMODhttps://bio3d.colorado.edu/imod/Pakiet oprogramowania do wyrównywania obrazów w seriach pochylonych i rekonstrukcji 3D
Lacey Formvar/siatki do mikroskopii elektronowej Eloise01883-F
LipidyAvanti Polar Lipids
L-&alfa;-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanAvanti Polar Lipids840046
Parownik metalowyLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 i NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Mikroskopia deltatetraoksydu osmu 4%19170
OsmometrLö ser15 M
Oczyszczacz plazmowyAlcatelpascal 2005 SD
Generator plazmyMikroskopia elektronowa Nauka
Sprzęt do zamrażania wgłębnegoLeica MicrosystemsEMGP
Transmisyjny mikroskop elektronowyThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Nauka22451ten produkt nie jest już dostępny w sprzedaży
Płytki woskowe, VitrexVWR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916(2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122(2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850(2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420(2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119(2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349(2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Filamenty septyntest in vitrowspierane lipidowe dwuwarstwygigantyczne p cherzyki jednowarstwoweskaningowa mikroskopia elektronowakriomikroskopia elektronowabia ka cytoszkieletusamorze bienie

Powiązane artykuły