Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63891

⸱

5 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Streszczenie

Aby rozszyfrować skomplikowane mechanizmy molekularne, które regulują składanie i rozkładanie filamentów aktynowych, bardzo przydatne jest monitorowanie poszczególnych reakcji na żywo w dobrze kontrolowanych warunkach. W tym celu w ciągu ostatnich 20 lat przeprowadzono eksperymenty na żywych pojedynczych włóknach, głównie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), które dostarczyły wielu kluczowych wyników. W 2011 roku, w celu dalszego rozszerzenia możliwości tych eksperymentów i uniknięcia powtarzających się problematycznych artefaktów, wprowadziliśmy do tych testów proste mikrofluidyki. Badanie to szczegółowo opisuje nasz podstawowy protokół, w którym poszczególne włókna aktyny są zakotwiczone jednym końcem w pasywowanej powierzchni szkiełka nakrywkowego, dopasowują się do przepływu i mogą być kolejno wystawione na działanie różnych roztworów białkowych. Przedstawiamy również protokoły dla konkretnych zastosowań i wyjaśniamy, w jaki sposób można zastosować kontrolowane siły mechaniczne dzięki lepkiemu oporowi przepływającego roztworu. Zwracamy uwagę na techniczne zastrzeżenia tych eksperymentów i pokrótce przedstawiamy możliwe rozwiązania oparte na tej technice. Te protokoły i wyjaśnienia, wraz z dzisiejszą dostępnością łatwego w użyciu sprzętu mikrofluidycznego, powinny umożliwić osobom niebędącym specjalistami wdrożenie tego testu w swoich laboratoriach.

Wprowadzenie

Montaż i demontaż filamentów aktynowych oraz sieci filamentów aktynowych są kontrolowane przez kilka reakcji biochemicznych i zależą od kontekstu mechanicznego. Aby uzyskać wgląd w te złożone mechanizmy, nieoceniona jest możliwość obserwowania poszczególnych reakcji na poszczególnych włóknach (w odpowiednio dużej liczbie). W ciągu ostatnich dziesięcioleci obserwacja dynamicznych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, głównie przy użyciu mikroskopii fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), stała się kluczową techniką i dostarczyła imponującej listy wyników, których nie można było uzyskać za pomocą testów biochemicznych roztworów masowych1.

Aby to osiągnąć, należy utrzymywać znakowane fluorescencyjnie filamenty aktynowe blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego mikroskopu, jednocześnie wystawiając je na działanie roztworów białek wiążących aktynę (ABP), które mogą być również znakowane fluorescencyjnie. W ten sposób można monitorować zdarzenia zachodzące na poszczególnych włóknach w dobrze kontrolowanych warunkach biochemicznych, a tym samym określać ilościowo szybkość reakcji. Należy jednak wziąć pod uwagę szereg konkretnych ograniczeń. Sztuczne utrzymywanie włókien blisko powierzchni, często dzięki wielu punktom kotwiczenia lub przy użyciu środka spulchniającego, takiego jak metyloceluloza, może zmienić ich zachowanie (np. powodując przerwy w ich polimeryzacji i depolimeryzacji2). Śledzenie konturu każdego filamentu może być trudne, zwłaszcza jeśli nowe włókna lub fragmenty filamentu gromadzą się z czasem w polu widzenia. Reakcje zachodzą w skończonej objętości, w której stężenie monomerów aktyny i ABP może zmieniać się w czasie, co potencjalnie utrudnia wyznaczenie dokładnych stałych szybkości. Wreszcie, odnowienie lub zmiana roztworu ABP jest trudna do osiągnięcia w czasie krótszym niż 30 s i często prowadzi do niejednorodnej zawartości białka w próbce.

Nieco ponad 10 lat temu, zainspirowani tym, co już zrobiono w celu zbadania pojedynczych nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)3, wprowadziliśmy nową technikę opartą na mikrofluidyce do obserwacji i manipulowania pojedynczymi filamentami aktyny4. Pozwala to na obejście wspomnianych wcześniej ograniczeń klasycznych technik jednowłóknistych. W tych testach mikrofluidycznych włókna aktynowe są hodowane z nasion spektryny-aktyny zaadsorbowanych na szkiełku nakrywkowym. Włókna są w ten sposób zakotwiczone tylko jednym końcem na dnie komory mikroprzepływowej i wahają się nad powierzchnią bez przywierania. Włókna dopasowują się do przepływu napływających roztworów, ułatwiając w ten sposób monitorowanie ich długości konturu i utrzymując je w płytkim obszarze nad szkiełkiem nakrywkowym, w którym można zastosować TIRF. Różne roztwory są jednocześnie przepływane do komory bez mieszania, a włókna mogą być wystawione na ich działanie sekwencyjnie i szybko.

Tutaj proponujemy serię podstawowych protokołów do przeprowadzenia testów mikrofluidycznych z pojedynczym filamentem aktyny w laboratorium. Szkiełka nakrywkowe i komory mikrofluidyczne można przygotować z wyprzedzeniem (w pół dnia), a sam eksperyment, w którym można przetestować kilka warunków biochemicznych, odbywa się w mniej niż jeden dzień.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komory mikrofluidycznej

  1. Wybierz matrycę główną z SU-8 z kilkoma wzorami komór. Typowe komory mają kształt krzyża z trzema wlotami i jednym wylotem, 20 µm wysoka i 800 µm szeroki (Rysunek 1). Takie formy matki można nabyć od zewnętrznych firm lub wykonać w laboratoriach akademickich (np. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Oklej krawędzie formy taśmą.
    1. Przygotuj standardową przezroczystą taśmę biurową o długości ok. 50 cm i szerokości 19 mm (patrz Tabela materiałów) na blacie, stroną klejącą do góry. Umieść formę pionowo na jednym końcu i wzdłuż linii środkowej taśmy.
    2. Przesuń formę do przeciwległego końca taśmy, aby utworzyć wokół niej 1 cm marginesu. Zagiąć taśmę na dno formy.
  3. Przygotowanie roztworu polidimetylosiloksanu (PDMS).
    1. Do jednorazowego naczynia wagowego wlej bezpośrednio 25–30 g bazy PDMS (Tabela materiałów). Dodać 10% masowych utwardzacza PDMS (Tabela materiałów) za pomocą jednorazowej plastikowej pipety Pasteura.
    2. Wymieszaj ręcznie i dokładnie za pomocą plastikowego patyczka. Upewnij się, że utwardzacz został dobrze włączony do bazy PDMS, nawet jeśli podczas mieszania powstaje wiele pęcherzyków powietrza.
  4. Odgazuj roztwór PDMS w deskrypcie próżniowym (Tabela materiałów) przez co najmniej 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Pęcherzyki powietrza powiększą się, wypłyną na powierzchnię i pękną po przerwaniu próżni.
  5. Wlej roztwór PDMS na formę z SU-8. Użyj plastikowego patyczka, aby zebrać i przenieść jak największą ilość mieszaniny.
  6. Ponownie odgazuj PDMS (5 min w desykatorze próżniowym). Upewnij się, że większość pęcherzyków powietrza została usunięta (kilka małych pęcherzyków na powierzchni górnej jest dopuszczalne).
  7. Umieść formę w piekarniku w temperaturze 70 °C przez co najmniej 5 h, aby PDMS uległ sieciowaniu i utwardzeniu.
  8. Usuń utwardzone komory z PDMS z formy.
    UWAGA: Wafery krzemowe do form SU-8 są niezwykle kruche, dlatego podczas oddzielania PDMS od waferów należy zachować szczególną ostrożność. Pracę należy wykonywać na twardej, płaskiej powierzchni, utrzymując wafer płasko na tej powierzchni.
    1. Za pomocą żyletki wykonaj okrągłe cięcie w PDMS, około 1 cm od krawędzi formy. Wszystkie wzory muszą znajdować się co najmniej 0,5 cm wewnątrz linii cięcia. Ostrożnie odklej centralny blok PDMS, delikatnie go pociągając.
      UWAGA: Podczas odrywania należy trzymać formę z SU-8 płasko na blacie, aby zapobiec jej pęknięciu.
    2. Umieść PDMS na czystej folii aluminiowej, stroną formowaną do folii, aby chronić powierzchnię przed kurzem i zwiększyć widoczność wzorów.
  9. Wybierz i wytnij komorę żyletką, zachowując co najmniej 0,5 cm odstępu od wzoru. Powstały blok PDMS ma wysokość około 0,5 cm, szerokość 1,5 cm i długość 3 cm. Wykonaj otwory dla trzech wlotów i jednego wylotu za pomocą bioptera o średnicy wewnętrznej 0,75 mm (Tabela materiałów).
  10. Oczyścić komorę PDMS za pomocą etanolu ultra czystego (Tabela materiałów) i wysuszyć powietrzem za pomocą bezpiecznego pistoletu przedmuchowego (Tabela materiałów). Umieść PDMS wzorem do góry w czystej szalce Petriego i zamknij szalkę pokrywką.

2. Czyszczenie szkiełek zakrywkowych

UWAGA: W tym miejscu szczegółowo opisano standardową procedurę czyszczenia szkiełek nakrywkowych, opartą na serii etapów sonikacji. W wielu innych publikacjach opisano inne procedury czyszczenia szklanych szkiełek nakrywkowych, które pozwalają na uzyskanie podobnych, satysfakcjonujących rezultatów6,7,8,9.

  1. Umieścić 10-20 szkiełek nakrywkowych (długość 40 mm) w uchwycie z politetrafluoroetylenu (PTFE) (Tabela materiałów). Podać kąpiel ultradźwiękową szkiełkom w 0,5 L 2% roztworu do mycia szkła (Tabela materiałów) w zlewce szklanej o pojemności 1 L (35 °C, 30 min).
  2. Zutylizować roztwór do mycia szkła i dokładnie wypłukać szkiełka nakrywkowe w dH2O w co najmniej trzech kolejnych kąpielach po 0,5 L.
  3. Przygotować 0,5 L 2 M KOH w zlewce szklanej o pojemności 1 L. Podać kąpiel ultradźwiękową szkiełkom w KOH (RT, 30 min). Zutylizować KOH i wypłukać szkiełka nakrywkowe w dH2O w co najmniej trzech kąpielach po 0,5 L.
    OSTROŻNIE: Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej w laboratorium (rękawiczki, okulary i fartuch laboratoryjny).
  4. Przenieść szkiełka nakrywkowe i poddać je kąpieli ultradźwiękowej w 0,5 L etanolu ultrazczystego (RT, 30 min). Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w etanolu do 2 tygodni. Zamknąć zlewkę folią termoplastyczną (Tabela materiałów), aby zapobiec odparowaniu. Przed użyciem osuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem powietrza.

3. Montaż komory PDMS

  1. Rozgrzej płytkę grzejną do 100 °C. Umieść do trzech oczyszczonych komór PDMS oraz szklanych kratek przykrywkowych w czystej płytce Petriego. Wstaw otwartą płytkę Petriego do głębokiego oczyszczacza ultrafioletowego (UV) (λ = 185 nm, patrz Tabela materiałów) i naświetlaj światłem UV przez 3-5 min.
    UWAGA: Alternatywnie komory PDMS i kratek przykrywkowych można poddać działaniu plazmy powietrznej lub tlenowej przez 30 s.
  2. Ostrożnie ułóż komorę PDMS na kratece przykrywkowej. Upewnij się, że obie powierzchnie stykające się były bezpośrednio naświetlone promieniowaniem UV. PDMS automatycznie przylega do szkła, a komora staje się wyraźnie widoczna.
  3. Aby usunąć powietrze uwięzione na styku PDMS i kratek przykrywkowych, bardzo delikatnie dociśnij powierzchnię palcem. W celu uzyskania mocniejszego wiązania mocniej dociśnij narożniki i krawędzie. Upewnij się, że górna ścianka komory nie styka się z powierzchnią szklaną.
  4. Umieść komorę szklanym dnem skierowanym w stronę płytki grzejnej o temperaturze 100 °C na 5 min. Po tym kroku wiązania szkło-PDMS stają się trwałe, a komory mogą być użyte tylko raz. Użyj komory natychmiast lub przechowuj ją w czystej płytce Petriego do tygodnia.

4. [OPCJONALNIE] Bezpośrednia pasywacja i funkcjonalizacja

UWAGA: W zależności od zastosowania, komory mogą być pasywowane i funkcjonalizowane albo po podłączeniu do urządzenia sterującego mikroprzepływowym (patrz Tabela materiałów), albo poprzez ręczne wstrzykiwanie roztworów bezpośrednio do komory za pomocą pipety przed jej podłączeniem do urządzenia mikroprzepływowego. Ta druga metoda pozwala na zużycie mniejszej ilości odczynników i pozwala uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia wynikającego z przepływu roztworu przez rurki z polietero-etero-ketonu (PEEK) urządzenia mikroprzepływowego. We wszystkich poniższych krokach roztwory są wstrzykiwane poprzez bezpośrednie wprowadzenie końcówki pipety do wylotu. Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz komory, należy upewnić się, że na końcówce pipety znajduje się mała kropla w momencie wprowadzania jej do wylotu komory PDMS. Podobnie, końcówkę pipety należy usunąć przed wstrzyknięciem całej objętości.

  1. Wstrzyknąć 20 µL PLL-PEG (1 mg/mL w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS)). Inkubować przez minimum 1 h (lub przez noc) w RT. Aby zapobiec odparowaniu, umieścić komorę PDMS w wilgotnym pojemniku (np. w pustym pudełku na końcówki z wodą w dolnej części i komorą PDMS na platformie do trzymania końcówek).
  2. Wstrzyknąć 20 µL zarodków spectrin-actin o stężeniu 100 pM (w buforze F, patrz Tabela 1 i Tabela 2). Odczekać nie więcej niż 1 min. Dostosować stężenie zarodków oraz czas oczekiwania, aby zregulować gęstość powierzchniową zarodków – powinna być ona wystarczająco wysoka dla uzyskania dużej statystyki i wystarczająco niska, aby filamenty nie nakładały się na siebie.
    UWAGA: Alternatywnie, jeśli zarodki spectrin-actin nie są dostępne, należy użyć funkcjonalizowanych biotyną krótkich segmentów filamentów, które zostaną unieruchomione na szkiełku podstawowym pokrytym streptawidyną9,10.
  3. [OPCJONALNIE] Wstrzyknąć 20 µL 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze F. Pozostawić w RT przez 10 min.
  4. [OPCJONALNIE] Wstrzyknąć 20 µL β-kazeiny o stężeniu 1 mg/mL w buforze F. Pozostawić w RT przez 10 min.
    UWAGA: Wykonać kroki 4.3 i/lub 4.4 w celu dalszej pasywacji komory. Wybór metody pasywacji zależy od użytych białek i nie wszystkie metody działają tak samo skutecznie dla wszystkich ABP. W przypadku stosowania samej aktyny wystarczający jest PLL-PEG lub BSA.

5. Podłączenie urządzenia mikrofluidycznego

UWAGA: Do kontrolowania przepływów w komorze mikrofluidycznej należy użyć mikrofluidycznego systemu opartego na ciśnieniu z maksymalnie czterema kanałami (Rycina 1A, patrz Tabela materiałów). Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w przewodach mikrofluidycznych i zakłócaniu stabilności przepływu, należy odgazować wszystkie roztwory. Umieścić 5 mL dH20 oraz 10 mL roztworu zapasowego buforu F w eksykancie próżniowym podłączonym do pompy próżniowej (próżnia końcowa <250 mbar) i odgazowywać przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej.

  1. Przepłukać przewody wlotowe i wylotowe dH2O (500 µL, 300 mbar).
  2. Napełnić wszystkie probówki zbiornikowe 2 mL (patrz Tabela materiałów) 300 µL buforu F. Ustawić ciśnienie na 300 mbar i pozwolić na wypłynięcie od pięciu do ośmiu kropel do odpadów. Powtórzyć czynność dla każdego kanału i ustawić ciśnienie na 0.
  3. Podłączyć wylot i dokładnie przepłukać komorę.
    1. Ustawić ciśnienie dla probówki zbiornikowej 4 (wylot) na 50 mbar. Gdy z końca przewodu pojawi się kropla, podłączyć przewód do wylotu komory PDMS. Ciecz wypełni komorę i wypłynie przez wszystkie wloty.
    2. [OPCJONALNIE] Jeśli komora została poddana bezpośredniej pasywacji (sekcja 4), ustawić ciśnienie na 100 mbar, aby przepłukać komorę 50-100 µL buforu F (3-5 min). Usunąć nadmiar cieczy z wlotów za pomocą chusteczki do czyszczenia.
    3. Ustawić ciśnienie na 20 mbar.
  4. Podłączyć wloty.
    1. Ustawić ciśnienie dla probówki zbiornikowej 1 na 50 mbar. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, upewnić się, że kropla pojawiła się w przewodzie oraz we wlocie PDMS.
    2. Podłączyć przewód do wlotu 1 (dwie krople powinny połączyć się podczas podłączania). Ustawić ciśnienie na 30 mbar.
    3. Powtórzyć kroki 5.4.1-5.4.2, aby podłączyć wloty 2 i 3.
  5. Ustawić ciśnienie wszystkich wlotów na 20 mbar, a ciśnienie wylotu na 0 mbar. Upewnić się, że szybkości przepływu we wlotach są w przybliżeniu równe (patrz sekcja Rozwiązywanie problemów).

Schemat mikrofluidycznego układu przepływu z kontrolerami ciśnienia; widoki boczne analizy przepływu filamentów aktyny.
Rysunek 1: Wstrzykiwanie roztworów przez komorę mikrofluidyczną. (A) Standardowy układ mikrofluidyczny do eksperymentów na pojedynczych filamentach aktyny. Roztwory białek, umieszczone w zbiornikach 1-3, są tłoczone do komory poprzez regulację ciśnienia w fazie gazowej. Generowane natężenia przepływu są mierzone za pomocą przepływomierzy. Wewnątrz komór mikrofluidycznych roztwory nie mieszają się i zajmują przestrzeń w zależności od przyłożonych ciśnień względnych (tutaj: równe ciśnienie na wszystkich wlotach). Typowe wymiary: rurki zbiorników zawierają do 2 mL roztworu. Przewody PEEK (średnica wewnętrzna 0,25 mm) łączą zbiorniki z przepływomierzami (po 10 cm przewodu), a następnie z komorą PDMS (po kolejnych 70 cm). Do połączenia przewodów PEEK z wlotami PDMS użyto silikonowych przewodów i stalowych złączek. Główny kanał mikrofluidyczny ma wysokość 20-60 µm, szerokość około 1 mm i długość 1 cm. (B,C) Profile przepływu wewnątrz komory mikrofluidycznej. (B) Płyn generuje profil paraboliczny w poprzek wysokości komory: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, gdzie h i w to wysokość i szerokość komory, a R to całkowite natężenie przepływu. Dół: Pojedynczy filament aktyny spolimeryzowany z zakotwiczonych na powierzchni zarodków spectrin-aktyna. (C) Gdy szerokość komory jest znacznie większa od jej wysokości, przepływ jest niemal jednolity w poprzek komory, z wyjątkiem powierzchni PDMS, gdzie spada do zera. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

6. Konfiguracja układu z zastosowaniem standardowych przepływów

UWAGA: System ciśnieniowy sterowany komputerowo umożliwia łatwą i precyzyjną regulację ciśnienia we wszystkich wlotach/wylotach podłączonych do komory PDMS, a tym samym kontrolę prędkości przepływu dopływowego i odpływowego. Predefiniowane konfiguracje można zapisywać i włączać/wyłączać jednym kliknięciem myszy. Poniżej przedstawiono zalecane konfiguracje (chyba że zaznaczono inaczej, ciśnienie wylotowe ustawiono na 0 mbar). Przewidywane prędkości przepływu dla tych predefiniowanych konfiguracji znajdują się w Tabeli 3. Wskazane tutaj wartości ciśnienia muszą zostać dostosowane w zależności od geometrii komory i konfiguracji systemu.

  1. Zmiana: Użyj tego ustawienia podczas wymiany jednego lub więcej zbiorników. Tworzy ono łagodny przepływ wsteczny w odpowiednich przewodach, aby zapobiec wprowadzaniu pęcherzyków powietrza.
    1. Ustaw wszystkie ciśnienia wlotowe na 12 mbar, a ciśnienie wylotowe na 5 mbar (Rysunek 2B).
  2. Wysoki przepływ „Wszystkie”: Użyj tego ustawienia, aby szybko wstrzyknąć trzy roztwory równolegle. Dotrą one do komory w ciągu 4 min.
    1. Ustaw wszystkie ciśnienia wlotowe na 150 mbar.
  3. Wysoki przepływ „x”: Użyj tego ustawienia, aby szybko wstrzyknąć roztwór. Dotrze on do komory w ciągu 3 min (Rysunek 3A-C).
    1. Ustaw ciśnienie wlotowe „x” na 150 mbar (~15 µL/min). Ciśnienie w pozostałych wlotach zostaje dostosowane do około 100 mbar, tak aby wynikowy przepływ w tych wlotach wynosił ~500 nL/min.
  4. Średni przepływ „Wszystkie”: Użyj tego ustawienia, aby wstrzymać pracę systemu.
    1. Ustaw wszystkie wloty na 20 mbar (Rysunek 2A).
  5. Średni przepływ „x”: Użyj tego ustawienia, aby pozwolić roztworowi „x” wypełnić większość szerokości głównego kanału (patrz Rysunek 2C,D), ograniczając jednocześnie roztwory z pozostałych wlotów do krawędzi kanału. W ten sposób filamenty aktynowe w komorze będą wystawione wyłącznie na warunki biochemiczne narzucone przez roztwór „x”.
    1. Ustaw ciśnienie wlotowe „x” na 12 mbar. Ustaw ciśnienie w pozostałych wlotach i dostosuj je do ~9 mbar, tak aby ich poszczególne prędkości przepływu wynosiły ~150 nL/min.

Wzory przepływu w urządzeniu mikroprzepływowym; schematy sterowania ciśnieniem dla wlotów; analiza kierunkowego przepływu.
Rysunek 2: Ciśnienie przyłożone do każdego zbiornika kontroluje podział/przestrzenną dystrybucję roztworów wewnątrz komory mikroprzepływowej. (A) Przy równym ciśnieniu przyłożonym do zbiorników każdy roztwór zajmuje jedną trzecią komory. (B) Podczas wymiany rurki zbiornika (tutaj zbiornika 3) ciśnienie efektywne spada do zera, co powoduje przepływ wsteczny. (C,D) Zwiększenie względnego ciśnienia w jednym ze zbiorników pozwala na wystawienie powierzchni szkła na działanie pojedynczego roztworu. Pole widzenia w środku komory może być sekwencyjnie wystawione na działanie roztworów 1 i 2 poprzez przełączanie między konfiguracją Mid Flow 1 (C) a Mid Flow 2 (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

7. Wymiana roztworu 'x'

UWAGA: Jak pokazano na Rysunku 3A-C, należy pamiętać, że przepływ roztworów z rurki zbiornika do głównego kanału komory zajmuje kilka minut. Ten minimalny „martwy” czas wynika z objętości cieczy zawartej w rurkach oraz profilu przepływu wewnątrz rurek (Rysunek 3A-C).

  1. Przygotować 200-300 µL roztworu w nowej probówce zbiorniku. Ustawić ciśnienie na ustawienie Change (patrz sekcja 6).
  2. Odkręcić probówkę zbiornika wlotu „x”. Roztwór w przewodach będzie powoli cofać się z komory w stronę wolnej końcówki przewodu. Pomiar prędkości przepływu stanie się ujemny (Rysunek 2B).
  3. Gdy na końcówce przewodu pojawi się mała kropla, przykręcić nową probówkę ze świeżym roztworem. Po prawidłowym dokręceniu probówki do systemu ciśnieniowego prędkość przepływu we wlocie ponownie stanie się dodatnia.
  4. Ustawić ciśnienie na High Flow 'x'.
  5. W zależności od konfiguracji mikrofluidycznej i geometrii komory odczekać 3-5 min, aż roztwór całkowicie wypełni przewody i dotrze do komory.
  6. [OPCJONALNIE] Przeprowadzić ten proces, mierząc wzrost fluorescencji w czasie (Rysunek 3C).

Eksperyment przepływu płynów z fluorescencją; schemat przedstawia wtryskiwanie G-aktyny i analizę przepływu buforu.
Rycina 3: Opóźnione dotarcie roztworów z rezerwuarów do komory PDMS i szybka zmiana warunków biochemicznych. (A-C) Opóźnione dotarcie roztworów z rezerwuarów do komory PDMS. (A) W zależności od geometrii komory, długości rurki i ciśnienia przyłożonego do wlotu/wlotów, zastąpienie jednego roztworu drugim nie następuje natychmiastowo. Po zmianie rurki rezerwuaru na taką, która zawiera roztwór fluorescencyjny (0 min), roztwór stopniowo wypełnia rurkę (0,4 min) oraz komorę PDMS (1-2 min). Przykładowy czas podano dla ciśnienia 150 mbar, rurki PEEK o długości 80 cm oraz komory PDMS o szerokości 1600 µm i wysokości 20 µm. (B) Paraboliczny profil przepływu wewnątrz rurki PEEK generuje efektywny gradient fluorescencji wzdłuż profilu radialnego rurki oraz wewnątrz komory (patrz również Rycina 1B). (C) Opóźnienie dotarcia roztworów można określić ilościowo poprzez pomiar tła sygnału epifluorescencyjnego w komorze w funkcji czasu. Warunki eksperymentalne: 0,5 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-568 jest wtryskiwana pod ciśnieniem 150 mbar przez przepływomierz i rurkę PEEK o długości 80 cm. (D,E) Szybka zmiana warunków biochemicznych. (D) Wzór dopływających roztworów w dwóch warunkach Mid Flow. (E) Wzrost fluorescencji tła jako odczyt stężenia aktyny. Czas t = 0 wyznaczono jako moment rozpoczęcia wzrostu fluorescencji. Roztwór 1: 0,5 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488, roztwór 2: bufor F. (C,E) Komora PDMS: wysokość 20 µm i szerokość 1600 µm. Intensywność epifluorescencji, ok. 2 µm powyżej powierzchni, została określona ilościowo poprzez uśrednienie sygnału w całym polu widzenia, znormalizowana do 0 w przypadku braku fluoroforu i 1 przy maksymalnej intensywności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

8. Podstawowy eksperyment na pojedynczym filamencie: depolimeryzacja końców typu „barbed” aktyny związanej z adenozynodifosforanem (ADP)

UWAGA: Niniejsza sekcja dotyczy komory niefunkcjonalizowanej (tylko sekcja 5). Jeśli komora została poddana bezpośredniej funkcjonalizacji (sekcja 4), należy rozpocząć od kroku 8.4.

  1. Funkcjonalizacja powierzchni zarodkami filamentów aktynowych:
    1. Zmienić roztwór 3 na 200 µL zarodków spektryny i aktyny o stężeniu 50 pM11 w buforze F (patrz sekcja 7).
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli zarodki spektryny i aktyny nie są dostępne, można zastosować krótkie segmenty filamentów z funkcjonalizacją biotynową, które zostaną unieruchomione na pokrywce powlekanej streptawidyną (szczegóły znajdują się w9,10).
    2. Wstrzykiwać przez 2 min przy ustawieniu High Flow 3.
      UWAGA: Dostosować stężenie i czas w zależności od końcowej gęstości zarodków.
  2. Pasywacja powierzchni:
    1. Zmienić zawartość probówki 3 na 300 µL 5% BSA w buforze F.
    2. Wstrzykiwać przez 5 min przy ustawieniu High Flow 3, a następnie przez 5 min przy Mid Flow 3. Podczas tego drugiego kroku obniżyć ciśnienie w kanałach 1 i 2 do 7-8 mbar, aby uzyskać przeciwprąd o wartości ok. -100 nL/min, tak aby wszystkie powierzchnie komory zostały spasywowane BSA.
      UWAGA: Ponieważ roztwór BSA jest bardziej lepki, ciśnienia muszą zostać odpowiednio dostosowane.
  3. Zmienić zawartość probówki 3 na bufor F i przepłukać kanał (5 min, High Flow 3).
  4. Przygotować następujące roztwory o objętości 200-300 µL, rozcieńczając wszystkie białka w buforze F:
    Wlot 1, roztwór polimeryzacyjny: 1 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488, 1 µM profiliny (Tabela 1).
    Wlot 2, roztwór starzenia: 0,15 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488.
    Wlot 3, roztwór depolimeryzacyjny: sam bufor F.
    UWAGA: Profilinę stosuje się tutaj w celu zapobiegania spontanicznej nukleacji oraz utrzymania stałego stężenia G-aktyny.
  5. Zmienić probówki od 1 do 3 (sekcja 7). Wstrzykiwać przez 3-4 min, korzystając z ustawienia wstępnego High Flow All. Trzy roztwory wypełniły teraz rurkę PEEK i dotarły do komory (Rysunek 3A). Powierzchnia szklana może być wystawiona na działanie dowolnego roztworu z wlotu bez czasu martwego (<1 s, Rysunek 3D,E).
  6. Włączyć mikroskop. Ustawić następujące parametry: laser wzbudzający 488 nm o mocy 150 mW przy mocy 10%-20%, czas ekspozycji kamery 100-200 ms, głębokość penetracji TIRF 200-300 nm, obiektyw 60x. Ustawienia te są stosowane w całym tekście.
  7. Polimeryzacja filamentów (Rysunek 4A):
    1. Ustawić ciśnienie na Mid Flow 1 przez ok. 10 min.
    2. [OPCJONALNIE] Rejestrować polimeryzację (1 klatka/20 s, TIRF). Filamenty powinny polimeryzować z prędkością około 10 podjednostek na sekundę (sub/s)1,12.
  8. Starzenie filamentów: Ustawić ciśnienie na Mid Flow 2 przez 15 min. Przy stężeniu krytycznym 0,15 µM G-aktyny długość filamentów pozostanie stała, a filamenty przekształcą się w >99% ADP-F-aktyny4.
  9. Depolimeryzacja (Rysunek 4A):
    1. Rozpocząć akwizycję przy 1 klatce/5 s w trybie epifluorescencji. Ze względu na bardzo niskie tło fluorescencji w kanałach 2 i 3, stosowanie TIRF nie jest konieczne.
    2. Po jednej lub dwóch klatkach przełączyć na Mid Flow 3. Filamenty powinny depolimeryzować z prędkością około 10 sub/s (referencja12).
  10. Aby zresetować eksperyment, zniszczyć wszystkie znakowane fluorescencyjnie filamenty poprzez ciągłe wystawianie ich na działanie lasera z maksymalną mocą przez ok. 2 min. Aby przetestować inne warunki, zmienić roztwory 1, 2 lub 3 i je wstrzyknąć (High Flow, 3-4 min). Powtórzyć kroki 8.7-8.9.

9. Inne eksperymenty z pojedynczymi filamentami

  1. Badanie oddziaływań ABP z F-aktyną
    UWAGA: Mikrofluidyka została z sukcesem wykorzystana do kwantyfikacji aktywności kilku ABP wiążących się z bokiem filamentu, takich jak kofilina, tropomiozyna i Arp2/3. Zgodnie z protokołem w sekcji 8:
    1. Zmień zawartość kanału 3 na fluorescencyjne ABP w buforze F. Wstrzyknij (High Flow 3, 3 min).
    2. Polimeryzacja filamentów: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 1 na 10 min.
    3. Wiązanie ABP: Rozpocznij akwizycję za pomocą TIRF. Dostosuj częstotliwość klatek w zależności od stężenia ABP. Po 1-2 klatkach przełącz na Mid Flow 3.
      UWAGA: W zależności od rodzaju ABP może być również możliwe szybkie (np. przez mniej niż 5 s) przełączenie na Mid Flow 2, aby dodatkowo zredukować fluorescencję tła podczas wykonywania zdjęcia.
    4. Odwiązanie ABP: Kontynuując akwizycję, przełącz na Mid Flow 2.
  2. Polimeryzacja z forminą na wolnym końcu barbed
    UWAGA: Wykazano, że forminy wpływają na polimeryzację końca barbed filamentów. Mikrofluidyka jest szczególnie dostosowana do pomiaru szybkości wiązania i odwiązywania forminy oraz ich wpływu na wydłużanie filamentów.
    1. Przygotuj następujące roztwory:
      Kanał 1: 10 nM forminy w buforze F (Tabela 1).
      Kanał 2: 1 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488, 4 µM profiliny.
      Kanał 3: bufor F.
    2. Wymień probówki 1, 2 i 3 (sekcja 7). Wstrzyknij, używając ustawienia High Flow All przez 3-4 min.
    3. Inicjuj polimeryzację filamentów: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 2 na 2 min.
    4. Wiązanie forminy do końca barbed filamentu: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 1 na 30 s.
    5. Polimeryzacja zapośredniczona przez forminę: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 2. W obecności forminy mDia1 na końcach barbed, filamenty powinny polimeryzować z szybkością około 50 sub/s13,14,15.
  3. Polimeryzacja/depolimeryzacja z forminy zakotwiczonej na powierzchni
    UWAGA: Wykazano, że szybkości polimeryzacji i depolimeryzacji końców barbed udekorowanych forminą zależą od napięcia przyłożonego do filamentu. W układach mikrofluidycznych tarcie przepływu cieczy wzdłuż boku filamentu generuje napięcie proporcjonalne do długości filamentu i szybkości przepływu14,16.
    1. Zastosuj metodę opisaną powyżej w sekcji 8, zastępując kroki 8.1, 8.2 i 8.3 pasywacją powierzchni następującymi działaniami:
      1. Zmień zawartość probówki 3 na 1 µg/mL przeciwciała anty-His w buforze F. Wstrzyknij przez 2 min przy High Flow 3.
      2. Zmień zawartość probówki 3 na 5% BSA w buforze F. Wstrzyknij przez 5 min przy High Flow 3, a następnie przez 5 min przy Mid Flow 3. Podczas tego drugiego kroku zmniejsz ciśnienie w kanałach 1 i 2 do 7-8 mbar, aby uzyskać przeciwprzepływ ~-100 nL/min, tak aby wszystkie powierzchnie komory zostały spasywowane BSA.
      3. Zmień zawartość probówki 3 na 100 nM forminy z tagiem His w buforze F. Wstrzyknij przez 5 min przy High Flow 3. Zmień zawartość probówki 3 na bufor F. Wstrzyknij przez 5 min przy High Flow 3, aby upewnić się, że w przewodach nie pozostały żadne forminy.
    2. Przygotuj i wstrzyknij następujące roztwory (po 200-300 µL każdy, w buforze F):
      Kanał 1: 1 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488.
      Kanał 2: 1 µM G-aktyny nieznakowanej, 4 µM profiliny.
      Kanał 3: tylko bufor F.
    3. Nukleacja filamentów: Poddaj forminy zakotwiczone na powierzchni działaniu G-aktyny (ustawienie Mid Flow 1).
    4. Polimeryzacja filamentów: Poddaj komorę działaniu profiliny i aktyny, używając Mid Flow 2.
    5. Rozpocznij akwizycję: 1 klatka/2 s, epifluorescencja. W przypadku forminy mDia1 filamenty powinny polimeryzować z szybkością 50-80 sub/s, w zależności od długości filamentu i szybkości przepływu14.
    6. Depolimeryzacja filamentów: Rozpocznij akwizycję (1 klatka/4 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach poddaj filamenty działaniu samego bufora, Mid Flow 3. W przypadku forminy mDia1 filamenty powinny depolimeryzować z szybkością 5-15 sub/s, w zależności od długości filamentu i szybkości przepływu14.
  4. Filamenty aktynowe z nieznakowanymi segmentami
    UWAGA: Fluorescencyjne znakowanie aktyny powoduje wystąpienie kilku artefaktów, takich jak przerwy podczas depolimeryzacji17 i zmienione wiązanie tropomiozyny18. Rozwiązaniem tych artefaktów jest wykorzystanie mikrofluidyki do składania filamentów posiadających nieznakowane segmenty.
    1. Przygotuj i wstrzyknij następujące roztwory (200-300 µL w buforze F):
      Kanał 1: 1 µM G-aktyny nieznakowanej, 1 µM profiliny.
      Kanał 2: 0,3 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488.
    2. Sekwencyjnie poddaj powierzchnię działaniu kanału 2 (5 min), kanału 1 (10 min) i kanału 2 (15 min), aby wytworzyć nieznakowane segmenty ADP-aktyny z fluorescencyjnie znakowanymi segmentami na każdym końcu.
  5. Filamenty zakotwiczone końcem barbed z żelsolną
    UWAGA: Przy użyciu zarodków spektryny i aktyny filamenty polimeryzują na swoim wolnym końcu barbed, podczas gdy koniec pointed jest stabilizowany przez zarodek spektryny i aktyny. Alternatywą jest zakotwiczenie filamentów za pomocą białka blokującego koniec barbed, takiego jak żelsolina.
    1. Przygotuj roztwór F-aktyny zawierający 4 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488 w 20 µL buforu F. Pozostaw aktynę do spontanicznej nukleacji i polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min na blacie. Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
    2. W międzyczasie przygotuj komorę mikrofluidyczną i spasywuj powierzchnię mieszaniną 5% BSA i 1% biotyny-BSA (patrz krok 8.2).
    3. Przepłucz kanał 3 buforem F (2 min przy High Flow 3). Wstrzyknij 10 µg/mL neutrawidyny w buforze F (4 min przy High Flow 3).
    4. Zmień zawartość probówek na:
      Kanał 1: 10 nM biotyny-żelsoliny (Tabela 1).
      Kanał 2: bufor F.
      Kanał 3: 0,4 µM prepolimeryzowanej F-aktyny.
    5. Wstrzyknij wszystkie roztwory jednocześnie, używając ustawienia High Flow All przez 3 min.
    6. Poddaj całą komorę działaniu żelsoliny (Mid Flow 1, 30 s).
    7. Przytwierdź filamenty do powierzchni (Low Flow 3: kanał 3 przy 3 mbar, kanały 1 i 2 przy ~2 mbar, przez około 2 min).
    8. [OPCJONALNIE] Jeśli gęstość filamentów jest zbyt niska, powtórz kroki 9.5.6 i 9.5.7.
    9. Depolimeryzacja końca pointed: Rozpocznij akwizycję (1 klatka/30 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach poddaj filamenty działaniu samego bufora, Mid Flow 2. Filamenty powinny depolimeryzować z szybkością około 0,2 sub/s.

10. Formowanie pęków filamentów indukowane przez fascynę oraz ich rozkład przez ADF/kofilin

UWAGA: Aby utworzyć wiązki filamentów aktynowych, należy zapewnić wystarczająco wysoką gęstość zarodników filamentów na powierzchni komory. Po wystawieniu na działanie białka fascyny sąsiednie filamenty, które fluktuują bocznie, zostaną dynamicznie powiązane przez białka fascyny. Ponieważ fascyna szybko odłącza się od boku filamentu19, musi być ona stale obecna w głównym przepływającym roztworze, aby utrzymać wiązanie filamentów w pęczki.

  1. Wykonaj kroki 8.1-8.3.
  2. Przygotuj następujące roztwory (200-300 µL w buforze F):
    Kanał 1, roztwór do polimeryzacji: 1 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488, 1 µM profiliny.
    Kanał 2, roztwór do wiązania w pęki: 200 nM fascyny (Tabela 1), 0,15 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488.
    Kanał 3, roztwór do depolimeryzacji: 200 nM ADF/kofiliny (Tabela 1), 100 nM fascyny, 0,15 µM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488.
  3. Zmień probówki od 1 do 3 (sekcja 7). Wstrzyknij roztwory, korzystając z ustawienia wstępnego High Flow All, przez 3-4 min.
  4. Polimeryzacja filamentów: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 1 na ok. 10 min. Polimeryzację można obrazować za pomocą TIRF.
  5. Wiązanie filamentów w pęki (Rysunek 4C): Rozpocznij akwizycję obrazów (1 klatka/5 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach ustaw ciśnienie na Mid Flow 2 i obserwuj wiązanie filamentów w pęki.
  6. Fragmentacja pęków: Rozpocznij akwizycję obrazów (1 klatka/5 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach ustaw ciśnienie na Mid Flow 3 i obserwuj indukowaną kofiliną depolimeryzację pojedynczych filamentów oraz pęków.

11. Procedura czyszczenia urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczeń między poszczególnymi eksperymentami, kluczowe jest dokładne wyczyszczenie i całkowite osuszenie wszystkich przewodów oraz przepływomierzy po każdym doświadczeniu.

  1. Odłączyć wszystkie przewody od komory PDMS i usunąć komorę.
  2. Aby oczyścić przewody PEEK i przepływomierze, przymocować końce przewodów taśmą w pustej plastikowej probówce o pojemności 15 mL i wstrzyknąć następujące roztwory przy maksymalnym ciśnieniu, aż do niemal całkowitego opróżnienia zbiornika:
    400 µL buforu F.
    400 µL 0.5 M NaOH.
    400 µL czystej wody.
    200 µL izopropanolu.
  3. Zastąpić zbiornik pustym i przedmuchać powietrzem, aż przewody będą całkowicie suche (~2-4 min, maksymalne ciśnienie).

12. Analiza obrazu

UWAGA: Choć niniejszy artykuł koncentruje się na metodzie składania, manipulowania i wizualizacji pojedynczych filamentów aktyny w układach mikroprzepływowych, przedstawiono tutaj również skróconą metodę analizy uzyskanych nagrań wideo. Analiza jest przeprowadzana na obrazach 16-bitowych przy użyciu programu ImageJ, zgodnie z sekcją 8.

  1. Obróbka obrazu jest minimalna:
    1. Zaimportuj stos obrazów polimeryzacji lub depolimeryzacji.
    2. [ OPCJONALNIE] Ujednolic intensywność obrazu za pomocą funkcji Subtract Background (ustawienia domyślne, tj. „Rolling ball radius” = 50 pixels). Jest to szczególnie przydatne, jeśli fluorescencja tła zmienia się w trakcie filmu lub jeśli oświetlenie fluorescencyjne nie jest jednorodne w polu widzenia.
    3. Dostosuj jasność i kontrast (tło bliskie zeru, filamenty bliskie maksimum).
  2. Utwórz kymograf filamentu:
    1. Wybierz filament, który nie zatrzymuje się, nie pęka ani nie odrywa się. Nie dokonuj wyboru na podstawie innych zachowań. Narysuj linię 1-2 piksele powyżej (Straight Line). Zapisz numer filamentu (Add w ROI Manager).
    2. Zastosuj funkcję Reslice (Slice count: 5 pixels). Oblicz maksymalną intensywność (funkcja Zprojection).
  3. Zmierz szybkość polimeryzacji/depolimeryzacji:
    1. Na kymografie narysuj linię wzdłuż końca barbowego filamentu (narzędzie Straight Line, Rycina 4A). Zmierz szerokość i wysokość linii (funkcja Measure).
  4. Powtórz kroki 12.2-12.3 dla wielu filamentów. Oblicz szybkości polimeryzacji/depolimeryzacji (Rycina 4A):
    Wzór obliczania prędkości v=w*pix/(2.7*h*dt), wyrażenie matematyczne, analiza fizyczna., gdzie v to szybkość (w sub/s), w szerokość linii (pixels), pix rozmiar piksela (nm), h wysokość linii (frames), a dt czas między klatkami (w sekundach). Tutaj 2.7 nm odpowiada efektywnemu wkładowi podjednostki aktyny w długość filamentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku wszystkich opisanych powyżej eksperymentów, fluorescencyjnie znakowane filamenty aktyny powinny być wyraźnie widoczne, z dobrym kontrastem, co świadczy o niskiej fluorescencji tła powierzchni (Rysunek 4, w celu rozwiązywania typowych problemów należy zapoznać się z Plikiem uzupełniającym 1). Filamenty aktyny nie powinny również przylegać do powierzchni: przy niskim dominującym przepływie, fluktuacje boczne filamentów aktyny powinny być zauważalne podczas obserwac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu ze standardowymi metodami jednowłókienkowymi, w których filamenty aktynowe są zakotwiczone w powierzchni przez wiele punktów na swojej długości lub utrzymywane blisko niej przez czynnik stłoczenia, taki jak metyloceluloza, mikrofluidyka oferuje szereg korzyści. Ponieważ interakcje z powierzchnią są minimalne, unika się sztucznych przerw, które te interakcje mogą wywołać zarówno podczas wydłużania, jak i depolimeryzacji. Włókna są ustawiane przez przepływ, równolegle do siebie, co ułatwia ich monitorowanie i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni B. Ladoux i R.-M. Mège lab za korzystanie z ich urządzeń do czyszczenia UV, a J. Heuvingh i 0. du Roure za wstępne szkolenie, które odbyliśmy w zakresie przygotowania form na płytkach krzemowych i udzielania wskazówek dotyczących mikrofluidyki. Potwierdzamy dofinansowanie z grantu Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych StG-679116 (dla A.J.) oraz Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin i Conformin (dla G.R.-L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β-KazeinaMerckC6905Stosowany w 8 mg / ml
Stempel do biopsji (z tłokiem)Ted Pella15115-2ID 0,75 mm, OD 1,07 mm
Biotyna-BSAMerckA8549Używany w 1 mg / ml
BSAMerckA8022Używany w 50 mg / ml
Szkiełko nakrywkowe Mini-Rack
Uchwyt teflonowy		InvitrogenC14784dla 8 Szkiełka nakrywkowe Szkiełka
nakrywkowe 22x40mm
Grubość #1.5		Menzel Glä ser631-1370
DABCOMerckD27802składnik w buforze f
DTTEuromedexEU0006-Dskładnik w buforze f
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorofor do znakowania aktyny na Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338Do biotynylacji aktyny na Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507Detergent do czyszczenia szkła
ImageJNIHN/Aoprogramowanie open source
Pompa próżniowa LaboportKNF811kn.18(próżnia końcowa: 240 mbar)
Magiczna niewidzialna taśmaScotch7100024666standardowa przezroczysta taśma biurowa
MicrewtubeSimportT341-6T2 ml mikroprzepływowe rurki
Urządzenie mikroprzepływowe Część 1: Jednostka przepływu SFluigentFLU-S-D-PCKBPrzepływomierz
Urządzenie mikroprzepływowe Część 2: Fluiwell-4C-2 mLFluigent14002001PCKUchwyt zbiornika
Urządzenie mikroprzepływowe Część 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		Regulator ciśnienia
Model 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220Ultrafioletowy środek czyszczący
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO używany do oznaczania aktyny
neutrawidynyThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)Stosować w dawce 1 mg/ml w PBS.
Polidimetylosiloksan (PDMS) Sylgard 184 Elastomer silikonowyDow Corning1673921Zawiera bazę PDMS i utwardzacz
Rurki z polieteroeteroketonu (PEEK)MerckZ226661" Niebieski" : ID = 0,25 mm
Bezpieczny pistolet do przedmuchiwaniaWąż cewkowy Pneumatyka700-Sfiltrowane powietrze
Rurki silikonoweVWR228-0701Ppodłączyć PEEK do złączki
Łącznik cewnika ze stali nierdzewnejPrime BioscienceSC22/15Wkładany do wlotów i wylotów PDMS do podłączenia do rurki PEEK
Folia termoplastycznaSigma AldrichPM996Standardowy "parafilm"
Ultraczysty etanolVWR64-17-5
Ultradźwiękowa kąpiel czyszczącaVWRUSC200THDo przechowywania zlewek o pojemności 1 l
Eksykator próżniowySP Bel-ArtF42022-0000do odgazowywania PDMS lub roztworów
zbiornikowe

Bibliografia

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963(2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883(2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548(2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470(2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Montaż filamentów aktynowychanaliza mikroprzepływowamikroskopia TIRFpęczki aktynowepolimeryzacja filamentówdepolimeryzacja filamentówpasywacja powierzchnibiałka wiążące aktynęsiły mechaniczne
Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.