Klinicznie istotny mysi model zwłóknienia otrzewnej za pomocą dializatu i cewników

Podsumowanie

Pacjenci z ciężkim zwłóknieniem otrzewnej mają wysoką zachorowalność i śmiertelność. Mechanizm zwłóknienia otrzewnej jest niejasny. W tym badaniu opisano prosty eksperymentalny mysi model zwłóknienia otrzewnej wywołanego wstrzyknięciem płynu do dializy otrzewnowej.

Streszczenie

Zwłóknienie otrzewnej może wystąpić u pacjentów poddawanych dializie otrzewnowej (PD), a pacjenci z ciężkim zwłóknieniem otrzewnej mają wysoką zachorowalność i śmiertelność. Zapalenie otrzewnej, płyn dializacyjny o wysokiej zawartości glukozy w otrzewnie i długi okres PD przyspieszają wystąpienie zwłóknienia otrzewnej. Badanie na zwierzętach zwłóknienia otrzewnej jest potrzebne ze względu na ograniczenia badań na ludziach i in vitro. Jednak większość modeli zwierzęcych nie naśladuje stanów klinicznych. Aby zbadać zwłóknienie otrzewnej, opracowaliśmy klinicznie istotny model mysi poprzez wszczepienie cewnika otrzewnowego i wstrzyknięcie 2,5% płynu PD o wysokiej zawartości glukozy oraz 20 mM metyloglioksalu (MGO) do jamy otrzewnej codziennie przez 21 dni. Implantacja cewnika otrzewnowego pozwala uniknąć uszkodzenia otrzewnej przez igły i naśladuje klinicznych pacjentów z chorobą Parkinsona. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że miofibroblasty gromadziły się w zwłókniejącej otrzewnej. W grupie eksperymentalnej stwierdzono mniejszą objętość ultrafiltracji i funkcję transportu błony otrzewnowej (test równowagi otrzewnowej). W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół modelu.

Wprowadzenie

Dializa otrzewnowa (PD) jest jednym z rodzajów terapii nerkozastępczej, którą otrzymuje około 11% pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek (ESRD)¹. Badania wykazały, że zwłóknienie otrzewnej rozwija się u pacjentów otrzymujących PD². Stwardnienie otrzewnowe (EPS), ciężka postać zwłóknienia otrzewnej, powoduje wysoką zachorowalność i śmiertelność³. Do czynników ryzyka zwłóknienia otrzewnej należą: zapalenie otrzewnej, płyn dializacyjny o wysokim stężeniu glukozy, długi okres choroby Parkinsona oraz czynniki genetyczne⁴. Mechanizm zwłóknienia otrzewnej obejmuje złożone zmiany w mikrośrodowisku otrzewnej i przesłuchy między różnymi typami komórek. Eksperymenty in vitro i obserwacje kliniczne ograniczają się do dostarczenia mechanistycznego wglądu w zwłóknienie otrzewnej i potrzebne są modele zwierzęce. Zwierzęta doświadczalne, takie jak psy, króliki, świnie, szczury i myszy, są zwykle używane w badaniach nad chorobami ludzi⁵, z których myszy są najczęściej używane ze względu na zalety ich małych rozmiarów, niskich kosztów i łatwości eksperymentowania. Co więcej, określone komórki mogą być badane w modelach chorobowych myszy przy użyciu technik śledzenia linii.

Stworzenie odpowiedniego modelu zwierzęcego byłoby pomocne w zrozumieniu patofizjologii zwłóknienia otrzewnej. Idealnie byłoby, gdyby model ten był niedrogi, łatwy do odtworzenia i stanowił podstawę klinicznego leczenia zwłóknienia otrzewnej.

Obecnie dostępne modele zwierzęce zwłóknienia otrzewnej są tworzone poprzez dootrzewnowe wstrzykiwanie płynu PD o wysokim poziomie glukozy codziennie przez 28 dni, glukonian chlorheksydyny (CG) trzy razy w tygodniu przez 3 tygodnie, lub pojedynczą dawkę podchlorynu sodu6^,7,8. Modele te mają jednak ograniczenia. Wstrzyknięcie płynu PD o wysokim poziomie glukozy, choć bardzo istotne w praktyce klinicznej, wywołuje jedynie łagodne zwłóknienie otrzewnej i nie podsumowuje stanów klinicznych ciężkiego zwłóknienia otrzewnej, takiego jak EPS. CG lub podchloryn może wywołać ciężkie zwłóknienie otrzewnej naśladujące EPS poprzez uraz chemiczny⁹. Jednak CG i podchloryn mogą wywoływać uszkodzenie otrzewnej i zwłóknienie poprzez różne mechanizmy od płynu PD o wysokiej zawartości glukozy.

To badanie opisuje protokół tworzenia mysiego modelu zwłóknienia otrzewnej. W tym modelu najpierw wprowadza się cewnik do PD, a następnie przez 21 dni wykonuje się codzienne wstrzyknięcia płynu PD o wysokiej zawartości glukozy oraz metyloglioksalu (MGO). MGO jest toksycznym produktem degradacji glukozy w płynie PD i sprzyja tworzeniu zaawansowanych produktów końcowych glikacji, które indukują stan zapalny i angiogenezę^10,11. Dodanie MGO do płynu PD o wysokiej zawartości glukozy indukuje akumulację miofibroblastów i sprzyja zwłóknieniu otrzewnej. Model ten naśladuje zatem warunki kliniczne.

Protokół

Eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z National Taiwan University College of Medicine oraz College of Public Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie myszy były trzymane pod standardową opieką.

1. Eksperyment na zwierzętach

1. Używaj samców i samic myszy C57BL/6 typu dzikiego (WT) w wieku powyżej 11 tygodni
.
2. Przygotuj materiały chirurgiczne, w tym mysz 4-francuski port silikonowy, rękawiczki, serwety, cewniki, szwy i igły.
3. Wszczep port myszy w następujący sposób:
   1. Znieczulić myszy ketaminą/ksylazyną (100/10 mg/kg masy ciała) poprzez wstrzyknięcie podskórne.
      1. Sprawdź częstość oddechów i głębokość znieczulenia myszy podczas operacji, aby upewnić się, że warunki znieczulenia.
         UWAGA: Jeśli częstość oddechów myszy staje się szybka i krótka, dodaj 20% poprzedniej dawki.
   2. Umieść myszy w pozycji leżącej podczas znieczulenia. Ogolić i oczyścić obszar o wymiarach 2 cm x 3 cm po lewej stronie pleców do zabiegu chirurgicznego i zdezynfekować skórę jodowidonem.
   3. Wykonaj 1,5 cm nacięcie w skórze po lewej stronie pleców.
   4. Dokładnie przeprowadź sekcję między skórą a mięśniem po lewej stronie pleców, aby stworzyć przestrzeń o wymiarach 1 cm x 2 cm do wszczepienia portu myszy.
   5. Wykonaj perforację małego otworu nad mięśniem lewej części pleców.
   6. Włóż całą 4-francuską dystalną część portu myszy do jamy otrzewnej
   7. Szew (nylon 4-0) korzeń portu myszy do mięśnia tylnego.
   8. Umieść głowę portu myszy między skórą a mięśniem pleców.
   9. Zamknij skórę za pomocą klipsów odblaskowych (7 mm).
      UWAGA: Klipsy refleksyjne są lepsze niż szwy, ponieważ myszy często gryzą ranę.
   10. Rozpocznij eksperyment po 7 dniach od implantacji portu myszy. Losowo podziel myszy na grupy eksperymentalne i kontrolne.
   11. Przed wstrzyknięciem płynu zdezynfekować skórę w miejscu dostępu powidonem jodem.
   12. Wstrzyknij grupie płynu PD (PDF) z 2,5% płynem PD i 20 mM MGO w sumie 2 ml dootrzewnowo dziennie przez 21 dni. Wstrzyknąć grupie kontrolnej sól fizjologiczną (NS).

2. Test funkcji otrzewnej (test równowagi otrzewnowej)

1. Przygotuj 2,5% płyn PD (2 ml) i zmierz stężenie glukozy w płynie PD, zdefiniowane jako początkowe stężenie glukozy (D0).
2. Wstrzyknij płyn PD do portu myszy.
3. Po 30 minutach należy złożyć ofiary myszy z powodu przedawkowania izofluranu (100%).
4. Zebrać płyn do jamy brzusznej za pomocą strzykawki, a następnie zmierzyć objętość płynu, zdefiniowaną jako objętość ultrafiltracji.
5. Zmierz stężenie glukozy w płynie wewnątrzbrzusznym, zdefiniowane jako końcowe stężenie glukozy (D).
6. Oblicz równowagę otrzewnową lub funkcję otrzewnej¹².
   UWAGA: Test równowagi otrzewnowej12 = Końcowe stężenie glukozy w płynie PD (D)/ Początkowe stężenie glukozy w płynie PD (D0). Stężenie glukozy jest wykrywane metodą heksokinazy za pomocą analizatora biochemicznego¹³.

3. Przygotowanie tkanek i analiza histologiczna

1. Pobrać tkanki otrzewnej: prawą górną ścianę brzucha (1 cm x 1 cm) i wątrobę. Utrwal tkankę otrzewnej 4% paraformaldehydem przez 2 godziny, a następnie na noc w 18% roztworze sacharozy⁷.
2. Przygotować zamrożone skrawki tkanki otrzewnej o grubości 4 μm i przeprowadzić analizę histologiczną zgodnie z wcześniejszymi publikacjami⁷.
3. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne.
   1. Do znakowania immunologicznego należy stosować przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko następującym białkom: aktyna α-mięśni gładkich (SMA; 2 godz., 1:200) do wykrywania miofibroblastów, cytokeratyna (2 godz., 1:200) do wykrywania komórek międzybłonka oraz 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) (5 min, 1:1000) do wykrywania jąder komórkowych.
4. Uzyskane dane należy wyrazić w odpowiednim formacie.
   UWAGA: W tym badaniu dane zostały wyrażone jako średnia ± SEM. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej (Tabela Materiałów), a istotność statystyczną oceniono za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA lub t-testu.

Wyniki

Przeprowadzono badanie histologiczne tkanki otrzewnej, które wykazało, że w grupie otrzymującej płyn do dializy otrzewnowej z dodatkiem MGO (PDF) skutecznie wywołano włóknienie otrzewnej. Barwienie immunofluorescencyjne otrzewnej trzewnej powierzchni wątroby wykazało większą akumulację miofibroblastów w uszkodzonej otrzewnej grupy PDF niż w grupie kontrolnej (Rysunek 1). Jak pokazano na Rysunku 2A, w grupie PDF odnotowano niższą objętość ultrafiltracji niż w gru...

Dyskusja

Otrzewna ma otrzewną trzewną i ciemieniową, pokrywającą narządy jamy brzusznej i ściany brzucha. Składa się z monowarstwy komórek międzybłonka, warstwy podmiędzybłonka, błony surowiczej, fibroblastów, limfocytów i wydzielanych białek¹⁴. Zwłóknienie otrzewnej to utrata i denudacja komórek międzybłonka, pogrubienie podmiędzybłonka i nagromadzenie wielu komórek zapalnych, takich jak miofibroblasty i makrofagi ^4,14.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
przeciwciało anty-cytokeratynowe o szerokim spektrum	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Analizator biochemiczny
DAPI, przeciwciało 4′,6-diamidino-2-fenyloindolowe	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Zasłony			dowolne
kozy FITC anty-królik	Jackson ImmunoResearch Secondary Przeciwciało	111-095-144
Rękawice			dowolne
GraphPad	Prizm Oprogramowanie GraphPad	Oprogramowanie GraphPad 9.0
Kellys			any
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Mysz 4-francuski port
silikonowyMonoklonalna antyaktyna, przeciwciało alfa--mięśni gładkich Cy3	Sigma-Aldrich	C6198
Igły			dowolne
Klipsy refleksyjne 7 mm			dowolne
Szew 4-0 Nylon			dowolny