Method Article

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

DOI:

10.3791/63891

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby rozszyfrować skomplikowane mechanizmy molekularne, które regulują składanie i rozkładanie filamentów aktynowych, bardzo przydatne jest monitorowanie poszczególnych reakcji na żywo w dobrze kontrolowanych warunkach. W tym celu w ciągu ostatnich 20 lat przeprowadzono eksperymenty na żywych pojedynczych włóknach, głównie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), które dostarczyły wielu kluczowych wyników. W 2011 roku, w celu dalszego rozszerzenia możliwości tych eksperymentów i uniknięcia powtarzających się problematycznych artefaktów, wprowadziliśmy do tych testów proste mikrofluidyki. Badanie to szczegółowo opisuje nasz podstawowy protokół, w którym poszczególne włókna aktyny są zakotwiczone jednym końcem w pasywowanej powierzchni szkiełka nakrywkowego, dopasowują się do przepływu i mogą być kolejno wystawione na działanie różnych roztworów białkowych. Przedstawiamy również protokoły dla konkretnych zastosowań i wyjaśniamy, w jaki sposób można zastosować kontrolowane siły mechaniczne dzięki lepkiemu oporowi przepływającego roztworu. Zwracamy uwagę na techniczne zastrzeżenia tych eksperymentów i pokrótce przedstawiamy możliwe rozwiązania oparte na tej technice. Te protokoły i wyjaśnienia, wraz z dzisiejszą dostępnością łatwego w użyciu sprzętu mikrofluidycznego, powinny umożliwić osobom niebędącym specjalistami wdrożenie tego testu w swoich laboratoriach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montaż i demontaż filamentów aktynowych oraz sieci filamentów aktynowych są kontrolowane przez kilka reakcji biochemicznych i zależą od kontekstu mechanicznego. Aby uzyskać wgląd w te złożone mechanizmy, nieoceniona jest możliwość obserwowania poszczególnych reakcji na poszczególnych włóknach (w odpowiednio dużej liczbie). W ciągu ostatnich dziesięcioleci obserwacja dynamicznych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, głównie przy użyciu mikroskopii fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), stała się kluczową techniką i dostarczyła imponującej listy wyników, których nie można było uzyskać za pomocą testów biochemicznych roztworów masowych1.

Aby to osiągnąć, należy utrzymywać znakowane fluorescencyjnie filamenty aktynowe blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego mikroskopu, jednocześnie wystawiając je na działanie roztworów białek wiążących aktynę (ABP), które mogą być również znakowane fluorescencyjnie. W ten sposób można monitorować zdarzenia zachodzące na poszczególnych włóknach w dobrze kontrolowanych warunkach biochemicznych, a tym samym określać ilościowo szybkość reakcji. Należy jednak wziąć pod uwagę szereg konkretnych ograniczeń. Sztuczne utrzymywanie włókien blisko powierzchni, często dzięki wielu punktom kotwiczenia lub przy użyciu środka spulchniającego, takiego jak metyloceluloza, może zmienić ich zachowanie (np. powodując przerwy w ich polimeryzacji i depolimeryzacji2). Śledzenie konturu każdego filamentu może być trudne, zwłaszcza jeśli nowe włókna lub fragmenty filamentu gromadzą się z czasem w polu widzenia. Reakcje zachodzą w skończonej objętości, w której stężenie monomerów aktyny i ABP może zmieniać się w czasie, co potencjalnie utrudnia wyznaczenie dokładnych stałych szybkości. Wreszcie, odnowienie lub zmiana roztworu ABP jest trudna do osiągnięcia w czasie krótszym niż 30 s i często prowadzi do niejednorodnej zawartości białka w próbce.

Nieco ponad 10 lat temu, zainspirowani tym, co już zrobiono w celu zbadania pojedynczych nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)3, wprowadziliśmy nową technikę opartą na mikrofluidyce do obserwacji i manipulowania pojedynczymi filamentami aktyny4. Pozwala to na obejście wspomnianych wcześniej ograniczeń klasycznych technik jednowłóknistych. W tych testach mikrofluidycznych włókna aktynowe są hodowane z nasion spektryny-aktyny zaadsorbowanych na szkiełku nakrywkowym. Włókna są w ten sposób zakotwiczone tylko jednym końcem na dnie komory mikroprzepływowej i wahają się nad powierzchnią bez przywierania. Włókna dopasowują się do przepływu napływających roztworów, ułatwiając w ten sposób monitorowanie ich długości konturu i utrzymując je w płytkim obszarze nad szkiełkiem nakrywkowym, w którym można zastosować TIRF. Różne roztwory są jednocześnie przepływane do komory bez mieszania, a włókna mogą być wystawione na ich działanie sekwencyjnie i szybko.

Tutaj proponujemy serię podstawowych protokołów do przeprowadzenia testów mikrofluidycznych z pojedynczym filamentem aktyny w laboratorium. Szkiełka nakrywkowe i komory mikrofluidyczne można przygotować z wyprzedzeniem (w pół dnia), a sam eksperyment, w którym można przetestować kilka warunków biochemicznych, odbywa się w mniej niż jeden dzień.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komory mikroprzepływowej

  1. Wybierz formę wzorcową SU-8 z kilkoma wzorami komór. Typowe komory mają kształt krzyżowy z trzema wlotami i jednym wylotem, o wysokości 20 μm i szerokości 800 μm (Rysunek 1). Takie wzorcowe formy można zakupić w firmach zewnętrznych lub wykonać w laboratoriach akademickich (np. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Umieść taśmę wokół krawędzi formy.
    1. Połóż standardową przezroczystą taśmę biurową o długości ~50 cm i szerokości 19 mm (patrz Tabela Materiałów) na ławce, lepką stroną do góry. Umieść formę pionowo na jednym końcu i wzdłuż linii środkowej taśmy.
    2. Zwiń formę na drugi koniec taśmy, aby utworzyć 1 cm obwódkę wokół formy. Złóż taśmę na dnie formy.
  3. Przygotować roztwór polidimetylosiloksanu (PDMS).
    1. Do jednorazowego naczynia wagowego wsypać bezpośrednio 25-30 g bazy PDMS (Tabela Materiałów). Dodać 10% wagowo-wagowo utwardzacza PDMS (tabela materiałów) za pomocą jednorazowej plastikowej pipety Pasteura.
    2. Wymieszaj ręcznie i dokładnie plastikowym patyczkiem. Upewnij się, że utwardzacz jest dobrze wkomponowany w bazę PDMS, nawet jeśli mieszanie tworzy dużo pęcherzyków.
  4. Odgazować roztwór PDMS w eksykatorze próżniowym (tabela materiałów) przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Bąbelki rozszerzają się, unoszą na powierzchnię i pękają, gdy próżnia zostanie przerwana.
  5. Wlej roztwór PDMS na formę SU-8. Użyj plastikowego patyczka, aby zeskrobać i przenieść jak najwięcej mieszanki.
  6. Odgazowuje PDMS po raz drugi (5 min w eksykatorze próżniowym). Upewnij się, że pozbyłeś się większości bąbelków (kilka małych bąbelków na górnej powierzchni jest w porządku).
  7. Umieścić formę w piekarniku w temperaturze 70 °C na co najmniej 5 godzin, aby PDMS zasiadł się i zestalił.
  8. Wyjmij stałe komory PDMS z formy.
    UWAGA: Wafle krzemowe do form SU-8 są niezwykle delikatne, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas oddzielania PDMS od wafli. Pracuj na twardej, płaskiej powierzchni i utrzymuj wafel płasko na powierzchni.
    1. Za pomocą żyletki wykonaj okrągłe nacięcie w PDMS, około 1 cm od krawędzi formy. Wszystkie wzory muszą znajdować się co najmniej 0,5 cm wewnątrz cięcia. Delikatnie oderwij centralny blok PDMS za pomocą delikatnych szarpnięć.
      UWAGA: Podczas odklejania trzymaj formę SU-8 płasko na blacie, aby zapobiec jej pęknięciu.
    2. Umieść PDMS na czystej folii aluminiowej, uformowanej powierzchni skierowanej w stronę folii aluminiowej, aby chronić jej powierzchnię przed kurzem i aby wzory były bardziej widoczne.
  9. Wybierz i wytnij komorę żyletką w odległości co najmniej 0,5 cm od wzoru. Powstały w ten sposób blok PDMS ma około 0,5 cm wysokości, 1,5 cm szerokości i 3 cm długości. Przebić trzy wloty i jeden wylot za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy wewnętrznej 0,75 mm (tabela materiałów).
  10. Wyczyść komorę PDMS ultraczystym etanolem (Tabela materiałów) i wysusz na powietrzu za pomocą bezpiecznego pistoletu pneumatycznego (Tabela materiałów). Umieść PDMS wzorem skierowanym do góry na czystej szalce Petriego i zamknij naczynie pokrywką.

2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Tutaj szczegółowo opisana jest standardowa procedura czyszczenia szkiełek nakrywkowych, oparta na serii etapów sonikacji. Inne procedury czyszczenia szkiełek nakrywkowych zostały opisane w wielu innych publikacjach, które mogą przynieść podobne zadowalające wyniki6,7,8,9.

  1. Umieść 10-20 szkiełek nakrywkowych (o długości 40 mm) na uchwycie z politetrafluoroetylenu (PTFE) (tabela materiałów). Sonikować szkiełka nakrywkowe w 0,5 l 2% roztworu do czyszczenia szkła (tabela materiałów) w szklanej zlewce o pojemności 1 l (35 °C, 30 min).
  2. Wylać roztwór do czyszczenia szkła i dokładnie spłukać szkiełka nakrywkowe dH2O w co najmniej trzech kolejnych kąpielach o objętości 0,5 l.
  3. Przygotować 0,5 l 2 M KOH w szklanej zlewce o pojemności 1 l. Sonikować szkiełka nakrywkowe w KOH (RT, 30 min). Wyrzucić KOH i spłukać szkiełka nakrywkowe dH2O w co najmniej trzech kąpielach o pojemności 0,5 l.
    UWAGA: Używaj odpowiedniego laboratoryjnego sprzętu ochronnego (rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny).
  4. Przenieść i poddać sonikacji szkiełka nakrywkowe w 0,5 l ultraczystego etanolu (RT, 30 min). Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w etanolu do 2 tygodni. Zamknąć zlewkę folią termoplastyczną (tabela materiałów), aby zapobiec parowaniu. Przed użyciem wysuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem powietrza.

3. Zespół komory PDMS

  1. Rozgrzej płytę grzejną do 100 °C. Umieść do trzech oczyszczonych komór PDMS i szklanych szkiełek nakrywkowych na czystej szalce Petriego. Umieść otwartą szalkę Petriego w środku czyszczącym w głębokim ultrafiolecie (UV) (λ = 185 nm, patrz Tabela materiałów) i wystawiaj ją na działanie światła UV przez 3-5 minut
    UWAGA: Alternatywnie, komory PDMS i szkiełka nakrywkowe mogą być wystawione na działanie plazmy powietrznej lub tlenowej przez 30 sekund.
  2. Delikatnie umieść komorę PDMS nad szkiełkiem nakrywkowym. Upewnij się, że dwie powierzchnie, które miały ze sobą kontakt, były bezpośrednio wystawione na działanie promieniowania UV. PDMS automatycznie przykleja się do szkła, a komora staje się wyraźnie widoczna.
  3. Aby usunąć powietrze uwięzione na styku PDMS i szkiełka nakrywkowego, bardzo delikatnie dociśnij powierzchnię palcem. Aby uzyskać ściślejsze wiązanie, mocniej dociśnij rogi i boki. Upewnij się, że sufit komory nie styka się ze szklaną powierzchnią.
  4. Ustawić komorę ze szklanym dnem skierowanym w stronę płyty grzejnej w temperaturze 100 °C na 5 minut. Po tym kroku wiązania szkło-PDMS stają się trwałe, a komory mogą być używane tylko raz. Użyj komory natychmiast lub przechowuj ją na czystej szalce Petriego przez okres do tygodnia.

4. [OPCJONALNIE] Bezpośrednia pasywacja i funkcjonalizacja

UWAGA: W zależności od zastosowania, komory mogą być pasywowane i funkcjonalizowane albo po podłączeniu do urządzenia sterującego mikroprzepływami (patrz Tabela Materiałów), albo poprzez ręczne wstrzykiwanie roztworów bezpośrednio do komory za pomocą pipety przed jej podłączeniem do urządzenia mikroprzepływowego. Ta ostatnia zaleta polega na zużyciu mniejszej ilości odczynnika i uniknięciu potencjalnego zanieczyszczenia poprzez przepływ roztworu przez rurkę polieteroeteroketonu (PEEK) urządzenia mikroprzepływowego. We wszystkich kolejnych krokach roztwory są wstrzykiwane poprzez bezpośrednie włożenie końcówki pipety do wylotu. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków wewnątrz komory, upewnij się, że z końcówki pipety wystaje niewielka kropelka podczas podłączania końcówki do wylotu komory PDMS. Podobnie, należy zdjąć końcówkę pipety przed wstrzyknięciem całej objętości.

  1. Wstrzyknąć 20 μl PLL-PEG (1 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)). Inkubować przez co najmniej 1 godzinę (lub noc) w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec parowaniu, umieść komorę PDMS w wilgotnym pudełku (np. puste pudełko na końcówki z wodą w dolnej komorze i komora PDMS na platformie przytrzymującej końcówkę).
  2. Wstrzyknąć 20 μl 100 pM nasion spektryny-aktyny (w buforze F, patrz Tabela 1 i Tabela 2). Poczekaj nie dłużej niż 1 minutę. Dostosuj stężenie i czas wysiewu, aby dostroić gęstość powierzchni nasion, wystarczająco wysoką dla dużych statystyk i wystarczająco niską, aby włókna nie zachodziły na siebie.
    UWAGA: Alternatywnie, jeśli nasiona spektryny-aktyny nie są dostępne, użyj funkcjonalnych biotyną krótkich segmentów włókien, które zostaną unieruchomione na szkiełku nakrywkowym pokrytym streptawidyną9,10.
  3. [OPCJONALNIE] Wstrzyknąć 20 μl 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze F. Wyjazd w RT na 10 min.
  4. [OPCJONALNIE] Wstrzyknąć 20 μl 1 mg/ml β-kazeiny do buforu F. Wyjazd w RT na 10 min.
    UWAGA: Wykonaj kroki 4.3 i/lub 4.4, aby dalej pasywować komorę. Wybór pasywacji zależy od użytych białek i nie działa równie dobrze na wszystkie ABP. W przypadku stosowania samej aktyny wystarczy PLL-PEG lub BSA.

5. Podłącz urządzenie mikroprzepływowe

UWAGA: Użyj systemu mikroprzepływowego opartego na ciśnieniu z maksymalnie czterema kanałami do kontrolowania przepływów w komorze mikroprzepływowej (Rysunek 1A, zobacz Tabelę Materiałów). Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w rurkach mikroprzepływowych i zakłócenia stabilności przepływu, należy odgazować wszystkie roztwory. Umieścić 5 ml dH20 i 10 ml buforu F w eksykatorze próżniowym podłączonym do pompy próżniowej (próżnia końcowa <250 mbar) i odgazowywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze suchej masy.

  1. Przepłukać wloty + rurki wylotowe za pomocą dH2O (500 μL, 300 mbar).
  2. Napełnij wszystkie probówki o pojemności 2 ml (patrz tabela materiałów) 300 μl buforu F. Ustaw ciśnienie na 300 mbar i pozwól, aby zmarnowało się od pięciu do ośmiu kropli. Powtórz dla każdego kanału i ustaw ciśnienie na 0.
  3. Podłącz wylot i dokładnie przepłucz komorę.
    1. Ustawić ciśnienie w rurze zbiornika 4 (wylot) na 50 mbar. Gdy kropla wydostanie się z końca rurki, podłącz rurkę do wylotu komory PDMS. Ciecz wypełnia się w komorze i wypływa ze wszystkich wlotów.
    2. [OPCJONALNIE] Jeśli komora była bezpośrednio pasywowana (sekcja 4), ustaw ciśnienie na 100 mbar, aby przepłukać komorę 50-100 μl buforu F (3-5 min). Usuń nadmiar płynu na wlotach chusteczką czyszczącą.
    3. Ustaw ciśnienie na 20 mbar.
  4. Podłącz wloty.
    1. Ustawić ciśnienie w rurze zbiornika od 1 do 50 mbar. Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, upewnij się, że kropla wydostaje się z rurki i wlotu PDMS.
    2. Podłącz rurkę do wlotu 1 (dwie kropelki łączą się podczas łączenia). Ustaw ciśnienie na 30 mbar.
    3. Powtórz kroki 5.4.1-5.4.2, aby połączyć wloty 2 i 3.
  5. Ustaw ciśnienie na wszystkich wlotach na 20 mbar, a ciśnienie wylotowe na 0 mbar. Upewnij się, że natężenia przepływu na wlotach są mniej więcej równe (patrz rozdział Rozwiązywanie problemów).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Wstrzykiwanie roztworów przez komorę mikroprzepływową. (A) Standardowy układ mikroprzepływowy do eksperymentów z pojedynczymi filamentami aktyny. Roztwory białkowe, umieszczone w zbiornikach 1-3, są wpychane do komory poprzez regulację ciśnienia w fazie gazowej. Generowane natężenia przepływu są mierzone przez przepływomierze. Wewnątrz komór mikroprzepływowych roztwory nie mieszają się i nie zajmują miejsca w zależności od przyłożonych ciśnień względnych (tutaj równe ciśnienie na wszystkich wlotach). Typowe wymiary: probówki zawierają do 2 ml roztworu. Rurka PEEK (średnica wewnętrzna 0,25 mm) łączy zbiorniki z przepływomierzami (po 10 cm wężyka), a następnie z komorą PDMS (po kolejnych 70 cm). Rurki silikonowe i łączniki rur ze stali nierdzewnej służą do łączenia rurek PEEK z wlotami PDMS. Główny kanał mikroprzepływowy ma wysokość 20-60 μm, około 1 mm szerokości i 1 cm długości. (B,C) Profile przepływu wewnątrz komory mikroprzepływowej. (B) Płyn generuje profil paraboliczny na całej wysokości komory: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, gdzie h i w to wysokość i szerokość komory, a R to całkowite natężenie przepływu. Dół: Pojedyncze włókno aktynowe polimeryzowane z zakotwiczonych powierzchniowo nasion spektryny-aktyny. (C) Gdy szerokość komory jest znacznie większa niż jej wysokość, przepływ jest prawie równomierny w poprzek komory, z wyjątkiem powierzchni PDMS, gdzie spada do zera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Konfiguracja konfiguracji ze standardowymi natężeniami przepływu

UWAGA: Sterowany komputerowo system ciśnieniowy umożliwia łatwą i precyzyjną regulację ciśnienia na wszystkich wlotach/wylotach podłączonych do komory PDMS, a tym samym kontrolę natężenia przepływu przychodzącego i wychodzącego. Zaprogramowane konfiguracje można zapisywać i włączać/wyłączać za pomocą jednego kliknięcia myszą. Poniżej znajdują się zalecane konfiguracje (o ile nie zaznaczono inaczej, ciśnienie wylotowe jest ustawione na 0 mbar). Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z oczekiwanymi natężeniami przepływu dla tych wstępnie ustawionych konfiguracji. Wskazane tutaj ciśnienia należy dostosować w zależności od geometrii komory i konfiguracji systemu.

  1. Zmień: Użyj tego ustawienia wstępnego podczas wymiany jednego lub więcej zbiorników. Tworzy łagodny przepływ wsteczny w interesującej nas rurce, aby zapobiec wprowadzaniu pęcherzyków.
    1. Ustaw wszystkie ciśnienia wlotowe na 12 mbar, a ciśnienie wylotowe na 5 mbar (Rysunek 2B).
  2. High Flow 'All': Użyj tego ustawienia wstępnego, aby szybko wstrzyknąć trzy roztwory równolegle. Do komory dotrą w ciągu 4 minut.
    1. Ustaw wszystkie ciśnienia wlotowe na 150 mbar.
  3. Wysoki przepływ "x": Użyj tego ustawienia wstępnego, aby szybko wstrzyknąć roztwór. Dotrze do komory w ciągu 3 minut (Rysunek 3A-C).
    1. Ustaw ciśnienie na wlocie "x" na 150 mbar (~15 μL/min). Ciśnienie w pozostałych wlotach jest regulowane na około 100 mbar, tak że wynikowe natężenie przepływu w tych wlotach wynosi ~500 nL/min.
  4. Mid Flow 'All': Użyj tego ustawienia wstępnego, aby wstrzymać system.
    1. Ustaw wszystkie wloty na 20 mbar (Rysunek 2A).
  5. Mid Flow 'x': Użyj tego ustawienia wstępnego, aby umożliwić rozwiązaniu "x" wypełnienie większości szerokości głównego kanału (patrz Rysunek 2C,D), jednocześnie ograniczając inne rozwiązania wlotowe do boków kanału. Filamenty aktynowe w komorze będą zatem wystawione na działanie warunków biochemicznych narzuconych tylko przez roztwór "x".
    1. Ustaw ciśnienie wlotowe "x" na 12 mbar. Ustaw ciśnienie w pozostałych wlotach i dostosuj do ~9 mbar, tak aby ich odpowiednie natężenia przepływu wynosiły ~ 150 nL/min.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Ciśnienie przyłożone do każdego zbiornika kontroluje podział/przestrzenny rozkład roztworów wewnątrz komory mikroprzepływowej. (A) Przy równym ciśnieniu przyłożonym do zbiorników, każdy roztwór zajmuje jedną trzecią komory. (B) Podczas wymiany rurki zbiornika (tutaj zbiornika 3) ciśnienie efektywne spada do zera, tworząc przepływ wsteczny. (C,D) Zwiększenie ciśnienia względnego na jednym ze zbiorników pozwala na wystawienie powierzchni szkła na działanie pojedynczego roztworu. Pole widzenia w środku komory może być sekwencyjnie wystawione na działanie roztworów 1 i 2 poprzez naprzemienne przełączanie konfiguracji Mid Flow 1 (C) i Mid Flow 2 (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Zmiana rozwiązania 'x'

UWAGA: Jak pokazano na Rysunek 3A-C, ważne jest, aby pamiętać, że roztwory potrzebują kilku minut, aby przepłynąć z rurki zbiornika do głównego kanału komory. Ten minimalny "martwy" czas jest narzucony przez objętość cieczy zawartą w rurce i profil przepływu w rurze (Rysunek 3A-C).

  1. Przygotować 200-300 μl roztworu w nowej probówce zbiornika. Ustaw ciśnienie na Zmień ustawienie (patrz rozdział 6).
  2. Odkręcić rurkę zbiornika wlotu "x". Roztwór w wężyku będzie powoli przepływał do tyłu, od komory do wolnej końcówki rurki. Zmierzone natężenie przepływu staje się ujemne (Rysunek 2B).
  3. Gdy na końcówce rurki utworzy się maleńka kropelka, wkręć nową rurkę ze świeżym roztworem. Po prawidłowym dokręceniu rurki do układu ciśnieniowego natężenie przepływu na wlocie powraca do wartości dodatniej.
  4. Ustaw ciśnienie na High Flow "x".
  5. W zależności od konfiguracji mikroprzepływowej i geometrii komory, odczekaj 3-5 minut, aż roztwór całkowicie wypełni rurkę i dotrze do komory.
  6. [OPCJONALNIE] Postępuj zgodnie z tym procesem, mierząc wzrost fluorescencji w czasie (Rysunek 3C).

figure-protocol-3
Rysunek 3: Opóźnione dostarczanie roztworów ze zbiorników do komory PDMS i gwałtowna zmiana warunków biochemicznych. (A-C) Opóźnione dotarcie roztworów ze zbiorników do komory PDMS. (A) W zależności od geometrii komory, długości rurki i ciśnienia przyłożonego do wlotu(ów), zastąpienie jednego roztworu innym nie jest natychmiastowe. Po zmianie rurki zbiornika na taką, w której znajduje się roztwór fluorescencyjny (0 min), roztwór stopniowo napełnia rurkę (0,4 min) i komorę PDMS (1-2 min). Podano orientacyjny czas dla przyłożonego ciśnienia 150 mbar, rurki PEEK o długości 80 cm i komory PDMS o szerokości 1600 μm i wysokości 20 μm. (B) Paraboliczny profil przepływu wewnątrz rurki PEEK generuje efektywny gradient fluorescencji wzdłuż profilu promieniowego rurki i wewnątrz komory (patrz również Rysunek 1B). (C) Opóźnione nadejście roztworów można określić ilościowo, mierząc sygnał epifluorescencji tła w komorze w funkcji czasu. Warunki eksperymentalne: 0,5 μM 10% G-aktyna znakowana Alexa-568 jest wstrzykiwana z 150 mbar przez przepływomierz i 80-centymetrową rurkę PEEK. (D,E) Gwałtowna zmiana warunków biochemicznych. (D) Wzór napływających roztworów w dwóch warunkach przepływu środkowego. (E) Wzrost fluorescencji tła jako odczyt stężenia aktyny. Czas t = 0 jest ustawiany jako początek wzrostu fluorescencji. Roztwór 1: 0,5 μM 10% G-aktyna znakowana Alexa-488, roztwór 2: bufor F. (C,E) Komora PDMS: 20 μm wysokości i 1600 μm szerokości. Intensywność epifluorescencji, ~2 μm nad powierzchnią, określono ilościowo poprzez uśrednienie sygnału w całym polu widzenia, znormalizowanym do 0 przy braku fluoroforu i 1 przy maksymalnej intensywności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Podstawowy eksperyment z pojedynczym włóknem: depolimeryzacja difosforanu adenozyny (ADP) i aktyny z kolczastym końcem

UWAGA: Ta sekcja zakłada niefunkcjonalizowaną komorę (tylko sekcja 5). Jeśli komora została bezpośrednio funkcjonalizowana (sekcja 4), należy rozpocząć od kroku 8.4.

  1. Funkcjonalizacja powierzchni za pomocą nasion filamentu aktynowego:
    1. Zmień roztwór 3 na 200 μl 50 pM nasion spektryny-aktyny11 w buforze F (patrz sekcja 7).
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli nasiona spektryny-aktyny nie są dostępne, można użyć funkcjonalizowanych biotyną krótkich segmentów włókien, które zostaną unieruchomione na szkiełku nakrywkowym pokrytym streptawidyną (szczegóły patrz 9,10).
    2. Wstrzykiwać przez 2 minuty z High Flow 3,
      UWAGA: Dostosuj stężenie i czas w zależności od końcowej gęstości nasion.
  2. Pasywacja powierzchni:
    1. Wymień probówkę 3 na 300 μl 5% BSA w buforze F.
    2. Wstrzykiwać przez 5 minut przy wysokim przepływie 3, a następnie przez 5 minut przy średnim przepływie 3. Podczas tego drugiego kroku należy zmniejszyć ciśnienie w kanałach 1 i 2 do 7-8 mbar, aby uzyskać przeciwprąd ~-100 nL/min, tak aby całe powierzchnie komory były pasywowane BSA.
      UWAGA: Ponieważ roztwór BSA jest bardziej lepki, należy odpowiednio dostosować ciśnienie.
  3. Wymień rurkę 3 na bufor F i przepłucz kanał (5 min, High Flow 3).
  4. Przygotować następujące roztwory o stężeniu 200-300 μl, przy czym wszystkie białka należy rozcieńczyć w buforze F:
    Wlot 1, roztwór polimeryzacyjny: 1 μM 10% Alexa-488 oznaczona G-aktyną, 1 μM profilina (Tabela 1).
    Wlot 2, roztwór starzenia: 0,15 μM 10% Alexa-488 oznaczony G-aktyną.
    Wlot 3, roztwór depolimeryzacyjny: tylko bufor F.
    UWAGA: Profilina jest tutaj stosowana w celu zapobiegania spontanicznemu zarodkowaniu i utrzymania stałego stężenia G-aktyny.
  5. Wymień rurki 1 na 3 (sekcja 7). Wstrzykiwać przy użyciu ustawienia wstępnego High Flow All przez 3-4 minuty. Trzy roztwory wypełniły teraz rurkę PEEK i dotarły do komory (Rysunek 3A). Szklana powierzchnia może być wystawiona na działanie dowolnego roztworu wlotowego bez czasu martwego (<1 s, Rysunek 3D, E).
  6. Włączyć mikroskop. Ustaw ustawienia: laser wzbudzający 150 mW 488 nm przy mocy 10%-20%, czas naświetlania kamery 100-200 ms, głębokość penetracji TIRF 200-300 nm, obiektyw 60x. Ustawienia te są używane w całym manuskrypcie.
  7. Polimeryzacja filamentów (Rysunek 4A):
    1. Ustaw ciśnienie na Mid Flow 1 na ~10 min.
    2. [OPCJONALNIE] Zapis polimeryzacji (1 klatka/20 s, TIRF). Filamenty powinny polimeryzować z prędkością około 10 podjednostek/sekundę (sub/s)1,12.
  8. Starzenie się filamentu: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 2 na 15 minut. Przy stężeniu krytycznym, 0,15 μM G-aktyny, długość filamentu pozostanie stała, a filamenty zmienią się w >99% ADP-F-aktyna4.
  9. Depolimeryzacja (Rysunek 4A):
    1. Rozpocznij akwizycję po 1 klatce/5 s, w trybie epifluorescencji. Ponieważ w kanałach 2 i 3 występuje bardzo niska fluorescencja tła, nie jest konieczne stosowanie TIRF.
    2. Po jednej lub dwóch klatkach przełącz się na Mid Flow 3. Filamenty powinny depolimeryzować z prędkością około 10 sub/s (odniesienie12).
  10. Aby zresetować eksperyment, przerwij wszystkie fluorescencyjnie znakowane włókna, stale wystawiając je na działanie lasera z maksymalną mocą przez ~2 min. Aby przetestować różne warunki, zmień roztwory 1, 2 lub 3 i wstrzyknij je (wysoki przepływ, 3-4 min). Powtórz kroki 8.7-8.9.

9. Inne eksperymenty z pojedynczym włóknem

  1. Badanie oddziaływań ABP z F-aktyną
    UWAGA: Mikrofluidyka została z powodzeniem wykorzystana do ilościowego określenia aktywności kilku wiążących bocznie ABP, takich jak kofilina, tropomiozyna i Arp2/3. Zgodnie z protokołem zawartym w sekcji 8:
    1. Zmień kanał 3 na fluorescencyjny ABP zainteresowania w buforze F. Wstrzykiwanie (wysoki przepływ 3, 3 min).
    2. Polimeryzacja filamentu: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 1 na 10 min.
    3. Wiązanie ABP: rozpocznij pozyskiwanie za pomocą TIRF. Dostosuj liczbę klatek na sekundę w zależności od stężenia ABP. Po 1-2 klatkach przełącz się na Mid Flow 3.
      UWAGA: W zależności od ABP możliwe może być również szybkie (np. na mniej niż 5 s) przełączenie na Mid Flow 2, aby jeszcze bardziej zmniejszyć fluorescencję tła podczas robienia zdjęcia.
    4. Uwolnienie ABP: Kontynuując przejęcie, przełącz się na Mid Flow 2.
  2. Polimeryzacja z forminą na wolnym końcu kolczastym
    UWAGA: Wykazano, że forminy wpływają na polimeryzację kolczastych końcówek włókien. Mikrofluidyka jest szczególnie przystosowana do pomiaru szybkości wiązania i rozwiązywania forminy oraz ich wpływu na wydłużenie włókien.
    1. Przygotuj następujące roztwory:
      Kanał 1: formina 10 nM w buforze F (Tabela 1).
      Kanał 2: 1 μM 10% Alexa-488 oznaczona G-aktyną, 4 μM profilin.
      Kanał 3: bufor F.
    2. Wymień rurki 1, 2 i 3 (sekcja 7). Wstrzykiwać przy użyciu ustawienia wstępnego High Flow All przez 3-4 minuty.
    3. Zainicjuj polimeryzację filamentu: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 2 na 2 min.
    4. Wiązanie forminy z zadziorowym końcem filamentu: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 1 na 30 s.
    5. Polimeryzacja za pośrednictwem forminy: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 2. Z forminą mDia1 na kolczastym końcu, włókna powinny polimeryzować w temperaturze około 50 sub/s13,14,15.
  3. Polimeryzacja/depolimeryzacja z zakotwiczonej powierzchniowo forminy
    UWAGA: Wykazano, że szybkość polimeryzacji i depolimeryzacji kolczastych końcówek ozdobionych forminą zależy od naprężenia przyłożonego do włókna. W mikrofluidyce tarcie przepływu płynu wzdłuż strony filamentu generuje napięcie proporcjonalne do długości filamentu i natężenia przepływu14,16.
    1. Metodę opisaną w sekcji 8 należy zastosować powyżej, zastępując kroki 8.1, 8.2 i 8.3 dla pasywacji powierzchni:
      1. Zmień probówkę 3 na 1 μg/ml przeciwciała anty-He w buforze F. Wstrzykiwać przez 2 minuty za pomocą High Flow 3.
      2. Wymień rurkę 3 z 5% BSA w buforze F. Wstrzykiwać przez 5 minut przy wysokim przepływie 3, a następnie przez 5 minut przy średnim przepływie 3. Podczas tego drugiego kroku należy zmniejszyć ciśnienie w kanałach 1 i 2 do 7-8 mbar, aby uzyskać przeciwprąd ~-100 nL/min, tak aby całe powierzchnie komory były pasywowane BSA.
      3. Zmień probówkę 3 na 100 nM Forminę znakowaną przez Hisa w buforze F. Wstrzykiwać przez 5 minut za pomocą High Flow 3. Wymień rurkę 3 z buforem F. Wstrzykiwać przez 5 minut za pomocą High Flow 3, aby upewnić się, że w rurce nie pozostały forminy.
    2. Przygotować i wstrzyknąć następujące roztwory (po 200-300 μl każdy, w buforze F):
      Kanał 1: 1 μM 10% Alexa-488 oznaczony jako G-actin.
      Kanał 2: 1 μM nieznakowana G-aktyna, 4 μM profilin.
      Kanał 3: tylko bufor F.
    3. Zarodkowanie włókien: Wystawić zakotwiczone powierzchniowo forminy na działanie G-aktyny (ustawienie Mid Flow 1).
    4. Polimeryzacja filamentu: Wystaw komorę na działanie profiliny-aktyny za pomocą Mid Flow 2.
    5. Rozpocznij akwizycję: 1 klatka/2 s, epifluorescencja. W przypadku forminy mDia1 filamenty powinny polimeryzować z prędkością 50-80 sub/s, w zależności od długości filamentu i natężenia przepływu14.
    6. Depolimeryzacja filamentu: Rozpocznij akwizycję (1 klatka/4 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach wystaw filamenty na działanie F-buffera, Mid Flow 3. Dzięki forminie mDia1 filamenty powinny depolimeryzować z prędkością 5-15 sub/s, w zależności od długości filamentu i szybkości przepływu14.
  4. Filamenty aktynowe z nieznakowanymi segmentami
    UWAGA: Znakowanie fluorescencyjne aktyny tworzy kilka artefaktów, takich jak przerwy podczas depolimeryzacji17 i zmienione wiązanie tropomiozyny18. Obejściem tych artefaktów jest użycie mikrofluidyki do składania włókien wyświetlających nieoznakowane segmenty.
    1. Przygotować i wstrzyknąć następujące roztwory (200-300 μl w buforze F):
      Kanał 1: 1 μM nieznakowana G-aktyna, 1 μM profilin.
      Kanał 2: 0,3 μM 10% Alexa-488 oznaczona jako G-aktyna.
    2. Sekwencyjnie wystaw powierzchnię na kanał 2 (5 min), kanał 1 (10 min) i kanał 2 (15 min), aby wygenerować nieznakowane segmenty ADP-aktyny z segmentami znakowanymi fluorescencyjnie na każdym końcu.
  5. Włókna ciągłe zakotwiczone z zadziorem z żelsoliną
    UWAGA: W przypadku nasion spektryny-aktyny włókna polimeryzują na swoim wolnym kolczastym końcu, podczas gdy spiczasty koniec jest stabilizowany przez ziarno spektryny-aktyny. Alternatywą jest zakotwiczenie filamentów za pomocą zaślepki z zadziorowym końcem, takiej jak gelsolin.
    1. Przygotuj roztwór F-aktyny składający się z 4 μM 10% G-aktyny znakowanej Alexa-488 w 20 μl buforu F. Pozwól aktynie spontanicznie zarodkować i polimeryzować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut na ławce. Owiń rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
    2. W międzyczasie przygotuj komorę mikroprzepływową i pasywuj powierzchnię mieszaniną 5% BSA i 1% biotyny-BSA (patrz krok 8.2).
    3. Przepłukać kanał 3 buforem F (2 min przy wysokim przepływie 3). Wstrzyknąć 10 μg/ml neutrawarydyny do buforu F (4 minuty przy wysokim przepływie 3).
    4. Zmień rury na:
      Kanał 1: 10 nM biotyna-żelsolina (Tabela 1).
      Kanał 2: bufor F.
      Kanał 3: 0,4 μM prepolimeryzowana F-aktyna.
    5. Wstrzykiwać wszystkie roztwory razem, używając ustawienia High Flow All przez 3 minuty.
    6. Wystawić całą komorę na działanie żelsoliny (Mid Flow 1, 30 s).
    7. Przymocuj filamenty do powierzchni (Low Flow 3: Kanał 3 przy 3 mbar, Kanały 1 i 2 przy ~2 mbar, przez około 2 minuty).
    8. [OPCJONALNIE] Jeśli gęstość filamentu jest zbyt niska, powtórz kroki 9.5.6 i 9.5.7.
    9. Depolimeryzacja spiczastego końca: Rozpocznij akwizycję (1 klatka/30 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach wystaw filamenty tylko na bufor, Mid Flow 2. Filamenty powinny ulegać depolimeryzacji z prędkością około 0,2 sub/s.

10. Tworzenie i demontaż wiązki włókien wywołanej faszyną za pomocą ADF/kofiliny

UWAGA: Aby utworzyć wiązki filamentów aktynowych, upewnij się, że gęstość zasiewu filamentu na powierzchni komory jest wystarczająco wysoka. Po wystawieniu na działanie białka faszynowego, sąsiednie włókna, które wahają się poprzecznie, będą dynamicznie sieciowane przez białka faszynowe. Ponieważ faszyna szybko odwiązuje się od strony filamentu19, faszyna musi być stale obecna w głównym płynnym roztworze, aby utrzymać wiązanie włókien.

  1. Wykonaj kroki 8.1-8.3.
  2. Przygotuj następujące roztwory (200-300 μl w buforze F):
    Kanał 1, roztwór polimeryzacyjny: 1 μM 10% Alexa-488 oznaczona G-aktyną, 1 μM profilina.
    Kanał 2, roztwór wiązany: faszyna 200 nM (tabela 1), 0,15 μM 10% Alexa-488 oznaczona G-aktyną.
    Kanał 3, roztwór do demontażu: 200 nM ADF/kofilina (Tabela 1), faszyna 100 nM, 0,15 μM 10% Alexa-488 oznaczona G-aktyną.
  3. Wymień rurki 1 na 3 (sekcja 7). Wstrzykiwać przy użyciu ustawienia wstępnego High Flow All przez 3-4 minuty.
  4. Polimeryzacja filamentu: Ustaw ciśnienie na Mid Flow 1 na ~10 min. Polimeryzację można obrazować za pomocą TIRF.
  5. Wiązanie włókien (Rysunek 4C): Rozpocznij akwizycję obrazu (1 klatka/5 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach ustaw ciśnienie na Mid Flow 2 i obserwuj wiązanie filamentu.
  6. Fragmentacja pęczka: Rozpocznij akwizycję obrazu (1 klatka/5 s, epifluorescencja). Po 1-2 klatkach ustaw ciśnienie na Mid Flow 3 i obserwuj wywołany kofiliną demontaż zarówno pojedynczych filamentów, jak i wiązek.

11. Procedura czyszczenia urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Aby uniknąć jakiegokolwiek zanieczyszczenia z jednego eksperymentu na drugi, ważne jest, aby dokładnie wyczyścić i całkowicie wysuszyć wszystkie rurki i przepływomierze po każdym eksperymencie.

  1. Odłącz wszystkie rurki od komory PDMS i wyrzuć komorę.
  2. Aby wyczyścić rurki PEEK i przepływomierze, zaklej końce przewodów taśmą do pustej plastikowej rurki o pojemności 15 ml i wstrzykuj następujące roztwory pod maksymalnym ciśnieniem, aż zbiornik będzie prawie pusty:
    400 μl buforu F.
    400 μl 0,5 M NaOH,
    400 μL czystej wody.
    200 μL izopropanolu.
  3. Wymień na pusty zbiornik i powietrzem, aż rurki całkowicie wyschną (~2-4 min, maksymalne ciśnienie).

12. Analiza obrazu

UWAGA: Chociaż ten manuskrypt skupia się na metodzie składania, manipulowania i wizualizacji pojedynczych filamentów aktynowych w mikrofluidyce, tutaj znajduje się krótka metoda analizy nabytych filmów. Analiza jest wykonywana na obrazach 16-bitowych przy użyciu ImageJ, zgodnie z sekcją 8.

  1. Obróbka obrazu jest minimalna:
    1. Zaimportuj stos obrazów polimeryzacji lub depolimeryzacji.
    2. [OPCJONALNIE] Ujednolicenie intensywności obrazu za pomocą funkcji Odejmij tło (ustawienia domyślne (np. "Promień toczącej się kuli" = 50 pikseli)). Jest to szczególnie przydatne, jeśli fluorescencja tła zmienia się w trakcie filmu lub jeśli oświetlenie fluorescencyjne nie jest jednorodne w polu widzenia.
    3. Dostosuj jasność i kontrast (tło bliskie zeru, włókna bliskie maksimum).
  2. Utwórz kimograf z filamentem:
    1. Wybierz filament, który nie zatrzymuje się, nie przerywa ani nie odłącza. W przeciwnym razie nie wybieraj na podstawie zachowania. Narysuj linię 1-2 piksele powyżej (narzędzie Linia prosta). Zapisz numer filamentu (Dodaj w Menedżerze ROI).
    2. Zastosuj funkcję Reslice (Liczba plasterków: 5 pikseli). Obliczyć maksymalne natężenie (funkcja Zprojection).
  3. Zmierz szybkość polimeryzacji/depolimeryzacji:
    1. Na kimografie narysuj linię wzdłuż kolczastego końca włókna (narzędzie Linia prosta, Rysunek 4A). Zmierz szerokość i wysokość linii (funkcja Zmierz).
  4. Powtórz kroki 12.2-12.3 na wielu filamentach. Oblicz szybkość polimeryzacji/depolimeryzacji ( Rysunek 4A):
    figure-protocol-4, gdzie v to szybkość (w sub/s), w szerokość linii (piksele), pix to rozmiar piksela (nm), h to wysokość linii (klatki), a dt to czas między klatkami (w sekundach). W tym przypadku 2,7 nm odpowiada efektywnemu wkładowi podjednostki aktyny w długość włókna.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wszystkich eksperymentów opisanych powyżej, fluorescencyjnie znakowane filamenty aktynowe powinny być wyraźnie widoczne, z dobrym kontrastem, co wskazuje na niską fluorescencję tła od powierzchni (Rysunek 4, zobacz Plik uzupełniający 1 do rozwiązywania typowych problemów). Filamenty aktynowe również nie powinny przyklejać się do powierzchni: gdy dominujące natężenie przepływu jest niskie, boczne fluktuacje włókien aktyny powinny być zauważalne podczas obserwacji na żywo i umożliwi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu ze standardowymi metodami jednowłókienkowymi, w których filamenty aktynowe są zakotwiczone w powierzchni przez wiele punktów na swojej długości lub utrzymywane blisko niej przez czynnik stłoczenia, taki jak metyloceluloza, mikrofluidyka oferuje szereg korzyści. Ponieważ interakcje z powierzchnią są minimalne, unika się sztucznych przerw, które te interakcje mogą wywołać zarówno podczas wydłużania, jak i depolimeryzacji. Włókna są ustawiane przez przepływ, równolegle do siebie, co ułatwia ich monitorowanie i ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni B. Ladoux i R.-M. Mège lab za korzystanie z ich urządzeń do czyszczenia UV, a J. Heuvingh i 0. du Roure za wstępne szkolenie, które odbyliśmy w zakresie przygotowania form na płytkach krzemowych i udzielania wskazówek dotyczących mikrofluidyki. Potwierdzamy dofinansowanie z grantu Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych StG-679116 (dla A.J.) oraz Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin i Conformin (dla G.R.-L.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-KazeinaMerckC6905Stosowany w 8 mg / ml
Stempel do biopsji (z tłokiem)Ted Pella15115-2ID 0,75 mm, OD 1,07 mm
Biotyna-BSAMerckA8549Używany w 1 mg / ml
BSAMerckA8022Używany w 50 mg / ml
Szkiełko nakrywkowe Mini-Rack
Uchwyt teflonowy		InvitrogenC14784dla 8 Szkiełka nakrywkowe Szkiełka
nakrywkowe 22x40mm
Grubość #1.5		Menzel Glä ser631-1370
DABCOMerckD27802składnik w buforze f
DTTEuromedexEU0006-Dskładnik w buforze f
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorofor do znakowania aktyny na Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338Do biotynylacji aktyny na Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507Detergent do czyszczenia szkła
ImageJNIHN/Aoprogramowanie open source
Pompa próżniowa LaboportKNF811kn.18(próżnia końcowa: 240 mbar)
Magiczna niewidzialna taśmaScotch7100024666standardowa przezroczysta taśma biurowa
MicrewtubeSimportT341-6T2 ml mikroprzepływowe rurki
Urządzenie mikroprzepływowe Część 1: Jednostka przepływu SFluigentFLU-S-D-PCKBPrzepływomierz
Urządzenie mikroprzepływowe Część 2: Fluiwell-4C-2 mLFluigent14002001PCKUchwyt zbiornika
Urządzenie mikroprzepływowe Część 3: MFCS-EZFluigentEZ-11000001
EZ-00345001		Regulator ciśnienia
Model 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220Ultrafioletowy środek czyszczący
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO używany do oznaczania aktyny
neutrawidynyThermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)Stosować w dawce 1 mg/ml w PBS.
Polidimetylosiloksan (PDMS) Sylgard 184 Elastomer silikonowyDow Corning1673921Zawiera bazę PDMS i utwardzacz
Rurki z polieteroeteroketonu (PEEK)MerckZ226661" Niebieski" : ID = 0,25 mm
Bezpieczny pistolet do przedmuchiwaniaWąż cewkowy Pneumatyka700-Sfiltrowane powietrze
Rurki silikonoweVWR228-0701Ppodłączyć PEEK do złączki
Łącznik cewnika ze stali nierdzewnejPrime BioscienceSC22/15Wkładany do wlotów i wylotów PDMS do podłączenia do rurki PEEK
Folia termoplastycznaSigma AldrichPM996Standardowy "parafilm"
Ultraczysty etanolVWR64-17-5
Ultradźwiękowa kąpiel czyszczącaVWRUSC200THDo przechowywania zlewek o pojemności 1 l
Eksykator próżniowySP Bel-ArtF42022-0000do odgazowywania PDMS lub roztworów
zbiornikowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963(2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883(2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548(2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470(2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Filament AssemblyMicrofluidics AssayFluorescence MicroscopyTIRF MicroscopyActin BundlesFilament PolymerizationFilament DepolymerizationSurface PassivationActin Binding ProteinsMechanical Forces

Related Articles