Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Summary

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Abstract

Systemy mikroprzepływowe znacznie poprawiły techniki testów immunologicznych. Jednak wiele technik mikrowytwarzania wymaga specjalistycznego, drogiego lub skomplikowanego sprzętu, co sprawia, że produkcja jest kosztowna i niekompatybilna z produkcją masową, co jest jednym z najważniejszych warunków wstępnych dla testów przyłóżkowych (POCT), które mają być stosowane w warunkach o niskich zasobach. W pracy opisano proces wytwarzania akrylowego (polimetakrylanu metylu, PMMA) urządzenia do badania immunoenzymatycznego testu immunologicznego sprzężonego z nanocząstkami przy użyciu techniki mikromielenia sterowanego numerycznie (CNC). Działanie urządzenia mikroprzepływowego zostało pokazane poprzez wykonanie testu immunologicznego w celu wykrycia komercyjnego przeciwciała przy użyciu lizozymu jako modelowego antygenu sprzężonego z nanocząstkami magnetycznymi o długości 100 nm. To urządzenie integruje fizyczne naprzemienne ograniczenie o wysokości zaledwie 5 μm, używane do wychwytywania mikrocząstek magnetycznych, które tworzą pułapkę magnetyczną poprzez umieszczenie zewnętrznego magnesu. W ten sposób siła magnetyczna działająca na wsparcie immunologiczne sprzężonych nanocząstek jest wystarczająca, aby je wychwycić i oprzeć się oporowi przepływu. To urządzenie mikroprzepływowe jest szczególnie odpowiednie do taniej produkcji masowej bez utraty precyzji wykonania testu immunologicznego.

Introduction

W ostatnich latach mikrofluidyka odegrała ważną rolę w technikach testów immunologicznych¹. Technologia miniaturyzacji ma wiele wyjątkowych zalet w porównaniu z tradycyjnymi testami immunologicznymi, takimi jak zmniejszone zużycie próbek i odczynników, krótszy czas inkubacji, wydajna wymiana roztworów oraz wyższa integracja i automatyzacja².

Ponadto, systemy mikroprzepływowe w testach immunologicznych, w połączeniu z nanocząstkami magnetycznymi jako wsparciem immunologicznym, znacznie skracają czas inkubacji, osiągając wysoką czułość wykrywania dzięki zwiększonemu stosunkowi powierzchni do objętości³. Ruch Browna cząstek poprawia kinetykę reakcji podczas tworzenia kompleksu antygen-przeciwciało^4,5. Co więcej, właściwości magnetyczne nanocząstek zapewniają wszechstronność integracji z różnymi konfiguracjami urządzeń mikroprzepływowych, co czyni je idealnym kandydatem do sygnalizacji i wychwytywania cząsteczek w zminiaturyzowanych systemach biodetekcji na chipie⁵. Jednak siły magnetyczne są znacznie słabsze niż siły oporu w skali nanometrowej ze względu na wysoki stosunek powierzchni do objętości⁶. W związku z tym wychwytywanie nanocząstek do kluczowych etapów testu immunologicznego, takich jak mycie i wykrywanie, może być trudne, a konwencjonalny magnes jest niewystarczający⁴.

Skutecznym sposobem manipulowania nanocząstkami jest użycie mikroprzepływowej pułapki magnetycznej utworzonej przez mikrocząsteczki żelaza, które są upakowane w strukturę mikroprzepływową³. Dlatego, gdy zbliża się magnes zewnętrzny, w namagnesowanym porowatym ośrodku powstaje złożona interakcja między siłami magnetycznymi i strumieniem. Siła magnetyczna działająca na nanocząstki jest wystarczająco duża, aby je wychwycić i oprzeć się oporowi przepływu^3,4,7. Podejście to wymaga technik mikrowytwarzania, które osiągają rozdzielczości rzędu kilku mikrometrów, aby wygenerować struktury mikrometryczne, które zatrzymują mikrocząstki.

Obecne techniki mikrofabrykacji pozwalają na wytwarzanie struktur w wysokiej rozdzielczości od kilku mikronów do setek nanometrów⁸. Jednak wiele z tych technik wymaga specjalistycznego, drogiego lub skomplikowanego sprzętu. Jedną z głównych trudności jest wymóg posiadania pomieszczenia czystego do produkcji form, co pozostaje kosztowne i czasochłonne^8,9. Ostatnio inżynierowie zajmujący się mikroprzepływami przezwyciężyli tę wadę, opracowując różne alternatywne metody wytwarzania, z różnymi zaletami, takimi jak niższe koszty, szybszy czas realizacji, tańsze materiały i narzędzia oraz zwiększona funkcjonalność⁸. W ten sposób rozwój nowych technik mikroprodukcji przyniósł tanie metody poza pomieszczeniami czystymi, które osiągają rozdzielczość tak niską jak 10 μm⁸. Wzorzec może być stosowany bezpośrednio na podłożu bez generowania kosztownego wzoru formowania, co pozwala uniknąć czasochłonnego procesu. Metody produkcji bezpośredniej obejmują frezowanie CNC, ablację laserową i litografię bezpośrednią⁸. Wszystkie te metody nadają się do wytwarzania kanałów o wysokim współczynniku kształtu w szerokim zakresie materiałów, niezależnie od ich twardości⁹, umożliwiając nowe i korzystne geometrie, zachowania fizyczne i cechy w urządzeniach mikroprzepływowych⁸.

CNC mikrofrezowanie tworzy struktury w mikroskali za pomocą narzędzi tnących, które usuwają materiał masowy z podłoża i jest efektywną metodą produkcji urządzeń mikroprzepływowych^10,11. Technika mikrofrezowania może być przydatna w zastosowaniach mikroprzepływowych do tworzenia mikrokanałów i elementów bezpośrednio na powierzchni roboczej, oferując kluczową zaletę: obrabiany przedmiot można wyprodukować w krótkim czasie (mniej niż 30 minut), co znacznie skraca czas realizacji od projektu do prototypu¹². Ponadto szeroka dostępność akcesoriów do cięcia z różnych materiałów, rozmiarów i kształtów sprawia, że frezarki CNC są odpowiednim narzędziem, które umożliwiło wytwarzanie różnych funkcji w wielu rodzajach tanich materiałów jednorazowych¹³.

Wśród wszystkich powszechnie stosowanych materiałów w mikromieleniu, tworzywa termoplastyczne pozostają wiodącym wyborem ze względu na ich wiele korzystnych właściwości i kompatybilność z zastosowaniami biologicznymi^10,14. Tworzywa termoplastyczne są atrakcyjnym podłożem dla systemów mikroprzepływowych ze względu na ich znaczące zalety w tworzeniu tanich, jednorazowych systemów analitycznych⁹. Ponadto materiały te są bardzo podatne na procesy produkcyjne na dużą skalę, dzięki czemu nadają się do komercjalizacji i produkcji masowej. Z tych powodów tworzywa termoplastyczne, takie jak PMMA, są uważane za niezawodne i wytrzymałe materiały od wczesnych lat mikrofluidyki¹⁰. Opisano różne protokoły wytwarzania zamkniętych kanałów w tworzywach termoplastycznych, takie jak klejenie rozpuszczalnikiem¹⁵, heat bonding¹⁶ i ultrafiolet (UV)/ozon surface treatment bonding¹⁷.

W wielu przypadkach rozdzielczość pozycjonowania osiągnięta za pomocą konwencjonalnych mikrofrezarek nie jest wystarczająca dla niektórych zastosowań mikroprzepływowych, które wymagają struktur mniejszych niż 10 μm. Wysokiej klasy mikrofrezowanie ma wystarczającą rozdzielczość. Niestety, ze względu na wysokie ceny, jego użycie jest ograniczone do garstki użytkowników¹². Wcześniej nasza grupa badawcza informowała o wytworzeniu i manipulacji tanim narzędziem, które umożliwia obróbkę struktur o wielkości mniejszej niż 10 μm, pokonując rozdzielczość konwencjonalnych frezarek¹². Oprawa jest platformą wyprodukowaną metodą druku 3D z prostą elektroniką, zawierającą trzy siłowniki piezoelektryczne. Powierzchnia zawiera połączenia w kształcie zawiasów, które umożliwiają jej podnoszenie, gdy elementy piezoelektryczne działają jednocześnie. Przemieszczenie osi Z może być kontrolowane z rozdzielczością 500 nm i dokładnością ±1,5 μm¹².

Ten artykuł przedstawia etapy procesu produkcji urządzenia akrylowego (PMMA) za pomocą techniki mikromielenia. Konstrukcja chipa składa się z kanału głównego o szerokości 200 μm i wysokości 200 μm oraz kanału bocznego o tych samych wymiarach do oczyszczania przepływu odczynników. W centralnym regionie kanał jest przerywany przez fizyczne ograniczenie o wysokości zaledwie 5 μm, wykonane za pomocą wydrukowanej w 3D platformy piezoelektrycznej wykonanej przez tę grupę¹², w celu wychwytywania mikrocząstek magnetycznych, które tworzą pułapkę magnetyczną dla nanocząstek, umieszczając zewnętrzny magnes. Pokazujemy działanie urządzenia mikroprzepływowego, wykonując test immunologiczny w celu wykrycia komercyjnego przeciwciała przy użyciu lizozymu jako antygenu modelowego sprzężonego z nanocząstkami magnetycznymi o długości 100 nm. To urządzenie łączy w sobie różne cechy, które czynią je wyjątkowym⁴: zastosowanie nanocząsteczek magnetycznych jako wsparcia immunologicznego skraca całkowity czas testu z godzin do minut; stosowanie enzymu fluorogennego do wykrywania pozwala na uzyskanie granic wykrywalności, które są porównywalne ze standardowymi testami immunoenzymatycznych (ELISA); a zastosowanie tworzywa termoplastycznego jako materiału produkcyjnego sprawia, że jest on kompatybilny z produkcją masową, co nie miało miejsca w przypadku poprzednich pułapek magnetycznych nanocząstek mikroprzepływowych³, i czyni go doskonałym kandydatem do opracowania POCT.

Protocol

1. Mikromielenie

1. Szlifowanie powierzchni
   1. Włącz mikrofrezarkę i sterownik piezoelektryczny. Uruchom odpowiednie oprogramowanie sterujące¹².
   2. Wybierz wymagane wiertła do frezów palcowych (średnice 200 μm i 800 μm). Umieść je w odpowiedniej komorze frezarki (Rysunek 1).
   3. Wycinanie prostokątów o wymiarach 9 mm x 25 mm z PMMA o grubości 1,3 mm za pomocą frezu palcowego 800 μm. Ostrożnie przymocuj jeden z tych prostokątów za pomocą dwustronnej taśmy klejącej do platformy piezoelektrycznej (Rysunek 2).
      UWAGA: Upewnij się, że prostokąt akrylowy jest zawsze umieszczany w tej samej pozycji, tak aby jeden z narożników pokrywał się ze współrzędnymi początku układu współrzędnych na osiach x i y do obróbki.
   4. Podłącz i umieść czujnik z na powierzchni prostokąta z PMMA. Wybierz kołek detekcyjny i przesuń go po powierzchni czujnika. Opuść sworzeń ręcznie, nie dotykając czujnika. Aktywuj tryb wykrywania Z0 (Rysunek 3).
   5. Wybierz wiertło do frezu palcowego 200 μm i przesuń je do punktu początkowego x, y. Wyjmij czujnik Z. Ostrożnie opuść wiertło, nie dotykając powierzchni akrylowej.
   6. Zakręć wiertłem do frezów palcowych 200 μm z prędkością 14 500 obr./min. Powoli opuść go do współrzędnej początku układu współrzędnych na osi z (z = 0). Zresetuj oś z o 30 μm poniżej początku układu współrzędnych. Ustaw tę współrzędną jako nową współrzędną z-origin.
      UWAGA: Nigdy nie opuszczaj wiertła, jeśli się nie obraca. W przeciwnym razie grozi pęknięciem.
   7. Kliknij przycisk Wytnij w oprogramowaniu mikrofrezarki, aby aktywować panel Wytnij. Kliknij przycisk Dodaj i wybierz .txt plik (Supplemental Coding File 1) z wcześniej utworzonym kodem do szlifowania powierzchni akrylowej. Kliknij przycisk Wyjście, aby rozpocząć proces.
   8. Doprowadzić wiertło frezu palcowego do współrzędnej, w której będzie obrabiane ograniczenie. Zapobiegaj unoszeniu się wiertła frezu palcowego nad powierzchnię gruntu po osiągnięciu tej współrzędnej, klikając przycisk Pauza. W przeciwnym razie ręcznie zmień położenie wiertła frezu palcowego na tę współrzędną (Rysunek 4A).
2. Frezowanie z ograniczeniem 5 μm
   1. Ustaw prędkość obrotową wiertła frezu palcowego na 11 000 obr./min. Podnieś platformę o 6,5 μm za pomocą interfejsu platformy piezoelektrycznej (rysunek uzupełniający S1). Przesunąć wiertło frezu palcowego wzdłuż osi y o 500 μm. Przywróć platformę piezoelektryczną do jej wartości początkowej na osi z interfejsem sterowania.
3. Frezowanie mikrokanalików
   1. Otwórz poprzednio utworzony plik projektu z poziomu oprogramowania do projektowania (Uzupełniający plik projektu 1). Kliknij przycisk Drukuj. Przejdź do menu Właściwości i kliknij okno kolorów odpowiadające warstwie zawierającej projekt do obróbki. Ustaw parametry produkcyjne w panelu Narzędzie, jak określono na rysunku uzupełniającym S2.
   2. Dezaktywuj niechciane warstwy, wybierając opcję Brak w menu rozwijanym Narzędzia.
4. Frezowanie otworów
   1. Przełącz się na frez palcowy 800 μm. Aktywuj warstwę wzoru otworów o średnicy 1,2 mm, klikając odpowiednie okno kolorów.
   2. Powtórz krok 1.3.2., ale w tym przypadku ustaw odpowiednie parametry produkcyjne zgodnie z opisem na rysunku uzupełniającym S3A dla otworów.
      UWAGA: Głębokość obrabianych otworów wynosi połowę grubości akrylu.
   3. Obrobić dwa dodatkowe otwory w przeciwległych rogach prostokąta do wyrównania akrylu w odwrócony sposób na nowej platformie ( Rysunek 4B). Oderwij akrylowy prostokąt od platformy piezoelektrycznej. Odwróć akryl i przyklej go dwustronną taśmą klejącą na adapterze z obrabianymi maszynowo słupkami (Rysunek 4C, D).
   4. Otwórz plik z wymiarem otworów dla przeciwległej ściany z oprogramowania do projektowania (Uzupełniający plik projektu 2). Ustaw odpowiednie parametry produkcyjne zgodnie z opisem na rysunku uzupełniającym S3B. Zmiel pozostałą połowę otworów wlotowych i wylotowych odczynnika o średnicy 1.5 mm i głębokości 0.7 mm (rysunek uzupełniający S3C).

Rysunek 1: Rozmieszczenie końcówek frezu palcowego. (A) Frezy trzpieniowe o średnicy 200 μm i 800 μm są umieszczane i mocowane za pomocą do stalowego wspornika. (B) Każdy bit frezu palcowego jest umieszczany w określonej komorze mikrofrezarki w celu automatycznego wyboru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Platforma piezoelektryczna. Platforma jest wytwarzana metodą druku 3D i składa się z dwóch sześciokątnych podstaw połączonych zawiasami, które umożliwiają drobne przemieszczenie w osi Z sterowane przez trzy siłowniki piezoelektryczne. Obserwuje się również adapter akrylowy, do którego przymocowany jest prostokąt z PMMA, a który pozwala na ustawienie narożnika wyrównania współrzędnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kalibracja osi Z. Etapy kalibracji osi z są szczegółowe. (A) Czujnik Z zawiera, który podłącza się do mikrofrezarki. (B) Czujnik umieszcza się bezpośrednio na obrabianej powierzchni. (C) Kołek detekcyjny składa się z metalowego pręta umieszczonego w specjalnej komorze obok wierteł do frezów palcowych. (D) Gdy oba akcesoria się zetkną, mikrofrezarka automatycznie oblicza współrzędną początku układu współrzędnych na osi z. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rektyfikowana powierzchnia akrylowa. (A) Frez palcowy o średnicy 200 μm omiata całą powierzchnię prostokąta akrylowego, usuwając warstwę o wysokości około 30 μm. (B) Obraz przedstawia różne struktury frezowane na powierzchni wcześniej rektyfikowanego akrylu. Obserwuje się kanały i otwory wlotu i wylotu odczynnika. Ograniczenie 5 μm nie jest widoczne gołym okiem. (C) Mikrofrezowana powierzchnia z otworami wyrównującymi i adapterem z filarami wyrównującymi w przeciwległych rogach. (D) Akryl jest wyrównany do góry nogami na adapterze ze słupkami, w które pasują otwory wyrównujące. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Uszczelnienie kanału

1. Czyszczenie akrylu
   1. Usuń akrylowy prostokąt z platformy adaptera słupka. Weź kolejny nieobrobiony prostokąt akrylowy. Umyj oba arkusze akrylowe alkoholem izopropylowym (IPA) i spłucz wodą destylowaną. Nosić rękawice i unikać kontaktu z IPA.
   2. Zanurz akryl w kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut (Rysunek 5A,B).
2. Narażenie na chloroform gazowy
   1. Idealnie wysusz oba arkusze akrylowe. Przyklej je do wewnętrznej strony szklanej pokrywki szalki Petriego za pomocą taśmy dwustronnej. Upewnij się, że strona obrabianego kanału jest odsłonięta (Rysunek 5C). Noś rękawiczki i unikaj bezpośredniego dotykania powierzchni akrylowej.
   2. Umieść podstawę szklanej szalki Petriego w większej szklanej szalce Petriego (Rysunek 5D). Wlej 1 ml chloroformu na dno szalki Petriego. Szybko umieść pokrywę z arkuszami akrylowymi przymocowanymi do wewnętrznej strony.
   3. Natychmiast dodaj wodę destylowaną do podstawy większej szalki Petriego do poziomu pokrywy szalki Petriego. Pozostawić akryl na działanie chloroformu przez 1 minutę (Rysunek 5E).
      UWAGA: Weź pod uwagę, że dłuższy czas ekspozycji na chloroform zaatakuje powierzchnię akrylową, a ograniczenie 5 μm stopi się, modyfikując jego wysokość lub całkowicie zniknie.
   4. Przechyl szalkę Petriego, aby zerwać utworzoną uszczelkę wodną. Natychmiast usunąć akryl z chloroformu, odsłaniając szalkę Petriego. Uważaj, aby nie rozlać wody.
      UWAGA: Wykonaj ten proces w dygestorii i używaj rękawiczek, ponieważ chloroform jest wysoce toksyczny.
3. Klejenie przez prasowanie i podgrzewanie
   1. Oderwij obie płyty akrylowe od taśmy dwustronnej.
   2. Wyrównaj oba akryle ze stronami, które były wystawione na działanie gazowego chloroformu, twarzą w twarz, tworząc kanapkę. Umieść akryle w prasie w temperaturze 18 kgf/^cm2 i temperaturze 90 °C (Rysunek 5F,G).
      UWAGA: Zaleca się ustawienie akrylu wzdłużnie i zmianę jego wyrównania po 2 minutach w celu uzyskania lepszego uszczelnienia. Jeżeli po tym czasie uszczelnienie jest niewystarczające, należy umieścić je z powrotem w prasie w odstępach nie dłuższych niż 1 minuta. Za pomocą stereoskopu sprawdź stan kanałów i ograniczenia. Należy wziąć pod uwagę, że w przypadku przekroczenia czasu prasowania istnieje ryzyko zniesienia ograniczenia.
4. Mocowanie węża
   1. Przytnij wąż o długości 2-3 cm. Wykonaj całkowicie proste cięcie. Przymocuj każdy wąż do otworów urządzenia za pomocą szybkoschnącego kleju w płynie (Rysunek 6A). Zapobiegaj przedostawaniu się kleju do wnętrza chipa.

Rysunek 5: Proces uszczelniania urządzenia. (A) Każdy z arkuszy akrylowych jest umieszczany w zamykanej torbie z wodą destylowaną i zanurzany w kąpieli ultradźwiękowej. (B) Obraz po lewej stronie pokazuje kanały tuż po wyprodukowaniu, a obraz po prawej pokazuje to samo urządzenie po umyciu IPA i kąpieli ultradźwiękowej, który usuwa wszelkie zanieczyszczenia i pozostałości akrylu z mikrokanału. Obserwuje się krawędzie ograniczenia przerywającego kanał centralny o wielkości 200 μm, co potwierdza udany proces frezowania. Podziałka = 500 μm. (C) Oba akryle są suszone i przyklejane do szklanej platformy na pokrywie. (D) Podstawa płytki Petriego umieszczana jest we wnętrzu innej płytki o większej średnicy. (E) Podczas zamykania płytki Petriego, uszczelnienie wodne zapobiega wydostawaniu się chloroformu gazowego. (F) Opis elementów dźwigni o ciężarze 5 kg. (G) Zdjęcie otwartej dźwigni, pokazujące na czerwono obszar, w którym umieszczony jest akryl. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie urządzenia

1. Napełnij kanały wodą destylowaną za pomocą strzykawki. Upewnij się, że nie ma wycieków ani oporów przepływu. Zanurz urządzenie w kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut, aby usunąć pozostały akryl, klej lub niechciany materiał wewnątrz kanałów.
2. Opróżnij wodę z kanałów urządzenia. Za pomocą strzykawki wprowadzić roztwór blokujący przygotowany z 5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w 1x soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) i uprzednio przefiltrowanej przez filtr strzykawkowy z polieterosulfonu (PES) o stężeniu 0,2 μm.
3. Przygotować zawiesinę mikrocząstek żelaza o średnicy 7,5 μm w 5% BSA.
   UWAGA: Mikrocząstki są wcześniej funkcjonalizowane warstwą glikolu krzemionkowo-polietylenowego (PEG), która nadaje odporność na wchłanianie białek⁴.
4. Inkubować chip i zawiesinę mikrocząstek z roztworem blokującym przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jeśli to możliwe, pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.

4. Powstawanie pułapek mikrocząstek

1. Włóż mikrocząsteczki do chipa za pomocą igły strzykawkowej przez wąż odpływowy kanału bocznego. Umieść chip pionowo i pozwól mikrocząsteczkom przepływać pod wpływem grawitacji przez boczny kanał. Obróć chip o 180° w dwóch krokach po 90° i pozwól, aby mikrocząstki skierowały się i zagęściły przy ograniczeniu 5 μm.
2. Usuń nadmiar mikrocząstek grawitacyjnie obracając się o 45° w kierunku kanału bocznego.
3. Trzymaj urządzenie w pozycji pionowej, aby uniknąć rozkręcenia pułapki na mikrocząsteczki. Zobacz Rysunek 6B dla podsumowania procesu tworzenia pułapek mikrocząstek.

5. Test immunologiczny

1. Przygotowanie nanocząstek
   1. Pobrać 2 μl zawiesiny nanocząstek o długości 100 nm uprzednio sprzężonych z lizozymem (model antygenowy). Dodać go do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej ze 100 μl roztworu blokującego. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Dodać 150 μl buforu do płukania (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Umieść probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml w separatorze magnetycznym. Przechowywać przez 15 minut, aby umożliwić oddzielenie nanocząstek (rysunek uzupełniający S4).
      UWAGA: Minimalna objętość separatora magnetycznego wynosi 200 μL. Unikaj używania mniejszej objętości.
   4. Usunąć płyn z probówki za pomocą mikropipety. Unikaj kontaktu ze ścianką rurki, w której uformowała się osadka nanocząstek.
   5. Dodać 250 μl świeżego buforu do płukania. Trzymaj probówkę w mieszadle przez 15 minut.
   6. Powtórz kroki 5.1.3.-5.1.5. jeszcze 2x, potrząsając tylko przez 5 minut.
   7. Dodać żądane stężenie pierwszorzędowego przeciwciała antylizozymowego (patrz tabela materiałów). Dostosować do końcowej objętości 100 μl w rozcieńczalniku przeciwciał (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Wytrząsać przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Powtórzyć kroki prania 5.1.2.-5.1.6.
   10. Dodać 100 μl rozcieńczalnika przeciwciał. Dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP-AbII) (patrz tabela materiałów) w rozcieńczeniu 1:500.
   11. Powtórzyć kroki prania 5.1.2.-5.1.6.
   12. Przechowywać nanocząstki w końcowej objętości 50 μl rozcieńczalnika przeciwciał.

6. Eksperymentalny montaż

1. Napełnij dwie szklane strzykawki o pojemności 100 μl wodą, podłącz wąż o długości 6,5 cm do każdej strzykawki, włóż metalowy kołek do końca węża i umieść obie strzykawki na sterowanej komputerowo pompie strzykawkowej.
2. Uszczelnij wszystkie węże urządzenia akrylowego ciepłem.
3. Przetnij wąż dopływowy i zachowaj tylko kilka milimetrów. Napełnij igłę dozującą buforem do płukania i włóż ją do odciętego węża. Poczekaj, aż roztwór kapie przed podłączeniem igły do urządzenia, aby zapobiec dostępowi powietrza do urządzenia.
4. Odetnij wąż odpływowy od kanału bocznego. Podłączyć do pompy strzykawkowej. Następnie wykonaj tę samą procedurę dla węża wylotowego kanału głównego.
   UWAGA: Kluczowe jest wykonanie kroków 6.3.-6.4. w tej kolejności, aby uniknąć rozpakowania pułapki na mikrocząsteczki. Jeśli to możliwe, sprawdź stan pułapki podczas tych kroków za pomocą szkła powiększającego.
5. Umieść szklane szkiełko na stoliku mikroskopu. Przymocuj magnes do szkiełka za pomocą taśmy dwustronnej i umieść mały kawałek taśmy z każdej strony, aby przymocować krawędzie chipa do szkła.
6. Ustawić natężenie przepływu na 50 μl/h za pomocą zakładek Natężenie przepływu i Jednostki w sterowniku pompy strzykawkowej. Wybierz tryb wycofywania i kliknij przycisk Start, aby aktywować przepływ bufora myjącego.
7. Ostrożnie zbliż urządzenie do zjeżdżalni z magnesem w poziomie, tak aby obszar chipa zawierający pułapkę stykał się z magnesem.
8. Przyklej krawędzie urządzenia do szyby taśmą dwustronną, aby zapobiec przesuwaniu się. Unikaj zasłaniania ścieżki optycznej dla mikroskopii (Rysunek 6C).

Rysunek 6: Końcowa konfiguracja urządzenia. (A) Urządzenie akrylowe z wężami podłączonymi do odpowiednich wejść i wyjść. Skala pokazuje wymiary urządzenia w centymetrach. (B) Protokół tworzenia pułapki na mikrocząstki. Mikrocząsteczki przepływają przez kanał grawitacyjnie, gdy urządzenie jest ustawione w pozycji pionowej. Mikrocząstki są skoncentrowane przy ograniczeniu 5 μm. Nadmiar mikrocząsteczek można łatwo usunąć, obracając chip przez boczny kanał. Chip jest utrzymywany w pozycji pionowej, aby zachować pułapkę przed testem immunologicznym. (C) Urządzenie mikroprzepływowe zamontowane na szkiełku podstawowym zawierającym magnes, na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Obserwuje się igłę dozującą, przez którą dodawane są odczynniki, a także węże wylotowe, które łączą się z pompą strzykawkową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Immunodetekcja

1. Utrzymuj przepływ buforu płuczącego przez 10 minut w temperaturze 50 μl/h w celu usunięcia nadmiaru BSA.
2. Usunąć pozostały bufor do przemywania z igły dozującej za pomocą mikropipety. Dodać 50 μl zawiesiny nanocząstek.
3. Zawiesinę nanocząstek należy przepływać przez 7 minut z natężeniem przepływu 100 μl/h. Następnie zmień natężenie przepływu na 50 μl/h i płyn przez kolejne 15 minut.
4. Wymień igłę dozującą. Płyn buforu płuczącego przez 10 minut z prędkością 50 μl/h. Na etapie prania należy przygotować podłoże fluorogeniczne zgodnie ze specyfikacją producenta.
5. Usunąć pozostały bufor do przemywania z igły dozującej za pomocą mikropipety. Dodać 100 μl substratu fluorogenicznego (patrz tabela materiałów). Przepływać przez podłoże fluorogeniczne przez 6 minut z prędkością 50 μl/h.
6. Ustaw parametry pomiaru natężenia przepływu (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h i 10 μL/h) oraz czasu (6 min) w odpowiednich zakładkach Natężenie przepływu i Ustaw Timer w interfejsie sterującym pompą strzykawkową. Pamiętaj, aby wybrać tryb wycofywania dla każdego z pomiarów, które mają zostać wykonane.
7. Ustaw dodatkową zakładkę Natężenie przepływu na 50 μl/h i ustaw timer na 3 min dla kroku prania.
8. Włącz fluorescencję mikroskopu 15 s przed zatrzymaniem podłoża przy 50 μl/h. Rozpocznij rejestrowanie obrazu za pomocą oprogramowania kamery mikroskopowej na 10 s przed zatrzymaniem podłoża przy czasie naświetlania 1,000 milisekund. Wykonuj obrazowanie przez 6 minut przy 1 klatce/s (FPS).
9. Kliknij przycisk Start dla żądanego parametru przepływu natychmiast po zatrzymaniu natężenia przepływu płukania podłoża przy 50 μL/h. Kliknij przycisk Start przepływu mycia (50 μL/h) natychmiast po zatrzymaniu wybranego przepływu pomiarowego.
10. Zatrzymaj przechwytywanie obrazu i wyłącz fluorescencję mikroskopu, aby uniknąć fotowybielania podłoża.
11. Powtórz kroki 7.8.-7.10. dla każdego zastosowanego natężenia przepływu pomiaru.

Results

Udało się ustalić wysoce powtarzalny protokół produkcji, który poprawia rozdzielczość konwencjonalnej techniki mikromielenia. Korzystając z tego protokołu, uzyskuje się wytworzenie kanału o wysokości zaledwie 5 μm, który działa jako ograniczenie naprzemienne w kanale o wysokości 200 μm. Prosta konstrukcja naprzemiennego ogranicznika wychwytuje mikrocząsteczki żelaza o średnicy 7,5 μm, które po zagęszczeniu w mikrokanaliku umożliwiają utworzenie pułapki magnetycznej, gdy do urządzenia zbliży się magnes zewnętrzny. To urzą...

Discussion

Akrylowe urządzenie mikroprzepływowe do testów immunologicznych wykorzystujących nanocząstki jako wsparcie immunologiczne zostało wytworzone przy użyciu techniki mikromielenia. Metoda bezpośredniej produkcji na podłożu ma tę zaletę, że pozwala uniknąć użycia formy wzorcowej oraz czasu i kosztów, które się z tym wiążą. Ogranicza się jednak do szybkiego prototypowania i produkcji urządzeń na dużą skalę.

W tym przypadku zastosowaliśmy wcześniej zgłoszoną akcesoryjną platformę piezoelektryczną do ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,008 Frez walcowo-czołowy	KYOCERA SGS	2204	2FL 0,008x1/8x0,12x1-1/12
0,032 Frez walcowo-czołowy	KYOCERA SGS	2228	2FL 0,032x1/8x0,48x1-1/12
Mikrocząstki karbonylo-żelazowe	Sigma-Aldrich	44890	7 μ m
Chloroform	Fermont	6201	Zagrożenie dla zdrowia: Umiarkowane Palność: Brak Reaktywność: Brak Ryzyko kontaktu: Umiarkowane
Kamera CMOS Moment	Teledyne Technologia czujnika fotometrycznego		: CMOS Wydajność kwantowa: 73% Rozmiar piksela: 4,5 i mikro; m x 4,5 i mikro; Obsługiwane interfejsy m : USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Oprogramowanie do grawerowania do projektowania i tworzenia ścieżki grawerowania na powierzchni
Okap ekstrakcyjny	Nieznany	Nieznany Elastyczny
plastikowy rurki	Tygon	AAD04103	ID = 0,020, OD = 0,060
Mikrosope fluorescencyjna	ZEISS	Axio Vert.A1
Igła dozująca o wysokiej precyzji	Loctite	98612
Domowa aplikacja sterownika piezoelektrycznego	LabView		Więcej informacji można znaleźć w odnośniku 12.
Klej błyskawiczny Loctite 495	Henkel	49503	Nakładać za pomocą końcówki do mikropipet lub igły dozującej
Stojak separacyjny MagJET	termonaukowy		12 x 1,5 ml
Prasa mechaniczna	Domowa
frezarka	Roland	MDX-50
Platforma piezoelektryczna	Domowej roboty		Zobacz referencje 12
Polimetakrylan metylu - Arkusz - PMMA, Akryl	Goodfellow	ME303018/1	Grubość: 1,3 mm, Przezroczystość: Przezroczysty/Przezroczysty
Oprogramowanie PVCamTest	Teledyne Photometrics	Wersja 3.10.107	Oprogramowanie do akwizycji obrazów
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Koraliki karboksylowe	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Pompka strzykawkowa	kd Scientific	KDS200	Może pomieścić do dwóch strzykawek
Kąpiel utrasoniczna	Branson	2800
VPanel software	SO Windows	wersja 1.0.3.0	Oprogramowanie do sterowania mikrofrezarką