Method Article

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

DOI:

10.3791/63891

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby rozszyfrować skomplikowane mechanizmy molekularne, które regulują składanie i rozkładanie filamentów aktynowych, bardzo przydatne jest monitorowanie poszczególnych reakcji na żywo w dobrze kontrolowanych warunkach. W tym celu w ciągu ostatnich 20 lat przeprowadzono eksperymenty na żywych pojedynczych włóknach, głównie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), które dostarczyły wielu kluczowych wyników. W 2011 roku, w celu dalszego rozszerzenia możliwości tych eksperymentów i uniknięcia powtarzających się problematycznych artefaktów, wprowadziliśmy do tych testów proste mikrofluidyki. Badanie to szczegółowo opisuje nasz podstawowy protokół, w którym poszczególne włókna aktyny są zakotwiczone jednym końcem w pasywowanej powierzchni szkiełka nakrywkowego, dopasowują się do przepływu i mogą być kolejno wystawione na działanie różnych roztworów białkowych. Przedstawiamy również protokoły dla konkretnych zastosowań i wyjaśniamy, w jaki sposób można zastosować kontrolowane siły mechaniczne dzięki lepkiemu oporowi przepływającego roztworu. Zwracamy uwagę na techniczne zastrzeżenia tych eksperymentów i pokrótce przedstawiamy możliwe rozwiązania oparte na tej technice. Te protokoły i wyjaśnienia, wraz z dzisiejszą dostępnością łatwego w użyciu sprzętu mikrofluidycznego, powinny umożliwić osobom niebędącym specjalistami wdrożenie tego testu w swoich laboratoriach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montaż i demontaż filamentów aktynowych oraz sieci filamentów aktynowych są kontrolowane przez kilka reakcji biochemicznych i zależą od kontekstu mechanicznego. Aby uzyskać wgląd w te złożone mechanizmy, nieoceniona jest możliwość obserwowania poszczególnych reakcji na poszczególnych włóknach (w odpowiednio dużej liczbie). W ciągu ostatnich dziesięcioleci obserwacja dynamicznych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, głównie przy użyciu mikroskopii fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), stała się kluczową techniką i dostarczyła imponującej listy wyników, których nie można było uzyskać za pomocą testów biochemicznych roztworów masowych

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komory mikroprzepływowej

  1. Wybierz formę wzorcową SU-8 z kilkoma wzorami komór. Typowe komory mają kształt krzyżowy z trzema wlotami i jednym wylotem, o wysokości 20 μm i szerokości 800 μm (Rysunek 1). Takie wzorcowe formy można zakupić w firmach zewnętrznych lub wykonać w laboratoriach akademickich (np. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Umieść taśmę wokół krawędzi formy.
    1. Połóż standardową przezroczystą taśmę biurową o długości ~50 cm i szerokości 19 mm (patrz Tabela Materiałów) na ławce, lepką stroną do góry. Umieść formę pionowo na jednym końcu ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wszystkich eksperymentów opisanych powyżej, fluorescencyjnie znakowane filamenty aktynowe powinny być wyraźnie widoczne, z dobrym kontrastem, co wskazuje na niską fluorescencję tła od powierzchni (Rysunek 4, zobacz Plik uzupełniający 1 do rozwiązywania typowych problemów). Filamenty aktynowe również nie powinny przyklejać się do powierzchni: gdy dominujące natężenie przepływu jest niskie, boczne fluktuacje włókien aktyny powinny być zauważalne podczas obserwacji na żywo i umożliwi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu ze standardowymi metodami jednowłókienkowymi, w których filamenty aktynowe są zakotwiczone w powierzchni przez wiele punktów na swojej długości lub utrzymywane blisko niej przez czynnik stłoczenia, taki jak metyloceluloza, mikrofluidyka oferuje szereg korzyści. Ponieważ interakcje z powierzchnią są minimalne, unika się sztucznych przerw, które te interakcje mogą wywołać zarówno podczas wydłużania, jak i depolimeryzacji. Włókna są ustawiane przez przepływ, równolegle do siebie, co ułatwia ich monitorowanie i .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni B. Ladoux i R.-M. Mège lab za korzystanie z ich urządzeń do czyszczenia UV, a J. Heuvingh i 0. du Roure za wstępne szkolenie, które odbyliśmy w zakresie przygotowania form na płytkach krzemowych i udzielania wskazówek dotyczących mikrofluidyki. Potwierdzamy dofinansowanie z grantu Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych StG-679116 (dla A.J.) oraz Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin i Conformin (dla G.R.-L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-KazeinaMerckC6905Stosowany w 8 mg / ml
Stempel do biopsji (z tłokiem)Ted Pella15115-2ID 0,75 mm, OD 1,07 mm
Biotyna-BSAMerckA8549Używany w 1 mg / ml
BSAMerckA8022Używany w 50 mg / ml
Szkiełko nakrywkowe Mini-Rack
Uchwyt teflonowy		InvitrogenC14784dla 8 Szkiełka nakrywkowe Szkiełka
nakrywkowe 22x40mm
Grubość #1.5		Menzel Glä ser631-1370
DABCOMerckD27802składnik w buforze f
DTTEuromedexEU0006-Dskładnik w buforze f
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorofor do znakowania aktyny na Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338Do biotynylacji aktyny na Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507Detergent do czyszczenia szkła
ImageJNIHN/Aoprogramowanie open source
Pompa próżniowa LaboportKNF811kn.18(próżnia końcowa: 240 mbar)
Magiczna niewidzialna taśmaScotch7100024666standardowa przezroczysta taśma biurowa
MicrewtubeSimportT341-6T2 ml mikroprzepływowe rurki
Urządzenie mikroprzepływowe Część 1: Jednostka przepływu SFluigentFLU-S-D-PCKBPrzepływomierz
Urządzenie mikroprzepływowe Część 2: Fluiwell-4C-2 mLFluigent14002001PCKUchwyt zbiornika
Urządzenie mikroprzepływowe Część 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		Regulator ciśnienia
Model 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220Ultrafioletowy środek czyszczący
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO używany do oznaczania aktyny
neutrawidynyThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)Stosować w dawce 1 mg/ml w PBS.
Polidimetylosiloksan (PDMS) Sylgard 184 Elastomer silikonowyDow Corning1673921Zawiera bazę PDMS i utwardzacz
Rurki z polieteroeteroketonu (PEEK)MerckZ226661" Niebieski" : ID = 0,25 mm
Bezpieczny pistolet do przedmuchiwaniaWąż cewkowy Pneumatyka700-Sfiltrowane powietrze
Rurki silikonoweVWR228-0701Ppodłączyć PEEK do złączki
Łącznik cewnika ze stali nierdzewnejPrime BioscienceSC22/15Wkładany do wlotów i wylotów PDMS do podłączenia do rurki PEEK
Folia termoplastycznaSigma AldrichPM996Standardowy "parafilm"
Ultraczysty etanolVWR64-17-5
Ultradźwiękowa kąpiel czyszczącaVWRUSC200THDo przechowywania zlewek o pojemności 1 l
Eksykator próżniowySP Bel-ArtF42022-0000do odgazowywania PDMS lub roztworów
zbiornikowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Filament AssemblyMicrofluidics AssayFluorescence MicroscopyTIRF MicroscopyActin BundlesFilament PolymerizationFilament DepolymerizationSurface PassivationActin Binding ProteinsMechanical Forces

Related Articles